CN102132672A - 一种培育附生兰的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培育附生兰的方法。本发明的培育附生兰的方法包括如下步骤：包括如下步骤：用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的组培苗根部，得到菌根化组培苗，再移栽所述菌根化组培苗进行驯化培养，得到附生兰植株。实验证明，与不接菌的对照相比，本发明方法显著提高了附生兰组培苗的移栽成活率，植株的鲜重显著提高，且植株的适应性广、抗逆性增强，且本发明方法促进幼苗生长，缩短蹲苗期，繁殖周期短。因此，本发明方法在附生兰的人工培育领域将有广阔的应用前景，为附生兰野生资源的保存奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种培育附生兰的方法。
背景技术
菌根化育苗技术已广泛应用于造林工程中，世界上许多发达国家已将其作为营造速生丰产林不可缺少的生物措施。菌根化育苗不仅可促进苗木的早期生长，而且可提高苗木质量。
兰科植物是典型的菌根植物，在长期的进化过程中已形成依赖菌根成活和生长的特性。许多兰花特别是腐生兰对菌根已产生绝对的依赖性，在自然条件下没有菌根就生长不良，甚至死亡。所有的兰花种子在自然条件下都需要与真菌共生才能萌发，形成菌根是它们在自然条件下成活和生长的前提。
自1924年美国植物学家Knudson利用人工添加营养物质的方法代替共生真菌，成功实现了兰花种子的室内无菌播种以来，组织培养技术已成为兰花产业种苗生产的一种常规方法。但是该技术应用于兰科植物的栽培仍有许多问题亟待解决：(1)组培苗移栽成活率低，人们虽然已成功培育出多种野生兰科植物组培苗，但极低的试管苗移栽成活率成为规模化繁育的主要限制因子；(2)幼苗生长缓慢，如国兰组培苗移栽在大田栽培时出现幼苗生长停滞，需经历一段较长时间的“墩苗期”才能恢复；(3)组培苗抗逆性、出瓶适应性差，易遭受病虫害。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于培育附生兰的菌株。
本发明所提供的菌株为假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3，其保藏编号为CGMCCNo.4148。
假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3CGMCC No.4148在培育附生兰植株中的应用也属于本发明的保护范围。
以上应用中，所述附生兰为兰科石斛(Dendrobium)属植物；所述兰科石斛属植物为华石斛(Dendrobium sinense)。
本发明的另一个目的是提供一种培育附生兰植株的方法。
本发明所提供的培育附生兰植株的方法，为如下1)或2)所示：
1)包括如下步骤：用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的组培苗根部，得到菌根化组培苗，再移栽所述菌根化组培苗进行驯化培养，得到附生兰植株；
2)包括如下步骤：用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的驯化苗根部，共培养，得到附生兰植株。
上述方法1)中，所述用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的组培苗根部的方法包括如下步骤：将附生兰的组培苗接入含有假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的共生培养基中，再共培养。
上述方法2)中，所述用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的驯化苗根部的方法为向所述附生兰的驯化苗根部喷洒假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的菌剂。
上述任一所述方法1)中，所述共培养的温度为23℃-26℃，具体为23℃、25℃或26℃；所述共培养的光照强度为2000Lx～3000Lx，具体为2000Lx、2500Lx或3000Lx；所述共培养的光周期为14h光照/10h黑暗；所述共培养的时间为30天-45天，具体为30天、35天或45天。
上述任一所述方法1)中，所述含有假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCCNo.4148的共生培养基按照包括如下步骤的方法得到：将所述假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148接种于共生培养基，进行菌的活化培养，得到所述含有假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的共生培养基；
