JP2022538745A - メチロバクテリウム属の菌株と、それを含む組成物と、生物刺激性およびエンドファイトの窒素固定用バクテリアとしてのその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】メチロバクテリウム属の菌株とそれを含む組成物と、作物に好影響を与える新種およびそれを構成する組成物を提供することである。更にメチロバクテリウム属の菌株を提供し、少なくとも化学窒素ベースの肥料の使用量を減らすことである。【解決手段】上記目的を達成する菌株は、受付番号（accession number）CECT9580で寄託されたメチロバクテリウム属（Methylobacterium sp.nov.）の菌株である。更にそれを含む化合物である。更にその使用である。【選択図】 図１

Description

本発明は、農学分野に関する。具体的には、メチロバクテリウム属（Mechylobacterium sp. nov.）の菌株（strain）と、それを含む組成物と、植物の生物刺激性およびエンドファイトの窒素固定用バクテリアとしてのその使用に関する。

多くの肥料が農業の分野では知られている。特に、窒素ベースの肥料、例えばアンモニア、硝酸アンモニウム（NH₄NO_３）、尿素等は、作物の収量を可能な限り高く維持するために一般的に使用されている。実際、植物の多くの生物学的プロセスには窒素が関係している。 例えば、窒素は、アミノ酸、従ってタンパク質の生産に関与している。

しかし、作物に施用される窒素ベースの肥料のごく一部だけが植物関連に変換されるに過ぎない。植物関連に変換されない肥料は、土壌に蓄積したり、地表水や地下水に流出したりして、水質汚染を引き起こすことがある。

化学肥料の使用量を減らすために、窒素固定細菌を含む接種物（inoculant）を使用して、そのような化学肥料を一部置換できる。

メチロトローフ細菌（methylotrophic bacteria）の主な貯蔵場所は、一般に、土壌と水 (塩分の有無を問わない)であるが、これらの細菌は、さまざまな自然環境や人工環境にも存在する。例えば、ほこり、湖の堆積物、空気、洗顔用クリーム、発酵製品など、給水網、洗面室、空調システムに存在する。

ただし、既知の接種物では、植物の成長刺激において満足のいく結果が得られず、化学肥料の置換もそのような化学製品の使用の大幅な削減もできない。

成長刺激剤又は窒素固定として機能する既知の微生物（microorganism）のほとんどは、大量の窒素含有を達成できず、植物の成長に必要な窒素単位を大幅に減らすことはできない。これらの既知の微生物は、インドール酢酸（indole acetic acid）のようないくつかの種類のオーキシン（auxin）を生成し、窒素固定よりも発根を促進する。
ＵＳ２０１５／１０１３７３Ａ１ ＫＲ２００７ ０１０６８６７Ａ ＵＳ２０１８／１６８１６７Ａ１ ＷＯ２０１５／０００６１２ ＷＯ２０１５／０００６１３ SI-W ON LEE ET AL：「飲料水から分離されたメチロバクテリウム・ダンコケンセ（Methylobacterium dankookense sp．nov.）」THE JOURNAL OF MICROBIOLOGY、vol．４７、ｎｏ．6、（2009-１2-0１）、ページ7１6-720、XP055３5.0３64、ＤＯＩ：１0.１007/Ｓ１2275.009-0１26-6

特許文献１は、メチロバクテリウムNRRLB-5.0628およびN RRLB-5.0629を促進する窒素固定および植物成長を開示する。
特許文献２は、窒素固定と植物成長を促進するMethylobacterium fujisawaense CBMB20を開示する。
特許文献３は、植物成長促進菌類Glomus Iranicum var. tenuihypharum ＢＣＣＭ5487１を開示する。
非特許文献１は、メチロバクテリウム・ダンコケンセの酵素活性と遺伝的類似性を開示する。

本発明の目的は、メチロバクテリウム属の菌株とそれを含む組成物と、作物に好影響を与える新種およびそれを構成する組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、メチロバクテリウム属の菌株を提供し、少なくとも化学窒素ベースの肥料の使用量を減らすことである。
これらおよび他の目的は、請求項１に記載のメチロバクテリウム属によって達成される。

以下の説明では、本発明の特徴は、例示的な一実施例を参照して説明される。 しかしながら、本明細書に開示される本発明の特徴は、本発明の更なる一実施例を提供するために、本明細書に開示される１つまたは複数の他の特徴と組み合わせることができる。従って、本発明の目的／対象は、受付番号ＣＥＣＴ９５８０で寄託されたメチロバクテリウム属の菌株である。

