CN108085282B - 一种复合乳酸菌菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合乳酸菌菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种复合乳酸菌菌剂，包括所述复合乳酸菌菌剂的菌肥，所述乳酸菌菌剂以及菌肥用于缩短蘑菇出菇时间以及提高蘑菇产量的用途。所述复合乳酸菌菌剂包括植物乳杆菌P‑8，嗜酸乳杆菌KT‑La9以及植物乳杆菌KT‑Lp9，将所述复合乳酸菌菌剂或者菌肥掺拌于用于发菇的培养基中，即使双孢菇的出菇时间缩短4天，产量提高10％以上。本申请还提供了一种制备所述复合乳酸菌菌剂的方法，所述方法简便易行，制得的复合乳酸菌菌剂中活菌数高。

Description

一种复合乳酸菌菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于生物技术领域，特别涉及一种乳酸菌菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
双孢蘑菇(Agaricusbisporus)简称双孢蘑、双孢菇，又名洋蘑菇、自蘑菇、世界蘑，俗称蘑菇,属伞菌目伞菌科蘑菇属，具有一定的营养和医疗保健价值，是目前世界上栽培规模和产量最大的一种食用菌，其产量约占世界食用菌产量的40％左右，也是我国最大的出口创汇食用菌。随着市场需求量的增加，双孢蘑菇已进入设施化和规模化栽培阶段。
双孢蘑菇是一种草腐菌，具有不覆土不出菇的特性。对于覆土的作用因子众说不一，目前主要从覆土的物理作用、化学作用和微生物作用3个方面进行探讨，相比之下，对微生物的研究较少。微生物是覆土层的重要组成之一，与覆土层的物理结构、化学环境及蘑菇子实体的生长发育密切相关。蘑菇覆土层中存在多种微生物，不同微生物对蘑菇菌丝生长的作用不一样。一些微生物可能存在某些特殊物质(微生物菌体或代谢产物)，这些物质可能是蘑菇生长发育必需的营养物质或是激素物质，对蘑菇生长有好处。因此，研究覆土微生物及其作用在蘑菇生产上有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本申请提供一种复合乳酸菌菌剂，所述复合乳酸菌菌剂包括：植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9。
本申请提供一种复合乳酸菌菌剂，所述复合乳酸菌菌剂包括：植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9。
在一种可实现的方式中，所述复合乳酸菌菌剂由包括以下步骤的方法制备：
步骤1，将植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9种子液混合，制得复合菌种子液；
步骤2，将步骤1制备的复合菌种子液接种于MRS培养液中，加入生长因子，培养；
步骤3，调节体系中活菌量为2.0×109CFU/ml～4.0×109CFU/ml，pH为5.0～7.0。
本申请提供的复合乳酸菌菌剂能够显著缩短双孢菇的出菇时间，延长双孢菇的采菇期，使双孢菇的产量提高10％以上。
本申请还提供一种制备所述复合乳酸菌菌剂的方法，所述方法包括：
步骤1，将植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9种子液混合，制得复合菌种子液；
步骤2，将步骤1制备的复合菌种子液接种于MRS培养液中，加入生长因子，培养；
步骤3，调节体系中活菌量为2.0×109CFU/ml～4.0×109CFU/ml，pH为5.0～7.0。
本申请提供的制备所述复合乳酸菌菌剂的方法简便易行，条件温和，获得的复合乳酸菌菌剂活菌数量高。
本申请还提供一种复合乳酸菌菌肥，所述菌肥包括以下重量配比的组分：
复合乳酸菌菌剂0.5～1重量份
基质100～200重量份，
其中，基于1kg计为1重量份，
所述复合乳酸菌菌剂为本申请所述乳酸菌菌剂，所述基质为腐植酸类物质，优选为黄腐酸钾。
本申请提供的复合乳酸菌菌肥在复合乳酸菌菌剂中复配有用于促进复合乳酸菌菌剂发挥作用的腐植酸类物质，为双孢菇提供养分，与复合乳酸菌菌剂协同作用，提高双孢菇的产量。