1升所述共生培养基由950mg KNO3、825mg NH4NO3、85mg KH2PO4、185mg MgSO4.7H2O、220mg CaCl2.2H2O、0.415mg KI、3.1mg H3BO3、11.15mg MnSO4.4H2O、4.3mg ZnSO4.7H2O、0.125mg Na2MoO4.2H2O、0.0125mg CuSO4.5H2O、0.0125mg CoCl2.6H2O、18.65mgNa2.EDTA、18.9mg FeSO4.7H2O、50mg肌醇、1mg甘氨酸、0.05mg VB1、0.25mg VB6、0.25mg烟酸、30g蔗糖、0.5g活性炭、30g香蕉、30g土豆、7g-8g琼脂和水组成；水补足体积；
所述共生培养基的pH值为5.5-5.8，具体为5.5、5.6或5.8；
上述任一所述方法2)中，所述假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的菌剂按照包括如下步骤的方法得到：将假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCCNo.4148用DE培养基培养，取带有菌丝的培养基块，将带有菌丝的培养基块捣碎与水混合，即得到菌剂；所述捣碎的带有菌丝的培养基块与水的体积比为1∶(2-4)，具体为1∶2、1∶3或1∶4。
上述任一所述方法1)中，所述菌的活化培养的温度为23-26℃，具体为23℃、25℃或26℃；所述菌的活化培养在黑暗的条件下进行；所述菌的活化培养的时间为6天-8天，具体为6天、7天或8天；
上述任一所述方法2)中，所述喷洒的方式为每隔10天喷洒1次，共喷洒7次-9次或7次或8次或9次，每次的喷洒剂量为5ml菌剂/株驯化苗。
上述任一所述方法1)中，所述驯化培养的培养基质为灭菌的苔藓；
上述任一所述方法2)中，所述共培养的培养基质为无菌苔藓；
上述任一所述方法1)中，所述驯化培养的温度为25℃-28℃，具体为25℃、26℃或28℃；所述驯化培养的湿度为70％-90％，具体为70％、80％或90％；所述驯化培养的遮阳率为60％-70％，具体为60％、65％或70％；
上述任一所述方法2)中，所述共培养的湿度为70％-90％，具体为70％、80％或90％；所述共培养的遮阳率为60％-70％，具体为60％、65％或70％；所述共培养的温度为25℃-28℃，具体为25℃、26℃或28℃。
上述任一所述方法中，所述附生兰为兰科石斛(Dendrobium)属植物；所述兰科石斛属植物为华石斛(Dendrobium sinense)。
实验证明，与不接菌的对照相比，本发明方法显著提高了附生兰组培苗的移栽成活率，植株的鲜重显著提高，且植株的适应性广、抗逆性增强，且本发明方法促进幼苗生长，缩短蹲苗期，繁殖周期短。因此，本发明方法在附生兰的人工培育领域将有广阔的应用前景，为附生兰野生资源的保存奠定了基础。
附图说明
图1为菌株的形态。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的附生兰种子为华石斛(Dendrobium sinense Tang&Wang)的种子，在文献“吴智彪，宋希强，李绍鹏.华石斛内生真菌诱导子对其组培苗生长的影响(J)，热带作物学报，2006，27(1)，77-79”中公开过，公众可从海南珠峰园林科技有限公司获得。
实施例1、真菌的分离与鉴定
一、分离方法
从采自海南省霸王岭的野生华石斛(Dendrobium sinense Tang&Wang)分离出菌株，其方法如下：
1.1、选取野生长势健壮并生长旺盛的野生华石斛的新鲜营养根，流水冲洗掉根表面腐殖质和杂物。
1.2、在超菌工作台上将根段浸入1％次氯酸钙溶液中10-12min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-4次。
1.3、将根段切成2-3mm长的小段，放置在PDA培养基上，25℃下暗培养，经过一段时间培养后，待菌丝自根段中长成菌落后，挑取菌丝转移至PDA培养基上进行培养纯化。
1.4、没有污染，转入指型管内PDA斜面培养基，4℃短期保存待用。
每升PDA培养基是由200克去皮土豆，20g蔗糖，20g琼脂粉和1L水制成，PH自然。将分离得到的菌株与目标苗分别进行共生培养，一定时间后检测该菌株对苗的生长的促进作用的大小(检测如下指标：单位时间内苗增加的鲜重、株高、节数、叶片数)，各指标均高于对照组，则确定该菌为益菌。
结果得到一株菌，命名为S3.