本発明のメチロバクテリウム属の菌株（以下「本発明の菌株」とも称する。）は、寄託者によって参照番号ＳＢ００２３／３で特定されたが、２０１８年３月２１日に国際寄託機関であるColeccion Espanola De Cultivos Tipo （CECT）、Edificio ３ CUE、Parc Cientific Universitat de Valencia（住所：Catedratico Agustin Escardino 9, 46980 Paterna (Valencia) Espana）に、本出願人により番号ＣＥＣＴ９５８０として寄託された。

本発明の菌株は、菌根菌（mycorrhizal fungus）グロムス イラニカム バー．テヌイハイファラム（Glomus iranicum var. tenuihypharum）の胞子（spore）の内部から単離された。このグロムス イラニカム バー．テヌイハイファラムは、当技術分野で知られているアーバスキュラー菌根菌（arbuscular mycorrhizal fungus）である。このグロムス イラニカム バー．テヌイハイファラムは、２０１３年４月１９日に、本出願人により、ＢＣＣＭ寄託番号５４８７１で、国際寄託機関であるBelgian Coordinated Collections of Micro-Organisms（ＢＣＣＭ）（住所：Universite Catholique de Louvain）、Mycothque de I’Universite catholique de Louvain (MUCL）(住所：Croix du Sud 2、Box L7.05.06、1348 Louvain-la-Neuve）に寄託された。
グロムス イラニカム バー．テヌイハイファラムは、特許文献４、５に開示されている。

本発明による菌株は、メチロバクテリウム・ダンコケンセ（Methylobacterium dankookense）と高い（１６Ｓ世代のシーケンスに基づいて９８．７％の）類似性を示す。

ＵＢＣＧによる系統発生学的分析によれば、メチロバクテリウム・ダンコケンセは本発明の菌株に最も近いものであることを示した。収集されたデータは、本発明の菌株を含む新種の創成を支持し、そのために、例えば、メチロバクテリウム・シムバイオエンス（Methylobacterium symbioense nov）という名前が提案された。

それが新種と見なすことができるかどうかを実証するために、表現型および遺伝子型の特徴づけをアッセイした。

本発明の菌株はグラム陰性（Gram-negative）であり、厳密に好気性であり、それは、側面べん毛（lateral flagellum）を有する桿菌（ballius、幅０．８～１μｍ、長さ１．２～１．６μｍ）の形状であり、胞子形成のない個別または２つの対として示される。ＭＭＭ寒天培地またはNFbM寒天培地で５－７日間増殖させたコロニーは、明確な境界線を持つ円形のピンク色である。これは他の類似の菌株ではこれまでは説明されていない。最適温度は２８℃である。ＮａＣｌの存在下では成長速度は３％まで低下するが、それ以上の濃度では成長しない。

複数遺伝子のゲノムベースの系統発生的アプローチが、ＵＢＣＧツールを使用することにより行われ、本発明の菌株ＣＥＣＴ９５８０に最も近い種をより明快に同定した。本発明による菌株の位置は、属内の近縁種の１５のゲノムを含むＵＢＣＧツリーで調査された。ツリー（図１３）は、Methylobacterium dankookense との特定の関係を示す。

有利なことに、一実施例によれば、本発明による菌株は、植物に窒素を供給できる（外部窒素投入量を６０％まで減少させる）内生又はエンドファイトの窒素固定細菌（endophyte nitrogen-fixing bacteria）であるという事実によって特徴付けられる。言い換えれば、本発明の菌株は、前記菌株が存在しない場合に必要となる外部窒素投入量に関して、外部窒素投入量を最大６０％削減できる。

有利なことに、本発明の株は、植物を根から葉に移動でき、その逆もできる。

本発明の菌株を単離するプロセスは、以下のステップを含む。
（ａ）グロムス イラニカム バー．テヌイハイファラムの胞子を提供するステップ、
（ｂ）細胞質（cytoplasm）を胞子（spore）から抽出するステップ、
（ｃ）抽出した細胞質をメタノール含有培地に接種するステップ、
（ｄ）接種した培地を培養して本発明の菌株であるメチロバクテリウム属を増殖するステップ。

