CN113951034A - 一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法 - Google Patents

一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，先采用层播法将丛枝菌根真菌接种到香樟树根部，再采用喷施或浇灌将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵稀释液接种到香樟树根部。本发明通过先后给香樟树根部施入丛枝菌根真菌和纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，与单一菌接种和空白组相比，本发明不仅增加了植物侧根数目以及生长点数量，还显著增加了香樟幼苗的株高、茎粗与鲜重；另外，本发明显著提高了香樟叶片中叶绿体含量，增强叶片的光合效应，有效提高香樟对铁的吸收，改善香樟缺铁黄化的现象，达到有效防治香樟缺铁性黄化病的效果。本发明工艺简单、持效期长、降低了成本和对土壤的酸化、盐渍化等方面的影响。

Description

一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法
技术领域
本发明涉及植物黄化病防治技术领域，具体涉及一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法。
背景技术
植物缺铁性黄化病是由于植物体内Fe元素含量相对过低而导致的叶片黄化，植物生长势衰弱，甚至危害植物生存的一种生理性病害。香樟是重要的绿化骨干树种，由于其四季常绿，抗病能力较强，被广泛应用到公园、绿地、行道树、庭院绿化。随着城市绿化占比的大幅增长，香樟越来越多的出现在人们面前，极大地改善了生态环境。但近两年来，香樟的树叶却渐渐发黄，有的开始落叶，严重的甚至枯萎而死，这主要是由于香樟黄化病导致的。
香樟黄化病主要是生理疾病，即根系缺乏对有效铁的吸收，因此又称缺铁性黄化病。香樟根系无法从土壤中正常吸收铁元素，而香樟病状初期表现为叶子变黄，随着叶绿素减少，光合作用减慢，最终导致树叶脱落，整颗香樟死亡。该发病初期不易被察觉，且土壤本底非常复杂，如pH值高的碱性土壤不利于香樟成长。土壤板结、管理差使香樟发病率提高。香樟是典型的喜酸性植物，要求种植土为微酸性或酸性，而世界范围内40％面积土地呈碱性，我国江苏、四川、河南、安徽、甘肃等省分布着大面积的碱性土壤，使土壤中的铁呈高价态，降低了铁对植物的有效性，直接影响到香樟等对铁的吸收利用，铁是合成叶绿素的主要成分之一，缺铁会使香樟叶片表现出不同程度的黄化现象。目前，常用的香樟缺铁性黄化病的防治技术为：施用铁肥、土壤应用有机肥、土壤局部酸化等。
施用铁肥是最直接简易的矫治措施，目前常见的铁肥种类有无机铁肥、螯合铁肥、有机铁肥、缓释铁肥，常用施用方式主要是为下几种：叶面喷施、土壤施用、树干注射。叶面喷施铁肥是一种矫治植物缺铁黄化的常用方法，对于一些价格比较昂贵的铁肥来说叶面喷施的方法可以节约成本，但同时也存在一些缺点，如铁肥不易附着于叶面、持效期短、常需要多次喷施、局部有效等。土壤施用铁肥是通过对缺铁土壤施用铁肥来改善植物缺铁黄化，一般施用无机铁肥即硫酸亚铁，但在碱性土壤上施用的无机铁肥由于氢化作用最终会转化为氢氧化铁，因此无机铁肥在碱性土壤中的效果很差，不仅用量大且持效短。树干注射是将铁肥直接注入香樟树干内，避免了铁的氧化及有效性短等问题，但树干注射也存在一些技术问题，如钻孔力度、钻孔深度把握不当等会影响液体流速，输液浓度控制不当将会导致香樟产生病害或死亡，同时该方式需要耗费一定的人力和物力，增加生产成本。
土壤施用有机肥能增加土壤有机质含量，促进土壤养分的释放及有效性产生，有机肥肥效平稳且持久性强，能够一定程度上增加土壤有效铁含量，但是效果缓慢，且过量施用会使土壤毛管水流失，保水保肥能力减弱。
土壤局部酸化就是通过向土壤中施酸化剂来降低土壤pH值，从而增加土壤中有效铁含量改善香樟黄化病，但使用酸化剂改良所需时间较长，且以传统的灌溉方式全田施用酸化剂会产生很大的成本，同时长期使用会造成土壤酸化或盐渍化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，能有效防治碱性土壤中香樟缺铁性黄化病，且工艺简单、持效期长、降低成本和对土壤酸化、盐渍化等方面的影响。
