CN103131641A

CN103131641A - 一种哈茨木霉多元发酵方法及其应用

Info

Publication number: CN103131641A
Application number: CN2013100586028A
Authority: CN
Inventors: 蒋立科; 魏练平; 程备久; 余梅
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2013-02-01
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2033-02-01
Also published as: CN103131641B

Abstract

本发明公开了一种哈茨木霉发酵液的制备方法及其应用，具体是将同一种木霉放入不同组分的培养基中进行培养发酵，即通过同一种真菌在不同效应物的诱导下进行发酵合成适应农作物不同生长阶段所需的发酵液。确切的说，是利用哈茨木霉在不同效应物的诱导下，进行发酵合成对作物不同生长发育阶段所需物质（如促进种子萌发，生长，抗逆，抗灰霉病等土壤病菌，促作物提前开花、授粉和座果），满足人们对作物增产的需要。

Description

一种哈茨木霉多元发酵方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种可用于促作物提前开花、授粉和座果的哈茨木霉发酵制备方法及其应用。

背景技术

推进人们对农产品安全性认识，减少“化学肥料和有机合成农药（含植物生长调节剂）”对生态环境的污染，已成为当代各国的共同心声和追求的目标。随着化学肥料和有机农药通过农产品对人类健康产生的严重危害研究的深入，各国研究者正在积极寻找天然微生物肥料农药和作物开花结果调节物质。以前人们对木霉在生长过程中促作物生长调节、改善因长期使用化肥农药而使土壤结构破坏、污染农产品并危害人畜状况进行研究时，根据不同利用方法可采用不同的培养方式或工艺流程，以获得不同的产物，如里氏木霉（T.reesei）通过液体发酵可产生纤维素酶和动物源的糖蛋白，形成了一类重要的轻工业产业；在生物防治上，哈茨木霉（T.hariamum）、绿色木霉（T.Vide）、钩状木霉（T.hamatumi）是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，可用于防治李属树银叶病的木霉制剂，同时利用其分生孢子制成产品防治白绢病，灰霉病、核菌立枯病、疫病等土传病害，被认为是以菌治菌最有希望的抗菌生物农药，在英、德、瑞典、俄以及美国等20余个国家均已走上商品化生产。特别令人注意的是美国和俄国科技人员在1986年就发现，在木霉生物农药和生物肥料的田间应用时，作物叶色浓郁，叶张变宽变绿，茎杆变粗壮，产量提高明显。美国科罗拉多州大学Windharma报道，在灭菌的土壤中添加木霉菌8周后，番茄和烟草的根与幼苗的总干重比对照组份分别增加213-275%和259-318%，萝卜的出苗率有所提高，萝卜长势好，前苏联的Buimistu也报道了木霉所产生刺激植物生长发育物质的田间试验情况。

近年来，由我国赵培洁等在木霉生物农药和生物肥料田间应用时也发现，许多作物使用木霉后，存在于Windharman和Buinislu所发现的类似现象。当有机物原料中植入木霉的分子和菌丝时，对肥料具有分解能力强，见效快、肥力持久等特点，而促进作物生长的物质（PGPS）主要存在于木霉液体培养基中。

发明内容

本发明的目的是提供一种哈茨木霉多元发酵方法及其应用，具体是将哈茨木霉加入不同效应物对应的培养液中生长，并合成出对作物不同生长阶段所需发酵液，以提高种子发芽率、果树坐果率、抗病害、抗逆性以及促进果树开花期提前。

本发明实现发明目的采用如下方案：

一种哈茨木霉发酵液的制备方法，其特征在于：按如下重量比配置培养基：

马铃薯1-5 %、血红蛋白0.5-3.3%、FeSO4 0.01-0.03%、KH2PO40.02-0.20 %、MgSO4 0.05-0.35%、CaSO4 0.05-0.1 %、ZnSO40.01-0.02 %，余量为水；所述培养基pH值调至5.7-6.5，然后将哈茨木霉接种在培养基中，于26-30℃±0.5℃条件下发酵培养5-10d；发酵终止后过滤分离，若发酵终止时，培养液pH大于等于4，则调pH小于等于4，静置6-8h后经虹吸吸取上清液，对下层胶状物过滤，滤液调至pH 6.2-6.4，得发酵液。