二、鉴定
菌株S3在PDA培养基上，菌落黑色，表面为灰白色，背面看有同心圆，菌落生长速度中等。菌丝浅褐色，有分支，未见分生孢子。如图1(A为肉眼观察，B为显微镜观察)。
检测该菌株中的ITS rDNA基因，得到的序列如SEQ ID NO：1所示。将该基因序列在ncbi数据库中进行blast比对。比对结果表明，该序列与假尾孢属的序列的相似性为99％。
综合以上鉴定结果，表明该菌株属于假尾孢(Pseudocercospora sp.)。该菌株已于2010年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4148，分类命名为假尾孢(Pseudocercospora sp.)。
实施例2、通过菌根化组培苗培育附生兰
方法I
一、组培苗的获得
组培苗的制备方法与现有技术中相同。
1、无菌播种：将成熟未开裂的果荚，经过灭菌消毒等处理后，播种至事先消毒好的空白培养基(即将8g琼脂粉和1000ml水混合，PH：5.5-5.8)上。23-26℃、黑暗培养15-20d后；改为光照强度为2000Lx～3000Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度23-26℃培养，20-30d种子即萌发。
2、圆球经培养：将已萌发的种子放入培养基为1/2MS+20g糖+50-100ml椰子汁+20g土豆+7g琼脂，PH：5.5-5.8。光照强度为2000Lx～3000Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度23-26℃下培养，30-45d，即可长成幼苗。
3、壮苗培养：将幼苗转接至培养基为1/2MS+20g糖+50ml椰子汁+30g土豆+30g香蕉+7g琼脂，PH：5.5-5.8。光照强度为2000Lx～3000Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度23-26℃下培养，30-45d，苗较粗壮，叶片数达4片，株高可达3cm，株径0.2cm。
4、生根培养：将经过壮苗培养后的苗转接至培养基为1/2MS+20g糖+50ml椰子汁+30g土豆+30g香蕉+0.5g活性炭+7g琼脂，PH：5.5-5.8。光照强度为2000Lx～3000Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度23-26℃下培养，30-45d，苗较粗壮，根数可达3根。
以上培养基均为每1升培养基所含的添加物的量。
二、菌剂的制备
1、活化
将假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148接种于PDA培养基，25℃下暗培养活化。
PDA培养基制备：与现有技术中相同，每升PDA培养基由200克去皮土豆，20g蔗糖，20g琼脂粉和1L水制成，PH自然。
2、菌块培养
将带有单一纯菌丝的培养基块接种于DE培养基中，在25℃下暗培养15天，得到含有假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148菌丝的DE培养基。
DE培养基组成：为现有技术中常用的培养基。
每一升培养基具体是由终浓度为110.98mg/L的CaCl2、终浓度为174.25mg/L的K2SO4、终浓度为123.24mg/L的MgSO4.7H2O、终浓度为54.44mg/L的KH2PO4、终浓度为1.55mg/L的H3BO4、终浓度为6.53mg/L的MnCl.4H2O、终浓度为0.80mg/L的ZnSO4.7H2O、终浓度为0.24mg/L的NaMO4.2H2O、终浓度为52.11mg/L的C10H14N2O8Na2.2H2O、终浓度为27.80mg/L的FeSO4.7H2O、终浓度为9g/L的可溶性淀粉、终浓度为1g/L的酵母膏、终浓度为8g/L的琼脂和水组成，其最终PH值为6.0。
可溶性淀粉购自国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为10021318。酵母膏购白国药集团化学试剂有限公司，产品目录号为69024838。
三、组培苗接菌
取直径为0.5cm的上述步骤二制备得到的带菌的培养基块，接种于共生培养基上，在25℃下暗培养7d(菌种活化)后，将实验一得到的组培苗接入共生培养基中，再共培养35d，共培养条件：光照强度为2500Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度25℃。利用菌根染色法进行组培苗菌根化的快速检测。