为了实现上述目的，本发明提供了一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，先将丛枝菌根真菌接种到香樟树根部，再将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种到香樟树根部。
进一步的，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌采用喷施或浇灌接种到香樟树根部，接种方法包括以下步骤：
(1)将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种于pH为8.5～10.5的LB液体培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下震荡培养至对数生长期得到种子菌液；将种子菌液按2％比例的接种量接种于pH为8.5～10.5的LB培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下振荡培养发酵40～48h得到发酵液；
(2)将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用水将发酵液稀释成活菌浓度为109CFU/mL的发酵稀释液用于浇灌或喷施于种植有香樟树的土壤中。
优选的，每株园林绿地香樟树喷施2～4L，每年平均喷施1～2次。
优选的，香樟树的胸径为20～30cm。
进一步的，所述丛枝菌根真菌采用层播法接种到香樟树根部，接种方法包括以下步骤：
(1)将质量比为2:1的本地原土和河沙混合后于121℃条件下进行高压蒸汽灭菌2h，冷却至室温后得到灭菌的栽培基质；
(2)对作为宿主的玉米种子进行预处理：玉米种子用4～5％高锰酸钾溶液浸泡20min，清水冲洗后备用；
(3)将步骤(2)得到的玉米种子播种于步骤(1)制备得到的栽培基质中，并接种丛枝菌根真菌，生长90天以后，栽培基质及玉米根系混合物作为香樟的接种菌剂，菌剂的孢子密度35个/g；
(4)绿地接种香樟树：将作为香樟的接种菌剂均匀施于香樟树冠滴水线40～50cm环形区域内的土壤中，接种计量为接种的土壤与作为香樟的接种菌之间的质量比为30:1。
本发明通过先后给香樟树根部施入丛枝菌根真菌菌剂和纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液，与单一菌接种和空白组相比，本发明不仅增加了植物侧根数目以及生长点数量，还显著增加了香樟幼苗的株高、茎粗与鲜重；另外，本发明显著提高了香樟叶片中叶绿体含量，增强叶片的光合效应，有效提高香樟对铁的吸收，改善香樟缺铁黄化的现象，达到有效防治香樟缺铁性黄化病的效果。本发明工艺简单、持效期长、降低了成本和对土壤酸化、盐渍化等方面的影响。
附图说明
图1为本发明不同接种处理对香樟的生长情况影响：(a)不同接种处理对香樟茎粗的影响；(b)不同接种处理对香樟株高的影响；(c)不同接种处理对香樟根长的影响；(d)不同接种处理对香樟鲜重的影响；
图2为本发明中不同接种处理后对香樟根系状况的对比效果图；
图3为本发明不同接种处理对香樟叶绿素含量的影响；
图4为本发明不同接种处理对香樟总铁含量的影响；
图5为本发明不同接种处理对香樟根系FCR活性的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所用原料及试剂除特殊说明外均可由市场购买得到。
本发明中丛枝菌根真菌购买于北京农业科学院(中国丛枝菌根真菌种质资源库(BGC))。
本发明中使用到的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)可以通过市场购买得到，也可以通过本领域技术人员的常规筛选方法得到。
本实施例中使用到的铁载体根际促生菌S5是通过如下筛选方法得到的：
(1)香樟铁载体根际促生菌的分离与纯化