所述培养基按重量比由如下物质组成：马铃薯2-4 %、血红蛋白2-3%、FeSO4 0.015%、KH2PO4 0.05-0.15%、MgSO4 0.05-0.35%、CaSO4 0.05-0.1 %、ZnSO4 0.01-0.02 %，余量为水。

所述培养基按重量比由如下物质组成：马铃薯3 %、血红蛋白2%、FeSO4 0.02%、KH2PO4 0.1%、MgSO₄ 0.2%、CaSO₄0.025 %、ZnSO₄0.01 %，余量为水。

所述培养基中血红蛋白的含量为1%，所述培养基中还含有2%几丁质；发酵终止后，所述滤液调至pH 6.2-6.4。

所述培养基中中CaSO₄由硼酸钠和亚硒酸钠代替，所述硼酸钠和亚硒酸按质量各占一半，发酵终止后，培养液pH值调节成6.2-6.4。

所述哈茨木霉为从自然界筛选或市场购得的产几丁质酶的哈茨木霉菌株。

本发明有益效果体现在：

本发明涉及适应农作物不同生长阶段所需物质可通过同一种真菌在不同效应物的诱导下进行发酵合成而获得。确切的说，是利用哈茨木霉在不同效应物的诱导下，进行发酵合成对作物不同生长发育阶段所需物质（如促进种子萌发，生长，抗逆，抗灰霉病等土壤病菌，促作物提前开花、授粉和座果），满足人们对作物增产的需要。

附图说明

图1是本发明实施例1所筛选的哈茨木霉菌形态图。

以下通过具体实施方式对本发明技术方案做进一步解释说明。

具体实施方式

实施例1：

一、哈茨木霉获得方式：1、市场购买获得；2、自然界筛选方法获得。

若筛选，可按如下方法进行：

（1）菌种的活化：将从腐烂木材中分离出野生哈茨木霉菌株接种到PDA培养基上培养5-7d，进行活化菌种；

（2）制备孢子悬浮液：用10ml无菌水冲洗活化后的孢子倒入150ml的无菌三角瓶中，内有玻璃珠，然后在恒温摇床上以120r/min摇20min，使孢子团充分散开。

（3）离子束注入：取生长在PDA培养基上的孢子制成孢子悬浮液，使孢子量在10⁶/ml，取0.1ml均匀涂于灭过菌的空白培养皿中，置于超净台上，用无菌微风晾干。分别用N⁺（或CO₂ ⁺）束以20kev，30kev、40kev的剂量进行离子束的注入，每个剂量两个皿，另作一个真空对照。

（4）将离子束注入的平板用1ml无菌水洗下孢子，然后将孢子液稀释后以每板100ul在PDA培养基上涂布，然后放入27-28℃条件下培养，待平板上长出单菌落的时，用牙签挑出单菌落采用影印的方法分别接种到几丁质筛选培养基上，待三天后测量各菌落的透明圈直径，并选出透明圈比较大的菌株进行二次筛选；原始菌种采取同样方法测透明圈大小。

（5）将二次筛选的菌株接种于PDA培养基上培养保存，五天后将保存的菌株用无菌水洗下孢子，将孢子液接种于发酵用几丁质液体培养基，待四天后取粗酶液（将发酵液于12000r/min条件下离心，上清液即为粗酶液）进行酶活力测定，并把结果与各菌株的透明圈结果进行比较。原始菌种也做同样处理后比较酶活力大小。将酶活力最大的菌株则定为是高产几丁质酶的菌株，即本实施例使用的菌株H2012，其显微镜形态如图1所示。经测算，在28±0.5℃条件下，H2012菌株中的几丁质酶基因酶活为730U。

二、木霉发酵用培养基配制（重量比）

培养基一：马铃薯1-5 %、血红蛋白0.5-3.3%、FeSO4 0.01-0.03%、KH2PO4 0.02-0.20 %、MgSO4 0.05-0.35%、CaSO4 0.05-0.1%、ZnSO₄ 0.01-0.02 %，余量为水。

优选一马铃薯3 %、血红蛋白2%、FeSO4 0.02%、KH2PO4 0.1%、MgSO₄ 0.2%、CaSO₄0.025 %、ZnSO₄0.01 %，余量为水。

优选二：马铃薯2-4 %、血红蛋白2-3%、FeSO4 0.015%、KH2PO4 0.05-0.15%、MgSO4 0.05-0.35%、CaSO4 0.05-0.1 %、ZnSO4 0.01-0.02 %，余量为水。

