ES2962935T3 - Nueva cepa de Methylobacterium sp., composiciones que la comprenden, y su uso como bioestimulante y bacteria fijadora del nitrógeno endófito - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere al campo agronómico. Específicamente, se refiere a Mmethylobacterium sp. nov. cepa, depositada con el número de acceso CECT 9580, a las composiciones que la comprenden, y a su uso como bioestimulante y bacteria endófita fijadora de nitrógeno en plantas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nueva cepa deMethylobacteriumsp., composiciones que la comprenden, y su uso como bioestimulante y bacteria fijadora del nitrógeno endófito
Campo de la invención
La presente invención está relacionada con el campo agronómico. Específicamente, versa sobre una nueva cepa deMethylobacteriumsp., sobre composiciones que la comprenden y sobre su uso como bioestimulante y bacteria fijadora del nitrógeno endófito en plantas.
Técnica antecedente
En el campo de la agricultura se conocen muchos fertilizantes. En particular, se usan comúnmente fertilizantes a base de nitrógeno, tales como amoniaco, nitrato de amonio (NH4NO3) y urea, para mantener el rendimiento del cultivo lo más alto posible. De hecho, muchos procesos biológicos en plantas involucran el nitrógeno; por ejemplo, el nitrógeno está implicado en la producción de aminoácidos y, por lo tanto, de proteínas.
Sin embargo, solo se convierte en materia vegetal una fracción de los fertilizantes a base de nitrógeno que se aplican a los cultivos. La cantidad de fertilizante que no se convierte en materia vegetal puede acumularse en el suelo o puede fluir hacia las aguas superficiales o hacia el agua subterránea, causando con ello la contaminación del agua.
Para reducir el uso de fertilizantes químicos, pueden usarse inoculantes que incluyen bacterias fijadoras del nitrógeno para remplazar parcialmente tales fertilizantes químicos.
Los principales reservorios de bacterias metilotróficas son, generalmente, el suelo y el agua (tanto dulce como salada), pero estas bacterias también están presentes en una amplia variedad de entornos naturales y artificiales, incluyendo el polvo, sedimentos lacustres, aire, cremas faciales, productos fermentados, redes de abastecimiento de agua, cuartos de baño y sistemas de aire acondicionado.
Sin embargo, los inoculantes conocidos no permiten resultados satisfactorios en el estímulo del crecimiento de las plantas y tampoco permiten la sustitución de los fertilizantes químicos, ni una reducción significativa en el uso de tales productos químicos.
La mayoría de los microorganismos conocidos que actúan como estimulantes del crecimiento y/o fijadores del nitrógeno no son capaces de producir un contenido significativo de nitrógeno para reducir significativamente las unidades de nitrógeno necesarias para el crecimiento de las plantas. Estos microorganismos conocidos producen algunos tipos de auxinas, como el ácido indolacético y promueven más el enraizamiento que la fijación de nitrógeno.
El documento US 2015/101373 A1 da a conocer elMethylobacteriumNRRL B-50628 y NRRL B-50629, fijador del nitrógeno y promotor del crecimiento de plantas.
El documento KR 2007 0106867 A da a conocer elMethylobacterium fujisawaenseCBMB 20, fijador del nitrógeno y promotor del crecimiento de plantas.
El documento US 2018/168167 A1 da a conocer el hongoGlomus iranicumvar.tenuihypharumBCCM 54871, promotor del crecimiento de plantas.
SI-WON LEE Y OTROS: “Methylobacterium dankookense sp. nov., isolated from drinking water”, THE JOURNAL OF MICROBIOLOGY, vol. 47, n° 6, (2009-12-01), páginas 716-720, XP055350364, DOI: 10.1007/s12275-009-0126-6, da a conocer la actividad enzimática y la similitud genética delMethylobacterium dankookense.
Sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención es, por tanto, proporcionar una nueva cepa deMethylobacteriumsp., así como composiciones que la comprenden, para proporcionar un impacto positivo a los cultivos. Otro objetivo de la invención es proporcionar una nueva cepa deMethylobacteriumsp. que permite al menos reducir el uso de fertilizantes químicos a base de nitrógeno. La nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580, logra estos y otros objetivos.
Descripción detallada
En la siguiente descripción se describirán las características de la invención con referencia a realizaciones ejemplares; sin embargo, cualquier característica de la invención divulgada en el presente documento puede ser combinada con una o más características adicionales dadas a conocer en el presente documento para proporcionar realizaciones adicionales de la presente invención. Se considerará que tales realizaciones son divulgadas por la presente solicitud.
Un objeto de la presente invención es, por tanto, una nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580.
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención, identificada por el depositante con la referencia SB0023/3, fue depositada el 21/03/2018 en la Autoridad Internacional de Depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valéncia, Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia), ESPAÑA, por Symborg S.L., con domicilio en el Campus de Espinardo, 7, edificio CEEIM, 30100 Murcia, España, con el número CEc T 9580.
La cepa de la invención fue aislada del interior de las esporas del hongo micorrízicoGlomus iranicumvar. tenuihypharum. ElGlomus iranicumvar. tenuihypharum es un hongo micorrízico arbuscular que se conoce por méritos propios en la técnica. ElGlomus iranicumvar. tenuihypharum fue depositado el 19/04/2013, con el número de entrada BCCM 54871 en la Autoridad Internacional de Depósito Belgian Coordinated Collections of Micro-Organisms (BCCM), sita en la Universidad Católica de Lovaina, Mycothéque de l'Université catholique de Louvain (MUCL), Croix du Sud 2, Box L7.05.06, 1348 Louvain-la-Neuve, por Symborg, S.L.
ElGlomus iranicumvar. tenuihypharum es dado a conocer en los documentos WO2015/000612 y WO2015/000613.
La cepa según la invención muestra gran similitud con elMethylobacterium dankookense(98,7% en función de la secuencia del gen 16S).
Un análisis filogenómico mediante UBCG demostró que elMethylobacterium dankookensees el pariente más próximo de la cepa de la invención. Los datos recopilados respaldaron la creación de una nueva especie para acomodar la cepa de la invención, para la cual podría proponerse, por ejemplo, el nombreMethylobacterium symbioensenov.
Para demostrar si podía ser considerado una nueva especie, se ensayó su caracterización fenotípica y genotípicamente.
La cepa de la invención es gramnegativa, estrictamente aeróbica, tiene la forma de un bacilo (0,8-1 pm de anchura y 1,2-1,6 pm de longitud) con un flagelo lateral, mostrado individualmente o en pares de dos en dos, sin formación alguna de esporas. Las colonias cultivadas en agar MMM o agar NFbM entre 5 y 7 días son circulares, de color rosado con un borde claro definido que no ha sido descrito en otras cepas similares. Tiene una temperatura óptima de 28°C. En presencia de NaCl, la tasa de desarrollo se redujo hasta un 3% de NaCl o superior, cuando ya no se desarrolla.
Se logró un planteamiento filogenético multigénico basado en el genoma usando la herramienta UBCG para identificar mejor los parientes más cercanos de la cepa de la invención, CECT 9580. La posición de la cepa según la invención se exploró en un árbol UBCG que contenía 15 genomas del pariente dentro del género. El árbol (Figura 13) muestra una relación específica conM. dankookense.
Ventajosamente, según realizaciones, la cepa según la invención se caracteriza por el hecho de que es una bacteria fijadora del nitrógeno endófito capaz de proporcionar nitrógeno a una planta, permitiendo la reducción del aporte externo de nitrógeno hasta el 60%. En otras palabras, la cepa según la invención permite una reducción del aporte externo de nitrógeno hasta el 60% con respecto al aporte externo de nitrógeno que sería necesario en ausencia de dicha cepa.
Ventajosamente, la cepa de la invención es capaz de desplazarse por la planta desde las raíces a las hojas y viceversa.
Un proceso para el aislamiento de la cepa de la invención comprende las siguientes etapas:
• proporcionar una o más esporas deGlomus iranicum var. tenuihypharum;
•extraer el citoplasma de las esporas;
• inocular el citoplasma extraído en un medio que contenga metanol; y
• incubar el medio inoculado para cultivar la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención.
Según algunas realizaciones, el proceso para el aislamiento de la cepa de la invención comprende las siguientes etapas:
• aislar de las esporas deGlomus iranicum var. tenuihypharum,previamente desinfectadas superficialmente mediante un proceso de ciclos de desinfección externos, para obtener una solución de esporas;
• después de dicho proceso, se maceran las soluciones de esporas y se cultiva el citoplasma fúngico en un medio salino mínimo con metanol (MMM);
• se identifican colonias de la cepa de la invención, y se eligió y reaisló del medio una de las que presentaron color rosado.
Según algunas realizaciones, antes de extraer el citoplasma, las esporas son tratadas con un desinfectante para desinfectar las paredes exteriores de las esporas.
La desinfección de las paredes exteriores de las esporas se puede llevar a cabo según técnicas que son conocidas por méritos propios en la técnica. Por ejemplo, la desinfección de la pared exterior de las esporas se puede llevar a cabo tratando las esporas con hipoclorito de sodio (por ejemplo, una solución de hipoclorito de sodio al 5% en un tampón, por ejemplo Tween® 80).
La extracción del citoplasma de las esporas deGlomus iranicumvar. tenuihypharum se puede llevar a cabo según técnicas que son conocidas por méritos propios en la técnica; por ejemplo, macerando las esporas en un tampón adecuado, preferiblemente soluciones de Ringer.
