CN107881113A - 一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法 - Google Patents

一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法，该方法是通过将菌根真菌印度梨形孢接种于无菌的兰科根部，通过优化保存培养基，实现常温下长期（>12个月）保存的目的，相对传统平板培养基保存，具有可在常温下长期保存，减少因频繁继代带来的污染与菌源变异的风险，同时，通过恢复培养基培养，可迅速获得分离具有共生能力的菌株。

Description

一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法
技术领域
本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法。
背景技术
印度梨形孢(Piriformospora indica )是从印度的塔尔沙漠中分离出来的一种植物根部内生真菌，属担子菌门（Basidiomycota），层菌纲（Agaricomycetes），蜡壳耳目（Sebacinales），蜡壳耳科（Sebacinaceae），梨形孢属（Piriformospora），是一种能够定殖在多种寄主植物根部的内生真菌，它的作用和丛植菌根真菌非常相似，能促进植物生长，加快植物对氮、磷等矿物质的吸收，提高作物逆境胁迫的忍耐性，诱导植物产生系统抗性等。
印度梨形孢可以不通过寄主植物而在人工培养基扩增与保存，传统方法常保存于PDA等培养基，具有易失去活力的特点，常温下2-3周就需继代一次，4-6℃冰箱低温保存也需要2-3个月继代一次。频繁继代除带来人工成本，还易造成菌源污染与变异。同时，印度梨形孢因长期保存于人工培养基，可能丧失与植物根部共生的能力。
为了减少继代培养操作，保持印度梨形孢较高的共生能力。本发明利用印度梨形孢可定殖于兰根薄壁细胞，且兰科植物生长慢的特点，通过优化保存培养基，恢复培养基，公布了一种将印度梨形孢接种于无菌的兰科根根部，实现常温下长期保存的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法，实现常温下长期保存的方法。
本发明是由以下技术方案实现的，其具体步骤如下：
1、印度梨形孢菌保存培养基制备
每升保存培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15g/L、甘露糖15-20g/L，琼脂粉5-6g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装9-11瓶，以覆有0.5 cm透气孔的透气膜或透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
2、无菌兰科植物制备
在无菌环境下，将无菌的带有根部的兰科植物茎段或小苗接种于所述保存培养基，置于20-28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养7-10 d备用。
3、接种与保存
在无菌条件下打开2所述兰科植物培养瓶，用打孔器把于PDA培养基新培养一周的印度梨形孢菌菌环周围具活力的菌块接种至兰科植物根部，菌块距离兰科植物根部0.5-1 cm处，接种后置于28℃、黑暗条件培养4～5天，转入20-28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。
4、恢复培养基制备
每升恢复培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15g/L、香蕉泥50-100g/L，琼脂粉5-6g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调控pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装9-11瓶，透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
5、恢复培养
将明显具有共生特征（根毛变多）植物茎段、植株或根部接种于4所述恢复培养基，转入20-28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。培养1周可见从菌根部长出幅射状白色菌块。
6、检测
利用印度梨形孢菌特异性引物（PiEF-F: CGCAGAATACAAGGAGGCC，PiEF-R:CGTATCGTAGCTCGCCTGC)对菌块DNA进行PCR扩增，25μL PCR 反应体系：10 X PCR buffer (plus Mg 2+) 2.5 μL，dNTPs ( 2.5 mmol∙L-1) 0.5 μL, 正向引物 (10 μmol∙L-1) 1 μL，反向引物( 10 μmol∙L-1 ) 1 μL，Taq( 5 U ∙μL-1) 0.2 μ L，ddH2O 18.8 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min, 94 ℃变性45 s, 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，设35个循环， 最后72℃延伸10 min。1.0% (W/V)琼脂糖电泳检测 PCR产物。可见290bp附近有阳性条带，则表明所保存并分离的为印度梨形孢菌。
本发明的显著特点在于：
1、利用根内生型共生真菌印度梨形孢菌可长期定殖于兰根部薄壁细胞，且兰科植物生长慢的特点，通过兰科无菌苗以内共生形式进行常温下长期保存。相对常规平板保存，可由每年接种继代20次缩短为每年接种1次。
2、利用兰科植物及印度梨形孢对甘露糖利用率低的特点，通过在保存培养基中添加甘露糖调整保存培养基渗透压，延缓兰科植物生长，可达到常温下长期保存目的。
3、以内共生形式保存，相对传统人工培养基，能保持印度梨形孢菌根内共生能力，减少菌源变异。
4、印度梨形孢菌可在多种人工培养基上生长，相对真菌通用PDA培养基，通过本发明的针对印度梨形孢菌优化的恢复培养基进行恢复培养，有利减少其他杂菌滋生。
附图说明
图1菌块于文心兰植物根部保存12个月效果。图为保存12个月后，可见文心兰虽出现少量黄叶，仍能生长，箭头处为生长异常加粗的文心兰共生菌根。而平板保存（对照）菌块生长迅速，但褐化失去活力。
图2印度梨形孢菌共生于文心兰根部生成共生孢子。图为保存12个月文心兰菌根横切片，1%丫啶橙染色后于荧光显微镜下观察效果。可见绿色孢子分布于根皮层与薄壁细胞。放大倍数200倍，激发光488nm，接收光505-540nm。 Ve: 根皮层，Ex: 外根鞘，Cort: 薄壁细胞，S: 孢子。
图 3恢复生长菌块于PDA培养基生长效果。图为保存12个月后，于常规平板保存（对照）菌块失去生长能力，而保存于文心兰根部印度梨形孢可于PDA平板生长出正常菌块。
图 4利用印度梨形孢菌特异性引物对菌块进行PCR扩增鉴定。图为保存12个月后，文心兰根所分离菌块（1-4号泳道）能于290bp扩增显著的亮带，表明所保存的确为具有活力的印度梨形孢菌。
具体实施方式
实施例1
1、印度梨形孢菌保存培养基制备
每升保存培养基添加1/2MS基本培养基，蔗糖12g/L、甘露糖17g/L，琼脂粉6g/L, 蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装10瓶，透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
2、无菌兰科植物制备
在无菌环境下，将无菌的带有根部的文心兰3 cm小苗接种于1所述培养基，置于25℃,2000lx、14 h/d光照条件，培养8d备用。
3、接种与保存
在无菌条件下打开文心兰培养瓶，用打孔器把于PDA培养基新培养一周的印度梨形孢菌菌环周围具活力的菌块接种至文心兰植物根部，菌块距离文心兰根部约1 cm处，接种后置于28℃、黑暗条件培养5天，转入25 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。保存12个月后可见文心兰根部异常增粗（图1），于荧光显微镜下可见绿色荧光孢子分布于根皮层与薄壁细胞（图2）。
4、恢复培养基制备