一実施例によれば、本発明の菌株を単離するプロセスは、以下のステップを含む。
（Ｘ）グロムス イラニカム バー．テヌイハイファラムの胞子を、外部消毒サイクルのプロセスを介して以前に表面消毒されたものから、分離して、胞子溶液を得るステップ、
（Ｙ）前記ステップの後、前記胞子溶液を浸軟し（macerated）、真菌の細胞質（fungal cytoplasm）を最小塩メタノール培地（Minimum salt Ｍethanol Medium）（以下「ＭＭＭ」と称する）で培養するステップ、
（Ｚ）本発明の菌株のコロニーを同定し、ピンク色を示したものの１つが拾い上げ、前記培地から再単離するステップ。

一実施例によれば、ステップ（ｂ）の前に、胞子を消毒剤で処理して胞子の外壁を消毒してもよい。

胞子の外壁の消毒は従来技術で実施できる。例えば胞子の外壁の消毒は、胞子を次亜塩素酸ナトリウム（sodium hypochlorite）で処理することによっても実施できる。次亜塩素酸ナトリウムの一例は、緩衝液中の５％次亜塩素酸ナトリウム溶液例えばＴｗｅｅｎ （登録商標）８０である。

グロムス イラニカム バー．テヌイハイファラムの胞子からの細胞質の抽出は、従来技術で実施できる。例えば胞子を適切な緩衝液（好ましくはリンゲル液）中で浸軟させることによって実施できる。

ステップ（ｃ）の最小塩メタノール培地（ＭＭＭ）は、以下の組成を有するのが好ましい。
メタノール；20.0ml、
NaNO_３；0.5g、
(NH₄)₂SO₄; 0.5g,
M gSO₄-7H₂O; 0.5g,
K₂HPO₄; 1.0g,
FeSO₄-7H₂O; 0.01g,
CaCI₂-2H₂O; 0.01g,
KCI; 0.5g,
ビタミン溶液; 1.0 ml;
微量栄養素溶液; 2.0ml,
寒天; 12g,
pH7.20である。
ステップ（ｄ）は、好ましくは２８℃で５日間培養され、本発明の菌株であるメチロバクテリウム属を増殖する。

一実施例によれば、培養は２５℃から３０℃の範囲の温度（好ましくは２８℃）で実施される。
一実施例によれば、培養は、ｐＨ５から９（好ましくはｐＨ７）の範囲で実施される。

ステップ（ｄ）後、本発明の菌株のコロニーを典型的なピンク色の発色によって視覚的に識別する。次に１つまたは複数のコロニーをピックアップして再分離し、これを少なくとも３回繰り返し、汚染の可能性がないことを確認する。
本発明の菌株は組成物に含めるのに適したものになる。

本発明の別の目的は、受付番号ＣＥＣＴ９５８０で寄託されたメチロバクテリウム属の菌株を含む組成物である。
一実施例によれば、本発明の組成物は、農業的に許容される担体（carrier）又は農業的に許容される共製剤（co-formulant）を含んでもよい。
これらの担体および共製剤は従来公知である。

一実施例によれば、担体又は共製剤は、タルク、粘土、マルトデキストリン、脱脂乳、グルコース、茶、カッサバおよびキノアなどの植物性乾燥抽出物、カオリン、コイル、珪藻土、キチン、CaCO_３、アルギン酸塩、カラゲン、サーファクチン、ラムノリピド、ソホロ脂質、サポニン、オレイン酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される。

一実施例によれば、組成物は、固体形態、水性液体形態、油性液体形態、乳濁液形態、半固体形態、またはゲルの形態のいずれでもよい。
好ましくは組成物は固体形態である。より好ましくは、組成物は粉末形態である。
本発明の目的は、本発明の菌株（即ち、受付番号ＣＥＣＴ９５８０で寄託されたメチロバクテリウム属の菌株）を含む組成物を生産する方法である。

一実施例によれば、本発明の組成物の特徴は、種子コーティングとして、例えば点滴灌漑システムまたは水浸による土壌施用によって、または葉面施用によって施用されることである。

本発明の組成物を生産する方法は、以下のステップを含む。
（Ａ）受付番号ＣＥＣＴ９５８０で寄託されたメチロバクテリウム属菌（以下「本発明の菌株」とも称する）を提供するステップ。
（Ｂ）前記メチロバクテリウム属菌をメタノール含有液体培地に接種するステップ。
（Ｃ）前記メチロバクテリウム属菌を培養しメチルバクテリアを含む液体培養物を得るステップ。
（Ｄ）前記液体培養物を乾燥させて乾燥組成物を得るステップ。