Después de la inoculación del citoplasma extraído en un medio que contenga metanol (por ejemplo, el medio salino mínimo con metanol (MMM)). Preferiblemente, el medio que contiene metanol tiene la siguiente composición: metanol, 20,0 ml; NaNOa, 0,5 g; (NH4)2SO4, 0,5 g; MgSO4'7H2O, 0,5 g; K2HPO4, 1,0 g; FeSO4'7H2O, 0,01 g; C a C h ^ O , 0,01 g; KCl, 0,5 g; solución de vitaminas, 1,0 ml; solución de micronutrientes, 2,0 ml; agar, 12g; pH 7,20. El medio inoculado se incuba, preferiblemente a 28°C durante 5 días, para permitir el desarrollo de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención.
Según algunas realizaciones, la incubación se puede llevar a cabo a una temperatura que oscila entre 25°C y 30°C (preferiblemente a 28°C).
Según algunas realizaciones, la incubación se puede llevar a cabo a un pH que oscila entre 5 y 9 (preferiblemente 7). Después de la incubación y el desarrollo de la cepa de la invención, las colonias son identificadas visualmente mediante la producción del típico color rosado. Luego, se eligen y reaíslan una o más colonias, preferiblemente al menos tres veces para garantizar que estén libres de cualquier posible contaminación.
La cepa de la presente invención es adecuada para ser incluida en una composición.
Otro objeto de la presente invención es, por tanto, una composición que comprende una nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580.
Según algunas realizaciones, la composición de la invención puede comprender uno o más vehículos agrícolamente aceptables y/o uno o más coformulantes agrícolamente aceptables.
En la técnica se conocen por méritos propios vehículos agrícolamente aceptables y coformulantes agrícolamente aceptables.
Según algunas realizaciones, los vehículos y/o los coformulantes se seleccionan del grupo constituido por talco, arcilla, maltodextrina, leche desnatada, glucosa, extractos secos vegetales, como los de té, yuca y quinua, caolín, fibra de coco, tierra de diatomeas, quitina, CaCO3, alginato, carragenos, surfactina, ramnolípido, soforolípido, saponina, oleato de potasio y mezclas de los mismos.
Según algunas realizaciones, la composición puede estar en forma sólida, forma líquida acuosa, forma líquida oleosa, forma de emulsión, forma semisólida o en forma de gel.
Preferiblemente, la composición está en forma sólida; más preferiblemente, la composición está en forma de polvo. También es objeto de la invención un proceso para la producción de una composición que comprende la cepa de la invención; es decir, la nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580. Según algunas realizaciones, la composición de la invención se caracteriza por el hecho de que es aplicada como recubrimiento de semillas, mediante aplicación en el suelo; por ejemplo, mediante un sistema de riego por goteo o por empapamiento, o mediante aplicación foliar.
El proceso para producir la composición de la invención comprende las siguientes etapas:
• proporcionar al menos una nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580 según la invención,
• inocular dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. en un medio líquido de cultivo que incluya metanol,
• cultivar dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. para obtener un cultivo líquido que comprendeMethylobacteriay;
•secar dicho cultivo líquido para obtener una composición seca.
Ventajosamente, al final de la etapa de cultivo, se confirma la producción final deMethylobacteriade la invención mediante la medición de la densidad óptica de las bacterias en el cultivo y en la producción de biomasa.
Según algunas realizaciones, el medio que incluye metanol es MMMM, es decir, medio mineral mínimo con metanol.
Según algunas realizaciones, dicha etapa de cultivo de dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. para obtener un cultivo líquido que comprendaMethylobacteriase puede llevar a cabo por incubación a una temperatura que oscila entre 25°C y 30°C (preferiblemente a 28°C) durante 3-10 días, preferiblemente durante 5-7 días.
Según algunas realizaciones, la etapa anteriormente mencionada de proporcionar al menos una nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención puede comprender una etapa de recuperación de la cepa de la invención usando un medio libre de nitrógeno; por ejemplo, NFBG (medio bacteriano carente de nitrógeno complementado con glucosa, por sus siglas en inglés). Por ejemplo, el medio NFBG puede tener la siguiente composición: glucosa, ácido málico 5,0 g, metanol 20,0 ml, (NH4^MoyO244H2O 0,002 g, MgSO47H2O 0,2 g, K2HPO40,1 g, KH2PO40,4 g, FeCla 0,01 g, NaCl 0,1 g, KOH 4,8 g, solución de micronutrientes 2,0 ml, solución de vitaminas 1,0 ml, solución de azul de bromotimol al 0,5% en KOH 2N 2,0 ml, pH 6,9.
Según algunas realizaciones, la recuperación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención usando un medio carente de nitrógeno se puede llevar a cabo por incubación a una temperatura que oscila entre 25°C y 30°C (preferiblemente a 28°C) durante 3-10 días, preferiblemente durante 5-7 días.
Ventajosamente, la cepa de la invención forma colonias de color rojo-rosado. Así pueden identificarse fácilmente las colonias de la cepa de la invención.
Según algunas realizaciones, la etapa anteriormente mencionada de proporcionar al menos una nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención puede comprender, además, una etapa de selección de una colonia de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención y de desarrollo selectivo de dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. usando un medio carente de nitrógeno que incluya metanol (por ejemplo, MMMNF, medio mineral mínimo con metanol carente de nitrógeno, por sus siglas en inglés).
Según algunas realizaciones, después del desarrollo selectivo usando un medio carente de nitrógeno que incluya metanol, puede seleccionarse e inocularse una colonia de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en un medio líquido de cultivo que incluya metanol. Según algunas realizaciones, la referida etapa de desarrollo selectivo se puede llevar a cabo por incubación a una temperatura que oscila entre 25°C y 30°C (preferiblemente a 28°C) durante 3-10 días, preferiblemente durante 5-7 días.
Según algunas realizaciones, la etapa anteriormente mencionada de cultivo de dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. para obtener un cultivo líquido que comprendaMethylobacteriase puede llevar a cabo por fermentación.
Según algunas realizaciones, la etapa anteriormente mencionada de cultivo de dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. para obtener un cultivo líquido que comprendaMethylobacteriapuede comprender una primera etapa de desarrollo para obtener un cultivo de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. para ser usado como preinóculo, y una segunda etapa de desarrollo masivo, preferiblemente por fermentación.
Un objeto adicional de la presente invención es el uso de la nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580 de la invención, como bioestimulante y/o bacteria fijadora del nitrógeno endófito en plantas.
De hecho, se ha observado con sorpresa que la cepa de la invención, así como la composición que la comprende, es capaz de estimular la planta para que aumente la salud y el rendimiento de la planta.
Ventajosamente, también se ha observado con sorpresa que la cepa de la invención, así como la composición que la comprende, puede ser usada para proporcionar nitrógeno a las plantas. En particular, se ha observado que, al proporcionar la cepa de la presente invención a una planta, puede reducirse sustancialmente el uso de fertilizantes químicos nitrogenados; por ejemplo, se ha observado que, usando la cepa de la invención, o una composición que la comprenda, puede obtenerse una reducción en la cantidad de fertilizante químico nitrogenado de hasta el 60%.
Ventajosamente, la cepa de la invención puede ser proporcionada sola a una planta, o como un componente de una composición que incluya otros componentes agrícolamente aceptables.
Se ha observado que la cepa de la invención puede estimular a la planta desde la raíz y/o la parte aérea fijando el nitrógeno atmosférico. Sin desear limitarnos a una explicación científica específica, se ha observado que la cepa de la invención penetra en los tejidos de la planta y activa un sistema enzimático microbiano que comprende un complejo de la enzima nitrogenasa, que reduce el nitrógeno atmosférico produciendo NH4+, que podría incorporarse directamente al Glu (ácido glutámico) por aminación del 2-oxoglutarato a través de la Glu deshidrogenasa mitocondrial (NADH-GDH) y, posteriormente, a la glutamina por medio de la glutamina sintetasa citosólica 1 (GS1), en condiciones fisiológicas particulares. La glutamina oxoglutarato aminotransferasa es una enzima, abreviada frecuentemente GOGAT, que produce glutamato a partir de glutamina y a-cetoglutarato y, junto con la glutamina sintetasa, desempeña un papel central en la regulación de la asimilación del nitrógeno por parte de la planta a través de la fotosíntesis.
Ventajosamente, también se ha observado que la cepa de la presente invención aumenta la solubilidad del fósforo (lo cual es particularmente útil en las fases de planta de semillero), es capaz de producir auxinas y carotenos, que estimulan el desarrollo de raíces secundarias.
Ventajosamente, la cepa de la invención puede ser proporcionada a diversos cultivos.
Por ejemplo, la cepa de la presente invención es particularmente útil cuando es proporcionada a cultivos hortícolas, gramíneas, cultivos cítricos, cultivo de frutas de hueso (drupa), cultivos vitícolas y silvicultura.
Otra ventaja de la cepa de la presente invención es que favorece la fotosíntesis en la planta anfitriona y, por lo tanto, un aumento en la biomasa vegetal.
Breve descripción de las figuras
• La Figura 1 muestra plantas que crecen en alvéolos en una cámara de crecimiento.
• La Figura 2 ilustra muestras de tejidos vegetales (raíces (a), tallos (b) y hojas (c)) expuestas a medios de cultivo específicos después de su desinfección para el desarrollo de metilobacterias.
• La Figura 3 muestra imágenes de muestras de tejidos vegetales de plantas tratadas con la cepa de la invención mediante recubrimiento de semillas (a-c), mediante riego (d-f) y aplicación foliar (g-i), expuestas a un medio nutriente específico para las metilobacterias.
• La Figura 4 muestra imágenes de la distribución de experimentos con el tratamiento 1, con la cepa de la invención, y el tratamiento 2, de control. Sembrado 1 (a), Sembrado 2 (b), Sembrado 3 (c).