每升恢复培养基添加1/2MS基本培养基，蔗糖12g/L、香蕉泥70 g/L，琼脂粉6 g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装10瓶，以覆有0.5cm透气孔的透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
5、恢复培养
将明显具有共生特征文心兰小苗接种于4所述恢复培养基，转入25℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。培养1周左右可见从根部周围长出幅射状白色菌块。培养12个月菌分离率可达100%。
6、检测
利用印度梨形孢菌特异性引物（PiEF-F: CGCAGAATACAAGGAGGCC，PiEF-R:CGTATCGTAGCTCGCCTGC)对菌块DNA进行PCR扩增，25μL PCR 反应体系：10 X PCR buffer (plus Mg 2+) 2.5 μL，dNTPs ( 2.5 mmol∙L-1) 0.5 μL, 正向引物 (10 μmol∙L-1) 1 μL，反向引物( 10 μmol∙L-1 ) 1 μL，Taq( 5 U ∙μL-1) 0.2 μ L，ddH2O 18.8 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min, 94 ℃变性45 s, 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，设35个循环， 最后72℃延伸10 min。1.0% (W/V)琼脂糖电泳检测 PCR产物。可见290bp附近有阳性条带（图4），则表明所保存并分离的为印度梨形孢菌。
实施例2
1、印度梨形孢菌保存培养基制备
每升保存培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10g/L、甘露糖15g/L，琼脂粉5g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装9瓶，透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
2、无菌兰科植物制备
在无菌环境下，将无菌的带有根部的金线莲茎段接种于所述保存培养基，置于20 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养7d备用。
3、接种与保存
在无菌条件下打开2所述金线莲培养瓶，用打孔器把于PDA培养基新培养一周的印度梨形孢菌菌环周围具活力的菌块接种至兰科植物根部，菌块距离兰科植物根部0.5cm处，接种后置于28℃、黑暗条件培养4天，转入20℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。
4、恢复培养基制备
每升恢复培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10 g/L、香蕉泥50g/L，琼脂粉5 g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调控pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装9瓶，以覆有0.5 cm透气孔的透气膜封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
5、恢复培养
将明显根毛变多金线莲植株接种于4所述恢复培养基，转入20℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。培养1周可见从菌根部长出幅射状白色菌块。
6、检测
利用印度梨形孢菌特异性引物（PiEF-F: CGCAGAATACAAGGAGGCC，PiEF-R:CGTATCGTAGCTCGCCTGC)对菌块DNA进行PCR扩增，25μL PCR 反应体系：10 X PCR buffer (plus Mg 2+) 2.5 μL，dNTPs ( 2.5 mmol∙L-1) 0.5 μL, 正向引物 (10 μmol∙L-1) 1 μL，反向引物( 10 μmol∙L-1 ) 1 μL，Taq( 5 U ∙μL-1) 0.2 μ L，ddH2O 18.8 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min, 94 ℃变性45 s, 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，设35个循环， 最后72℃延伸10 min。1.0% (W/V)琼脂糖电泳检测 PCR产物。可见290bp附近有阳性条带，则表明所保存并分离的为印度梨形孢菌。
实施例3
1、印度梨形孢菌保存培养基制备
每升保存培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖15g/L、甘露糖20g/L，琼脂粉6g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装11瓶，以覆有0.5cm透气膜封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
2、无菌兰科植物制备
在无菌环境下，将无菌的带有根部的铁皮石斛小苗接种于所述保存培养基，置于28℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养10 d备用。
3、接种与保存
在无菌条件下打开2所述铁皮石斛培养瓶，用打孔器把于PDA培养基新培养一周的印度梨形孢菌菌环周围具活力的菌块接种至兰科植物根部，菌块距离兰科植物根部1 cm处，接种后置于28℃、黑暗条件培养5天，转入28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。
4、恢复培养基制备
每升恢复培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖15 g/L、香蕉泥100 g/L，琼脂粉6 g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调控pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，每升培养基分装11瓶，以覆有0.5 cm透气膜或透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用。
5、恢复培养
将明显具有共生特征植物（根毛变多）铁皮石斛植株接种于4所述恢复培养基，转入28℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存。培养1周可见从菌根部长出幅射状白色菌块。
6、检测
利用印度梨形孢菌特异性引物（PiEF-F: CGCAGAATACAAGGAGGCC，PiEF-R:CGTATCGTAGCTCGCCTGC)对菌块DNA进行PCR扩增，25μL PCR 反应体系：10 X PCR buffer (plus Mg 2+) 2.5 μL，dNTPs ( 2.5 mmol∙L-1) 0.5 μL, 正向引物 (10 μmol∙L-1) 1 μL，反向引物( 10 μmol∙L-1 ) 1 μL，Taq( 5 U ∙μL-1) 0.2 μ L，ddH2O 18.8 μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min, 94 ℃变性45 s, 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，设35个循环， 最后72℃延伸10 min。1.0% (W/V)琼脂糖电泳检测 PCR产物。可见290bp附近有阳性条带，则表明所保存并分离的为印度梨形孢菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 三明市农业科学研究院
福建明台农业投资有限公司
<120> 一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgcagaatac aaggaggcc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtatcgtag ctcgcctgc 19