有利なことに、前記ステップ（Ｃ）の終わりに、本発明のメチルバクテリア（Mechylobacteria）の最終生成物は、培養中の細菌の光学密度およびバイオマス生産を測定することによって、確認される。

一実施例によれば、受入番号ＣＥＣＴ９５８０で寄託された本発明のメチロバクテリウム属菌は、ＢＣＣＭ寄託番号５４８７１で寄託された菌根菌グロムス イラニカム バー．テヌイハイファラムの胞子の内部から単離される。
一実施例によれば、メタノール含有培地は、ＭＭＭＭ（即ちメタノールを含む最小ミネラル媒体：Minimal Mineral Medium with Methanol）である。
一実施例によれば、前記ステップ（Ｃ）は、培養によって実施することができる。２５℃－３０℃の範囲の温度（好ましくは２８℃）で３～１０日間（好ましくは５～７日間）培養する。

一実施例によれば、ステップ（Ａ）は、（Ａ１）窒素を含まない培地を使用して本発明の菌株を回収するステップを含む。窒素を含まない培地の一例は、ＮＦＢＧ培地（グルコースを補充した窒素を含まない細菌培地；Nirogen Free Bacterial Medium supplemented Glucose）である。このＮＦＢＧ培地は以下の組成を有する。
グルコース、
リンゴ酸; 5.0ｇ、
メタノール; 20.0 ml、
(NH₄）₆MO₇O₂₄ 4H₂O; 0.002g、
MgSO_4;7H₂O; 0.2g、
K₂HPO₄ ; 0.1g、
KH₂PO₄ ; 0.4g、
FeCl_３;0.0１g、
NaCl; 0.1g、
KOH; 4.8g、
微量栄養素ゾル; 2.0 ml、
ビタミンゾル; 1.0ml
ブロモチモール・ブルー・ゾル：0.5%
後者の３つは、KOH 2N; 2.0mlに対してである。
ｐＨ６．９

一実施例によれば、前記ステップ（Ａ１）の実施は、２５℃から３０℃の範囲の温度（好ましくは２８℃）で３～１０日間（好ましくは５～７日間）の培養によって実施できる。
有利なことに、本発明の菌株は赤ピンク色のコロニーを形成する。従って本発明の菌株のコロニーは容易に同定できる。
一実施例によれば、前記ステップ（Ａ）は、
（Ａ２）本発明の菌株のコロニーを選択するステップと
（Ａ３）窒素不含有メタノール含有培地を用いて本発明の菌株を選択的に増殖させるステップ
を含む。窒素不含有メタノール含有培地の一例は、ＭＭＭＮＦ即ちメタノールを含むが窒素を含まないミネラル最小培地である。

一実施例によれば、ステップ（Ａ３）の後、本発明のメチロバクテリウム属のコロニーを選択し、メタノールを含む液体培地に接種することができる。
一実施例によれば、ステップ（Ａ３）は、２５℃から３０℃の範囲の温度（好ましくは２８℃）で３～１０日間（好ましくは５～７日間）培養することによって実施できる。

一実施例によれば、ステップ（Ｃ）は、発酵（fermentation）によって行うことができる。
一実施例によれば、ステップ（Ｃ）は、下記の第１と第２のステップで実施できる。
第１ステップは前接種物として使用されるメチロバクテリウム属の培養物を得る。
第２ステップは発酵により大量増殖する。

本発明の更なる目的は、受付番号ＣＥＣＴ９５８０として寄託された本発明のメチロバクテリウム属の菌株（以下「本発明の菌株」とも称する。）の植物における生物刺激剤又はエンドファイト窒素固定細菌としての使用である。

実際驚くべきことに、本発明の菌株ならびにそれを含む組成物は、植物を刺激すると、植物の健康および収量を増加させることが観察された。

また有利なことに、本発明の菌株ならびにそれを含む組成物を使用して、植物に窒素を供給できることが観察された。特に本発明の菌株を植物に提供することにより、化学窒素肥料の使用を大幅に減らすことができることが観察された。 例えば本発明の菌株またはそれを含む組成物を使用して、化学窒素肥料の使用量が最大６０％減少させることができる。