• La Figura 5 muestra un gráfico con mediciones de ADPS tras 30 días de aplicación.
• La Figura 6 muestra el índice NDVI para el Sembrado 1 (a), el Sembrado 2 (b) y el Sembrado 3 (c).
• La Figura 7 muestra el índice CIR combinado para el Sembrado 1 (a), el Sembrado 2 (b) y el Sembrado 3 (c). • La Figura 8 muestra imágenes de la distribución de experimentos con el tratamiento 1, con la cepa de la invención, y el tratamiento 2, de control. Sembrado 1 (a), Sembrado 2 (b).
• La Figura 9 muestra un gráfico con mediciones de ADPS tras 30 días de aplicación.
• La Figura 10 muestra el índice NDVI en el Sembrado 1 tras 45 días de tratamiento, medido cada 15 días.
• La Figura 11 muestra el índice NDVI en el Sembrado 2 tras 45 días de tratamiento, medido cada 15 días.
• La Figura 12A muestra el nebulizador en el momento de aplicación del tratamiento o los tratamientos y la Figura 12B muestra el tamaño de los granos en el momento de aplicación del tratamiento o los tratamientos. •
• La Figura 13 muestra un árbol filogenético generado con UBCG usando secuencias de aminoácidos. Los números en los nodos indican el índice soporte génico (el valor máximo es 92). Los números de acceso al genoma están indicados entre paréntesis. Barra, 0,05 sustituciones por posición.
Sección experimental
Se ilustrarán aspectos y ventajas adicionales de la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
La cepa de la invención se obtuvo a partir de esporas deGlomus iranicumvar.tenuihypharum.
Fue aislada del interior de las esporas, a través de un proceso de varias desinfecciones de las paredes externas de la espora lavándolas con hipoclorito de sodio al 0,5% más Tween 80 durante 5 minutos, llevando a cabo 5 ciclos de desinfección. Tras ello, las soluciones de esporas se maceraron y el citoplasma fúngico se sembró en un medio salino mínimo con metanol (MMM) (metanol, 20,0 ml; NaNO3, 0,5 g; (NH4)2<s>04, 0,5 g; MgSO4'7H2O, 0,5 g; K2HPO4, 1,0 g; FeSO4'7H2O, 0,01 g; CaCl2-2H2O, 0,01 g; KCl, 0,5 g; solución de vitaminas, 1,0 ml; solución de micronutrientes, 2,0 ml; agar, 12g; pH 7,20) a 28°C durante 5 días. A partir del medio, se identificaron 5 colonias diferentes, y las que presentaban color rosado fueron elegidas y reaisladas al menos tres veces para garantizar que estaban limpias de cualquier otra posible contaminación.
Ejemplo 1
Experimento 1. Vías de aplicación de la cepa de la invención
Se efectuaron experimentos en una cámara de cultivo aplicando la cepa de la invención, es decir, la nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580, mediante aplicación foliar, aplicación en el suelo y recubrimiento de semillas, es decir, revestimiento de semillas.
Se evaluó la presencia de la cepa de la invención en hojas, tallos y raíces. También se evaluaron el tiempo de desplazamiento de la cepa en la planta, de la raíz a la hoja y de la hoja a la raíz, y la penetración de la cepa a través de los estomas de las raíces y la semilla.
Para corroborar la entrada de las metilobacterias en la planta y la colonización de diferentes tejidos, se llevó a cabo un experimento inoculando semillas en alvéolos y plantas de maíz en macetas de cultivo. En este caso, se aplicaron tres tratamientos: recubrimiento de semillas, aplicación mediante riego y aplicación foliar. Se analizó la presencia de colonias de la cepa de la invención en la raíz, el tallo y las hojas de tres réplicas biológicas a diferentes horas y días tras la inoculación (“h.t.i.”, y “d.t.i.”).
• Materiales y procedimientos
Materia vegetal y microorganismos usados
Como materia vegetal se usaron semillas de maíz(Zea maysL.) recubiertas con los fungicidas Fludioxonil y Mefenoxam. Como inoculantes microbianos se usaron bacterias pertenecientes a la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención yHerbaspirillum seropedicae.
Condiciones de crecimiento de las plantas de maíz
Para el crecimiento de las plantas de maíz se usaron pequeños recipientes de plástico, con una mezcla de sustrato estéril a base de arena de sílice y fibra de coco en una proporción de 2:1, dispuestos en una cámara de crecimiento a 24°C y una humedad relativa (HR) del 60% en presencia de luz, como se muestra en la Figura 1, durante 4 semanas. Las plantas fueron regadas dos veces por semana con agua descalcificada estéril. Después de 15 días desde la siembra, las plantas fueron regadas solamente una vez con una solución nutritiva de N:P:K: 4:1,7:4,5 al 0,3%, más una solución de micronutrientes.
Tratamientos con la cepa de la invención en plantas de maíz
Se llevaron a cabo diferentes tratamientos en plantas de maíz específicamente con la nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580, mediante recubrimiento de semillas (es decir, revestimiento de semillas), mediante riego y mediante aplicación foliar, es decir, por vía foliar. Se usó el inóculo en forma sólida (polvo). La concentración bacteriana en el polvo fue del orden de 1 * 109 UFC/g. Cada tratamiento estudiado fue comparado con plantas no tratadas como control negativo. Además, se usó la bacteriaHerbaspirillum seropedicaefijadora del nitrógeno como control positivo del experimento a una concentración de 1,2 * 106 UFC/g en formato sólido.
a) Recubrimiento de semillas
Las semillas de maíz se recubrieron con un inóculo en polvo de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención.
b) Vía de riego
Después de 4 días tras la siembra, se inocularon la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención yHerbaspirillum seropedicaemediante riego con una concentración entre 1-1,2 * 106 UFC por planta. Con este fin, se diluyó en agua el inóculo bacteriano en forma sólida para el tratamiento ulterior.
c) Vía foliar
Cuando las plantas presentan entre dos y tres hojas verdaderas, correspondientes con la clasificación BBCH 12-13, se inocularon por vía foliar la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención yHerbaspirillum seropedicae.El inóculo bacteriano sólido fue diluido en agua a una concentración de 1 * 106 UFC/planta. Previamente, el sustrato fue cubierto con plástico para prevenir la contaminación con el tratamiento.
El tratamiento bacteriano se llevó a cabo pulverizando las hojas con un pulverizador.
• Detección de colonias de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en la raíz, el tallo y las hojas
Después de los tratamientos con la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención, se analizó la presencia de esta bacteria junto con su control positivo,Herbaspirillum seropedicae,en diferentes tejidos vegetales. Estos fueron desinfectados para evitar falsos positivos. Para hacer esto, fueron sumergidos durante 30 segundos en una solución de etanol (70%) e hipoclorito de sodio (1%) durante 2 minutos, con un lavado subsiguiente con agua doblemente destilada. Una vez desinfectados (la raíz y las hojas), se practicaron cortes longitudinales y transversales en el tallo para la posterior transferencia a un medio de cultivo específico para las metilobacterias. La Figura 2 ilustra tales muestras de tejidos vegetales expuestas a medios de cultivo específicos para el desarrollo de metilobacterias. En particular, el panel “a” de la Figura 2 ilustra muestras de raíces, el panel “b” de la Figura 2 ilustra muestras de tallos y el panel “c” de la Figura 2 ilustra muestras de hojas. Las muestras de tejidos puestas en el medio de cultivo se incubaron durante 7 días a 28°C. El desarrollo de colonias se observó en un estereomicroscopio Leica Wetzlar, y se tomaron fotos con una cámara Leica MC170 HD. Las plantas se cosecharon para su análisis entre 1 y 24 h del primer día y entre 2-10 días tras la inoculación (riego y foliar) o tras la germinación (recubrimiento). Se usaron tres réplicas biológicas para cada uno de los tres tratamientos y tiempos analizados.
• Análisis estadístico de los resultados obtenidos
Para el análisis estadístico de los resultados, el procedimiento usado fue un ANOVA simple, junto con la prueba de Fisher de diferencia significativa mínima, para un nivel de significancia p<0,05. Se usó el soporte lógico STATGRAPHICS Centurion 18, así como Microsoft Excel para el procesamiento de datos y la representación gráfica.
• Resultados
Efecto de la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención: Infección y colonización de la planta
(a) Recubrimiento de semillas
La primera evaluación para detectar colonias bacterianas en las plantas tratadas inoculadas por recubrimiento se realizó a las 48 horas, coincidiendo con el tiempo de germinación de las semillas. Los análisis revelaron que después de dos días la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención estaba presente en el tejido interno; después de 4 días estaba en el tallo y después de 6 días aparecía en las hojas. Por lo tanto, el paso de las bacterias hacia las nuevas estructuras tenía lugar a medida que la planta se desarrollaba.
b) Riego
En el caso de la inoculación por riego, las bacterias estaban en los tejidos internos de la raíz en 1 hora y subían hasta el tallo en entre 4 y 8 días, alcanzando las hojas 10 días después del tratamiento. No está de más resaltar que, en este caso, la cadencia no fue homogénea en todas las réplicas.
c) Vía foliar
Por vía foliar, las bacterias se encontraron en el tejido interno de las hojas 1 hora tras la inoculación; tras 6 horas desde el tratamiento, se detectaron tanto en el tallo como en las raíces.
La Figura 3 muestra imágenes de muestras de tejidos vegetales tratados con la cepa de la invención mediante recubrimiento de semillas (a-c), mediante riego (d-f) y aplicación foliar (g-i), expuestas a un medio nutriente específico para las metilobacterias.
