CN105532411A

CN105532411A - 一种保存丛枝菌根真菌的方法

Info

Publication number: CN105532411A
Application number: CN201610061105.7A
Authority: CN
Inventors: 孙锦; 张�杰; 郭世荣; 束胜; 王磊; 吴亚胜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2016-05-04

Abstract

本发明公开一种保存丛枝菌根真菌的方法，该方法采用穴盘育苗方法，以泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩为保存基质，番茄植株为寄主植物，其中保存基质中泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩的体积比为2:2:1:1。将番茄种子播至于装有混合基质的穴盘中，待种子出苗后，用活化的丛枝菌根真菌菌液灌根，4周后丛枝菌根真菌与番茄根系共生后，剪断番茄植株，收集根系及基质，混合均匀即可用于保存丛枝菌根真菌。本发明的优点是：采用穴盘育苗方法，占用空间少，成本低；利用番茄作为丛枝菌根真菌的寄主植物，植株容易培养，周期短；采用泥炭、椰糠等天然有机物作为保存介质原料，代替天然土壤、河沙，培养条件易控制，更容易满足丛枝菌根真菌生长；基质轻便，降低劳动强度；保存基质原料易于获得，配制方法简单；保存环境条件容易控制，适用于丛枝菌根真菌的大规模保存。

Description

一种保存丛枝菌根真菌的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及到一种保存丛枝菌根真菌的方法。

背景技术

丛枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizafungi,AMF)是一类能与绝大部分植物的根系形成互惠共生体的微生物，它在地球上存在了4.6亿年之久，广泛的分布在农田、森林、草地、荒漠等各种生态系统中。丛枝菌根真菌资源丰富，从地球南极到北极都有分布；宿主多样性丰富，全世界有380科30万种高等植物均能与其形成丛枝菌根。AMF的应用领域广泛，在农林业生产中具有重要的意义。迄今为止，AMF尚不能完全在离体条件下纯培养，其保存方法主要有：①盆栽培养法(Potculture)，一般采用沙、土壤等的混合基质，高梁和白三叶草为宿主植物。是一种最为可靠与广泛的丛枝菌根真菌的保存方法；②培养基培养法(Mediumculture)，是将宿主植物和AMF抱子在无菌培养基上共培养的方法，克服了土壤因素对培养的影响，可得到纯度较高的无杂菌菌剂。但培养基成分要求严格，较难达到高侵染水平，无法完成大规模保存AMF的目的；③静止营养液培养法(Restinghydroponicculture)，利用白三叶草在灭菌的营养液中培养AMF。这种方法所需装置成本较高，实际应用中局限性较大。；④营养流动液培养法(Nutritionflowculture)，这种方法尽管没有了土壤微生物的污染，但由于根系长期浸泡在液体中，不利于根系和真菌的呼吸，对菌剂的繁殖速度和质量产生一定的影响；⑤汽雾培养法(Aeroponicculture)，可在无土条件下大量生产AMF菌剂，生产的菌剂质量较高，但雾化培养系统需要特制的喷雾培养装置，对参数要求严格的营养液，技术要求高，操作复杂，成本较高，产量相对较少；⑥玻璃珠分室培养法(Glassbeadssplit-compartmentculture)，此法得到的菌剂较为纯净，真菌和基质易于分离，培养出大量保持自然菌落的AMF，但培养过程中养分等培养条件需要严格控制，操作繁琐，技术要求高；⑦大田培养法(Fieldculture)，这是生产上大面积生产菌剂的方法，可以大大降低成本，便于大面积推广应用，但AMF仍然受多种因素的影响；⑧AMF与植物离体根器官的无菌双重培养法(DualaxeniccultureofAMFwithRiT-DNAtransformedroot)，AMF孢子在无菌的无机矿质营养培养基中与离体根建立共生体，即双重培养。此法排除了外界微生物的干扰，且不需要植物地上部分，避免外因的影响。但操作复杂，制备工艺繁琐，不适于丛枝菌根真菌的大规模保存；⑨AMF与RiT-DNA转型根的双重单胞无菌培养法(DualmonoaxeniccultureofAMFwithRiT-DNAtransformedroot)，这种方法避免了人为环境条件的干扰，不破坏菌根菌丝生长可原位观察到它的形态发育及其生理生化特性。但这种方法同样面临着操作复杂，制备工艺繁琐的问题，并不适用于AMF的大规模保存。