本発明の目的は、窒素外部投入を好ましくは６０％まで低減する発明の菌株の使用である。
有利なことに、本発明の菌株は、植物に単独でまたは他の農業的に許容される成分を含む組成物の成分として提供できる。

本発明の菌株は、大気中の窒素を固定することにより、植物の根又は地上部分を刺激できることが観察されている。特定の科学的説明から縛られることはないが、本発明の菌株が植物の組織に浸透し、大気中の窒素をN H₄ ⁺に還元するニトロゲナーゼ酵素複合体（nitrogenase enzyme complex）を含む微生物酵素系（Microbial enzymatic system）を活性化することが観察された。N H₄ ⁺は、特定の生理学的条件下で、Glu（グルタミン酸）に直接組み込まれる。これは、ミトコンドリアのGluデヒドロゲナーゼ（NADH-GDH）を介した２－オキソグルタレート（2-oxoglutarate）のアミノ化（amination）により行われ、その後、サイトゾル・グルタミン・シンテターゼ１（cytosolic glutamine synthetase）（GS１）によってグルタミンに組み込まれる。グルタミン・オキソグルタル酸・アミノトランスフェラーゼ（Glutamine OxoGlutarate AminoTransferase）は、GOGATと略される酵素であり、グルタミンとα-ケトグルタル酸（α-ketoglutarate）からグルタミン酸（glutarate）を生成し、グルタミン・シンテターゼと共に、植物が同化する光合成における窒素同化の調節において中心的な役割を果たす。

有利なことに本発明の菌株は、リンの溶解度を増加させ（これは実生段階で特に有用である）、二次根の発達を刺激するオーキシン（auxin）およびカロテン（carotene）を生成ができることも観察された。

有利なことに、本発明の菌株は、様々な作物に提供され得る。例えば、園芸栽培、イネ科植物栽培、柑橘類栽培、核果（drupe）の栽培、つる栽培、林業に提供される場合に特に有用である。

本発明の菌株の別の利点は、本発明の菌株が宿主植物における光合成を促進し、従って植物バイオマスの増加を促進することである。

成長室内の胞（alveoli）が成長している植物を示す。 メチルバクテリアの増殖のために消毒した後、特定の培地に曝露された野菜組織サンプル（根（a）、茎（b）、葉（c））を示す。 本発明の菌株で処理した植物の植物組織サンプルの画像を示す。これは、メチロバクテリア用の特定の栄養培地に曝される条件で、シードドレッシング（a-c）、灌漑(d-f)、葉面散布(g-i）により行われた。 本発明の菌株による処理１ と対照処理２を用いた試験の分布の画像を示す。ａは農場１ を、ｂは農場2を、ｃは農場３を示す。 ３０日間の適用後のＳＰＡＤ測定値のグラフを示す。 農場１（a）、農場２（b）、農場３（c）のＮＤＶＩ指数を示す。 農場１（a）、農場２（b）、農場３（c）のＣＲＩ指数の組み合わせを示す。 本発明の菌株を用いた処理１ と対照を用いた処理2による試験の分布の画像を示す。農場１ (a）、農場２（b）。 ３０日間の適用後のＳＰＡＤ測定値のグラフを示す。 １５日毎に測定された４５日間の処理後の農場１の指数ＮＤＶＩを示す。 １５日毎に測定された４５日間の処理後の農場２の指数ＮＤＶＩを示す。 図１２Ａは、処理を適用した時点の噴霧器（nebulizer）を示し、図１２Ｂは、処理を適用した時点の粒子サイズを示す。 アミノ酸配列を使用してＵＢＣＧで生成された系統樹（phylogenetic tree）を示す。ノードの数字は遺伝子サポート指数（最大値は９２）を示す。ゲノム受付番号は括弧内に示す。位置毎に０．０５置換。

実験の説明
本発明の菌株は、グロムス イラニカム バー．テヌイハイファラム（Glomus iranicum var. tenuihypharum）の胞子から得られた。
本発明の菌株は、胞子の内側から、胞子の外壁を数回消毒するプロセスを経て、単離した。このプロセスは、０．５％次亜塩素酸ナトリウムとTween80で５分間洗浄し、５回の消毒サイクルを実行して、行った。その後、胞子溶液を浸軟させ、真菌細胞質（fungal cytoplasm）をＭＭＭ（この組成は段落００２５で記載のとおりである。）に２８℃で５日間接種した。この培地から５つの異なるコロニーが特定され、ピンク色を示したコロニーがピックアップされ、少なくとも３回再分離されて、他の汚染はないことを確認した。