La Tabla 1, presentada a continuación, muestra datos relativos a la detección de colonias de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en diferentes partes de la planta durante 10 días. Clave: H: horas, d: días, presencia de bacterias en un 20-40% (+), un 50-80% (++) y un 90-100% (+++). Tallo A: Tallo apical; Tallo B: Tallo basal.
Tiempo
Tratamientos Planta 8h 9h 12h 24h 2d 8d 10d Raíz - - - - - - - - - - - -Tallo A - - - - - - - - - - - -Control
Tallo B - - - - - - - - - - - -Hoja - - - - - - - - - - - -Raíz - - - - - - ++ ++ ++ ++ + + Tallo A - - - - - - - - ++ ++ + + Tratamiento de semillas
Tallo B - - - - - - - - ++ ++ + + Hoja - - - - - - - - - + Raíz + + + + + ++ ++ ++ Tallo A ND ND ND ND ND ND - - + Riego
Tallo B ND ND ND ND ND ND - - - - - + Hoja ND ND ND ND ND ND - - - - - + Raíz ND ND ND ND ND ND - - - + Tallo A ND ND ND ND ND ND - - - + Aplicación foliar
Tallo B ND ND ND ND ND ND - - - + Hoja ++ ++ ++ + + + + + ++
• Conclusiones
En este experimento se determinó que la entrada del microorganismo era efectiva tanto a través de la zona de la raíz como por la parte aérea. Por lo tanto, en las plantas tratadas por cualquier procedimiento, se localizaron colonias de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención, lo que indica que este microorganismo endófito es transportado de la raíz a la hoja y viceversa.
Ejemplo 2
Experimento 2. Eficacia del uso de la cepa de la invención en una reducción del 40% de fertilizante nitrogenado en el cultivo de maíz de ciclo largo
• Objetivos
Conocer la eficacia de la cepa de la invención sobre el desarrollo del maíz, frente a la reducción de un 40% de la fertilización por cobertura nitrogenada en condiciones de crecimiento convencionales, a través de la evolución del verdor de la hoja (ADPS), índices de vegetación, niveles de nitrógeno en la planta, concentración del microorganismo en la hoja y rendimiento de producción.
• Materiales y procedimientos
Sembrados experimentales y fertilización
El experimento se llevó a cabo en España, en tres fincas de Huesca. La primera finca, con coordenadas 41° 52' 12,7" N 0° 23' 11,1" W, estaba en Montesusín, Huesca; la segunda finca, con coordenadas 41° 40' 47,6" N 0° 17' 09,5" E, en Belver de Cinca, Huesca; la tercera finca, con coordenadas 41° 47' 58,1" N 0° 23' 56,0" E, en Tamarite de Litera, Huesca.
Las recomendaciones de fertilización fueron una fertilización convencional y una reducción del 40% en tratamientos de reducción del nitrógeno. Con este fin, el fertilizante se distribuyó con una abonadora con las cantidades especificadas en la Tabla 2, presentada a continuación.
La Tabla 2 muestra la cantidad, el tipo de fertilizante y las unidades de fertilizantes nitrogenados (UFN) usadas en cada fertilizante en cada parcela.
TABLA 2
• Distribución de los tratamientos en los sembrados
Los sembrados tenían la siguiente superficie: Sembrado 1 (5,43 ha), Sembrado 2 (3,28 ha) y Sembrado 3 (2,34 ha). Para la evaluación de los parámetros se tomaron dos zonas contiguas de 16 metros de anchura. La zona marcada con “1” es la zona tratada y la zona marcada con “2” es la zona de control.
La Figura 4 muestra la distribución de experimentos con el tratamiento 1 (en la zona 1) con la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención, y el tratamiento 2 de control (en la zona 2). En particular, el panel “a” de la Figura 4 muestra el Sembrado 1, el panel “b” de la Figura 4 muestra el Sembrado 2 y el panel “c” de la Figura 4 muestra el Sembrado 3.
• Características del cultivo y la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en maíz de ciclo largo
Se seleccionaron semillas de maíz (Zeamays)para grano de la variedad “40F” con una relación de plantación de 300 kg/ha, sembradas a una profundidad de 3 cm con una separación de 75 cm entre hileras y una separación de 15 cm dentro de la misma hilera. La anchura de cada línea de siembra es de 16 m entre aspersores. La fecha de siembra fue del 1 al 5 de mayo de 2018; después de cinco días emergió el tallo, y la fecha de aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención fue 40 días después de la siembra, el 12 de junio de 2018, y se sembró usando una sembradora en campos indicados por los agricultores como zona representativa de cultivo de maíz en España. Se realizó un diseño aleatorio en la elección de una parcela del sembrado para cada tratamiento.
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención se aplicó a una dosis de 333 g/ha (3 * 107 UFC/g) mediante aplicación foliar, con una reducción del 40% en fertilización nitrogenada. Los resultados se compararon con un tratamiento de fertilización convencional. La aplicación foliar se llevó a cabo con un pulverizador con 300-400 litros de caldo por hectárea, cuando la planta estaba en la fase 13-14 de la escala BBCH, con una temperatura del aire de 17°C y una humedad relativa del 52%, con una velocidad del viento de 2,3 mps en dirección norte, sin presencia de rocío en las hojas y una nubosidad del 60%.
• Parámetros y metodología de evaluación
Recuento de unidades formadoras de colonias por gramo de hoja (UFC/g)
Se midió este parámetro para tener la certeza de que el microorganismo está en todo el ciclo de cultivo y en qué cantidad se encuentra en las hojas. Se mide tomando un gramo de las hojas desde la cuarta hoja de menos de 20 plantas y realizando disoluciones en serie sembrándolas en medios de cultivo selectivos carentes de nitrógeno con metanol como fuente de carbono.
ADPS (nivel de clorofila en la hoja)
Este parámetro es un indicador del buen estado nutricional de la planta y está estrechamente relacionado con los niveles de nitrógeno y hierro. Para esto, se usó un medidor denominado ADPS (Análisis del desarrollo de plantas en el suelo) y se efectuaron 100 mediciones de la cuarta hoja de menos de 100 plantas de cada tratamiento.
Nitrógeno en la hoja, el tallo y el grano en la mazorca
Este parámetro es un indicador de la cantidad de nitrógeno acumulada en cada tejido vegetal en el momento de la cosecha. Se toman las hojas, los tallos y los granos en la mazorca de 100 plantas para analizar el nitrógeno total mediante el procedimiento de Kjeldahl.
Fotos de dron (vuelo de dron para obtener diferentes índices)
NDVI (Índice de vegetación de diferencia normalizada, por sus siglas en inglés). Contrasta las bandas de luz roja e infrarrojo cercano reflejadas en las hojas de las plantas. Es un indicador general de la densidad del dosel y suele usarse para distinguir la vegetación verde viva del suelo, que parece más azul cuanta más clorofila tiene.
CIR (color infrarrojo) combinado. Color compuesto infrarrojo que combina bandas NIR (infrarrojo cercano, por sus siglas en inglés), roja y verde. La vegetación sana refleja un alto nivel de NIR (infrarrojo cercano) y se ve roja. La vegetación latente es, a menudo, verde o bronceada, mientras que los suelos arenosos son de color marrón claro y los suelos arcillosos son de color marrón oscuro o verde azulado.
Rendimiento
Para evaluar el rendimiento de la cosecha, se toman 6 bloques aleatorios y se cosechan 30 metros cuadrados de superficie. Se pesa el cereal obtenido descontando la pérdida por humedad en cada zona.
Análisis estadístico
Se analizaron los factores (ADPS y rendimiento) y su interacción para cada parámetro mediante ANOVA, usando el soporte lógico Statgraphics Plus 5.1 para Windows (Manugistics, Inc., EE. UU.).
• Resultados
Recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)
La Tabla 3, presentada a continuación, muestra datos relativos a las unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de hoja y en el tanque de aplicación, después del tratamiento (4/6/18) y después de un mes desde el tratamiento (4/7/18).
TABLA 3
En el tanque de aplicación había una mezcla homogénea del producto y se realizó una aplicación correcta en la planta, de modo que, tras un mes de la aplicación en las hojas de maíz, las poblaciones se mantienen y aumentan su desarrollo, como puede verse en todas las parcelas.
ADPS
La Figura 5 muestra la medición de ADPS 30 días después de la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención.
Después de un mes desde la aplicación, las plantas mantuvieron niveles de ADPS iguales a las del control, sin diferencias significativas, en todos los sembrados, verificándose que la reducción del nitrógeno químico no tuvo un efecto negativo en la planta, dado que fue aportado por las bacterias.
Nitrógeno en la hoja, el tallo y la mazorca
La Tabla 4, presentada a continuación, muestra datos relativos a las concentraciones de nitrógeno (g/planta) encontradas en los diferentes tejidos de la planta de maíz en el momento de la cosecha.
TABLA 4
Fotos de dron (45 dtt)
La Figura 6 muestra fotos de dron usadas para la determinación del índice NDVI para el Sembrado 1 (panel “a”), el Sembrado 2 (panel “b”) y el Sembrado 3 (panel “c”).
La Figura 7 muestra fotos de dron usadas para la determinación del índice CIR combinado para el Sembrado 1(panel “a”), el Sembrado 2 (panel “b”) y el Sembrado 3 (panel “c”).
Considerando los índices NDVI y CIR combinado, no se observó ninguna diferencia en la densidad del dosel de las plantas, en la clorofila ni en la salud de las plantas (intensidad de los colores azul y rojo) en ninguno de los sembrados, con respecto al control, salvo en el Sembrado 3, en el que hubo un problema en la presión del agua de riego, y se observa una diferencia en color en la cosecha en las zonas en las que el aspersor no regó debidamente.