本申请还提供所述乳酸菌菌剂用于提高蘑菇产量，缩短出菇时间的用途，尤其是用于提高双孢菇产量，缩短双孢菇出菇时间的用途。
附图说明
图1为本申请实验例1中各组出菇时间的结果；
图2为本申请实验例1中各组双孢菇产量的结果。
具体实施方式
下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本申请提供一种复合乳酸菌菌剂，所述复合乳酸菌菌剂包括：植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9，其中，植物乳杆菌P-8的保藏编号为CGMCCNo.6312；嗜酸乳杆菌KT-La9的保藏编号为CGMCC No.12949；植物乳杆菌KT-Lp9的保藏编号为CGMCC No.12950。
本申请中所用植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9均为现有技术已经公开的菌株，如，中国专利CN102864096A公开了植物乳杆菌P-8，中国专利CN106720939A公开了嗜酸乳杆菌KT-La9，中国专利CN106720939A公开了植物乳杆菌KT-Lp9。
在一种可实现的方式中，所述复合乳酸菌菌剂由包括以下步骤的方法制备：
步骤1，将植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9种子液混合，制得复合菌种子液。
在一种可实现的方式中，所述植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9种子液可以根据包括以下步骤的方法制备：
步骤1-1，将植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9的冷冻保藏菌种分别接种于MRS液体培养基中，在37±1℃条件下培养20～35小时，按此方式活化三代后分别用无菌生理盐水离心洗涤3次，获得菌体沉淀物；
步骤1-2，在各菌体沉淀物上分别加入5wt％～15wt％，优选为10wt％灭菌脱脂乳液后，将三种乳酸菌体系中菌体的浓度分别调整为1×108～1×109CFU/mL。
所述脱脂乳能够贴合在菌体细胞膜表面，形成保护层，从而对菌体进行保护，避免菌体细胞受到外界伤害。而5wt％～15wt％的灭菌脱脂乳液能够使脱脂乳均匀的分散于菌体表面，形成均匀的保护层。
通常，乳酸菌的生长符合生长特性曲线，即，生长初期为调整期，此阶段为菌体适应新环境做调整，菌体数量增长较少，调整期后为对数生长期，此阶段菌体数量快速增加，对数生长期后为稳定期，此阶段菌体数量趋于稳定，菌体活性增加，稳定期后为衰亡期，此阶段由于体系中营养匮乏等因素导致菌体开始衰亡。
本发明人发现，植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9的生长特征曲线相似，如果体系中菌体稀释后的接种浓度小于1×108CFU/mL，则菌体活性达到最大时，耗时太长，而如果体系中菌体稀释后的接种浓度大于1×109CFU/mL，则菌体在对数生长期生长速度过快，培养基中菌体数量最大时，但菌体的活性尚未达到最大，而此时培养基中营养物质等已无法满足菌体继续生长，使菌体过早进入衰亡期，即，菌体尚未达到活性最大就开始衰亡。而如果体系中菌体的浓度为1×108～1×109CFU/mL，培养基中的菌体在活菌数最大时活性最强，有利于菌体的后续利用。
在一种可实现的方式中，所述植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9种子液按照植物乳杆菌P-8中活菌数:嗜酸乳杆菌KT-La9中活菌数:植物乳杆菌KT-Lp9中活菌数＝(2-4):(0.5-1):1进行配合，优选为2:1:1。本发明人发现，所述植物乳杆菌P-8的代谢产物中苯乳酸的含量最高，而苯乳酸能够显著缩短双孢菇出菇时间、提高双孢菇产量。嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9的代谢产物与所述植物乳杆菌P-8的代谢产物协同作用，使双孢菇的出菇时间进一步缩短，产量进一步增加。
步骤2，将步骤1制备的复合菌种子液接种于MRS液体培养基中，加入生长因子，培养。