对照：以不接入任何菌的共生培养基培养相同的组培苗。
用菌根染色法进行组培苗菌根化的快速检测：将对照和不同处理的根分别放入10％KOH中，121℃脱色20min，取出后用无菌水冲洗3次，用苯胺蓝90℃条件下染色4h，碱性H2O2脱色8min，脱水后根段中染上颜色的即为真菌侵染成功的菌根。结果：实验组的组培苗菌根化成功，且出现丝状的蓝色条带，即为被染色的菌丝，对照组的组培苗未出现菌根。
共生培养基的组成如表1，用水定容，PH：5.6。
表1、每1升共生培养组成：
四、菌根化组培苗移栽
将菌根化成功的组培苗移栽到穴盘中，在温度26℃、湿度80％和遮阳率为70％的条件下培养。
培养基质：经121℃高压灭菌2h的新鲜苔藓，待苔藓凉至常温后用来种植。
以未菌根化的组培苗作为对照组。
从驯化开始时计起，90d后统计苗的移栽成活率并计算苗的鲜样质量增长率。
实验设3次重复，结果取平均数。
结果如下：
1)移栽成活率：实验组85％；对照组60％。
2)鲜样质量增长率：实验组25％；对照组13％。鲜样质量增长率的计算公式：鲜样质量增长率＝单位时间内鲜样质量增长量/鲜样总质量。鲜样质量检测方法：将苗清洗干净用棉布吸干植株表面的水直接用电子天平称量。
3)苗的抗逆性检测：取直径为0.5cm的上述步骤二制备得到的带菌的培养基块，接种于共生培养基上，在25℃下暗培养7d(菌种活化)后，将实验一得到的组培苗接入共生培养基中，再共培养60d，然后将共培养60d后的组培苗接种于含有不同铜离子浓度的共生培养基中，继续培养，观察苗的生长情况。共培养条件：光照强度为2500Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度25℃。
共生培养基中铜离子浓度分别为0.0064mg/L、0.0128mg/L、0.0192mg/L、0.0256mg/L。
以未菌根化的组培苗作为对照。
实验设三次重复，结果取平均数。
结果如下：
实验组：当培养基中铜离子浓度为0.0256mg/L时，从用含0.0256mg/L铜离子的培养基开始培养时计起，培养50d后时植株开始表现为幼叶发黄，至90天时，苗叶片大部分发黄，个别或极少数死亡。当培养基中铜离子浓度为0.0064mg/L、0.0128mg/L或0.0192mg/L时，苗的生长正常。
对照组：当培养基中铜离子浓度为0.0192mg/L时，从用含0.0192mg/L铜离子的培养基开始培养时计起，培养20d左右，苗的幼叶便发黄；至90天时，苗叶片大部分发黄，个别或极少数死亡。当培养基中铜离子浓度为0.0256mg/L时，培养10-20几天，苗的幼叶便发黄。
实验组对于铜离子浓度的抗性可增加1倍多。
方法II
一、组培苗的获得：与方法I中所述相同。
二、菌块的制备：与方法I中所述相同。
三、组培苗接菌
取直径为0.5cm的上述步骤二制备得到的带菌的培养基块，接种于共生培养基上，在23℃下暗培养6d(菌种活化)后，将实验一得到的组培苗接入共生培养基中，再共培养30d，共培养条件：光照强度为2000Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度23℃。
对照：以不接入任何菌的共生培养基培养相同的组培苗。
共生培养基与方法I中所述基本相同，不同的是pH值为5.5。
结果：实验组的组培苗菌根化成功，对照组的组培苗未出现菌根。
四、菌根化组培苗移栽
将菌根化成功的组培苗移栽到穴盘中，在温度25℃、湿度70％和遮阳率为60％的条件下培养。
培养基质：经121℃高压灭菌2h的新鲜苔藓，待苔藓凉至常温后用来种植。
以未菌根化的组培苗作为对照组。
从驯化开始时计起，90d后统计苗的移栽成活率并计算苗的鲜样质量增长率。
实验设3次重复，结果取平均数。
结果如下：
1)移栽成活率：实验组与方法I无显著差异。
2)鲜样质量增长率：实验组与方法I无显著差异。
3)苗的抗逆性检测：实验组与方法I无显著差异。
方法III
一、组培苗的获得：与方法I中所述相同。
二、菌块的制备：与方法I中所述相同。
三、组培苗接菌
取直径为0.5cm的上述步骤二制备得到的带菌的培养基块，接种于共生培养基上，在26℃下暗培养8d(菌种活化)后，将实验一得到的组培苗接入共生培养基中，再共培养45d，共培养条件：光照强度为3000Lx，光周期为14h光照/10h黑暗，温度26℃。
