CN105579573A - 涉及分离的植物内生菌的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了涉及分离的哈茨木霉及其菌株的组合物和方法。

Description

涉及分离的植物内生菌的组合物和方法
技术领域
本公开内容涉及分离的植物内生菌及其用途，例如用于接种植物以促进胁迫耐受性和/或增加生长或发芽。
背景技术
共生(定义为两种或更多种生物体以紧密或亲密的关系生活在一起)通常是2种生物体之间的互利相互作用。多数的植物是与真菌共生的(Petrini,1986)，并且这些真菌在植物群落的结构、功能以及健康和适应中起重要的作用(BaconandHill,1996；ClayandHolah,1999；Petrini,1986；Read,1999；RodriguezandRedman,1997)。
已经证明与真菌的共生关系可以增强宿主植物在胁迫条件下的生长。例如，植物内生真菌的特定菌株赋予宿主植物针对极端环境条件(包括温度、干旱和盐度)的耐受性(Redman等人,2002b；Rodriguez等人,2004；RodriguezandRedman,2008；Rodriguez等人,2009；Redman等人,2011；Rodriguez等人,2012)。植物内生菌是一类驻留在宿主植物根、茎和/或叶中的真菌共生体。除了促进胁迫耐受性以外，植物内生菌还增加宿主植物的养分获取和生长速率(生物量和产率)，并改善水利用效率(Rodriguez等人,2008；Rodriguez等人,2009)。
非生物胁迫(例如干旱、温度、盐度、pH和养分)改变植物的生理学，从而导致降低的适应性、健康、发育和产率。在边缘生长条件(通常由于非生物胁迫)下繁殖植物会使得农作物和原生植物的农业产量得到增加和气候诱导的生境变化得到缓解。此外，产生新的植被对于由现代工业和其它人类活动导致的污染场所的土壤和水补救而言是重要的。
之前公开的研究(Redman等人,2002b&2011；Rodriguez等人,2008&2012)已经证明特定种类的真菌共生体(种类2)可以简单地通过使用植物内生真菌定植植物而给植物赋予生物和非生物胁迫益处。
发明概述
如本文所述，已发现与之前鉴定的植物内生真菌相比，诸如哈茨木霉(Trichodermaharzianum)(例如菌株ThLm1)的植物内生真菌赋予优异的非生物/生物胁迫耐受性，并增加农业和原生植物的产率。因此，本公开内容的多个方面涉及与分离的植物内生真菌有关的组合物和方法，其中所述植物内生真菌例如为物种哈茨木霉，包括菌株ThLm1。
根据本发明的一个方面，提供了分离的哈茨木霉菌株ThLm1真菌或者其后代或孢子，所述哈茨木霉菌株ThLm1真菌保藏于美国农业研究菌种保藏中心，专利保藏指定编号为NRRL50846(保藏日期2013年7月26日)。还提供了包含哈茨木霉菌株ThLm1真菌和/或其后代和/或孢子的组合物。所述组合物包括例如液体组合物和粉末组合物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于促进胁迫耐受性和/或增强植物生长或种子发芽的方法。该方法包括使用分离的哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其孢子或后代、或者其组合物接种植物或植物种子。在一些实施方案中，胁迫耐受性为干旱耐受性、盐耐受性、养分减少耐受性、真菌耐受性和/或温度耐受性。在一些实施方案中，增强的植物生长或种子发芽包括大小、根发育的程度、种子的发芽率、叶绿素含量/水平、光合效率、产率或质量的增加。
在一些实施方案中，接种植物可以包括使用哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其孢子或后代定植植物的根和/或茎。
在一些实施方案中，方法进一步包括使植物或植物种子生长，所述生长可以处于特征为高盐度、低水分和/或低养分含量的土壤中。在一些实施方案中，高盐度为高于35mM的盐量。在一些实施方案中，低水分含量为0-0.18in3水/in3土壤。在一些实施方案中，低养分含量为低于80lbs/英亩的养分，其中所述养分包含各20％的氮、磷和钾，以及相关的微量元素养分。
在一些实施方案中，植物或植物种子在特征为高盐度和/或低养分含量的水中生长。
在一些实施方案中，植物或植物种子在平均温度为或高于35℃、或者平均温度为或低于15℃生长或发芽。
在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、番茄、玉米、小麦、大豆、葫芦科植物(cucurbits)、胡椒(peppers)、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆(beans)、豌豆(peas)、块茎、浆果、木本植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科、百合科、杜鹃花科(Azalea)、杜鹃花属(Rhododendron)、禾本科或菊属。
根据本发明的另一个方面，提供了植物或植物种子，其接种有分离的哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其孢子或后代、或者其组合物。
在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜,番茄,玉米,小麦,大豆,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎,浆果,木本植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
根据本发明的另一个方面，提供了用于增加胁迫耐受性的方法。该方法包括使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物或植物种子，由此增加所接种的植物的胁迫耐受性。
在一些实施方案中，胁迫为干旱、盐升高、养分减少和/或温度胁迫。在一些实施方案中，胁迫不是多环芳香烃、环烷酸或高pH的存在。
在一些实施方案中，接种植物包括使用哈茨木霉菌株真菌或其孢子或后代定植植物的根、茎和/或叶。
在一些实施方案中，方法进一步包括使植物或植物种子生长，所述生长可以处于特征为高盐度、低水分和/或低养分含量的土壤中。在一些实施方案中，高盐度为高于35mM的盐量。在一些实施方案中，低水分含量为0-0.18in3水/in3土壤。在一些实施方案中，低养分含量为低于80lbs/英亩的养分，其中养分包括各20％的氮、磷和钾，以及相关的微量元素养分。
在一些实施方案中，植物或植物种子在特征为高盐度和/或低养分含量的水中生长。
在一些实施方案中，植物或植物种子在平均温度为或高于35℃、或者平均温度为或低于15℃生长或发芽。
在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、番茄、玉米、小麦、大豆、葫芦科植物、胡椒、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆、豌豆、块茎、浆果、木本植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科、百合科、杜鹃花科、杜鹃花属、禾本科或菊属。
在一些实施方案中，哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-1或菌株T-22。
根据本发明的另一个方面，提供了用于增加种子发芽的方法。该方法包括使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物种子，由此增加所接种的种子的发芽。
在一些实施方案中，使用杀真菌剂(fungicide)和/或杀昆虫剂(insecticide)预先、同时和/或随后处理植物种子。
在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、番茄、玉米、小麦、大豆、葫芦科植物、胡椒、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆、豌豆、块茎、浆果、木本植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科、百合科、杜鹃花科、杜鹃花属、禾本科或菊属。
在一些实施方案中，哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-1或菌株T-22。
根据本发明的另一个方面，提供了用于减少植物中非哈茨木霉的真菌的建立的方法。该方法包括使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物种子或幼苗，由此减少从所接种的种子或幼苗生长的植物中非哈茨木霉的真菌的建立。
在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、番茄、玉米、小麦、大豆、葫芦科植物、胡椒、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆、豌豆、块茎、浆果、木本植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科、百合科、杜鹃花科、杜鹃花属、禾本科或菊属。
在一些实施方案中，哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-1或菌株T-22。