在一种可实现的方式中，所述复合菌种子液在MRS液体培养基中的接种比例为2％～15％(V/V)，优选为4％～10％(V/V)。以该接种比例将复合菌种子液接种于培养基中，能够使菌生长数量最大时，菌活性最强。
所述生长因子用于促进乳酸菌组合物的生长，选自椰汁、菠萝汁、橙汁等，优选为椰汁。本申请中生长因子可以为富含糖类、维生素等的水果汁，本发明人发现，椰汁含有的多种糖类、维生素等，更适合作为本申请所述复合乳酸菌体生长的生长因子，能够使所述复合乳酸菌菌体生长速度更快，缩短复合乳酸菌的对数生长期，获得的复合乳酸菌的活性更强。
在一种可实现的方式中，基于所述复合菌种子液的总体系，所述生长因子的加入量为30～80mL/L，如50mL/L，所述生长因子的体积以生长因子分散体系的总体积计。按照上述比例向复合菌种子液中加入生长因子，能够使体系中的复合菌的菌体生长速度最快，菌活性最强。
在一种可实现的方式中，将接种有复合菌种子液的体系置于37±1℃条件下培养12小时～24小时。由于37±1℃是乳酸菌最适生长温度，在培养12小时～24小时后，体系中复合菌达到生长的稳定期，菌体数量最大，活性最强，如果继续增加培养时间，则复合菌进入衰亡期，菌活性减弱。
步骤3，调节体系中活菌量为2.0×109CFU/ml～4.0×109CFU/ml，pH为5.0～7.0，优选为5.2～6.5。
在一种可实现的方式中，可以通过加入培养基的方法稀释步骤2制备的复合菌种子液，本发明人发现，如果体系中的活菌量小于2.0×109CFU/ml，则制得的复合乳酸菌菌剂对缩短双孢菇出菇时间以及提高双孢菇产量方面的作用不明显，如果体系中的活菌量大于4.0×109CFU/ml，则会使生产成本过高，因此，基于缩短出菇时间、增产效果以及生产成本的考虑，本申请选择体系中活菌量为2.0×109CFU/ml～4.0×109CFU/ml。
由于复合乳酸菌的最适生长pH为5.0～7.0，体系过酸或过碱都会降低复合乳酸菌的活性。
在一种可实现的方式中，可以通过向体系中加入氨水或氢氧化钠水溶液的方法调节体系的pH。在本步骤中，对氨水或者氢氧化钠水溶液的浓度不做特别限定，以不破坏菌体细胞并且能够有效调节体系pH为优选。可选地，加入氨水或者氢氧化钠的方法为滴加。
本申请还提供一种制备所述复合乳酸菌菌剂的方法，所述方法包括：
步骤2-1，将植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9种子液混合，制得复合菌种子液。
本步骤的具体方法可参见步骤1。
步骤2-2，将步骤1制备的复合菌种子液接种于MRS培养液中，加入生长因子，培养。
本步骤的具体方法可参见步骤2。
步骤2-3，调节体系中活菌量为2.0×109CFU/ml～4.0×109CFU/ml，pH为5.0～7.0。
本步骤的具体方法可参见步骤3。
本申请还提供所述乳酸菌菌剂用于提高蘑菇产量，缩短出菇时间的用途，尤其是用于提高双孢菇产量，缩短出菇时间的用途。
本申请提供的乳酸菌菌剂中包含丰富的植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9，这三种菌协同作用，能够在不施用农药或者化学肥料的条件下显著缩短双孢菇的出菇时间和产量，提升了双孢菇的品质安全。具体可参见实施例1。
而且，本申请提供的乳酸菌菌剂的施用方法简单，将所述菌剂掺拌于发菇基质中即可。
本申请还提供一种复合乳酸菌菌肥，所述菌肥包括以下重量配比的组分：
复合乳酸菌菌剂 0.5～1重量份
基质 100～200重量份，
其中，基于1kg计为1重量份，
所述复合乳酸菌菌剂为本申请所述乳酸菌菌剂，所述基质为腐植酸类物质，优选为黄腐酸钾。黄腐酸钾的分子量相对于腐植酸类物质中其它物质较小，更容易被双孢菇的菌丝吸收和利用，有助于提高双孢菇的产量。
所述腐植酸类物质能够提高肥效，增强双孢菇抗病、抗逆能力，刺激双孢菇生长。
由于黄腐酸钾是酸性物质，浓度太高会降低体系的pH，降低菌体活性。而按照上述比例，特别是按照复合乳酸菌的重量:基质的重量＝1:200的重量比进行混合，黄腐酸钾既能够为双孢菇提供充足的营养，也能够使体系保持适宜双孢菇生长的pH。
本申请还提供所述乳酸菌菌肥用于提高蘑菇产量，缩短出菇时间的用途，尤其是用于提高双孢菇产量，缩短出菇时间的用途。