对比这些丛枝菌根真菌的培养保存方法，活体宿主植物盆栽培养法是最简单、最容易、也是最可靠的AMF保存方法。传统的活体宿主植物盆栽培养法保存丛枝菌根真菌是把植物和丛枝菌根同时接入到土壤或者沙土基质中进行培养。采用这种方法保存丛枝菌根真菌的过程中，为保证菌种的单一纯净，在接种菌种前都要对于栽培基质进行高压蒸汽灭菌，杀死基质中含有的杂菌。土壤一经灭菌，不但破坏了土壤中原本微生物赖以生存的生存环境，而且削弱了土壤肥力；相较于有机基质栽培，寄主植物生长缓慢，导致与丛枝菌根真菌的共生发生时间较长；另外，土壤因地区不同而差异较大，且内部环境复杂，影响丛枝菌根真菌的生长及活性；而且，天然土壤笨重，完成以土壤为基质的盆栽培养，需要大量重体力劳动。此外，该方法制备流程繁琐，且易造成生态破坏，并不适于商业化大规模生产。

选用沙、土壤等的混合基质，以根系数量大的多年生草本植物或一年生植物做寄主植物培养丛枝菌根真菌的报道较多，然而利用泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩等有机物混配作为培养基质，以生长速度快的番茄作为寄主植物，采用穴盘育苗的方法保存丛枝菌根真菌的保存的方法尚未见报道。

发明内容

本发明针对上述领域的空白，提供一种保存丛枝菌根真菌的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种保存丛枝菌根真菌的方法，在有机基质中播种番茄种子，待番茄幼苗出土，用活化的丛枝菌根真菌孢子悬浮液灌根，番茄植株生长4周后，丛枝菌根真菌与番茄根系共生，把根剪断，收集有机基质与番茄根系并混合均匀，所得丛枝菌根真菌与寄主植物根系的混合物即为保存的丛枝菌根真菌；其中，所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积份数为1～50份、1～50份、0～50份、0～50份复配组成。

所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比为1～50：1～50：0～50：0～50组成；优选由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比为25～33：25～33：0～50：0～50组成；还可优选泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比1～2:0～2:0～2:0～2混合而成，作为本发明的优选实施方式，所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比2:0:0:1、1:1:2:0、1:1:0:2、1:1:1:1、1:1:1:0、1:1:0:1、2:2:1:1混合而成。

所述的有机基质进一步优选由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比1～2:1～2:1:1混合而成，特别优选由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比2:2:1:1混合而成。

本发明有机基质中各原料优选具备以下参数：泥炭容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH5.0～7，EC为0.1～5mS·cm^-1；椰糠容重为0.1～0.25g·cm^-3，pH4.5～6，EC为1.3～3.6mS·cm^-1；蛭石容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH6.8～8.0；珍珠岩容重为0.08～0.2g·cm^-3，pH7.0～7.5。

本发明所述的方法，番茄优选采用穴盘育苗培养法栽培，播种前对番茄种子表面消毒。

本发明所述的方法，优选在基质混配前，对原料进行高压蒸汽灭菌，杀死基质中的微生物后再混合制备有机基质。

本发明保存的丛枝菌根真菌可根据需要直接使用，也可放置低温、干燥处或4℃冰箱保存，丛枝菌根真菌活性可保持1年左右。

本发明的有益效果：

本发明以泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩等有机物混配作为培养基质，以生长速度快的番茄植株为寄主，开发出一种新的保存丛枝菌根真菌的方法。与传统培养丛枝菌根真菌的方法相比，本发明利用番茄作为丛枝菌根真菌的寄主植物，植株容易培养，生长周期短；采用泥炭、椰糠等有机物作为保存介质原料代替天然土壤、河沙等，培养条件易控制，更容易满足丛枝菌根真菌生长；基质轻便，降低劳动强度；原料易于获得，配制方法简单；采用穴盘育苗方法，占用空间少，成本低。本发明方法保存环境条件容易控制，适用于丛枝菌根真菌的大规模保存。

附图说明

图1为不同混配基质施加AMF4周后有机质含量(g/kg)

图2为不同混配基质施加AMF4周后微生物呼吸强度(mg/(g·h))