在下文的描述中，示出了本发明的一个或多个实施方案的详情。根据以下的附图和多个实施方案的详述、并且还根据所附的权利要求书，本发明的其它特征或益处将显而易见。
附图简述
以下附图形成了本说明书的一部分，并且包含这些附图以进一步证明本公开内容的某些方面，通过参照这些附图的一个或多个，并结合本文呈现的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1为显示玉米幼苗对ThLm1的生物量反应的柱状图。非共生的(NS-每对中左侧的柱)以及与ThLm1共生的(S-每对中右侧的柱)玉米植物(N＝24)在无胁迫下在温室中生长1个月。Y轴上的值为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
图2为描绘通过与ThLm1共生而使得玉米生长和产率增加的柱状图。左侧＝非共生的(NS)，右侧＝与ThLm1共生的(S)。Y轴上的值为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
图3为显示通过与ThLm1共生而使得玉米生长和产率增加的图。左侧2个柱＝非共生的(NS)，右侧2个柱＝与ThLm1共生的(S)。Y轴上的值为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
图4为描绘与ThLm1共生的(S)或非共生的(NS)的玉米的种子发芽的柱状图。左侧＝非共生的(NS)，右侧＝与ThLm1共生的(S)。Y轴上的值表示种子发芽百分率，并显示平均值。
图5为描绘共生玉米植物中增加的叶绿素含量的图。左侧＝非共生的(NS)，右侧＝共生的(S)，对在不存在胁迫的情况下温室生长的成熟玉米植物就叶绿素含量(Y轴，数字为SPAD值)进行测量，并显示平均值。
图6A为显示暴露于干旱胁迫的玉米植物的根和苗(shoot)重量的一系列柱状图。各图中左侧的柱＝非共生的(NS)，各图中右侧的柱＝与ThLm1共生的(S)。Y轴上的值为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
图6B为显示暴露于低养分胁迫的玉米植物的根和苗重量的柱状图。各图中左侧的柱＝非共生的(NS)，各图中右侧的柱＝与ThLm1共生的(S)。Y轴上的值为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
图7为描绘暴露于盐胁迫的玉米的重量的柱状图。左侧＝非共生的(NS)，右侧＝与ThLm1共生的(S)。Y轴上的数字为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
图8为描绘稻幼苗中的寒冷胁迫耐受性的图。根生物量通过各柱的上半部分描绘。显示了根和苗的生长(cm)。苗的生长通过各柱的下半部分描绘。
图9为描绘在干旱胁迫下田地评价的图。显示了各自包含120个玉米植物的5个重复样地的产率数据。与ThLm1共生的植物产生比非共生的(NS)植物平均85％更高的产率。
图10为显示非共生的(NS)或与ThLm1共生的(S)的玉米的苗和根生物质的图。Y轴上的值为鲜重生物质，以克(g)计。
图11是显示使用ThLm1接种的共生玉米植物产生更加伸展的具有更多侧根的根系统的照片。图11为来自图10的植物的非共生的(NS，左侧)和共生的(S，右侧)的根的代表性照片。
图12为显示非共生的(NS)或与ThLm1共生的(S)大豆的根和苗生物质的柱状图。Y轴上的值为鲜重生物质，以克(g)计。
图13为描绘玉米植物的叶的叶绿素含量的柱状图。采用SPAD测量，其指示叶绿素相对％。3个“S”柱的每一个表示ThLm1的3种独特的制备物。
图14为与ThLm1共生的(S，右侧的柱)或非共生的(NS，左侧的柱)的大豆植物的SPAD测量的柱状图。SPAD测量指示植物中的叶绿素相对％。
图15为显示与ThLm1的不同制备物共生的(S)或非共生的(NS)玉米的果实产率的柱状图。
图16为描绘与ThLm1共生的(S，各图中的右侧的柱)或非共生的(NS，各图中的左侧的柱)玉米植物在低养分胁迫下的根、苗和产率的一系列柱状图。
图17为描绘与ThLm1共生的(S，各图中的右侧的柱)或非共生的(NS，各图中的左侧的柱)玉米植物在干旱胁迫下的根、苗和产率的一系列柱状图。
图18为描绘与ThLm1共生的(S，左侧的柱)或非共生的(NS，右侧的柱)大豆植物在盐胁迫下的根和苗生物量的柱状图。
图19为描绘与ThLm1共生的(S，左侧的柱)或非共生的(NS，右侧的柱)玉米在盐胁迫下的苗和根生物量的柱状图。
图20为描绘暴露于高温的非共生的(NS)或ThLm1共生的(S)玉米植物的生长的柱状图。在暴露于高温(45-50℃)2周后，测量共生的(各对中的右侧的柱)和非共生的(各对中的左侧的柱)玉米植物的生长。
图21为描绘暴露于高温的非共生的(NS)或ThLm1共生的(S)番茄植物的生长的柱状图。在暴露于高温(45-50℃，右侧对)或正常温度(25-30℃，左侧对)2周后，测量共生的(各对中的右侧的柱)和非共生的(各对中的左侧的柱)玉米植物的生长。
图22为使用ThLm1处理的(S)或未使用ThLm1处理的(NS)玉米种子在高温(50-55℃)的发芽百分比的图。
图23为使用ThLm1处理的(S)或未使用ThLm1处理的(NS)大豆种子在高温(50-55℃)的发芽百分比的图。
图24为使用ThLm1处理的(S)或未使用ThLm1处理的(NS)玉米种子在暴露于寒冷温度(5℃)144小时的发芽百分比的图。测试3种玉米种类(A、P和D)。
图25为使用ThLm1处理的(S)或未使用ThLm1处理的(NS)大豆种子在暴露于寒冷温度(5℃或15℃)72小时的发芽百分比的图。
图26为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的干旱胁迫耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于干旱胁迫(完全不浇水)9天，并且标准偏差低于5％。未萎蔫＝植物具有完全膨胀并且与在不具有植物胁迫下生长的植物无不同；轻微萎蔫＝植物具有完全膨胀但在顶端具有轻微的叶卷边；永久性萎蔫点＝当重新浇水时植物不能从其恢复的严重萎蔫。
图27为由哈茨木霉分离物赋予大豆的干旱耐受性的代表性图像。将植物暴露于干旱条件6天，所有的NS植物均萎蔫，而E1定植的植物保持完全的膨胀。在干旱胁迫过程中，E1定植的植物还继续生长，如通过植物大小可见的。
图28为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的干旱胁迫耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于干旱胁迫(完全不浇水)9天，并且标准偏差低于5％。未萎蔫＝植物具有完全膨胀并且与在不具有植物胁迫下生长的植物无不同；轻微萎蔫＝植物具有完全膨胀但在顶端具有轻微的叶卷边；永久性萎蔫点＝当重新浇水时植物不能从其恢复的严重萎蔫。
图29为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的盐胁迫耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于盐胁迫(300mMNaCl)14天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌均显著地增加了植物根生物量。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图30为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的盐胁迫耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于盐胁迫(300mMNaCl)14天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌将用水量降低超过100％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图31为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的盐胁迫耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于盐胁迫(300mMNaCl)14天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌将用水量降低超过300％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图32为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的盐胁迫耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于盐胁迫(300mMNaCl)14天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使植物根生物量增加12-32％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图33为显示由11种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的热耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于45℃根部温度10天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