本申请提供的乳酸菌菌肥使用简便，掺拌于双孢菇的发菇基质中即可。
实施例
本申请实施例中所用植物乳杆菌P-8的保藏编号为CGMCC No.6312；
本申请实施例中所用嗜酸乳杆菌KT-La9的保藏编号为CGMCC No.12949；
本申请实施例中所用植物乳杆菌KT-Lp9的保藏编号为CGMCC No.12950；
本申请实施例中所用MRS液体培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，250g/瓶；
本申请实施例中所用椰汁购自：海南省椰子。
实施例1复合乳酸菌菌剂的制备
步骤1，将植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9的冷冻保藏菌种分别接种于MRS液体培养基中，在37±1℃条件下分别培养26小时，按此方式活化三代后分别用无菌生理盐水离心洗涤3次，获得菌体，在各菌体沉淀物上分别加入8wt％灭菌脱脂乳液后，分别将三种种子液菌体浓度调整为1×108～1×109CFU/mL，即种子液制备完成；
步骤2，将步骤1得到的植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9的种子液按照3:0.5:1的比例进行混合，其中，各菌体的量以其中活菌数量计，制得复合菌种子液，将复合菌种液按7％(V/V)的接种量接种于MRS培养液中，并且，基于接种后MRS培养体系的总体积，按照50mL/L的比例加入椰汁，在37±1℃条件下培养18小时后，调整其菌数为2.8×109cfu/ml，pH值为5.8，至此复合菌剂制备完成。
实施例2复合乳酸菌菌剂的制备
步骤1，将植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9的冷冻保藏菌种分别接种于MRS液体培养基中，在37±1℃条件下分别培养32小时，按此方式活化三代后分别用无菌生理盐水离心洗涤2次，获得菌体，在各菌体沉淀物上分别加入10wt％灭菌脱脂乳液后，分别将三种种子液菌体浓度调整为1×108～1×109CFU/mL，即种子液制备完成；
步骤2，将步骤1得到的植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9的种子液按照2:1:1的比例进行混合，其中，各菌体的量以其中活菌数量计，制得复合菌种子液，将复合菌种子液按4％(V/V)的接种量接种于MRS培养液中，并且，基于接种后MRS培养体系的总体积，按照50mL/L的比例加入椰汁，在37±1℃条件下培养12小时后，调整其菌数为2.4×109CFU/ml，pH值为5.2，至此复合菌剂制备完成。
实施例3复合乳酸菌菌剂的制备
步骤1，将植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9的冷冻保藏菌种分别接种于MRS液体培养基中，在37±1℃条件下分别培养20小时，按此方式活化三代后分别用无菌生理盐水离心洗涤4次，获得菌体，在各菌体沉淀物上分别加入12wt％灭菌脱脂乳液后，分别将三种种子液菌体浓度调整为1×108～1×109CFU/mL，即种子液制备完成；
步骤2，将步骤1得到的植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9的种子液按照4:1:1的比例进行混合，其中，各菌体的量以其中活菌数量计，制得复合菌种子液，将复合菌种液按10％(V/V)的接种量接种于MRS培养液中，并且，基于接种后MRS培养体系的总体积，按照50mL/L的比例加入椰汁，在37±1℃条件下培养24小时后，调整其菌数为3.2×109cfu/ml，pH值为6.5，至此复合菌剂制备完成。
实施例4复合乳酸菌菌肥的制备
将基质与实施例1制备的复合菌剂按1:200(w/w)的比例混合制成微生物菌肥，所述基质为黄腐酸钾。
实施例5复合乳酸菌菌肥的制备
将基质与实施例2制备的复合菌剂按1:200(w/w)的比例混合制成微生物菌肥，所述基质为黄腐酸钾。
实施例6复合乳酸菌菌肥的制备
将基质与实施例3制备的复合菌剂按1:200(w/w)的比例混合制成微生物菌肥，所述基质为黄腐酸钾。
实验例