对照：以不接入任何菌的共生培养基培养相同的组培苗。
共生培养基与方法I中所述基本相同，不同的是pH值为5.8。
结果：实验组的组培苗菌根化成功，对照组的组培苗未出现菌根。
四、菌根化组培苗移栽
将菌根化成功的组培苗移栽到穴盘中，在温度28℃、湿度90％和遮阳率为65％的条件下培养。
培养基质：经121℃高压灭菌2h的新鲜苔藓，待苔藓凉至常温后用来种植。
以未菌根化的组培苗作为对照组。
从驯化开始时计起，90d后统计苗的移栽成活率并计算苗的鲜样质量增长率。
实验设3次重复，结果取平均数。
结果如下：
1)移栽成活率：实验组与方法I无显著差异。
2)鲜样质量增长率：实验组与方法I无显著差异。
3)苗的抗逆性检测：实验组与方法I无显著差异。
实施例3、通过驯化苗接菌培养附生兰
方法I
一、菌剂的制备
取实施例2中步骤二中步骤2制备得到的带有菌丝的培养基块，将其捣碎，再将其与无菌水混合，捣碎的菌块与水的体积比为1∶3。
二、驯化苗的获得
驯化苗的获得方法与现有技术中相同。
按照实施例2中实验一的方法得到组培苗。以无菌苔藓为栽培基质，将组培苗种于直径为5cm小盆中，在遮阳率为70％、温度为28℃，湿度为70％的条件下，培养7d，得到驯化苗。
三、驯化苗及接菌
向驯化苗的根部喷施菌剂，每隔10d喷洒1次，5mL/个苗，共喷8次。在此期间的培养条件为：温度为26℃，湿度为80％，遮阳率为65％。
从开始喷洒菌剂时计起，培养90d后统计苗的移栽成活率和苗的鲜样质量增长率。
以不喷洒菌剂的驯化苗作为对照。
实验设3次重复，结果取平均数。
结果如下：
1)移栽成活率：实验组90％；对照组75％。
2)鲜样质量增长率：实验组25％；对照组15％。
方法II
一、菌剂的制备
与方法I中所述方法基本相同，不同的是菌块与水的体积比为1∶2。
二、驯化苗的获得：与方法I中所述相同。
三、驯化苗及接菌
向驯化苗的根部喷施菌剂，每隔10d喷洒1次，5mL/个苗，共喷7次。在此期间的培养条件为：温度为25℃，湿度为70％，遮阳率为60％。
从开始喷洒菌剂时计起，培养90d后统计苗的移栽成活率和苗的鲜样质量增长率。
以不喷洒菌剂的驯化苗作为对照。
实验设3次重复，结果取平均数。
结果如下：
1)移栽成活率：实验组结果与方法I无显著差异。
2)鲜样质量增长率：实验组结果与方法I无显著差异。
方法III
一、菌剂的制备
与方法I中所述方法基本相同，不同的是菌块与水的体积比为1∶4。
二、驯化苗的获得：与方法I中所述相同。
三、驯化苗及接菌
向驯化苗的根部喷施菌剂，每隔10d喷洒1次，5mL/个苗，共喷9次。在此期间的培养条件为：温度为28℃，湿度为90％，遮阳率为70％。
从开始喷洒菌剂时计起，培养90d后统计苗的移栽成活率和苗的鲜样质量增长率。
以不喷洒菌剂的驯化苗作为对照。
实验设3次重复，结果取平均数。
结果如下：
1)移栽成活率：实验组结果与方法I无显著差异。
2)鲜样质量增长率：实验组结果与方法I无显著差异。
Claims (10)
1.一种培育附生兰植株的方法，为如下1)或2)所示：
1)包括如下步骤：用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的组培苗根部，得到菌根化组培苗，再移栽所述菌根化组培苗进行驯化培养，得到附生兰植株；
2)包括如下步骤：用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的驯化苗根部，共培养，得到附生兰植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法1)中，所述用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的组培苗根部的方法包括如下步骤：将附生兰的组培苗接入含有假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的共生培养基中，再共培养；