使植物苗高度增加15-46％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图34为显示由11种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的热耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于45℃根部温度10天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使植物叶的叶绿素水平增加16-37％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图35为显示由6种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于45℃根部温度10天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使植物用水量降低26-77％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图36为显示由6种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物暴露于45℃根部温度10天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使植物根生物量增加30-100％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图37为显示由哈茨木霉的分离物(ThLm1)赋予大豆植物的寒冷耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9个种子的3个重复(n＝27，标准偏差<10％)。对种子进行接种并在5℃、15℃和25℃放置72小时，以评估发芽。与非共生的对照植物相比，在所有温度，植物内生菌赋予寒冷耐受性并增加种子发芽。
图38为显示由哈茨木霉的分离物(ThLm1)赋予玉米植物的寒冷耐受性的图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9个种子的3个重复(n＝27，标准偏差<10％)。对3种玉米种类(A、P、D)的种子进行接种并在15℃放置96小时，以评估发芽。与非共生的对照植物相比，植物内生菌赋予寒冷耐受性并显著增加种子发芽。
图39A-39C表示显示在发芽后2周的非共生的(NS)和共生的(TT＝ThLM1)玉米幼苗中随时间过去所测量的光合效率(Qmax,Y轴)的一系列图。使植物在不存在胁迫(图39A)、或者在干旱胁迫(图39B)或热胁迫(图39C)的存在下生长。在所有情况下，量子效率显著高于共生的植物。
图40为显示在Michigan,USA的一个场所中在干旱胁迫后的平均玉米产率的柱状图。该场所经过随机化设计，具有25个样地(每个样地为20英尺x20英尺)。使用2种(配制的ThLm1)处理(L＝低数量孢子/种子以及H＝高数量孢子/种子)测试4种玉米种类，并且具有10个重复/处理，且N＝30/处理。使用的粉末配制物接种种子，并在2个小时内种植。(所有其它田地研究均涉及液体配制物)。使用的处理使得玉米产率相对于未接受处理的植物升高30-85％。
图41为显示在Michigan和Indiana,USA的几个生态地带中由独立的合作者建立的场所处，在低胁迫下的平均玉米产率的柱状图。该场所经过随机化设计，具有总计215个样地。使用(配制的ThLm1)处理的样地的总体84％具有玉米产率的增加，其中平均增加6.5％，并且增加范围为3-20％。以蒲式耳/英亩计的增加的范围为5-38。
图42为显示在Texas,USA的2种土壤类型中建立的样地中，在低胁迫下的平均稻产率的柱状图。该场所经过随机化设计，具有总计105个样地(每个样地为20英尺x20英尺)。使用2种(配制的ThLm1)处理测试3种稻种类，并且具有4个重复/处理，播种机以80lb/英亩播种。诱导的产率增加范围为191-657lbs/英亩，并且田地平均增加6％，并且增加范围为2.1-18.2％。
图43为显示在低胁迫下的平均大麦产率的柱状图。一种大麦种类种植在18个随机的样地(每个样地为20英尺x20英尺)上。(配制的ThLm1)处理使大麦产率增加7％。
图44为显示在盐胁迫下的草产率的柱状图。在30-80mM的恒定盐胁迫存在下评估总计18个草样地。(配制的ThLm1)处理的植物比未接受处理的的植物(未处理的)具有86％更多的生物量。
图45为显示由15种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的柱状图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物根暴露于45℃10天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使植物叶的叶绿素水平增加16-37％。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图46为显示由15种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的柱状图。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n＝36)。使植物根暴露于45℃10天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌均增加植物生物量。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。
图47为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的养分耐受性的柱状图。对1周龄的大豆植物给予具有氮、磷、钾(NPK)的初始浇水，此后，在试验的过程中(大约90天)，每2天使植物暴露于无NPK胁迫(具有完全强度NPK的浇水)或高NPK胁迫(具有1/4强度NPK的浇水)。然后，针对生物量(根和苗)评估植物，并显示高NPK胁迫植物的数据。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物。
图48为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的养分耐受性的柱状图。对1周龄的玉米植物给予具有氮、磷、钾(NPK)的初始浇水，此后，在试验的过程中(大约90天)，每2天使植物暴露于无NPK胁迫(具有完全强度NPK的浇水)或高NPK胁迫(具有1/4强度NPK的浇水)。然后，针对生物量(根和苗)评估植物，并显示高NPK胁迫植物的数据。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物。
图49为显示由19种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的种子发芽增强的柱状图。UT(未处理的)表示不具有植物内生菌的对照种子，各柱表示20个种子。数据表示高于未处理的对照种子的发芽增强百分比。与未处理的对照种子相比，所有植物内生菌使种子发芽增加40-70X。
图50为显示由17种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的寒冷耐受性的柱状图。寒冷耐受性表达为来自发芽的种子的根(rootradical)长度。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示30个幼体(germling)暴露于15℃6天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使幼体生长增加10-32x。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是矮小的和干枯的。
图51为显示由18种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的寒冷耐受性的柱状图。寒冷耐受性表达为在15℃的种子发芽。NS(非共生的)表示不具有植物内生菌的对照种子，各柱表示18个种子暴露于15℃4天，其中标准偏差<10％。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使种子发芽增加85-240％。
发明详述
在本世纪中，对农业生产率的可预见的限制包括非生物胁迫，例如干旱、温度极限和盐度。目前，没有胁迫耐受的农作物植物或能够产生胁迫耐受农作物的商业产品。非生物胁迫耐受的农作物没能通过育种、突变选择或遗传修饰(GM)方法产生，从而仍然为农业的“神圣渴望物”。
玉米、大豆、小麦和稻在世界范围内大量生长，并且被认为是维持人口的最重要的农作物。然而，种植者在保持农业可持续性所需的高农作物产率中面对许多挑战。近年来，全球性气候变化在许多农业背景中造成频率增加的严重干旱。通过灌溉可以缓和干旱的影响，但这是昂贵的应急措施，并且水质/可利用性也在降低。
存在几种可利用的增加生长、改变植物的养分状态或保护植物对抗微生物或昆虫病原体的微生物产品(表1；Berg,2009)。
表1.用于农业的微生物产品
微生物属/群 描述 农业用途分类
白粉寄生孢属 真菌 疾病控制
固氮螺菌属 细菌 生长增强
芽孢杆菌属 细菌 疾病控制和生长增强
白僵菌属 真菌 昆虫控制
短根瘤菌属 细菌 养分补充
念珠菌属 真菌 收获后疾病控制
毛盘孢属 真菌 杂草控制