取碱性土壤条件下香樟树根际土壤10g，pH为8.36-8.4，放入100mL无菌水中充分混合后制作成为1：10的悬浊液，静止一段时间后等待土粒沉淀后取1mL样液上清液加入1L无菌水中制备10-4的稀释液，以同样方法依次制备10-6的稀释液和10-7的稀释液。
将制备好的LB培养液(酵母粉5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g混合后，加去离子水定容1000mL制得LB培养液；将制备好的LB培养液分装至100mL的锥形瓶中，分别加入3g琼脂至每个锥形瓶，包扎好放入高温120℃灭菌锅中灭菌20min。待溶液温度到80-85℃后取出放入超净台倒板，静置30min冷却。在超净台上用100uL移液器将稀释的菌液109CFU/mL转移至LB固体培养基平板上，用涂布器均匀涂布，用封口胶封好贴上标签放入生化培养箱中28℃培养，每日定时观察菌株生长状况，待到48h后，观察菌株外观形态。
采取平板划线纯化法对分离的菌株进行纯化，根据外观形态鉴别不同菌种，每种菌挑取3个单菌落划线。
(2)香樟铁载体根际促生菌的筛选
将分离纯化得到的不同类型菌株分别接种至CAS固体培养基，配制材料为：络天青60.5mg、CTAB 72.9mg、1mmol/L六水三氯化铁(溶于10mmol/L的氯化氢溶液中)10mL、0.1mol/L磷酸缓冲液50mL、去离子水940mL、琼脂含量为0.9％。每种细菌挑取3个单菌落(3次重复)，然后将接有菌株的平板倒置于28℃生化培养箱中培养，每日定时观察菌株生长状况，铁载体能与Fe3+形成更稳定的螯合物，使其颜色从蓝色变为橙红色，观察菌株周围有无黄色圆晕以及圆晕大小，具有黄色圆晕的为铁载体细菌，圆晕越大，产生铁载体的能力越强，对能产生铁载体的细菌进行划线纯化后保存备用。
将上述筛选出的菌株进行种属鉴定，鉴定结果为：该铁载体根际促生菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)，同源性达到98.80％。
实施例一
一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，先将丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)接种到香樟树根部，再将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)接种到香樟树根部。
所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌采用喷施或浇灌接种到香樟树根部，接种方法包括以下步骤：(1)将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种于pH为8.5～10.5的LB液体培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下震荡培养至对数生长期得到种子菌液；将种子菌液按2％比例的接种量接种于pH为8.5～10.5的LB培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下振荡培养发酵40～48h得到发酵液；
(2)将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用水将发酵液稀释成活菌浓度为109CFU/mL的发酵稀释液用于浇灌或喷施于种植有香樟树的土壤中；每株园林绿地香樟树喷施2～4L，每年平均喷施1～2次；香樟树的胸径为20～30cm。
所述丛枝菌根真菌采用层播法接种于香樟树根部，接种方法包括以下步骤：
(1)将质量比为2:1的本地原土和河沙混合后于121℃条件下进行高压蒸汽灭菌2h，冷却至室温后得到灭菌的栽培基质；
(2)对作为宿主的玉米种子进行预处理：玉米种子用4～5％高锰酸钾溶液浸泡20min，清水冲洗后备用；
(3)将步骤(2)得到的玉米种子播种于步骤(1)制备得到的栽培基质中，并接种丛枝菌根真菌，生长90天以后，栽培基质及玉米根系混合物作为香樟的接种菌剂，菌剂的孢子密度35个/g；