图3为不同混配基质施加AMF4周后微生物代谢熵(h^-1)

图4为不同混配基质施加AMF4周后FDA水解酶活性(μg/(g·h))

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

1材料准备

本实施例以地表球囊霉(Glomusversiforme，简称为V菌，BGC编号：GD01C,资源平台编号：1511C0001BGCAM0031)、摩西球囊霉(Glomusmosseae简称为M菌，BGC编号：YN05，资源平台编号：1511C0001BGCAM0013)为例说明本发明方法，但并不能因此限定本发明保护范围，本发明方法适用于所有的丛枝菌根真菌。丛枝菌根真菌的培养：采用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)进行培养：200g马铃薯去皮洗净，切块，水煮30min，纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1L，分装，121℃灭菌20min。孢子悬浮液：接种真菌于装有100mlPDA的250ml锥形瓶中，28℃,150r/min,光暗交替培养，待培养基悬浮液长出明显菌丝，变为黄棕色，采用灭菌后的纱布过滤，收集孢子悬浮液(浓度4.35×108CFU·L^-1)。

寄主植物为番茄植株。

基质材料为泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩。其中，泥炭容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH5.0～7，EC为0.1～5mS·cm^-1；椰糠容重为0.1～0.25g·cm^-3，pH4.5～6，EC为1.3～3.6mS·cm^-1；蛭石容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH6.8～8.0；珍珠岩容重为0.08～0.2g·cm^-3，pH7.0～7.5。

2、保存基质配制

在基质混配前，对原料进行高压蒸汽灭菌(121℃，1h),以杀死基质中的微生物，之后按如下步骤进行混配：

首先泥炭、椰糠体积比按照1:0；0:1；1:1三个方案混配，形成混合物A；

其次，蛭石、珍珠岩体积比按照1:0；0:1；1:1三个方案混配，形成混合物B；

然后，混合物A与B按照1:1、2:1进行混配，共配制18个不同配比，具体比例如下表：

表118种保存丛枝菌根真菌的基质配比(体积比V/V)

3、试验方法：

寄主植物番茄种子采用10％的次氯酸钠溶液表面消毒5～10min，然后在55℃温烫水中处理15min，然后在30℃的温水中浸种8h，之后置于28℃的恒温箱中催芽，湿度80％，保持黑暗，直至发芽。

待种子萌发，选取饱满、发芽整齐一致的番茄种子播种于装有混配基质的21孔穴盘中，每穴一粒。播种完成后，将穴盘置于光照良好的温室中以减少其他微生物通过风雨的污染。播种前测定混配基质有机质含量。

待番茄幼苗出土，在植株周围加入4ml丛枝菌根真菌孢子悬浮液。育苗期间根据育苗基质的湿润程度和幼苗生长状态，不定期用自来水补充基质水分，每个穴盘每次浇水量以浇灌的清水不向穴盘外渗漏为准。

在加入丛枝菌根真菌孢子悬浮液后，4周后选取番茄根系周围基质，测定所取基质样本的有机质含量、微生物呼吸强度、FDA水解酶活性，用这些指标来判断不同基质配比对丛枝菌根真菌活性的影响，目的在于筛选出能够保持丛枝菌根真菌活性最高的基质配比。

4、实验结果：

综合考虑基质有机质含量的改变，微生物呼吸强度以及FDA水解酶活性。T18对于丛枝菌根真菌的保存效果最好，可将寄主植物为番茄，按T18方案(体积比泥炭：椰糠：蛭石：珍珠岩＝2:2:1:1)混配基质以盆栽生产法保存丛枝菌根真菌。

表2、不同混配基质施加AMF后有机质含量(g/kg)

同列中不同字母表示同期处理间在0.05水平上差异显著。下同

高压蒸汽灭菌降低了基质微生物生物量，在基质灭菌过程中导致大量微生物死亡，使得部分以微生物形式存的炭转化成了有机炭。有机炭含量与有机质含量成正相关，混配基质中有机质含量的变化可间接反映出施加丛枝菌根真菌后，菌根的生物量变化。通过表2、图1可以看出泥炭、椰糠含量增加使得有机质含量增加；施加丛枝菌根真菌后，不同混配基质中有机质含量均增加，相较于施加当天，4周后混配基质的有机质含量虽然下降，但仍高于施加丛枝菌根真菌前。两种丛枝菌根真菌施加后增幅最大都出现在T1，但18种不同的混配基质中有机质增幅显著性差异不大。