盾壳霉属 真菌 疾病控制
代尔夫特菌属 细菌 生长增强
欧文氏菌属 细菌 疾病控制
绿僵菌属 真菌 昆虫控制
菌根 真菌 养分获取
拟青霉属 真菌 疾病控制
盾壳霉属 真菌 疾病控制
疫霉属 真菌 杂草控制
毕赤酵母属 真菌 收获后疾病控制
假单胞菌属 细菌 疾病控制,生长增强,霜冻保护
根际细菌属 细菌 疾病控制
根瘤菌属 细菌 氮补充
沙雷氏菌属 细菌 疾病控制
链霉菌属 细菌 疾病控制,生长增强
木霉属 真菌 疾病控制
哈茨木霉(T.harzianum)为真菌物种，其涵盖种类广泛的生理学特化的菌株，其中的一些菌株用作对抗土壤传播的植物病原体的生物杀虫剂或者用于酶的工业生产(Naseby等人,2000)。哈茨木霉已经显示在植物中诱导代谢变化，这增加植物对种类广泛的植物病原体微生物和病毒的抗性(Harman等人,2004)。之前已显示，哈茨木霉菌株T-22在一些条件下可以增加植物的生长和根的发育。T-22还可以溶解植物养分用于植物摄取，否则这些养分在某些土壤中是不能被植物利用的(Altomare等人,1999；Harman等人,2004)。此外，发现哈茨木霉的另一种菌株TSTh20-1(专利保藏指定编号PTA10317)(从被发现在油砂尾矿上生长的植物分离的植物内生真菌)促进植物的生长，特别是在关于水、有机碳、氮和矿物质含量、温度和被多环芳香烃或环烷酸污染的亚最佳或胁迫条件下(PCT公开No.WO2011/032281)。
如本文所述，在本文中称为ThLm1的新型植物内生真菌共生体哈茨木霉菌株是从在华盛顿州的海滩上生长的草(禾本科(Poacea))物种分离的。该菌株不是已知的植物或动物病原体。
当诸如农作物植物和原生植物的其它植物接种哈茨木霉菌株ThLm1时，发现此接种产生多种益处，包括植物种子发芽率、生长和产率的增加；水消耗和NPK(氮、磷和钾)补充的减少；赋予针对非生物胁迫包括干旱、温度、盐度的耐受性；以及植物总体健康的增强。已发现ThLm1能够定植范围广泛的植物，包括单子叶植物和真双子叶植物，并因此具有交叉植物/农作物效用。此外，已发现哈茨木霉菌株ThLm1完全驻留在植物营养组织中并且不会生长至已接种的植物的种子或果实中。因此，ThLm1具有交叉农作物(cross-crop)效用，可以用于向消费者提供不含植物内生菌的产品，并且赋予非生物胁迫耐受性(盐、温度、低NPK、干旱)、生物量和产率增加、以及增加植物总体健康和健壮性。
哈茨木霉的其它菌株在商业上用作生物杀虫剂、植物生长增强剂并用于工业酶的生产。未报道有菌株能够如针对ThLm1所发现的那样增强种子发芽或者赋予盐度或温度胁迫耐受性。尽管已报道其它菌株降低水消耗，但ThLm1在农业农作物中产生优异的结果，并且已显示在田地条件下赋予益处(参见实施例)。
因此，本公开内容的多个方面涉及分离的哈茨木霉菌株ThLm1，及其组合物和使用方法。
本公开内容的其它方面涉及如本文针对菌株ThLm1所述的使用哈茨木霉的方法。提供了通过以下过程增加胁迫耐受性的方法：使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物或植物种子，由此增加所接种的植物的胁迫耐受性。在一些实施方案中，所述胁迫为干旱、盐升高、养分减少和/或温度胁迫，和/或不是多环芳香烃、环烷酸或高pH的存在。还提供了用于增加种子发芽的方法，其中植物种子接种有分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物，由此增加所接种的种子的发芽。还提供了通过以下过程减少植物中非哈茨木霉的真菌的建立的方法：使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物种子或幼苗，由此减少从所接种的种子或幼苗生长的植物中非哈茨木霉的真菌的建立。在这些方面的一些实施方案中，哈茨木霉真菌不是菌株TSTh20-1或菌株T-22。
定义：
如本文所用，术语“非生物胁迫”是指物理和化学因素在特定环境中对活生物体的不利影响。物理和化学因素可以包括但不限于水、有机养分水平、矿物质养分水平、化学污染、化学处理(例如杀虫剂，例如杀真菌剂和杀昆虫剂)、温度、降雨、pH、氧化还原作用、氧含量、烃残余物、碱、金属、盐度、大气气体、光、土壤组成。
如本文所用，术语“植物内生菌”是指一类驻留在宿主植物根、茎和/或叶中的真菌共生体。
如本文所用，例如使用真菌“接种植物”的术语是指使用真菌或任何真菌发育期来应用于或感染植物。
如本文所用，术语“植物”包括可以被真菌定植的植物界的任何成员。在一个实施方案中，植物为农业农作物，包括但不限于玉米,大豆,稻,小麦,棉花,大麦,高粱,番茄,葫芦科植物,绿叶蔬菜,棉花,浆果,木本植物和草坪草。这些植物物种已被测试，并且哈茨木霉菌株诸如ThLm1已显示赋予这些植物物种生长益处。在其它的实施方案中，植物为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
如本文所用，术语“ThLm1的后代”是指由ThLm1细胞衍生的所有细胞。
如本文所用，术语“促进植物生长”或“增加的植物生物量和产率”是指植物或其部分(例如根和苗、以及种子/果实产率)与未使用真菌接种的对照非共生植物或其部分相比、或者与预定的标准相比，具有增加的大小、质量或数量。
如本文所用，术语“ThLm1的孢子”是指由ThLm1真菌或其有性阶段Hypocrea形成的无性繁殖细胞。
如本文所用，术语“共生”和/或“共生关系”是指2种生物体之间的有益相互作用，包括多数植物具有的与真菌诸如菌根的相互作用。类似地，如本文所用，术语“共生体”是指共生相互作用中的生物体。
如本文所用，术语“用水效率”是指在预定的时期内由植物消耗的水或流体的量。其还可以由每克植物生物量的水或流体的利用或水势来定义。
分离的哈茨木霉ThLm1
在一个方面中，本公开内容涉及分离的哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其后代或孢子，该真菌于2013年7月25日提交给美国农业研究菌种保藏中心，并以专利保藏指定编号NRRL50846保藏(保藏日期：2013年7月26日)。
ThLm1的后代包括由ThLm1细胞衍生得到的任何细胞。ThLm1的孢子包括由ThLm1真菌或由其有性阶段Hypocrea形成的无性繁殖细胞。如本文所用，“分离的”是指已从其天然共生宿主移出的细胞或真菌。例如，分离的哈茨木霉菌株ThLm1可以从禾本科草物种移出。可以使用本领域公知的或本文所述方法来分离真菌。分离的真菌或细胞可以在分离后使用本领域已知的方法例如通过在补充有氨苄青霉素、四环素和链霉素的0.1X马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养来维持，并利用12hr光照方案在22℃生长。在生长5-14天后，可以通过加入10ml无菌水并使用无菌载玻片轻柔地刮去孢子来从平板收获分生孢子。
ThLm1的突变体和变体可以提供与亲代菌株相同的(或更好的)益处。可以使用本领域技术人员已知的方法来产生突变体，例如通过暴露于各种化学制品、辐射、物理条件、分子操作、基于病毒的DNA修饰和/或基于质粒的DNA修饰。然后，可以通过本文所述方法选择突变体，以鉴定提供与亲代菌株相同的或更好的益处的突变体。还可以通过将定植的植物暴露于物理或化学条件并针对共生益处进行选择来形成变体。
组合物
本公开内容的一个方面涉及包含哈茨木霉菌株(例如ThLm1)和/或其后代和/或孢子的组合物。
在一些实施方案中，所述组合物可以包含生理学可接受的载体，例如对种子和/或植物无害的载体。这样的载体是本领域已知的(参见例如PCT公开No.WO96/039844和美国专利No.5,586,411；5,697,186；5,484,464；5,906,929；5,288,296；4,875,921；4,828,600；5,951,978；5,183,759；5,041,383；6,077,505；5,916,029；5,360,606；5,292,507；5,229,114；4,421,544和4,367,609，这些文献各自以引用方式并入本文)。
此外，在处理种子的过程中可以加入多种物质，例如杀真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、杀细菌剂、养分、生物杀虫剂、其它微生物接种剂、着色剂、水合基质和聚合物，所有这些物质均是本领域公知的。在种子处理中常用的大部分物质不会干扰哈茨木霉菌株(例如ThLm1)与植物物种之间的共生关系的建立。
在一些实施方案中，组合物为适用于喷雾应用或浸渍应用的流体形式。组合物可以是稀释的或浓缩的。在一个实施方案中，组合物在接种之前用水稀释。在另一个实施方案中，组合物为糊状形式。在另一个实施方案中，组合物为用于撒粉的干燥粉末状形式。组合物可以施加于植物的任何部分，包括根、叶、茎或种子。组合物优选地施加于干燥的种子，例如以种子涂层的形式。
本领域技术人员可以容易地测定可以施加于植物或植物种子以实现所需结果(例如诱导胁迫耐受性和/或增强植物的生长)的组合物量或浓度。在一个实施方案中，每个种子可以使用哈茨木霉菌株(例如ThLm1)的大约5至大约100000个活的孢子，优选为每个种子大约50至1000个活的孢子。
植物和植物种子
本公开内容的其它方面涉及已用本文所述的分离的哈茨木霉菌株(例如ThLm1)或其孢子或后代接种的植物和植物种子。如本文所用，术语“植物”包括可以被真菌定植的植物界的任何成员。可以使用本领域技术人员已知的标准方法来测定植物是否被哈茨木霉菌株(例如ThLm1)定植，例如从植物分离真菌并对其进行鉴定(通过本领域已知的方法，例如本文所描述的方法)，从植物直接提取DNA然后进行检测分析(例如使用PCR或探针)。可以与非共生的植物相比较，通过简单地观察植物的健康和胁迫耐受性、或者生理学指标的改变，来测定植物被定植。