(4)绿地接种香樟树：将作为香樟的接种菌剂均匀施于香樟树冠滴水线40～50cm环形区域内的土壤中，接种计量为接种的土壤与作为香樟的接种菌之间的质量比为30:1。
实施例二：盆栽香樟复合接种丛枝菌根真菌AMF与铁载体细菌S5
1材料设备
1.1实验材料
AMF为地表球囊霉(Gv:Glomus versiforme)，来源于中国丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)，在本地土壤进行多年繁殖驯化。
香樟铁载体根际促生菌S5：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)，通过本发明筛选得到。
香樟苗：香樟种子来自徐州种子有限公司，选用颗粒饱满的香樟种子，以70～80℃的热水浸泡，水与种子的体积比为2:1，充分搅拌至水温为50～60度之间，置于恒温28℃的生化培养箱里，自然冷却，24h后取出，清洗后取湿润毛巾包好继续置于培养箱内催芽，每日清洗1次，洗去种子表面的黏着物，待种子出苗后移植到盆中。
盆栽土壤采于徐州工程学院一期校园内，土壤性质与质地见表1，利用五点取样法进行取样，深度约为10-15cm，装入封口袋，密封带回实验室，为消除其他微生物的影响，在使用前对土壤进行高压蒸汽灭菌(121℃，2h)。
表1土壤基本性质
Figure BDA0003321601240000051
1.2铁载体细菌S5的扩繁
将筛选出的高效铁载体细菌S5接种于pH为8.5～10.5的LB液体培养基中，振荡培养，于28℃、150r/min条件下震荡培养至对数生长期得到种子菌液。将种子菌液按2％比例的接种量接种于pH为8.5～10.5的LB液体培养基中，于28C、150r/min条件下振荡培养40～48h得到发酵液。将发酵液倒出后，通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用水将发酵液稀释成菌液浓度为109CFU/mL的溶液，用于香樟盆栽试验。
1.3主要试剂
台盼蓝染色：曲利苯蓝(Trypan blue)乳酸酚溶液：乳酸100mL，蒸馏水100mL，甘油100mL，苯酚100mL，曲利苯蓝0.2g；FAA固定液：70％酒精:甲醛:冰醋酸之间体积比比为90:5:5；乳酸酚溶液：乳酸100mL，甘油100mL，苯酚100mL，蒸馏水100mL；10％过氧化氢：30％过氧化氢33mL，蒸馏水67mL；10％氢氧化钾：氢氧化钾56g，蒸馏水950mL。
根系三价铁螯合物还原酶(FCR)测定：饱和硫酸钙；FCR测定液：2-2’-联吡啶100μM，Fe3+-EDTA400μM。
消煮：浓硫酸4mL，过氧化氢8mL。
邻菲洛琳比色法：盐酸羟胺溶液：盐酸羟胺10g，蒸馏水1000mL；邻菲洛琳溶液：邻菲洛琳1.2g，蒸馏水1000mL；醋酸-醋酸铵缓冲溶液：醋酸铵25g，蒸馏水150mL，醋酸700mL；铁离子标准溶液：硫酸铁铵0.863g，蒸馏水100mL，浓硫酸10mL。
2实验方法
2.1实验设计
将出芽的香樟种子转移至盆中，共有三种处理分别为：未接种AMF+S5；接种S5；接种AMF+S5(表2)。每种处理重复5次，共15盆。AMF的接种采用层播法，每盆使用灭菌土壤1.5kg、香樟的接种菌剂50g(AMF孢子密度35个/g)，灭菌土壤与香樟的接种菌剂之间的质量比为30：1，香樟的接种菌剂在香樟种子种植时施入栽培基质中；S5的接种量为15mL，菌剂密度109cfu/mL，S5接种半个月后，测定其各项生理指标。
2.2测定方法
用常规方法测定植株株高、鲜重、根长、茎粗与叶片数量；丛枝菌根侵染率利用曲利苯蓝染色法测定；孢子密度利用蔗糖离心法测定；植株叶绿素含量使用95％乙醇提取，利用在分光光度计测定叶；光合活性指数利用光和仪进行测定；植株总铁含量在植株消煮后，利用邻菲洛琳比色法测定；根系三价铁还原酶(FCR)活性通过将香樟根系浸泡在FCR测定液中，利用分光光度计测定计算还原力。
2.3统计制图方法
数据用平均数±标准差表示。
数据处理、方差分析与相关性分析用软件SPSS 21.0实现；图表制作用软件Origin2017实现。
3结果与分析