Claims (2)

1.一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法，其特征在于：通过将菌根真菌印度梨形孢接种于无菌的兰科根部，通过保存培养基，实现常温下长期保存的目的。
2.根据权利要求1所述的一种菌根真菌印度梨形孢的长期保存方法，其特征在于：具体方法包括如下：
（1）印度梨形孢菌保存培养基制备
每升保存培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15g/L、甘露糖15-20g/L、琼脂粉5-6g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，以覆有0.5 cm透气孔的透气膜或透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用；
（2）无菌兰科植物制备
在无菌环境下，将无菌的带有根部的兰科植物茎段或小苗接种于所述保存培养基，置于20-28℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养7-10 d备用；
（3）接种与保存
在无菌条件下打开步骤（2）所述兰科植物培养瓶，用打孔器把于PDA培养基新培养一周的印度梨形孢菌菌环周围具活力的菌块接种至兰科植物根部，菌块距离兰科植物根部0.5-1 cm处，接种后置于28℃、黑暗条件培养4～5天，转入20-28℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存；
（4）恢复培养基制备
每升恢复培养基添加1/2MS基本培养基、蔗糖10-15 g/L、香蕉泥50-100 g/L、琼脂粉5-6 g/L，蒸馏水定容，煮沸，稀盐酸调pH值至5.8，分装于625 mL兰花瓶，以覆有0.5 cm透气孔透气膜或透气盖封口，以121℃高压蒸汽灭菌方式灭菌20 min，冷却备用；
（5）恢复培养
将明显具有根毛变多共生特征的植物茎段、植株或根部接种于所述恢复培养基，转入20-28 ℃，2000lx、14 h/d光照条件，培养保存；培养1周可见从菌根部长出幅射状白色菌块；
（6）检测
利用印度梨形孢菌特异性引物PiEF-F: CGCAGAATACAAGGAGGCC和PiEF-R:CGTATCGTAGCTCGCCTGC，对菌块DNA进行PCR扩增，25μL PCR 反应体系：10×PCR buffer (plus Mg 2+) 2.5 μL，2.5 mmol∙L-1dNTPs 0.5 μL，10 μmol∙L-1正向引物1 μL，10 μmol∙L-1反向引物1 μL，5 U ∙μL-1Taq0.2 μ L，ddH2O 18.8 μL；PCR反应程序：94 ℃预变性4 min，94℃变性45 s, 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，设35个循环，最后72 ℃延伸10 min；1.0%(W/V)琼脂糖电泳检测 PCR产物，可见290bp附近有阳性条带，则表明所保存并分离的为印度梨形孢菌。
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