植物或植物种子可以是例如单子叶植物或真双子叶植物。在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或其种子，包括但不限于玉米,大豆,稻,小麦,西瓜,番茄,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎和木本植物。
在一些实施方案中，植物为原生植物。如本文所用，原生植物为对于栖息或气候带而言是本土的或自然化的植物。原生植物的实例包括但不限于草、树、有花植物、灌木和草本植物，例如穗翦股颖、一年生银须草、加州雀麦草、细茎银须草、蓝野生黑麦、草地大麦、美洲沙丘草、美洲商陆和拟南芥。本领域技术人员可以例如使用已知的分类系统和数据库来容易地鉴定特定栖息或气候带的原生植物(参见例如，在wildflower.org上的NativePlantDatabase；在nativeplantnework.org的NativePlantNetwork；通过美国农业部的Plants数据库；Kenrick,Paul&Crane,PeterR.(1997).TheOriginandEarlyDiversificationofLandPlants:ACladisticStudy.Washington,D.C.:SmithsonianInstitutionPress.ISBN1-56098-730-8；Raven,PeterH.,Evert,RayF.,&Eichhorn,SusanE.(2005).BiologyofPlants(7thed.).NewYork:W.H.FreemanandCompany；以及PranceG.T.(2001)."DiscoveringthePlantWorld".Taxon(InternationalAssociationforPlantTaxonomy)50(2,GoldenJubileePart4):345–359.)。
在一些实施方案中，植物为非原生植物。如本文所用，非原生植物为对于栖息或气候带而言不是本土的并且可以被自然化或侵入的植物。非原生植物的实例包括但不限于草、树、有花植物、灌木、草本植物、肉质植物等。本领域技术人员可以例如使用已知的分类系统和数据库来容易地鉴定特定栖息或气候带的原生植物(参见例如，通过美国农业部的Plants数据库)。
可以使用本领域已知的或本文所述的任何方法来接种植物或植物种子。例如通过使用标准的过程由植物分离真菌并通过本文所述方法鉴定该真菌；由植物直接提取DNA，然后进行检测分析；或者通过与非共生的植物相比，观察植物健康和胁迫耐受性、或者生理学指标的改变，针对使用哈茨木霉菌株(例如ThLm1)或其孢子或后代的接种，可以测试植物。
可以就哈茨木霉菌株(例如ThLm1)或其孢子或后代的接种测试植物，例如通过使用标准的程序从植物分离真菌并通过本文所描述的方法对其进行鉴定，通过从植物直接提取DNA然后进行检测分析，或者与非共生的植物相比较，通过观察植物健康和胁迫耐受性、或者生理学指标的改变。
方法
本公开内容的其它方面涉及用于促进胁迫耐受性和/或增强植物生长或种子发芽的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用分离的哈茨木霉菌株(例如ThLm1)或其孢子或后代接种植物或植物种子。
如本文所用，术语“胁迫”是指物理、有机和化学因素在特定的环境中对活生物体(例如植物)的不利影响，包括对种子发芽、植物生长或发育、和/或植物(例如果实)产率的影响。物理和化学因素可以包括但不限于水(包括土壤湿度和降雨)、养分水平(包括有机和矿物质养分水平，特别是低的养分水平)、温度(包括特定植物所能耐受的或者对于特定植物而言是最佳的温度范围之外的高温或低温)、pH(包括特定植物所能耐受的或者对于特定植物而言是最佳的pH范围之外的高或低pH)、氧化还原作用、氧含量、盐度、大气气体、光和土壤组成。有机因素可以包括可以为病原体的真菌、细菌、病毒、线虫或昆虫，或者可以为食草动物的其它动物。如本文所用，“胁迫耐受性”是指活生物体(例如植物)对胁迫条件的抗性。抗性可以为例如在胁迫条件下生长或存留的能力，否则会导致植物死亡或者植物的生长减少和/或产率降低。在一些实施方案中，胁迫耐受性是干旱耐受性、盐耐受性、养分减少耐受性、真菌耐受性和/或温度耐受性。在一些实施方案中，接种有哈茨木霉菌株(例如ThLm1)的植物相对于未接种所述菌株的植物而言具有更高的胁迫耐受性。
可以通过将接种有哈茨木霉菌株(例如ThLm1)或其孢子或后代的植物中的胁迫耐受性水平与未接种的对照植物中的胁迫耐受性水平进行比较来测定胁迫耐受性的增加或促进。例如可以在胁迫条件下在接种的植物中测量生长速率、发芽率、产率、质量、生理学指标和其它这样的因素，并将其与在相似胁迫条件下对照未接种植物中的相同因素进行比较。接种的植物中的一个或多个这样的因素的增加会指示胁迫耐受性的增加或促进。还可以通过将接种有哈茨木霉菌株(例如ThLm1)或其孢子或后代的植物中的胁迫耐受性水平与预定的标准进行比较来测定胁迫耐受性的增加或促进。预定的标准可以为例如植物群体(例如未接种的植物群体)的平均生长速率、发芽率、光合效率、产率或质量。在一些实施方案中，促进胁迫耐受性包括胁迫耐受性比对照或预定的标准增加至少5％,10％,15％,20％,25％,30％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,100％,110％,120％,130％,140％,150％,160％,170％,180％,190％,200％或更多。
如本文所用，术语“增强生长”是指与未接种真菌的对照植物或其部分相比、或者与预定的标准相比，植物或其部分(例如根和苗)的大小、根发育的程度(例如根系统伸展的程度)、种子的发芽率、叶绿素含量/水平、产率(例如种子的数量或果实产量)或质量增加。预定的标准可以为例如植物群体(例如未接种的植物的群体)的植物或植物部分的平均大小、根发育的程度、发芽率、叶绿素含量/水平、光合效率、产率或质量。可以以多种方式来评估对植物生长的增强的测定。例如，可以测量整个植物或其部分(例如种子、果实、苗和根)的大小、根发育的程度、发芽率、叶绿素含量/水平、光合效率、产率或质量。在一些实施方案中，增强生长包括植物或其部分的大小、根发育的程度、发芽率、叶绿素含量/水平、光合效率、产率或质量比对照或预定标准增加至少5％,10％,15％,20％,25％,30％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,100％,110％,120％,130％,140％,150％,160％,170％,180％,190％,200％或更多。
如本文所用，例如使用真菌“接种植物或植物种子”是指使用真菌或来自任何真菌发育期的真菌细胞(例如孢子)应用于或定植植物或植物种子。在一些实施方案中，接种植物包括使用哈茨木霉菌株(例如ThLm1)定植植物的根和/或茎。
在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括使植物或植物种子生长。植物或植物种子可以在一种或多种胁迫条件下生长，例如干旱条件、高盐条件、养分减少条件、低光照条件、寄生真菌条件和/或高温条件。
因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括使植物或植物种子在特征为高盐度、低水分和/或低养分含量的土壤中生长。特征为高盐度的土壤包括土壤中存在的盐(例如Na、Mg、Ca或K氯化物、硫酸盐或碳酸盐)量高于35mM的土壤，例如高于：35mM,40mM,45mM,50mM,60mM,70mM,80mM,90mM,100mM,120mM,140mM,160mM,180mM,200mM,250mM,300mM,350mM,400mM,450mM,500mM或更高的盐量。特征为低水分的土壤包括取决于土壤类型具有0-0.18in3水/in3土壤的土壤，例如低于：0.18,0.17,0.16,0.15,0.14,0.13,0.12,0.11,0.10,0.09,0.08,0.07,0.06,0.05,0.04,0.03,0.02或0.01in3水/in3土壤。特征为低养分含量的土壤包括具有低于80lbs/英亩的养分(包括各自为20％的氮、磷和钾(NPK)，以及相关的微量元素养分)的土壤，例如低于：75,70,65,60,55,50,45,40,35,30,25,20,15,10或5lbs/英亩的养分。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使植物或植物种子在平均温度为或高于36℃生长，例如在36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50℃或更高的温度生长。在一些实施方案中，所述方法包括使植物种子在平均温度为或高于36℃发芽，例如在36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50或更高的温度发芽。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使植物或植物种子在平均温度为或低于15℃生长，例如在15,14,13,12,11,10,9,8,7,6,5或更低的温度生长。在一些实施方案中，所述方法包括使植物种子在平均温度为或低于15℃发芽，例如在15,14,13,12,11,10,9,8,7,6,5或更低的温度发芽。