Rendimiento
La Tabla 5, presentada a continuación, muestra datos relativos al rendimiento de cada sembrado.
TABLA 5
En la Tabla 5, los promedios seguidos por letras diferentes en la línea difieren significativamente entre sí.
En el Sembrado 1, el control tuvo un rendimiento de 16881 kg/ha. Con la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención, se obtuvo un rendimiento de 17511 kg/ha, lo que significó un 4% más de producción.
En el Sembrado 2, el control tuvo un rendimiento de 14346 kg/ha. La aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención produjo un rendimiento de 18335 kg/ha, es decir, un aumento productivo del 28%.
En el Sembrado 3, el control tuvo un rendimiento de 14312 kg/ha. La aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención generó un rendimiento de 17539 kg/ha, dando lugar a un aumento del 22,5% en la producción neta.
La Tabla 6, presentada a continuación, muestra datos relativos al balance de nitrógeno: nitrógeno proporcionado (aportado) mediante fertilización, nitrógeno asimilado por la planta después de su extracción, balance de asimilación entre el aportado y el extraído en la planta. El requerimiento de nitrógeno (es decir, la aportación requerida) por tonelada de cereales y la extracción de nitrógeno por tonelada de cereales.
TABLA 6
UFN Extracción de Balance de Aportación requerida Extracción (kg aportadas/ha las plantas (kg asimilación (UFN/tonelada de N/tonelada de N/ha) (UFN/ha) cereales) cereales) (extracción -aportación)
Sembrado 1 175 286,63 111,63 9,99 16,36 Tratado
Sembrado 1 293 243,40 -49,59 17,35 14,41 Control
Sembrado 2 295 361,00 66,00 16,08 20,61 Tratado
Sembrado 2 480 373,38 -106,61 33,45 22,11 Control
Sembrado 3 142 246,23 104,22 8,09 14,06 Tratado
Sembrado 3 237 253,45 16,44 16,55 15,01 Control
• Conclusiones
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención tiene una aplicación eficaz en el cultivo de maíz y persistencia del microorganismo en la planta.
La cepa de la invención mantiene un nivel de ADPS (clorofila), de salud de las plantas y de densidad del dosel de las plantas (índice NDVI e índice CIR combinado) iguales a los de la fertilización convencional, en donde se usa una mayor cantidad de fertilizante nitrogenado.
La cepa de la invención proporciona el 40% de las unidades de fertilizante nitrogenado totales que se redujeron en la fertilización de cobertura, y también proporciona un aumento en la producción de entre el 4 y el 27%. Dado que las plantas solo tenían una mazorca por planta, este aumento estaría ligado al peso específico del grano y/o al número de filas.
Si observamos el balance de las unidades de fertilizante nitrogenado aportadas mediante fertilización y la extracción del nitrógeno que se llevó a cabo en la planta, hay una ganancia de nitrógeno de entre 66 y 111 kg de nitrógeno por hectárea. Esto quiere decir que esos kilogramos de nitrógeno fueron fijados por la cepa de la invención durante el ciclo de cultivo. Este resultado se observa indirectamente en el requerimiento de nitrógeno por tonelada de cereales producida en las plantas tratadas, dado que el requerimiento para producir una tonelada de cereales es menor que el de los controles. También debe tenerse en cuenta que los requerimientos para producir una tonelada de cereal tratado son menores que la extracción de nitrógeno que se realizó para producir esa tonelada de cereales. Ocurre al revés en el control, dado que se precisa más nitrógeno para producir la misma cantidad de cereales.
Ejemplo 3
Experimento 3. Eficacia del uso de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en la reducción de un 30% del fertilizante nitrogenado en el cultivo de maíz de ciclo corto
• Objetivos
Conocer la eficacia de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención sobre el desarrollo del maíz, frente a la reducción de un 30% de la fertilización por cobertura nitrogenada en condiciones de crecimiento convencionales, a través de la evolución del verdor de la hoja (ADPS), índices de vegetación, niveles de nitrógeno en la planta, concentración del microorganismo en la hoja y rendimiento de producción.
• Materiales y procedimientos
Sembrados experimentales y fertilización
El experimento se llevó a cabo en España, en dos sembrados: un sembrado de Pomar de Cinca en Huesca con coordenadas 41° 50' 13,8" N 0° 05' 38,0" E, y el otro en la Finca Orán, Albacete, con coordenadas 38° 49' 55,3" N 1° 50' 27,1" W.
Las recomendaciones de fertilización fueron una fertilización convencional y una reducción del 30% en tratamientos de reducción del nitrógeno. Con este fin, el fertilizante se distribuyó con una abonadora con las cantidades especificadas en la Tabla 7, presentada a continuación.
La Tabla 7 muestra la cantidad, el tipo de fertilizante y las unidades de fertilizantes nitrogenados (UFN) usadas en cada fertilizante en cada parcela.
TABLA 7
• Distribución de los tratamientos en los sembrados
Los sembrados tenían la siguiente superficie: Sembrado 1 (74 ha), Sembrado 2 (3,67 ha) y se tomaron dos zonas contiguas de 16 metros de anchura para la evaluación de los parámetros. La zona marcada con “1” es la zona tratada y la zona marcada con “2” es la zona de control.
La Figura 8 muestra la distribución de experimentos con el tratamiento 1 (en la zona 1) con la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención, y el tratamiento 2 de control (en la zona 2). En particular, el panel “a” de la Figura 8 muestra el Sembrado 1, y el panel “b” de la Figura 8 muestra el Sembrado 2.
• Características del cultivo y la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención
Se seleccionaron semillas de maíz de la variedad “Guasi” en el Sembrado 1 y en la variedad DKC 5032 YG en el Sembrado 2, con una relación de plantación de 300 kg/ha, sembradas a una profundidad de 3 cm con una separación de 75 cm entre hileras y una separación de 15 cm dentro de la misma hilera. La anchura de cada línea de siembra es de 16 m. La fecha de siembra fue el 20 de junio en el Sembrado 1 y el 30 de junio en el Sembrado 2; después de diez días emergió el tallo, y la fecha de aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención fue 22 y 20 días, respectivamente, después de la siembra, el 12 de julio (Sembrado 1) y el 20 de julio de 2018 (Sembrado 2).
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención se aplicó a una dosis de 333 g/ha (3 * 107 UFC/g) mediante aplicación foliar.
La aplicación foliar se llevó a cabo con una máquina pulverizadora con 300-400 litros de caldo por hectárea, cuando la planta estaba en la fase 13-14 de la escala BBCH, con una temperatura del aire de 22 y 20°C y una humedad relativa del 72 y el 58%, con una velocidad del viento de 2,3 y 12 mps en dirección norte y noroeste, sin presencia de rocío en las hojas y una nubosidad del 0 y el 15%, respectivamente.
• Parámetros y metodología de evaluación
Recuento de unidades formadoras de colonias por gramo de hoja (UFC/g)
Se midió este parámetro para tener la certeza de que el microorganismo está en todo el ciclo de cultivo y en qué cantidad se encuentra en las hojas. Se mide tomando un gramo de las hojas desde la cuarta hoja de menos de 20 plantas y realizando disoluciones en serie sembrándolas en medios de cultivo selectivos carentes de nitrógeno con metanol como fuente de carbono.
ADPS (nivel de clorofila en la hoja)
Este parámetro es un indicador del buen estado nutricional de la planta y está estrechamente relacionado con los niveles de nitrógeno y hierro. Para esto, se usó un medidor denominado ADPS (Análisis del desarrollo de plantas en el suelo) y se efectuaron 100 mediciones de la cuarta hoja de menos de 100 plantas de cada tratamiento.
Nitrógeno en la hoja, el tallo y el grano en la mazorca
Este parámetro es un indicador de la cantidad de nitrógeno acumulada en cada tejido vegetal en el momento de la cosecha. Se toman las hojas, los tallos y los granos en la mazorca de 100 plantas para analizar el nitrógeno total mediante el procedimiento de Kjeldahl.
Fotos tomadas por satélite
Las fotos tomadas por el satélite Copernicus de la Agencia Espacial Europea (ESA, por sus siglas en inglés) fueron descargadas y procesadas con el programa Qgis para obtener el índice NDVI.
NDVI (Índice de vegetación de diferencia normalizada, por sus siglas en inglés). Contrasta las bandas de luz roja e infrarrojo cercano reflejadas en las hojas de las plantas. Es un indicador general de la densidad del dosel y suele usarse para distinguir la vegetación verde viva del suelo, que parece más azul cuanta más clorofila tiene.
Rendimiento
Para evaluar el rendimiento de la cosecha, se toman 6 bloques aleatorios y se cosechan 30 metros cuadrados de superficie. Se pesa el cereal obtenido descontando la pérdida por humedad en cada zona.
Análisis estadístico
Se analizaron los factores (ADPS y rendimiento) y su interacción para cada parámetro mediante ANOVA, usando el soporte lógico Statgraphics Plus 5.1 para Windows (Manugistics, Inc., EE. UU.).
• Resultados
Recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)
La Tabla 8, presentada a continuación, muestra datos relativos a las unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de hoja y en el tanque de aplicación (12-20/7/18), después del tratamiento (12-20/7/18) y después de un mes desde el tratamiento (15/8/18).