实验例1不同复合乳酸菌菌剂对出菇时间和产量的影响
试验地点：四川省成都市大邑县韩场镇成都市富瑞达生物技术有限公司。
试验材料与分组处理
试验材料：双孢菇
分组处理：
(1)空白对照组：清水；
(2)单纯植物乳杆菌KT-Lp9组：喷施植物乳杆菌KT-Lp9种子液活菌总数含量2.4-3.2×109cfu/ml；
(3)双菌复合菌组：由植物乳杆菌P-8和嗜酸乳杆菌KT-La9的种子液按比例进行混合发酵而成，所述植物乳杆菌P-8和嗜酸乳杆菌KT-La9的种子液活菌数量比为2:1，活菌总数含量2.4-3.2×109cfu/ml；
(4)三菌复合菌组：实施例2制备。
实验条件：空白对照组、单纯植物乳杆菌KT-Lp9组、双菌复合菌组和三菌复合菌组分别做3个菇房，每个菇房600m2。空白对照组在基料中喷施等体积的清水，其它农事与(2)～(4)组相同。
实验方法：基料接种入菇房前的基料搅拌过程中均匀喷施复合乳酸菌菌剂稀释溶液，稀释浓度按照拌料需水量进行稀释，使用量为每平米基料20mL菌液。
双孢菇取样检测方法及指标：以第一潮菇的出菇时间统计出菇时间，以每个菇房三潮菇累计产量统计产量，采收菇按照统一标准进行采收，具体为：在菇盖3～4cm、菌膜未破时进行采收。
出菇时间的结果如下表1和图1所示。
表1乳酸菌对双孢菇出菇时间的影响
Figure BDA0001541774860000061
由图1和表1可知，单纯植物乳杆菌KT-Lp9组、双菌复合菌组以及三菌复合菌组的双孢菇出菇时间较空白对照组均有不同程度的提前，其中三菌复合菌组出菇时间最早，出菇时间较空白对照组提前4天，相对提前了16％，接近1/6，不仅省时省工，多茬节省时间累积可再多种一茬，提高种植效率，而且，缩短双孢菇菌丝生长期，节省菌丝生长期的生产成本，并且，提前4天进入采菇期，即，延长采菇期，从而能够增加产量。综合现有技术最佳种植条件，双孢菇的最短出菇时间为25天，因此，本申请将出菇时间提前4天，对于双孢菇来说是一个巨大的突破。与空白对照组相比，双菌复合菌组和单纯植物乳杆菌KT-Lp9组的出菇时间分别为24天和23天，二者差别不明显。3种处理对双孢菇出菇时间的提前效果表现为三菌复合菌组>双菌复合菌组>单纯植物乳杆菌KT-Lp9组>空白对照。
双孢菇产量的结果如下表2及图2所示。
表2乳酸菌对双孢菇产量的影响
Figure BDA0001541774860000062
注：数值采用“平均值±标准差”的形式表示，同一行中不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
由表2和图2可知，3种处理对双孢菇产量均产生影响，单纯植物乳杆菌KT-Lp9组、双菌复合菌组和三菌复合菌组与空白对照组相比，双孢菇产量分别增产1.48kg/m2、1.85kg/m2和2.34kg/m2，增产比例分别达到了7.08％、8.86％和11.20％，总体来看，三菌复合菌组对双孢菇增产的作用最明显。在现代标准化种植双孢菇中，蘑菇的生产种植条件已经经过多次筛选和优化，蘑菇类产品很难突破一次性增产10％，因此，本申请提供的方法对于提高双孢菇产量来说，具有十分明显的作用。通常，一个菇房一茬总产量约为10万斤，如果增产10％，则可多收获1万斤，经济效益十分可观。
综合出菇时间以及双孢菇产量的实验结果可知，不同乳酸菌对双孢菇生长的影响不同，总体表现为三菌复合菌组>双菌复合菌组>单纯植物乳杆菌KT-Lp9组>空白对照组。植物乳杆菌P-8、嗜酸乳杆菌KT-La9和植物乳杆菌KT-Lp9可以协同促进双孢菇生长发育，缩短出菇时间，且对双孢菇增产能起到明显的促进作用。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种复合乳酸菌菌剂用于提高双孢菇产量，缩短出菇时间的用途，其特征在于，所述复合乳酸菌菌剂包括：植物乳杆菌P-8，嗜酸乳杆菌KT-La9以及植物乳杆菌KT-Lp9，其中，植物乳杆菌P-8的保藏编号为CGMCC No.6312；嗜酸乳杆菌KT-La9的保藏编号为CGMCCNo.12949；植物乳杆菌KT-Lp9的保藏编号为CGMCC No.12950。
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