在本文提供的任何方法的一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子。在一些实施方案中，农作物植物或农作物植物种子为西瓜,番茄,玉米,小麦,大豆,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎,木本植物,浆果或稻，或它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语意欲具有相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数参照物，除非上下文另外地清楚说明。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请均以引用方式并入本文，如同每一份单独的出版物或专利申请明确地且单独地指明以引用方式并入本文。
无需进一步的详细阐述，据信本领域技术人员可以基于上述描述，最大程度地利用本发明。因此，以下的具体实施方案应解释为仅是举例说明性的，并且无论如何不以任何方式限制本公开内容的其余部分。为了本文参考的目的或主题，本文引用的所有出版物均以引用方式并入本文。
实施例
实施例1.ThLm1作为有益共生体的分离和鉴定
ThLm1的分离和接种
哈茨木霉菌株ThLm1是由生长在华盛顿州的海滩上的草(禾本科)物种分离的。对这些植物的栖息地胁迫被鉴定为干旱、低土壤养分和升高的盐度。从SanJuanIslandArchipelago,WA的几个海滩栖息地收集滨麦(Leymusmollis)(沙丘草)植物。清洗植物直至除去土壤残渣，放置于塑料拉链锁袋子中，并按照之前所述进行表面灭菌(Redman等人,2001,2002a)。使用无菌技术，将植物切成代表根、根茎和茎的部分，铺板于真菌生长培养基[0.1XPDA(马铃薯葡萄糖琼脂)]上，并在冷荧光下在室温温育5-7天以允许真菌出现。当出现后，将所代表的优势植物内生真菌(X95％)的30个代表性分离物传代培养，并且在其中，按照之前所述对10个代表性分离物进行单孢子分离(Redman等人,1999)。所有10个代表性分离物均置于无菌1.5ml螺帽管中的无菌水(补充有50-100mg/ml氨苄青霉素)中，并放置在4℃用于长期储存。
使用ThLm1定植种子和植物
使用ThLm1接种几株测试植物。将玉米(Zeamays)和大豆(Glycinemax)种子在0.5-1.0％(v/v)次氯酸钠溶液中表面灭菌15-20分钟，并伴随温和的搅拌，使用10-20体积的无菌蒸馏水漂洗。这些植物物种代表2种主要的植物谱系—单子叶植物和真双子叶植物。然而，ThLm1还与许多其它的植物(包括蔬菜(例如番茄,葫芦科植物,胡椒,豌豆,豆,草地,绿叶蔬菜等),主要农作物(例如小麦,稻,大麦,块茎),草和木本植物)建立共生关系，所述这些植物均按照针对玉米和大豆所描述的使用ThLm1定植来进行处理。可以通过使用孢子的液体或粉末配制物(10-10000个孢子/种子)直接处理(喷雾、浸泡、混合或浇水)种子、幼体、幼苗或较老阶段的植物来使植物建立与ThLm1的共生关系。可以将孢子施加在植物的任何部分上，其中通过接种较低的茎和根获得最佳的结果。
发现ThLm1与接种ThLm1的许多植物物种(包括农作物植物和原生植物)建立了共生关系。发现接种ThLm1赋予胁迫耐受性。接种ThLm1的并具有改善的胁迫耐受性的植物的概括示于表2中。
表2.接种ThLm1的植物
在不存在胁迫的情况下ThLm1增加植物生长和健康
将玉米植物接种或不接种ThLm1，并使其在温室中在不存在胁迫的情况下生长1个月。然后，将玉米植物分成根和苗部分用于湿重测量。重量测量的统计学分析显示接种ThLm1的植物(与ThLm1共生的)比未接种的植物显著更大(ANOVA,P<0.05,图1)。
还在接种或未接种ThLm1的玉米植物中测量玉米的生长和产率。在不存在胁迫的情况下，成熟的温室植物进一步生长以产生玉米穗(产率)用于湿重测量。统计学分析显示，接种ThLm1的植物(与ThLm1共生的)产生比未接种的植物显著更高的产率(N＝48；P>0.05,图2)。
进一步测量在不存在胁迫的情况下生长的ThLm1接种的玉米中的玉米生长和产率增加。将在不存在胁迫的情况下生长的成熟温室植物分成全株重量(生物量)或玉米穗(产率)用于湿重测量。统计学分析显示接种ThLm1的植物(与ThLm1共生的)比未接种的植物显著更大(N＝48；P>0.05,图3)。
还测量了ThLm1接种的植物的种子发芽增强。在植物生长恒温器和温室中测量了在胁迫存在和不存在情况下的玉米种子发芽。统计学分析显示接种ThLm1的种子(与ThLm1共生的)具有比未接种的(NS)种子显著更高的发芽率(N＝100；SD<5；P<0.05,图4,22-25)。
还测量了ThLm1接种的植物的叶绿素含量。测量了在不存在胁迫的情况下生长的成熟温室玉米植物的叶绿素含量％。统计学分析显示ThLm1接种的植物(与ThLm1共生的)具有比未接种的植物更高的叶绿素含量(N＝9；P>0.05,图5,13,14)。作为一般性观察，ThLm1接种的植物看起来比未接种的植物更绿并且更健壮。
这些数据显示植物的ThLm1接种在不存在胁迫的情况下普遍增加植物健康，包括植物生长、产率、发芽率和叶绿素含量。
在存在胁迫的情况下ThLm1增加植物生长和健康
还测试了胁迫条件以确定接种ThLm1的植物是否比未接种ThLm1的植物更健康。在暴露于干旱胁迫的玉米植物中测量根和苗重量，所述玉米植物预先接种或未接种了ThLm1。使60日龄的玉米植物暴露于无胁迫(每2天充分浇水)、中等的干旱胁迫(每4天浇水)或高度的干旱胁迫(每7天浇水)。然后，针对来自高度干旱暴露的植物的生物量(根和苗)来评估植物。将植物分成根和苗部分用于湿重测量。统计学分析显示，接种ThLm1(与ThLm1共生的)比未接种的植物显著更大(N＝36；P>0.05,图6A)。
还在暴露于低养分胁迫的玉米植物中进行根和苗的测量，所述玉米植物预先接种或未接种了ThLm1。对1周龄的玉米植物给予具有养分的初始浇水(基于氮、磷和钾的植物肥料，NPK)，此后，在试验过程中(大约90天)，每2天将植物暴露于无养分胁迫(具有完全强度NPK的浇水)或低养分胁迫(具有1/4强度NPK的浇水)。然后针对生物量(根和苗)来评估植物。将植物分成根和苗部分用于湿重测量。统计学分析显示接种ThLm1的植物(与ThLm1共生的)比未接种的植物显著更大(N＝36；P>0.05,图6B)。
在盐胁迫下在预先接种或未接种ThLm1的玉米植物中进行重量测量。将60日龄的植物每2天暴露于无盐胁迫(使用标准水平的NPK浇水)或盐胁迫(在标准的NPK溶液中具有200mMNaCl)，持续30天。测量植物湿重。统计学分析显示接种ThLm1的植物(与ThLm1共生的)比未接种的植物显著更大(N＝36；P≥0.05,图7)。
在预先接种或未接种ThLm1的稻幼苗中测量寒冷胁迫耐受性。将稻幼苗暴露于冷水胁迫。2周后，针对根和苗生物量(湿重g)评估稻幼苗。接种ThLm1的稻具有显著更大的根和苗(N＝10；P<0.05,图8)。
还实施在干旱胁迫下的田地评价。使植物在Michigan,USA的旱地栽培下生长，并使其暴露于50年中最严重的干旱。针对每个样地包含120株玉米植物的4个重复样地获得产率数据。接种ThLm1的植物(与ThLm1共生的)产生比未接种的植物平均85％更高的产率，图9。
这些数据显示ThLm1的接种改善在胁迫条件(包括干旱、低养分、温度和盐胁迫)下的植物健康，例如生长和产率。
总结
总之，数据显示ThLm1的接种增加种子发芽率和幼苗生长，赋予对各种胁迫(盐、温度、干旱、养分)的耐受性，增强总体健壮性和健康(例如叶绿素％增加)，以及增加产率。此外，发现(数据未显示)ThLm1在竞争植物定植中能够竞争性地胜出其它的微生物，并且通过这样的行为，能够在广泛的农作物植物(例如大豆、稻和玉米)中，阻碍病原生物体的进入(由此降低疾病的发生率)。接种后ThLm1提供给植物的益处的列表概述于表3中。
表3.ThLm1接种的植物的益处
实施例2.具有ThLm1的植物的分离和接种
ThLm1的分离
为了分离ThLm1，清洗植物直至除去土壤残渣，放置于塑料拉链锁袋子中，并按照之前所述进行表面灭菌(Redman等人,2001,2002a)。使用无菌技术，将植物切成代表根、根茎和茎的部分，铺板于真菌生长培养基[0.1XPDA(马铃薯葡萄糖琼脂，Difco)]上，并在冷荧光下在室温温育5-7天，以允许真菌出现。在出现后，将所代表的优势植物内生真菌的30个代表性分离物传代培养，并且在其中，按照之前所述对10个代表性分离物实施单孢子分离(Redman等人,1999)。所有10个代表性分离物均置于无菌1.5ml螺帽管中的无菌水(补充有50-100mg/ml氨苄青霉素)中，并放置在4℃用于长期储存。
培养ThLm1
在0.1X马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(Difco)上培养ThLm1。所述培养基补充有50-100ug/ml氨苄青霉素、四环素和链霉素，并使真菌培养物以12hr光照方案在22℃生长。在生长5-14天后，通过加入10ml无菌水并使用无菌载玻片轻柔地刮掉孢子而从平板收获分生孢子。使用无菌水将孢子的最终体积调节至100ml，过滤通过4层无菌粗棉纱布，并将孢子浓度调节至104-105个孢子/ml。
ThLm1的鉴定