TABLA 8
12-20/07/2018 15/08/2018
UFC/ml en tanque de aplicación UFC/gr de hoja UFC/gr de hoja Sembrado 1 2,70E+02 5,40E+03 1,00E+04
Sembrado 2 1,20E+03 3,00E+03 8,10E+03
En el tanque de aplicación había una mezcla homogénea del producto y se realizó una aplicación correcta en la planta, de modo que, tras un mes de la aplicación en las hojas de maíz, las poblaciones se mantienen y aumentan su desarrollo, como puede verse en todos los sembrados.
ADPS
La Figura 9 muestra mediciones de ADPS 30 días después de la aplicación.
Después de un mes desde la aplicación, las plantas mantuvieron niveles de ADPS iguales a las del control, sin diferencias significativas, en todos los sembrados, verificándose que la reducción del nitrógeno químico no tuvo un efecto negativo en la planta, dado que fue aportado por las bacterias.
Nitrógeno en la hoja, el tallo y la mazorca
La Tabla 9, presentada a continuación, muestra datos relativos a las concentraciones de nitrógeno (gramos) de cada tejido de la planta de maíz.
TABLA 9
Sembrado 1 Sembrado 2
Control Tratado Control Tratado
Hoja 0,35 0,49 0,49 0,58
Tallo 0,46 0,58 0,58 0,86
Grano 1,09 1,38 1,30 1,14
Total 1,90 2,45 2,37 2,58
Fotos tomadas por satélite
La Figura 10 muestra fotos tomadas por satélite usadas para la determinación del índice NDVI para el Sembrado 1 después de 45 días del tratamiento medido cada 15 días.
La Figura 11 muestra fotos tomadas por satélite usadas para la determinación del índice NDVI para el Sembrado 2 después de 45 días del tratamiento medido cada 15 días.
Con el tratamiento con la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención, con reducción de la fertilización, se observa una homogeneidad en el valor de NDVI (intensidad del verdor) en todo el ciclo de cultivo en comparación con el control.
Rendimiento
La Tabla 10, presentada a continuación, muestra datos relativos al rendimiento de cada sembrado.
TABLA 10
Rendimiento (kg/ha) Aumento % (kg/ha)
Control Tratado Tratado
Sembrado 1 10515 a 11828 b 12,48
Sembrado 2 12525 a 12863 b 2,7
En el Sembrado 1 el control tuvo un rendimiento de 10515 kg/ha; sin embargo, con la aplicación de la cepa de la invención se obtuvo un rendimiento de 11828 kg/ha, con un aumento del 12,5% en la producción.
En el Sembrado 2 el control tuvo un rendimiento de 12525 kg/ha, y con la cepa de la invención se obtuvo un rendimiento de 12863 kg/ha, con un aumento del 2,7%.
La Tabla 11 muestra datos relativos al balance de nitrógeno: nitrógeno proporcionado mediante fertilización, nitrógeno asimilado por la planta después de las extracciones, balance de asimilación entre el aportado y el extraído en la planta. El requerimiento de nitrógeno por tonelada de cereales y la extracción de nitrógeno por tonelada de cereales.
TABLA 11
UFN Extracción de Balance de Aportación requerida Extracción (kg aportadas/ha las plantas (kg asimilación (UFN/tonelada de N/tonelada de N/ha) (UFN/ha) cereales) cereales) (extracción -aportación)
Sembrado 1 161 218,46 51,46 13,61 18,47 Tratado
Sembrado 1 230 170,03 -59,97 21,87 10,95 Control
Sembrado 2 188 361,00 43,30 14,61 17,98 Tratado
Sembrado 2 216 373,38 -65,08 22,03 16,83 Control
• Conclusiones
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención tiene una aplicación eficaz en el cultivo de maíz y persistencia del microorganismo en la planta.
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención mantiene un nivel de ADPS (clorofila), de salud de las plantas y de densidad del dosel de las plantas (índice NDVI) iguales a los de la fertilización convencional, en donde se usa una mayor cantidad de fertilizante nitrogenado.
Con respecto al rendimiento, la cepa de la invención proporciona el 30% de las unidades de fertilizante nitrogenado totales que se redujeron en la fertilización de cobertura, y también proporciona un aumento en la producción de entre el 2,7 y el 12,5%. Dado que las plantas solo tenían una mazorca por planta, este aumento estaría ligado al peso específico del grano y/o al número de filas.
Si observamos el balance de las unidades de fertilizante nitrogenado aportadas mediante fertilización y la extracción del nitrógeno que se llevó a cabo en la planta, hay una ganancia de nitrógeno de entre 43 y 57 kg de nitrógeno por hectárea. Esto quiere decir que esos kilogramos de nitrógeno fueron fijados por la cepa de la invención durante el ciclo de cultivo. Este resultado se observa indirectamente en el requerimiento de nitrógeno por tonelada de cereales producida en las plantas tratadas con la cepa de la invención, dado que el requerimiento para producir una tonelada de cereales es menor que el de los controles. También debe tenerse en cuenta que los requerimientos para producir una tonelada de cereal tratado son menores que la extracción de nitrógeno que se realizó para producir esa tonelada de cereales y en el control ocurre al revés, dado que se precisa más nitrógeno para producir la misma cantidad de cereales.
Ejemplo 4
Experimento 4. Evaluación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en el cultivo de fresas para diferentes dosis de fertilización nitrogenada
• Objetivos
Conocer la eficacia de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención sobre el desarrollo del cultivo de fresas sometido a diferentes dosis de fertilización nitrogenada del 0, 25, 50, 75 y 100% de la fertilización convencional, a través de la evolución del verdor de la hoja (ADPS), niveles de nitrógeno en la planta, concentración del microorganismo en la hoja y rendimiento de producción.
• Materiales y procedimientos
Sembrado experimental y fertilización
El experimento se llevó a cabo en un sembrado situado en la finca experimental de Symborg con coordenadas 37° 48' 59,6" N 1° 05' 43,6" W, en Los Martínez del Puerto, Murcia. El sembrado tiene una extensión de 192 m2, y tenía 8 m de anchura y 24 m de longitud.
La gestión del riego y la fertilización es diferente para todos los tratamientos. El programa de fertilización mineral consta de 5 soluciones con diferente contenido de nitrógeno.
La Tabla 12 muestra las diferentes fertilizaciones de los tratamientos, medidos en UFN.
TABLA 12
UFN
100% de fertilización nitrogenada 670
75% de fertilización nitrogenada 502,5
50% de fertilización nitrogenada 335
25% de fertilización nitrogenada 167,5
0% de fertilización nitrogenada 0
• Tratamientos
La Tabla 13 se refiere a 10 tratamientos basados en 5 niveles de fertilización que, a su vez, se dividen en tratados con la cepaMethylobacteriumde la invención y no tratados.
TABLA 13
T1. 0% de fertilización nitrogenada
T2. 25% de fertilización nitrogenada
T3. 50% de fertilización nitrogenada
T4. 75% de fertilización nitrogenada
T5. 100% de fertilización nitrogenada
T6. Nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención con un 0% de fertilización nitrogenada
T7. Nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención con un 25% de fertilización nitrogenada T8. Nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención con un 50% de fertilización nitrogenada T9. Nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención con un 75% de fertilización nitrogenada T10. Nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención con un 100% de fertilización nitrogenada
• Características del cultivo y la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención
Materia vegetal
Se plantaron plantas de fresa de raíz desnuda, de la variedad Fortuna, proporcionadas por viveros.
Marco y densidad de plantación
El marco de plantación tiene 2 m entre filas de cultivo, 0,1 m entre plantas, está plantado en sacos de fibra de coco de 1 m x 0,18 m * 0,15 m en quincunce, dando una densidad de 100.000 plantas por hectárea, 10 plantas por m2; el sembrado tiene una extensión de 192 m2, por lo que hay 1920 plantas para todo el experimento.
Fecha de la plantación y retirada del cultivo
El trasplante de las fresas se realizó el 2/11/2017, dando lugar a la retirada del cultivo el 01/06/2018.
Diseño hidráulico
Se usó una bomba eléctrica de 3,5 kv, que va a una tubería secundaria de 32 mm, que se conecta con mangueras de 16 mm con gotero externo autocompensante de 3 l/h.
Agua de riego
El agua de riego usada para llevar a cabo el experimento procede de una planta desalinizadora, y en todo el experimento se aplicaron 130 litros de agua por planta, con una concentración de 0,1 gramos por litro de nitrato (13 gramos por planta). Las características de dicha agua se resumen en la siguiente tabla (Tabla 14). La Tabla 14, presentada a continuación, muestra datos relativos a las características del agua de riego.
La cepa de la invención se aplicó a una dosis de 333 g/ha (3 * 107 UFC/g) mediante aplicación foliar.
La aplicación foliar se realizó con una mochila pulverizadora a razón de 200 litros de caldo por hectárea cuando la planta estaba en la fase 13-14 de la escala BBCH, con una temperatura del aire de 20°C y una humedad relativa del 50%, sin presencia de rocío en las hojas y una nubosidad del 15%.
• Parámetros y metodología de evaluación
Recuento de unidades formadoras de colonias por gramo de hoja (UFC/g)
Se midió este parámetro para tener la certeza de que el microorganismo está en todo el ciclo de cultivo y en qué cantidad se encuentra en las hojas. Se mide tomando un gramo de hojas de 50 plantas y realizando disoluciones en serie sembrándolas en medios de cultivo selectivos carentes de nitrógeno con metanol como fuente de carbono. Nitrógeno en la hoja
Este parámetro es un indicador de la cantidad de nitrógeno acumulada en cada tejido vegetal en el momento del análisis. Se toman las hojas, los tallos y el fruto de 100 plantas para analizar el nitrógeno total mediante el procedimiento de Kjeldahl.