所述方法2)中，所述用假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148侵染附生兰的驯化苗根部的方法为向所述附生兰的驯化苗根部喷洒假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的菌剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法1)中，所述共培养的温度为23℃-26℃，具体为23℃、25℃或26℃；所述共培养的光照强度为2000Lx～3000Lx，具体为2000Lx、2500Lx或3000Lx；所述共培养的光周期为14h光照/10h黑暗；所述共培养的时间为30天-45天，具体为30天、35天或45天。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法1)中，所述含有假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的共生培养基按照包括如下步骤的方法得到：将所述假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148接种于共生培养基，进行菌的活化培养，得到所述含有假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCCNo.4148的共生培养基；
1升所述共生培养基由950mg KNO3、825mg NH4NO3、85mg KH2PO4、185mg MgSO4.7H2O、220mg CaCl2.2H2O、0.415mg KI、3.1mg H3BO3、11.15mg MnSO4.4H2O、4.3mg ZnSO4.7H2O、0.125mg Na2MoO4.2H2O、0.0125mg CuSO4.5H2O、0.0125mg CoCl2.6H2O、18.65mgNa2.EDTA、18.9mg FeSO4.7H2O、50mg肌醇、1mg甘氨酸、0.05mg VB1、0.25mg VB6、0.25mg烟酸、30g蔗糖、0.5g活性炭、30g香蕉、30g土豆、7g-8g琼脂和水组成；水补足体积；
所述共生培养基的pH值为5.5-5.8，具体为5.5、5.6或5.8；
所述方法2)中，所述假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148的菌剂按照包括如下步骤的方法得到：将假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148用DE培养基培养，取带有菌丝的培养基块，将带有菌丝的培养基块捣碎与水混合，即得到菌剂；所述捣碎的带有菌丝的培养基块与水的体积比为1∶(2-4)，具体为1∶2、1∶3或1∶4。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法1)中，所述菌的活化培养的温度为23-26℃，具体为23℃、25℃或26℃；所述菌的活化培养在黑暗的条件下进行；所述菌的活化培养的时间为6天-8天，具体为6天、7天或8天；
所述方法2)中，所述喷洒的方式为每隔10天喷洒1次，共喷洒7次-9次或7次或8次或9次，每次的喷洒剂量为5ml菌剂/株驯化苗。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法1)中，所述驯化培养的培养基质为灭菌的苔藓；
所述方法2)中，所述共培养的培养基质为无菌苔藓；
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法1)中，所述驯化培养的温度为25℃-28℃，具体为25℃、26℃或28℃；所述驯化培养的湿度为70％-90％，具体为70％、80％或90％；所述驯化培养的遮阳率为60％-70％，具体为60％、65％或70％；
所述方法2)中，所述共培养的湿度为70％-90％，具体为70％、80％或90％；所述共培养的遮阳率为60％-70％，具体为60％、65％或70％；所述共培养的温度为25℃-28℃，具体为25℃、26℃或28℃。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述附生兰为兰科石斛(Dendrobium)属植物；所述兰科石斛属植物为华石斛(Dendrobium sinense)。
9.假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3，其保藏编号为CGMCC No.4148。
10.假尾孢(Pseudocercospora sp.)S3 CGMCC No.4148在培育附生兰植株中的应用。
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