培养基二：血红蛋白1%、几丁质2%，马铃薯1-5 %、FeSO4 0.01-0.03%、KH2PO4 0.02-0.20 %、MgSO4 0.05-0.35%、CaSO4 0.05-0.1 %、ZnSO₄ 0.01-0.02 %，余量为水。

培养基三：马铃薯1-5 %、血红蛋白0.5-3.3%、FeSO4 0.01-0.03%、KH2PO4 0.02-0.20 %、MgSO₄ 0.05-0.35%、 Na₂B₄O₇·10H₂O0.025-0.05 %、Na₂SeO₃0.025-0.05 %、ZnSO4 0.01-0.02 %，余量为水。

三、哈茨木霉发酵液制备：

（1）促进种子萌发生长的木霉发酵液制备将配制的培养基一用氨水或0.5mol的NaOH调节pH至5.7-6.5，经高压灭菌后，向该培养液接入由H2012菌株孢子（每mL1×10⁶），于26-30℃±0.5℃条件下发酵培养5-10d。发酵终止后过滤分离，若发酵终止时，培养液pH大于等于4，则调pH小于等于4，静置6-8h后经虹吸吸取清液，对下层胶状物过滤，即为促进种子萌发生长的木霉发酵液（记为A）。

（2）提高作物抗病害、抗逆性（灰霉病，腐皮病，涤绢病等土传病）的木霉发酵液制备：将配制的培养基二用氨水或0.5mol的NaOH调节pH至5.7-6.5，经高压灭菌后，向该培养液接入由H2012菌株孢子（每mL1×10⁶），于26-30℃±0.5℃条件下发酵培养5-10d。发酵终止后过滤分离，若发酵终止时，pH值调节成5.8-6.2，静置6-8h后经虹吸吸取清液，对下层胶状物过滤，即为提高作物抗病害的木霉发酵液（记为B）。

（3）促进果树授粉座果的木霉发酵液制备：将配制的培养基三用氨水或0.5mol的NaOH调节pH至5.7-6.5，经高压灭菌后，向该培养液接入由H2012菌株孢子（每mL1×10⁶），于26-30℃±0.5℃条件下发酵培养5-10d。发酵终止后过滤分离，若发酵终止时，pH调节成6.2-6.4，静置6-8h后经虹吸吸取清液，对下层胶状物过滤，即为促进果树授粉座果的木霉发酵液（记为C）。

（4）将培养基一、二、三同比例混合，经高压灭菌，接入H2012菌种，于28±0.5℃条件下发酵5-7d后，于冷室静置6-8h，即虹吸转移，底部沉淀物用240目尼龙布过滤或离心沉淀，其清液与虹吸液合并，于负5-负10℃冷冻一昼夜，除水层即为浓缩液，放10℃下贮存。该浓缩液若当作为抗病害使用，则只需加自来水稀释成250倍（记为D），若作为促生长（沾根）和授粉座果用，则稀释成100倍使用（记为E）。

采用市售哈茨木霉作为发酵菌株，方法同上，分别发酵制备出促进种子萌发生长的木霉发酵液（记为A1）、提高作物抗病害（灰霉病，腐皮病，涤绢病等土传病）的木霉发酵液（记为B1）、促进果树授粉座果的木霉发酵液（记为C1）。

以上发酵液分别经江苏省疾病预防控制中心进行毒性试验（试验编号2002571），大鼠急性经口LD50大于4640mg/Kg,属低毒级。

实施例2：

提高种子发芽率的试验：取已冷储（-15℃以下）30d油茶籽15Kg，人工剔除明显损伤的籽粒，取出300粒作对照，随即分成3组，每组约400粒±10粒，作为平行实验组，平行组均放入经稀释100倍后的木霉发酵液（A和A1）至刚漫过种子搅棒，24h后翻动再浸种24h放至已准备的5—7cm厚的沙床中，于温室下培育35d，延续一周，检查至无萌发幼苗为止，统计处理的以水代替发酵液对照组的处理并与实验组对照所育出的幼苗数，分别将其除以入沙床籽数乘上100%即获试验组萌发率。其结果如表1所示。