3.1 AMF与S5复合接种对香樟侵染状况
香樟接种AMF与S5后其菌根侵染率见表2，AMF与S5复合接种根系侵染率为42.2％，根际周围AMF孢子密度，252个/g。这表明AMF地表球囊霉能成功侵染香樟根系。
表2香樟根系侵染率
Figure BDA0003321601240000071
3.2 AMF与S5复合接种对香樟生长的影响
AMF与S5单一与复合接种后对香樟的影响见图1，图2，从图1中可以看出，与单一处理和对照组比较，S5与AMF复合接种显著增加了香樟幼苗的茎粗、株高、根长与鲜重。从图2中可以看出，AMF+S5复合接种不仅增加了香樟侧根数目以及生长点数量，而且增加了香樟根的长度，复合接种明显改善丛枝的外在状态，更好的促进根的伸展，从而增加根际吸收面积，有效促进植物对营养元素的吸收，利于植物的生长发育，改善植物缺铁黄化的现象。
3.3 AMF与S5复合接种对香樟叶绿素含量影响
从图3中可以看出，在对照、S5、S5+AMF三个处理中，植物叶片中叶绿素含量分别为2.592mg/g、2.948mg/g、3.866mg/g，可见接种S5、S5+AMF较对照组都显著提高了香樟叶片中叶绿体含量，分别提高了13.7％、49.1％，其中以S5+AMF复合接种的效果最好，显著高于单一处理与对照。接种S5与AMF均能提高叶绿素含量，防治香樟的黄化病。
3.4 AMF与S5复合接种对香樟光合活性的影响
由表3可知，净光合速率各处理呈显著差异，CK<S5<AMF+S5，其中，S5比CK高18.92％，AMF+S5比CK高37.83％；胞间CO2浓度中，AMF+S5<S5<CK，各种处理呈显著性差异，其中，S5比CK低3.76％，AMF+菌S5比CK低8.73％；对于蒸腾速率，CK≤S5<AMF+S5，S5与CK无显著差异，AMF+S5比CK高58.82％；气孔导度各处理呈显著差异，CK<S5<AMF+S5，其中，S5处理比CK高14.96％，AMF+S5比CK高46.72％。由此可见，接种S5与AMF均能改善香樟的光合组织，提高的光合效应，但以S5+AMF复合接种的效果最好，显著优于单一处理与对照。
表3丛枝菌根真菌与铁载体细菌复合接种对香樟光合活性的影响
Figure BDA0003321601240000081
3.5 AMF与S5复合接种对香樟总铁含量以及根系FCR活性的影响
由图4，图5可见，与对照相比，接种S5或AMF+S5显著提高香樟叶片总铁含量与FCR活性，而AMF与S5复合接种则更为有效的改善香樟铁营养的状况。
实施例三园林绿地香樟树复合接种AMF与铁载体细菌S5
1研究对象：绿地中的香樟树，胸径为20～30cm。
2研究方法
2.1实验设计：共3个处理，包括对照、S5单独接种、AMF+S5复合接种。
2.2香樟接种：
AMF接种包括以下步骤：
(1)将质量比为2:1的本地原土和河沙混合后于121℃条件下进行高压蒸汽灭菌2h，冷却至室温后得到灭菌的栽培基质；
(2)对作为宿主的玉米进行预处理：玉米种子用4～5％高锰酸钾溶液浸泡20min，清水冲洗后备用；
(3)将步骤(2)得到的玉米种子播种于步骤(1)制备得到的栽培基质中，并接种丛枝菌根真菌菌剂，生长90天以后，栽培基质及玉米根系混合物作为香樟的接种菌剂，菌剂的孢子密度35个/g；
(4)绿地接种香樟树：将作为香樟的接种菌剂均匀施于香樟树冠滴水线40～50cm环形区域内的土壤中，接种计量为接种的土壤与作为香樟的接种菌之间的质量比为30:1。
AMF接种2个月后接种铁载体细菌S5：将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用水将发酵液稀释成活菌浓度为109CFU/mL的溶液用于浇灌香樟树根部；每棵香樟树根部浇灌4L。
2.3数据统计
S5接种一个月后开始观察统计香樟的黄化情况，2个月后首先观察植物整株情况，后对植物上、中、下三层，每层东南西北各取一个枝条进行具体统计，整体与具体统计综合考虑进行黄化级别分类，结果如表4所示。
3研究结果与分析