利用分生孢子梗和分生孢子形态学来鉴定真菌(Arx,1981；BarnettandHunter,1998；LeslieandSummerell,2005)。在来自滨麦的分离物在显微镜下被鉴定为相同的真菌物种后，随机地选择3个分离物用于分子物种鉴定。物种的指定基于rDNA的可变ITS1和ITS2序列[ITS4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’；SEQIDNO:1)/ITS5(5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’；SEQIDNO:2)引物]和翻译延长因子[EF1T(5’-atgggtaaggaggacaagac-3’；SEQIDNO:3)/EF2T(5’-ggaagtaccagtgatcatgtt-3’；SEQIDNO:4)以及EF11(5’-gtggggcatttaccccgcc-3’；SEQIDNO:5)/EF22(5’-aggaacccttaccgagctc-3’；SEQIDNO:6)引物(O’Donnell等人,2000；White等人,1990)]的序列分析。按照之前所述，从菌丝体提取DNA并进行PCR扩增(Rodriguez,1993；RodriguezandYoder,1991)。将PCR产物测序并针对GenBank数据库进行BLAST检索。形态学和GenBank分析鉴定该3个分离物/种类为相同的物种(哈茨木霉)，并就植物益处测试所有的分离物。
哈茨木霉菌株ThLm1的益处
进行一系列研究以评估哈茨木霉菌株ThLm1对单子叶植物(玉米)和真双子叶植物(大豆和/或番茄)的益处，以证明该真菌与两种谱系的植物建立有益的共生关系。
在不存在胁迫的情况下ThLm1增加植物生长和健康
首先，在不具有胁迫条件的情况下进行试验，以测定ThLm1接种的植物在不存在胁迫的情况下的总体植物健康，例如植物生长和发育。
在生长12周后，针对苗和根生物量评估接种或未接种ThLm1的玉米幼苗。在接种ThLm1的植物中观察到生长增强(N＝48；SD<6.8；P<0.050,图10)。此外，发现接种ThLm1的玉米产生更加伸展的具有更多侧根的根系统(图11)。
类似地，在生长13天后，针对苗和根的生物量评估接种或未接种ThLm1的大豆幼苗。在接种ThLm1的植物中观察到大豆幼苗的生长增强(N＝10；SD<10％；P<0.050,图12)。
针对叶绿素含量来评估接种或未接种ThLm1的玉米植物。采用SPAD测量，其指示叶绿素相对％。发现接种ThLm1的玉米植物具有比未接种的植物更高的叶绿素含量(N＝60,P<0.05,图13)。一般而言，接种ThLm1的玉米植物比未接种的植物具有更深的绿色。
类似地，针对叶绿素含量来评估接种或未接种ThLm1的大豆植物。接种ThLm1的大豆植物具有比未接种的植物显著更多的叶绿素(N＝10,SD<5％,P<0.05,图14)。
针对发芽来评估接种或未接种ThLm1的玉米种子。接种ThLm1的玉米种子具有更高的发芽％(N＝100；SD<5；P<0.05,图4)。
针对果实产率来评估接种或未接种ThLm1的玉米植物。针对玉米产率评估，合并6株玉米植物以测定穗的生产重量。ThLm1接种的植物产生比未接种的植物更多的果实(N＝6,P<0.05,图15)。
总之，这些数据显示在不存在胁迫的情况下，ThLm1接种赋予生长增强、更伸展的根系统、增加的叶绿素水平、更高的发芽率和更高的果实产率。
在存在胁迫的情况下ThLm1增加植物生长和健康
接着，在胁迫条件下进行试验以测定在存在胁迫的情况下ThLm1接种的植物的总体植物健康。
针对在低养分胁迫下的根质量、苗质量、幼苗重量和产率来评估接种或未接种ThLm1的玉米植物。对1周龄的玉米植物给予具有氮、磷、钾(NPK)的初始浇水，此后，在试验过程(大约90天)中，将植物每2天暴露于无NPK胁迫(具有完全强度NPK的浇水)、低NPK胁迫(具有1/2强度NPK的浇水)或高NPK胁迫(具有1/4强度NPK的浇水)。然后，针对产率和生物量(根和苗)来评估植物。ThLm1接种的植物在低养分胁迫下具有比未接种的植物更高的根质量、苗质量、幼苗重量和产率(N＝12-60；SD<10％,P<0.05,图16)。
针对在干旱胁迫下的根质量、苗质量和产率来评估接种或未接种ThLm1的玉米植物。将60日龄的玉米植物暴露于无胁迫(每2天充分浇水)或高度干旱的胁迫(每7天浇水)。然后，针对产率和生物量(根和苗)来评估植物。ThLm1共生的植物在干旱胁迫下具有比NS植物更高的根质量、苗质量和产率(N＝12-60；SD<10％,P≤0.05,图17)。
针对在盐胁迫下根和苗生物量来评估接种或未接种ThLm1的大豆植物。将8株接种的和8株未接种的幼苗暴露于盐(300mM)，持续2周。接种的植物产生显著更多的苗和根生物量(图18)。在研究结束时，未接种的植物的叶是萎蔫的，而接种的植物保持健康。
针对在盐胁迫下的根和苗生物量来评估接种或未接种ThLm1的玉米植物。将8株接种的和8株未接种的幼苗暴露于盐(300mM)，持续2周。接种的植物产生显著更多的苗和根生物量(图19)。在研究结束时，未接种的植物的叶是萎蔫的，而接种的植物保持健康。
针对在高温胁迫下的生长来评估接种或未接种ThLm1的玉米植物。在暴露于高温(45-50℃)2周后，测量生长。ThLm1接种的植物在热胁迫下比未接种的植物生长得更多(图20)。未接种的植物是萎蔫的，而接种的植物保持健康。
针对在高温胁迫下的生长来评估接种或未接种ThLm1的番茄植物。在暴露于高温(45-50℃)2周后，测量生长。ThLm1接种的植物在热胁迫下比未接种的植物生长得更多(图21)。未接种的植物是萎蔫的，而接种的植物保持健康。
针对在高温(50-55℃)胁迫下的发芽来评估使用ThLm1处理或未使用ThLm1处理的玉米种子。使用ThLm1处理的种子(N＝15)比未处理的对照种子显著更好地发芽(图22)。
针对在高温(50-55℃)胁迫下的发芽来评估使用ThLm1处理或未使用ThLm1处理的大豆种子。使用ThLm1处理的种子(N＝15)比未处理的对照种子显著更好地发芽(图23)。
针对在低温胁迫下的发芽来评估使用ThLm1处理或未使用ThLm1处理的玉米种子。将玉米种子暴露于寒冷温度(5℃)144小时。使用ThLm1处理的种子(N＝30)比未处理的对照种子显著更好地发芽(图24)。
针对在低温胁迫下的发芽来评估使用ThLm1处理或未使用ThLm1处理的大豆种子。将大豆种子暴露于寒冷温度(5℃或15℃)72小时。使用ThLm1处理的种子(N＝30)比未处理的对照种子显著更好地发芽(图25)。
总之，这些数据表明使用ThLm1的接种改善在胁迫条件例如干旱、盐、高温和低温下的植物健康和生长，包括根和苗质量、产率和发芽。
在胁迫存在和不存在的情况下ThLm1增加光合效率
光合效率(Qmax)是在光合作用的过程中转化为化学能的光能的分数。在胁迫存在或不存在的情况下使用ThLm1的几项研究表明使用ThLm1处理植物在单子叶植物和真双子叶植物中使得Qmax增加，例如在图39A-39C中对于玉米所显示的。
在胁迫存在和不存在的情况下ThLm1增加农作物产率
使用(配制的ThLm1)接种的和未接种的玉米、稻、谷物和草的种子在8个州中进行为期2年的田地测试(图40-44)。在高度干旱和盐胁迫的条件、或者极低的胁迫水平(正常的生长季节)下进行田地测试。在所有条件下增加农作物产率，尽管在高胁迫水平下观察到更高的产率增加。不论土壤类型和气候带，均发生产率增加。
总结
总之，数据显示使用ThLm1的接种增加种子发芽率和植物生长，赋予针对各种胁迫(盐、温度、干旱、养分)的耐受性，增强总体健壮性和健康(例如增加叶绿素％)以及增加产率。
实施例3.哈茨木霉分离物对增加胁迫耐受性、增加发芽和排斥其 它真菌的作用
使用从多个地理位置(菌株中16种的来源记录于表4中)分离的哈茨木霉菌株，通过使用上述实施例中描述的方法来评估除了ThLm1以外的哈茨木霉菌株的益处。
图4：所用的哈茨木霉菌株的地理学多样性
针对由地理学不同的哈茨木霉分离物赋予植物的干旱胁迫耐受性、盐胁迫耐受性、温度耐受性(热和冷耐受性)和低养分耐受性的结果描绘于图26-38、45-48、50和51中。并非所有的地理学不同的哈茨木霉分离物均用于每一个试验或条件，但结果清楚地支持哈茨木霉一般性地用于增加针对各种胁迫的耐受性的用途。
针对在高温胁迫下的生长来评估接种或未接种地理学不同的哈茨木霉分离物的大豆植物。在暴露于高温(45-50℃)2周后，测量生长。接种地理学不同的哈茨木霉分离物的植物在热胁迫下具有比未接种的植物增加的叶的叶绿素水平和更高的植物生物量(图45和46)。
针对在低养分胁迫下的幼苗重量来评估接种或未接种地理学不同的哈茨木霉分离物的大豆或玉米植物。对1周龄的大豆或玉米植物给予具有氮、磷、钾(NPK)的初始浇水，此后，在试验过程(大约90天)中，将植物每2天暴露于无NPK胁迫(具有完全强度NPK的浇水)、低NPK胁迫(具有1/2强度NPK的浇水)或高NPK胁迫(具有1/4强度NPK的浇水)。然后，针对幼苗重量来评估植物。接种地理学不同的哈茨木霉分离物的植物在低养分胁迫下具有比未接种的植物更高的幼苗重量(图47为大豆；图48为玉米)。
此外，在预先接种或未接种地理学不同的哈茨木霉分离物的玉米幼苗中测量寒冷胁迫耐受性。将玉米幼苗暴露于寒冷胁迫，然后针对幼体根长度进行评估。接种哈茨木霉的玉米具有统计学上更长的幼体(图50)。
类似地，在预先接种或未接种地理学不同的哈茨木霉分离物的大豆幼苗中测量寒冷胁迫耐受性。将大豆幼苗暴露于寒冷胁迫，然后针对幼体根长度进行评估。接种哈茨木霉的大豆幼苗具有统计学上更长的幼体(图51)。
在其它的试验中，使用本文所述方法学，对地理学不同的哈茨木霉分离物就它们对种子发芽的作用来进行测试，如图49所示。针对发芽来评估接种或未接种地理学不同的哈茨木霉分离物的大豆种子。接种地理学不同的哈茨木霉分离物的大豆种子具有比未处理的大豆种子显著更高的发芽％(图49)。结果支持哈茨木霉一般性地用于增加种子发芽的用途。