表1 油茶种子萌发率试验

	1	2	3	平均发芽率（%）
					木霉发酵液A	87.2	91	83.2	87.3
木霉发酵液A1	90.5	88	82.1	86.9
					水（对照）	83.3	72.8	75.3	77.3

实施例3：

促进植物提前开花、提高植物授粉率及产量的试验：将木霉发酵液（C或C1）分别在植物长出3-5叶时做为基肥，按每株9-25g发酵液量施用，然后在花期来临前一个月再将木霉发酵液稀释至200-500倍以每亩15公斤进行喷施；通过木霉发酵产物的调控发育使较长的同型花期不延期，即所开花量集中于某一时段，达到与昆虫的传粉采蜜活动协同，以提高授粉率和坐果率，实现产量增产。以油茶和黄瓜为例，按上述方法施用了木霉发酵液后，油茶的早、中花期由寒露提前到秋分，减少晚花率7%-10%；黄瓜提前开花20-25d，为作物栽培茬口安排提供可操作性。实验结果如表2所示。

表2 油茶树三次花期百分率统计数

据统计，油茶和黄瓜的早花授粉率提高了22-27%；中花授粉率提高了18-22%；晚花授粉率提高了2-5%；由于花期提前，同时提高了果实座果率，与对照组相比，油茶和黄瓜的产量整体提高了3.2-3.6倍。

实施例4：

提高抗逆性的试验：作物(如小麦、油茶、豌豆等)播种前2-3d将经木霉发酵液（B或B1)稀释100倍后的液体倒入已称过的种子中，其液体以淹没种子为宜。若为水稻秧，则在插秧前，将一把把秧苗的根插入上述稀释的发酵液种浸泡3-5h，再插入水田中，在分蘖前再喷经稀释100倍的液体的同上的木霉液体发酵物，每亩用量15Kg。较对照组增产：水稻增产5.2%-7.0%，小麦增产10.2%-14.2%，黄瓜增产18%-56%。

实施例5：

提高抗病害的试验：本项实验用量和方法视作物抗病强弱而定。用木霉发酵原液稀释100倍后浸种，4h-2d，时间长短视种子皮的厚薄而异播入土壤中，同时依照播种方式；穴播（如小麦、玉米、马铃薯、花生等）则播种时每穴施入木霉发酵液（B或B1）（或将木霉发酵液制备成固体颗粒）25g，每亩施30Kg。若生长过程中遇阴雨天气则易患土传病，害虫诱发的煤病、落叶病等，此时按上述同样剂量连续两天，每天施用一次，施用时间为每天早晨7:00-10:00为宜,对施用的作物进行统计，其抗土传真菌类疾病效果达85%-90%。

本发明发酵液不限于实施例中所用的作物品种，它可以施用于各类农作物和果树；根据作物品种及生长环境的差异，其施用量只需进行简单调整，即可达到本发明所述的效果。

Claims

1.一种哈茨木霉发酵液的制备方法，其特征在于：按如下重量比配置培养基：

2.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉发酵液的制备方法，其特征在于，所述培养基按重量比由如下物质组成：马铃薯2-4 %、血红蛋白2-3%、FeSO4 0.015%、KH2PO4 0.05-0.15%、MgSO4 0.05-0.35%、CaSO4 0.05-0.1 %、ZnSO4 0.01-0.02 %，余量为水。

3.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉发酵液的制备方法，其特征在于，所述培养基按重量比由如下物质组成：马铃薯3 %、血红蛋白2%、FeSO4 0.02%、KH2PO4 0.1%、MgSO₄ 0.2%、CaSO₄0.025 %、ZnSO₄0.01 %，余量为水。

4.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉发酵液的制备方法，其特征在于，所述培养基中血红蛋白的含量为1%，所述培养基中还含有2%几丁质；发酵终止后，所述滤液调至pH 6.2-6.4。

5.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉发酵液的制备方法，其特征在于，所述培养基中中CaSO₄由硼酸钠和亚硒酸钠代替，所述硼酸钠和亚硒酸按质量各占一半，发酵终止后，培养液pH值调节成6.2-6.4。

6.按权利要求1或2或3所述方法制备获得的哈茨木霉发酵液在促进种子萌发生长中的应用。

7.按权利要求4所述方法制备获得的哈茨木霉发酵液在提高作物抗病害、抗逆性中的应用。

8.按权利要求5所述方法制备获得的哈茨木霉发酵液在促进果树授粉座果中的应用。