从表4中可以看出，接种S5一个月后叶片开始逐渐变绿，统计显示，对对照相比，接种S5或S5+AMF第Ⅰ级别全绿的香樟植株在各处理当中基本很难见到，主要是因为香樟新抽生的枝条最先端叶片有少许黄化，尤其是树冠上层，属于正常的生长现象；接种S5或S5+AMF第Ⅱ、Ⅲ级别株数增加，即不明显黄化或稍微黄化植株明显增加，说明转绿效果更明显，生长正常的植株比例明显增加，S5+AMF复合接种效果更明显；相应的，接种S5或S5+AMF第Ⅳ、Ⅴ级株数逐渐减少，说明明显黄化与严重缺铁黄化的植株减少，转绿效果更明显，S5+AMF复合接种效果更明显。2个月后表5中实验数据显示叶绿素含量及叶片中铁元素含量明显增加，香樟缺铁性黄化症状明显改善，实践显示丛枝菌根真菌和纺锤形赖氨酸芽孢杆菌剂先后接种能更好的防治香樟缺铁性黄化病。
表4园林绿地中接种S5、AMF+S5防治香樟树不同级别黄化比率
Figure BDA0003321601240000091
表5园林绿地中接种S5、AMF+S5防治香樟树黄化效果
处理 叶绿素含量(mg/g) 全铁含量(mg/kg)
CK对照 0.145～1.898 314.641～508.873
S5 0.434～3.610 369.854～620.942
AMF+S5 0.573～3.911 431.636～667.816

Claims (5)

1.一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，其特征在于，先将丛枝菌根真菌接种到香樟树根部，再将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种到香樟树根部。
2.根据权利要求1所述的一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，其特征在于，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌采用喷施或浇灌接种到香樟树根部，接种方法包括以下步骤：
(1)将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌接种于pH为8.5～10.5的LB液体培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下震荡培养至对数生长期得到种子菌液；将种子菌液按2％比例的接种量接种于pH为8.5～10.5的LB培养基中，于26～30℃、140～160r/min条件下振荡培养发酵40～48h得到发酵液；
(2)将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液通过平板计数的方式计算发酵液中的有效活菌数，然后将发酵液进行离心，弃去上清液，用水将发酵液稀释成活菌浓度为109CFU/mL的发酵稀释液用于浇灌或喷施于种植有香樟树的土壤中。
3.根据权利要求2所述的一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，其特征在于，每株园林绿地香樟树喷施2～4L，每年平均喷施1～2次。
4.根据权利要求2或3所述的一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，其特征在于，香樟树的胸径为20～30cm。
5.根据权利要求1或2所述的一种防治适于碱性土壤的香樟缺铁性黄化的方法，其特征在于，所述丛枝菌根真菌采用层播法接种到香樟树根部，接种方法包括以下步骤：
(1)将质量比为2:1的本地原土和河沙混合后于121℃条件下进行高压蒸汽灭菌2h，冷却至室温后得到灭菌的栽培基质；
(2)对作为宿主的玉米种子进行预处理：玉米种子用4～5％高锰酸钾溶液浸泡20min，清水冲洗后备用；
(3)将步骤(2)得到的玉米种子播种于步骤(1)制备得到的栽培基质中，并接种丛枝菌根真菌，生长90天以后，栽培基质及玉米根系混合物作为香樟的接种菌剂，菌剂的孢子密度35个/g；
(4)绿地接种香樟树：将作为香樟的接种菌剂均匀施于香樟树冠滴水线40～50cm环形区域内的土壤中，接种计量为接种的土壤与作为香樟的接种菌之间的质量比为30:1。
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