Rendimiento
Para evaluar el rendimiento del cultivo, se seleccionan aleatoriamente 30 plantas de cada tratamiento y se cosechan durante todo el ciclo de cultivo.
Análisis estadístico
Se analizaron el factor (rendimiento) y su interacción para cada parámetro mediante ANOVA, usando el soporte lógico Statgraphics Plus 5.1 para Windows (Manugistics, Inc., EE. UU.).
• Resultados
Recuento de unidades formadoras de colonias por gramo de hoja (UFC/g)
La Tabla 15, presentada a continuación, muestra resultados relativos a las unidades formadoras de colonias por gramo de hoja medidos mensualmente desde la aplicación.
Mediante el muestreo de colonias, se observa la permanencia de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en todo el ciclo de cultivo de la planta.
Nitrógeno total
La Tabla 16, presentada a continuación, muestra datos relativos a la concentración de nitrógeno (g /100 g de planta), el nitrógeno total (g/planta) y peso en fresco de plantas en el cultivo de fresas.
La Tabla 16 muestra que hay un aumento en la concentración de nitrógeno a medida que aumenta la fertilización nitrogenada, tanto en el control como lo tratado con la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención.
Se observa un aumento del nitrógeno total hasta que se alcanza un 75% de fertilizante nitrogenado en las plantas tratadas con la cepa de la invención, encontrándose el valor máximo en 3,28, el valor máximo de concentración de nitrógeno en plantas tratadas con la cepa de la invención. Con un 100% de la fertilización, el contenido de N en la planta tratada se reduce.
Producción
Desde el momento en que empiezan a producir, se cosechan 30 plantas semanalmente, seleccionadas de forma aleatoria de cada tratamiento durante todo el ciclo de cultivo.
La Tabla 17, presentada a continuación, muestra el rendimiento en kilogramos por planta para cada tratamiento.
TABLA 17
Tratamientos Producción (kg/planta)
T 1 0,24 a
T 2 0,8 b
T 3 1,07 c
T 4 1,05 c
T 5 1,15c
T 6 0,17a
T 7 1,04 c
T 8 1,12c
T 9 1,4 d
T 10 1,02 c
El tratamiento con la producción máxima fue el 9 (75% de nitrógeno con la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención), con 1,4 kilos por planta, significativamente diferente de los demás tratamientos.
Los tratamientos con 0 UFN fueron los que tuvieron la menor producción de kg de fresas por planta, con diferencias significativas.
La Tabla 18, presentada a continuación, muestra datos relativos al balance de nitrógeno: nitrógeno proporcionado mediante fertilización, nitrógeno asimilado por la planta después de su extracción, balance de asimilación entre el aportado (es decir, el nitrógeno proporcionado) y el extraído en la planta.
• Conclusiones
Recuento de unidades formadoras de colonias por gramo de hoja (UFC/g de hoja)
Se observa la persistencia de los microorganismos en la hoja en todo el ciclo de cultivo de las fresas.
Nitrógeno total
Las plantas tratadas con la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en el tratamiento 9 tienen la máxima concentración de nitrógeno en la hoja, en comparación con todos los tratamientos de control.
Producción
La aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en el tratamiento 9 (503 UFN) promovió un aumento del 21% en la producción con respecto al tratamiento 5 de control (671 UFN) y un aumento del 33% con respecto su a tratamiento 4 homólogo con fertilización (503 UFN).
Ejemplo 5
Experimento 5. Experimento de validación de sembrados en el cultivo de vides
• Objetivos
Conocer la eficacia de la cepa de la invención sobre el desarrollo del cultivo de vides, sometidas a una dosis convencional de fertilización nitrogenada, a través de la evolución del verdor de la hoja (ADPS), concentración del microorganismo en la hoja y el rendimiento de producción.
• Materiales y procedimientos
Sembrados experimentales y fertilización
El experimento se llevó a cabo en dos sembrados, situados en Jumilla, con coordenadas 38° 33' 13,9" N 1° 21' 16,5" W, y Tomelloso, con coordenadas 39° 11'22,4" N 2° 59' 15,8" W.
Las recomendaciones de fertilización fueron una fertilización convencional con fertilización de fondos con 700 kg de NPK (15-15-15), correspondientes a 105 UFN para todo el ciclo de cultivo.
• Distribución de los tratamientos en los sembrados
Los sembrados tenían la siguiente superficie: Sembrado 1 (1 ha), Sembrado 2 (2,20 ha) y se tomaron dos bloques (es decir, zonas) adyacentes de 16 metros de anchura para la evaluación de los parámetros.
• Características del cultivo y la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención
En el Sembrado 1 la variedad de vid es la petit verdot; en el Sembrado 2 la variedad es la garnacha. La fecha de aplicación de la cepa de la invención fue el 10 de mayo de 2018 (Sembrado 1) y el 15 de mayo de 2018 (Sembrado 2).
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención se aplicó a una dosis de 333 g/ha (3 * 107 UFC/g) mediante aplicación foliar.
La aplicación foliar se llevó a cabo con un nebulizador con 350 litros de caldo por hectárea, cuando la planta estaba en la fase de grano, con una temperatura del aire de 17 y 20°C y una humedad relativa del 20 y el 38%, con una velocidad del viento de 5,4 y 9 mps en dirección sur y noroeste, sin presencia de rocío en las hojas y una nubosidad del 10 y el 25%, respectivamente.
La Figura 12A muestra el nebulizador en el momento de la aplicación del tratamiento o de los tratamientos, y la Figura 12B muestra el tamaño del grano en el momento de la aplicación del tratamiento o de los tratamientos.
• Parámetros y metodología de evaluación
Rendimiento
Para evaluar el rendimiento de la cosecha, se toman 6 bloques al azar y se cosechan 30 metros cuadrados de superficie, pesando las uvas obtenidas en las plantas.
Análisis estadístico
Se analizaron el factor (rendimiento) y su interacción para cada parámetro mediante ANOVA, usando el soporte lógico Statgraphics Plus 5.1 para Windows (Manugistics, Inc., EE. UU.).
• Resultados
Rendimiento
La Tabla 19A y la Tabla 19B, presentadas a continuación, muestra resultados relativos al rendimiento en kilogramos por planta para cada tratamiento.
TABLA 19A - Sembrado 1
Tratamiento Peso total (kg/planta) ° Brix kg/ha
Tratado 6,02 24,8667 16464
Control 5,09 24,5778 13937
TABLA 19B - Sembrado 2
Tratamiento Peso total (kg/planta) ° Brix kg/ha
Tratado 19,77 17,5 49440
Control 14,02 18 35065
Conclusión
En el Sembrado 1, la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención fue capaz de aumentar el rendimiento en un 18% con respecto al control no tratado.
En el Sembrado 2, la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención fue capaz de aumentar el rendimiento en un 41% con respecto al control no tratado.
Ejemplo 6
Experimento 6. Evaluación de los efectos de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención sobre el rendimiento en el cultivo de escarola(Cichorium endivia latifolia,variedad Lempika)
La siguiente prueba fue efectuada por una entidad acreditada independiente para la realización de experimentos GEP. El diseño, el análisis de resultados y la documentación de este estudio se llevaron a cabo siguiendo, siempre que fue posible, las directrices EPPO PP 1/152(4), PP 135(4) y PP 1/181(4).
Información general del experimento
El experimento comenzó el 17 de agosto de 2018 en Vila-Sacra, provincia de Girona, en España, finalizando el 12 de noviembre del mismo año. La fecha del trasplante fue el 21 de agosto de 2018. Se llevó a cabo una fertilización convencional el 23 de agosto, y la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención fue el 28 de septiembre, una vez que el cultivo hubo alcanzado la debida fase de desarrollo (BBCH 17-19).
Diseño del experimento
El experimento consistió en un sistema de bloques aleatorizados con 4 tratamientos y 5 réplicas. Cada sembrado (parcela) elemental tenía 2,5 metros de anchura y 7 metros de longitud, con una superficie de 17,5 m2. Las hileras de las plantas estaban separadas 0,56 metros y el espacio en la hilera era de 0,35 m, dando lugar a un total de 80 plantas en 4 hileras.
Cultivo
Se estudió el efecto de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en el cultivo de endivia(Cichorium endivia latifolia,variedad Lempika). Los cultivos anteriores en ese terreno fueron de cebolla en 2018 y de girasol y lechuga en 2017.
Suelo
El suelo mostró un buen nivel de fertilización:
% MO: 2,02
Textura: suelo franco arcilloso
pH: 7,70
CEC: 0,22
Drenaje del suelo: aceptable
Mantenimiento
En todo el ciclo de cultivo se aplicaron los tratamientos fitosanitarios necesarios para mantener la salud de las plantas. Comentarios estadísticos
El análisis y los informes estadísticos se realizaron con el soporte lógico Agricultural Research Manager (ARM) (desarrollado por Gylling Data Management, Inc.). Los datos evaluados se analizaron usando un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) combinado con una prueba de Student-Newman-Keuls en a = 5% para la comparación de medias. Las medias seguidas por la misma letra no difieren de forma significativa.
Objetivos del experimento
1. - Evaluar los efectos de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención sobre el comportamiento del cultivo y su rendimiento sobre el cultivo de escarola, aplicada con una dosis normal de fertilización o con fertilización reducida.
2. - Comparar los efectos de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención en relación con una fertilización comercial estándar.
3. - Evaluar cualquier efecto imprevisto de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención sobre el cultivo diana.