在其它的试验中，对16种地理学不同的哈茨木霉分离物就它们对在植物中建立非哈茨木霉的真菌的作用进行测试。使用分离的哈茨木霉分离物或其孢子接种种子或幼苗，并使该种子或幼苗生长。评价不是所接种的哈茨木霉分离物的真菌的生长。结果支持哈茨木霉一般性地用于减少非哈茨木霉的真菌在从所接种的种子或幼苗生长的植物中的建立的用途。
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其它实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行结合。本说明书中公开的每个特征可以被用作相同的、等价的或相似的目的的备选特征替代。因此，除非另外作出明确的陈述，否则所公开的每个特征仅是一系列通用等价或相似特征的实例。
根据上文的描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所述技术人员可以对本发明作出多种改变和修改，以使其适用于不同的使用和条件。因此，其它实施方案也在权利要求书的范围内。

Claims (44)

1.一种分离的哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其后代或孢子，所述哈茨木霉菌株ThLm1真菌保藏于美国农业研究菌种保藏中心，专利保藏指定编号为NRRL50846。
2.一种组合物，其包含权利要求1所述的哈茨木霉菌株ThLm1真菌和/或其后代和/或孢子。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述组合物为液体或粉末。
4.一种用于促进胁迫耐受性和/或增强植物生长或种子发芽的方法，所述方法包括：
使用权利要求1所述的分离的哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其孢子或后代、或者权利要求2所述的组合物接种植物或植物种子。
5.权利要求4所述的方法，其中所述胁迫耐受性为干旱耐受性、盐耐受性、养分减少耐受性、真菌耐受性和/或温度耐受性。
6.权利要求4所述的方法，其中增强的植物生长或种子发芽包括大小、根发育的程度、种子的发芽率、叶绿素含量/水平、光合效率、产率或质量的增加。
7.权利要求4-6的任意一项所述的方法，其中接种植物包括使用哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其孢子或后代定植所述植物的根和/或茎。
8.权利要求4-7的任意一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述植物或植物种子生长。
9.权利要求8所述的方法，其中所述植物或植物种子在特征为高盐度、低水分和/或低养分含量的土壤中生长。
10.权利要求8所述的方法，其中所述植物或植物种子在特征为高盐度和/或低养分含量的水中生长。
11.权利要求8-10的任意一项所述的方法，其中所述植物或植物种子在平均温度为或高于35℃、或者平均温度为或低于15℃生长或发芽。
12.权利要求4-11的任意一项所述的方法，其中所述植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子。
13.权利要求12所述的方法，其中所述农作物植物或农作物植物种子为西瓜,番茄,玉米,小麦,大豆,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎,浆果,木本植物或稻，或者它们的种子。
14.权利要求4-11的任意一项所述的方法，其中所述植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
15.一种植物或植物种子，其接种有权利要求1所述的分离的哈茨木霉菌株ThLm1真菌或其孢子或后代、或者权利要求2所述的组合物。
16.权利要求15所述的植物或植物种子，其中所述植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子。
17.权利要求16所述的植物或植物种子，其中所述农作物植物或农作物植物种子为西瓜,番茄,玉米,小麦,大豆,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎,浆果,木本植物或稻，或它们的种子。
18.权利要求15所述的方法，其中所述植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
19.一种用于增加胁迫耐受性的方法，所述方法包括：
使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含所述分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物或植物种子，由此增加所接种的植物的胁迫耐受性。
20.权利要求19所述的方法，其中所述胁迫为干旱、盐升高、养分减少和/或温度胁迫。
21.权利要求19所述的方法，其中所述胁迫不是多环芳香烃、环烷酸或高pH的存在。
22.权利要求19至21的任意一项所述的方法，其中接种植物包括使用哈茨木霉菌株真菌或其孢子或后代定植所述植物的根、茎和/或叶。
23.权利要求19至22的任意一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述植物或植物种子生长。
24.权利要求23所述的方法，其中所述植物或植物种子在特征为高盐度、低水分和/或低养分含量的土壤中生长。
25.权利要求24所述的方法，其中所述高盐度为超过35mM的盐量。
26.权利要求24所述的方法，其中所述低水分含量为0-0.18in3水/in3土壤。
27.权利要求24所述的方法，其中所述低养分含量为低于80lbs/英亩的养分，其中所述养分包含各20％的氮、磷和钾，以及相关的微量元素养分。
28.权利要求24所述的方法，其中所述植物或植物种子在特征为高盐度和/或低养分含量的水中生长。
29.权利要求24所述的方法，其中所述植物或植物种子在平均温度为或高于35℃、或者平均温度为或低于15℃生长或发芽。
30.权利要求19至29的任意一项所述的方法，其中所述植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子。
31.权利要求30所述的方法，其中所述农作物植物或农作物植物种子为西瓜,番茄,玉米,小麦,大豆,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎,浆果,木本植物或稻，或者它们的种子。
32.权利要求19至29的任意一项所述的方法，其中所述植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
33.权利要求19至32的任意一项所述的方法，其中所述哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-1或菌株T-22。
34.一种用于增加种子发芽的方法，所述方法包括：
使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含所述分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物种子，由此增加所接种的种子的发芽。
35.权利要求34所述的方法，其中使用杀真菌剂和/或杀昆虫剂预先、同时和/或随后处理所述植物种子。
36.权利要求34至35的任意一项所述的方法，其中所述植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子。
37.权利要求36所述的方法，其中所述农作物植物或农作物植物种子为西瓜,番茄,玉米,小麦,大豆,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎,浆果,木本植物或稻，或者它们的种子。
38.权利要求34至35的任意一项所述的方法，其中所述植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
39.权利要求34-38的任意一项所述的方法，其中所述哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-1或菌株T-22。
40.一种用于减少植物中非哈茨木霉的真菌的建立的方法，所述方法包括：
使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含所述分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物种子或幼苗，由此减少从所接种的种子或幼苗生长的植物中非哈茨木霉的真菌的建立。
41.权利要求40所述的方法，其中所述植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子。
42.权利要求41所述的方法，其中所述农作物植物或农作物植物种子为西瓜,番茄,玉米,小麦,大豆,葫芦科植物,胡椒,绿叶蔬菜,大麦,棉花,豆,豌豆,块茎,浆果,木本植物或稻，或者它们的种子。
43.权利要求40所述的方法，其中所述植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科,百合科,杜鹃花科,杜鹃花属,禾本科或菊属。
44.权利要求40-43的任意一项所述的方法，其中所述哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-1或菌株T-22。
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