表3、不同混配基质施加AMF后微生物呼吸强度(mg/(g·h))

微生物的呼吸强度是衡量基质中微生物活力的一项重要指标。呼吸强度同时反映着微生物对于环境的适应能力。因基质在混配之前进行过高压蒸汽灭菌，所以可将测定的微生物呼吸强度看作是丛枝菌根真菌所产生的。通过表3、图2可以看出，混配基质中添加丛枝菌根真菌后的微生物呼吸强度差异显著，从整体来看，施加不同种丛枝菌根真菌，微生物呼吸强度变化规律相同。观察呼吸强度的变化，不同种混配基质对于呼吸强度的影响差异显著。4周后微生物呼吸强度相较于刚施加时都有所下降，但T11、T18微生物呼吸强度仍表现为最强，并且显著高于其他处理。说明丛枝菌根真菌更适应该混配基质的保存环境。

表4、不同混配基质施加AMF后微生物代谢熵(h^-1)

代谢熵是单位数量的土壤微生物的呼吸强度。通过表4、图3可以看出，代谢熵在不同处理间差异显著，根据前人的研究，代谢熵在逆境情况下会出现增长的现象，本实验中可能是丛枝菌根真菌在新环境的中完成适应环境的一个过程，造成早期代谢熵大于施加丛枝菌根真菌4周后的代谢熵。施加V菌T1、T8显著高于施加V菌的其他处理；施加M菌T8、T18显著高于施加M菌的其他处理。说明在这些处理中，丛枝菌根真菌的活性较强。

表5、不同混配基质施加AMF后FDA水解酶活性(μg/(g·h))

FDA水解酶法已经逐渐应用到根际土壤、植物残体的总微生物活性分析上。FDA水解酶活性与微生物活性之间的相关性比其他酶活性更显著，现已被公认为快速而有效地反映土壤微生物活性的重要指标。由表5、图4可知，在基质中添加丛枝菌根真菌后，T3FDA水解酶活性最大，且显著高于其他处理。而添加AMF4周后处理T11、T18FDA水解酶活性显著高于其他处理。不同菌种间FDA水解酶活性差异不显著。

相较于只含泥炭、椰糠的处理，当泥炭与椰糠混配后的处理暨T7、T8、T9、T16、T17、T18，丛枝菌根真菌的活性表现更好。综合考虑基质有机质含量的改变，微生物呼吸强度以及FDA水解酶活性T18对于丛枝菌根真菌的保存效果最好，可将寄主植物为番茄，按T18方案(泥炭：椰糠：蛭石：珍珠岩＝2:2:1:1)混配基质以盆栽生产法保存丛枝菌根真菌。

上述试验只为说明本发明的技术构思及特点，主要目的是为了公布出一种保存丛枝菌根真菌的方法，让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种保存丛枝菌根真菌的方法，其特征在于在有机基质中播种番茄种子，待番茄幼苗出土，用活化的丛枝菌根真菌孢子悬浮液灌根，丛枝菌根真菌与番茄根系共生，番茄植株生长4周后，把根剪断，收集有机基质与番茄根系并混合均匀，即获得丛枝菌根真菌与寄主植物根系的混合物；其中，所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比为1～50：1～50：0～50：0～50组成。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比为25～33：25～33：0～50：0～50组成。

3.根据权利要求2中所述的方法，其特征在于所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积份数为1～2:0～2:0～2:0～2组成。

4.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比1～2:1～2:1:1组成。

5.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于所述的有机基质由泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩按体积比2:2:1:1组成。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于泥炭容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH5.0～7，EC为0.1～5mS·cm^-1；椰糠容重为0.1～0.25g·cm^-3，pH4.5～6，EC为1.3～3.6mS·cm^-1；蛭石容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH6.8～8.0；珍珠岩容重为0.08～0.2g·cm^-3，pH7.0～7.5。

7.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于番茄采用穴盘育苗培养法栽培，播种前对番茄种子表面消毒。

8.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于；在基质混配前，对原料进行高压蒸汽灭菌，杀死基质中的微生物后再混合制备有机基质。