Resumen del experimento
El objetivo de este experimento era evaluar los efectos de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención (3 x 107 UFC/g) sobre el rendimiento del cultivo de escarola cuando se reduce la dosis de nitrógeno (fertilización). El experimento se realizó en la zona noreste de España, en el municipio de Vila-Sacra (Girona), a campo abierto, en una pequeña zona típica para el cultivo de verduras. El estudio se efectuó respetando los principios de Buenas Prácticas Experimentales definidos por la Normativa 1107/2009 de la Unión Europea.
La cepa de la invención se probó a la misma dosis (300 g de f.p./ha) en tres zonas con diferentes dosis de fertilización nitrogenada (100% (habitual), 60% y 40%), y se evaluó y comparó con un control “no tratado” (con el 100% de fertilización nitrogenada, pero sin la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención).
La fertilización se efectuó antes del trasplante (23 de agosto de 2018). El producto fue aplicado en la fase 17-19 de BBCH (28 de septiembre de 2018), usando una mochila pulverizadora calibrada HONDA WRJ2525.
Se realizaron tres valoraciones del vigor de la cosecha como porcentaje durante el desarrollo de la cosecha. En el momento de la cosecha, o cerca de él, se registraron los parámetros de rendimiento evaluando las dos hileras centrales de las parcelas, con 20 plantas cada una; para las valoraciones no se tuvieron en cuenta las dos hileras del perímetro. Se valoraron el diámetro de la planta (cm), el número de plantas presentes (distinguiendo entre plantas comercializables, no comercializables, muertas y cloróticas), el peso de la planta y la producción (número y kg en las 2 hileras centrales (7,84 m2)). La producción y el número de plantas comercializables por hectárea y el porcentaje de aumento en función del tratamiento sin fertilización estándar (tratamiento 1) se calcularon automáticamente usando el soporte lógico ARM. En todo el experimento se realizaron valoraciones de fitotoxidad y vigor.
La Tabla 20, presentada a continuación, muestra la lista de tratamientos.
En la Tabla 20 se usan las referencias siguientes:
CNT: Control no tratado
FH: Fertilización habitual
F: Fertilización
M.s.: Nueva cepa deMethylobacteriumsp., es decir, la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención Conclusiones
Efectos del producto
Según las condiciones del experimento, puede concluirse que la aplicación de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención con una dosis reducida de nitrógeno obtuvo un aumento numérico del peso medio de la planta (kg) y una producción comercial (número de plantas por hectárea) en comparación con una única aplicación de fertilizante convencional (sin la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención), lo que quiere decir que la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención aportó el nitrógeno necesario para un correcto desarrollo de la planta.
Los tratamientos 3 y 4 lograron un aumento en el rendimiento de la cosecha del 3,8 y el 13,89%, respectivamente, con respecto al tratamiento 1, obteniendo diferencias estadísticas significativas. No se obtuvo ninguna diferencia significativa entre tratamientos con la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención tratamientos con dosis diferentes de nitrógeno en el resto de los parámetros valorados, pese a que los resultados obtenidos sugerían resultados óptimos con una mayor reducción del nitrógeno.
La nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención se aplicó con una dosis de 300 g/ha (3 * 107 UFC/g) cuando las plantas del cultivo tenían entre 7 y 9 hojas (BBCH 17-19).
La cepa de la invención aplicada a razón de 300 g/ha (3 * 107 UFC/g) con fertilización convencional (N = 40%) presentó los mejores resultados del experimento, con un aumento del 13,89% en el rendimiento, con diferencia estadística significativa.
En cuanto a los demás parámetros valorados, no hubo diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos, lo que indica que la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención fue capaz de aportar el nitrógeno necesario para el correcto desarrollo de las plantas.
El uso de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. de la invención reduce la cantidad de fertilización nitrogenada requerida en los cultivos, dado que los resultados de los parámetros evaluados fueron similares o aun superiores a los obtenidos con fertilización convencional.
Ejemplo 7. Proceso para la producción de una composición ejemplar según la invención
• Recuperar la nueva cepa deMethylobacteriumsp. en un medio NFBG (medio bacteriano carente de nitrógeno complementado con glucosa).
Parámetros de desarrollo:
oTemperatura de desarrollo 20-35°C.
oTiempo de incubación 5 - 7 días.
• Seleccionar una colonia rosada-roja aislada y volver a sembrarla en un medio MMMNF (medio mínimo con metanol carente de nitrógeno) selectivo.
Parámetros de desarrollo:
oTemperatura de desarrollo 20-35°C.
oTiempo de incubación 5 - 7 días.
• Seleccionar una colonia aislada (rosada-roja) y volver a sembrarla en un medio MMM (medio mineral mínimo con metanol) para desarrollar un cultivo líquido para ser usado como preinóculo.
Parámetros de fermentación:
oTemperatura de desarrollo 20-35°C.
oAgitación (r.p.m.) 50-250.
oTiempo de fermentación 5 - 7 días.
• Inoculación de todo el volumen del biorreactor con el preinóculo del microorganismo.
Parámetros de fermentación:
oTemperatura de desarrollo 20-35°C.
oAgitación (r.p.m.) 50-250.
oAireación 0,3-3,2 N*m3/h.
oTiempo de fermentación 80-130 horas.
• Mezclar con los vehículos y secar por aspersión.
• Cada litro de caldo fermentado con el microorganismo se mezcla con vehículos agrícolamente aceptables.
• A continuación, secar la mezcla usando secado por aspersión según los siguientes parámetros de secado:oCaudal de alimentación 7-11 ml/l.
oCaudal de aire comprimido 225-375 l/h.
oCaudal de aire de secado 35-50 m3/h.
oTemperatura de entrada 100-180°C.
oRendimiento del ciclón 25-40%.
• Mezclar los productos para la formulación del producto final
Cada gramo de producto seco (polvo microorganismo) es mezclado con los siguientes coformulantes, hasta la obtención de 101-550 g de producto final, para ser usado en la fertilización de una hectárea:
o1-50 g de coformulante agrícolamente aceptable.
o100-500 g de vehículo agrícolamente aceptable.
La Tabla 21, presentada a continuación, muestra la composición en g/l de los medios de cultivo usados en todo el proceso de elaboración.
Los componentes esterilizados por filtración se añaden después del tratamiento en autoclave, una vez que el medio de cultivo haya enfriado hasta una temperatura < 60°C.
La Tabla 22, presentada a continuación, se refiere a la cantidad en gramos de los micronutrientes y las vitaminas.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. La nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580.
2. Una composición que comprende una nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580.
3. La composición según la reivindicación 2 que, además, comprende uno o más vehículos agrícolamente aceptables y/o uno o más coformulantes agrícolamente aceptables.
4. La composición según la reivindicación 3 en la que dicho vehículo y/o coformulante se selecciona del grupo constituido por talco, arcilla, maltodextrina, leche desnatada, glucosa, extractos secos vegetales, como los de té, yuca y quinua, caolín, fibra de coco, tierra de diatomeas, quitina, CaCO3, alginato, carragenos, surfactina, ramnolípido, soforolípido, saponina, oleato de potasio y mezclas de los mismos.
5. La composición según la reivindicación 2, estando dicha composición en una forma seleccionada entre una forma sólida, una forma líquida acuosa, una forma líquida oleosa, una forma de emulsión, una forma semisólida o una forma de gel.
6. La composición según la reivindicación 5 en donde dicha composición está en forma sólida.
7. La composición según la reivindicación 6 en donde dicha composición está en forma de polvo.
8. La composición según la reivindicación 2 caracterizada por el hecho de que se aplica como recubrimiento de semillas, mediante aplicación en el suelo, preferiblemente mediante un sistema de riego por goteo o por empapamiento, o mediante aplicación foliar.
9. Un proceso para la producción de una composición según la reivindicación 2 que comprende las siguientes etapas:
• proporcionar al menos una nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580 según la invención,
• inocular dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. en un medio líquido de cultivo, incluido el metanol,
• cultivar dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp. para obtener un cultivo líquido que comprendeMethylobacteria, •secar dicho cultivo líquido para obtener una composición seca.
10. El proceso según la reivindicación 9 en donde dicha nueva cepa deMethylobacteriumsp., depositada con el número de entrada CECT 9580, se aísla del interior de las esporas del hongo micorrízicoGlomus iranicumvar. tenuihypharum, depositado con el número de entrada BCCM 54871.
11. El proceso según la reivindicación 9 que, además, comprende una etapa de adición de uno o más vehículos agrícolamente aceptable al cultivo líquido que comprendeMethylobacteriaantes de secarse.
12. El proceso según la reivindicación 9 que, además, comprende una etapa de adición de uno o más coformulantes agrícolamente aceptables.
13. El proceso según la reivindicación 12 en donde se agregan dichos uno o más coformulantes agrícolamente aceptables a dicha composición seca.
14. El uso de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. según la reivindicación 1 como bioestimulante en plantas.
15. El uso según la reivindicación 14 en donde dichas plantas son cultivos hortícolas, cultivos extensivos herbáceos y de gramíneas, cultivos leñosos como la vid, las bayas, y leguminosas.
16. El uso según la reivindicación 14 para aumentar el rendimiento de dichas plantas.
17. El uso de la nueva cepa deMethylobacteriumsp. según la reivindicación 1 para reducir el aporte externo de nitrógeno hasta un 60%.
18. El uso de una composición según la reivindicación 2 como bioestimulante en plantas.
19. El uso según la reivindicación 18, en donde dichas plantas son cultivos hortícolas, cultivos extensivos herbáceos y de gramíneas, cultivos leñosos como la vid, las bayas, y leguminosas.
20. El uso según la reivindicación 18 para aumentar el rendimiento de dichas plantas.
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