例１
試験１．本発明の菌株の適用経路。
本発明の菌株、即ち受付番号ＣＥＣＴ９５８０で寄託されたメチロバクテリウム属菌を適用して、培養室内で実験が行われた。これは、葉面散布（foliar application）、土壌散布（soil application）、種子コーティング（seed coating）（又は種子ドレッシング）による。
本発明の菌株の存在は、葉、茎および根で評価された。植物における菌株の移動時間、即ち根から葉へと葉から根への菌株の移動時間、ならびに根の気孔および種子を通る菌株の浸透も評価された。

メチルバクテリアの植物への侵入および異なる組織のコロニー形成を裏付けるために、胞状部（alveoli）に種子を接種し、培養ポットにトウモロコシ植物（maize plant）を接種する試験を実施した。この場合、３つの処理が適用された。即ちシードコーティング、灌漑による適用、葉面適用である。本発明の菌株のコロニーの存在を、接種後の異なる時間および日（「h.a.i.」および「d.a.i.」）に、３つの生物学的レプリカの根、茎および葉で分析した。

材料および方法
使用される植物材料および微生物。
トウモロコシ種子（Zea mays L.）を、これはフルディオキソニル（Fludioxonil）およびメフェノキサム（Mefenoxam）の殺菌剤でコーティングしたものであるが、植物材料として使用した。本発明の菌株とヘルバスピリウム・セロペディカエ（Herbaspirillum seropedicae）に属する細菌（以下「窒素固定細菌」とも称する）を微生物接種物（microbial inoculant）として使用した。

トウモロコシの生育条件。
トウモロコシ植物の成長には、小型のプラスチック容器を使用した。この容器はケイ砂とココナッツファイバーを２：１の比率で混合したものをベースにした滅菌培地（sterile substrate）で満たされ、２４℃相対湿度（ＲＨ）６０％の成長室内に光の存在下で４週間配置された（図１）。植物は滅菌脱灰水（sterile decalcified water）を週２回与えられた。播種から１５日後、植物に０．３％の栄養溶液（比率N：P：K：4：17：4.5）と微量栄養素の溶液を１回だけ与えた。

トウモロコシ植物における本発明の菌株による処理。
異なる処理をトウモロコシ植物に対し本発明の菌株で行った。種子コーティング（即ち種子ドレッシング）、灌漑、および葉面散布（即ち葉面経路）によって行い、接種物は固体形態（粉末）で使用された。この粉末中の細菌濃度は１ｘ１０^９ＣＧＦＵ／ｇのオーダーであった。実験された各処理は陰性対照（negative control）としての未処理植物と比較された。更に固体形態濃度１－１．２ｘ１０^６ＣＦＵ／ｇの窒素固定細菌を実験の陽性対照（positive control）として使用した。

ａ）シードコーティング
トウモロコシの種子は、本発明の菌株の粉末接種物でコーティングした。

ｂ）灌漑ルート
播種の後４日後、本発明の菌株と窒素固定細菌を、植物あたり１－１．２ｘ１０^６ＣＦＵ／ｇの間の濃度で、灌漑により接種した。このために、固体形態の細菌接種物は、水で希釈し更に処理した。

ｃ）葉状ルート
植物に２－３枚の本葉が出た時に、分類ＢＢＣＨ１２－１３の本発明の菌株と窒素固定細菌を葉の経路で接種した。固形細菌接種物は水で希釈して植物あたり１－ｘ１０^６ＣＦＵ／ｇの濃度にした。この前に、培地はプラスチックで覆い処理による汚染を防いだ。細菌処理は噴霧器で葉に噴霧することによって実施された。

＊根、茎および葉における本発明の菌株のコロニーの検出。
本発明の菌株による処理後、この細菌の存在を、異なる植物組織におけるその陽性対照の窒素固定細菌と共に、分析した。これらは誤陽性を避けるために表面を消毒した。そのため、それらをエタノール（７０％）と次亜塩素酸ナトリウム（１％）の溶液に３０秒又は２分間浸漬し、その後２回蒸留水で洗浄した。消毒（根と葉を）した後、縦方向と横方向の切り込みを茎に入れ、メチロバクテリア用の特定の培地に移した。図２は、消毒後、特定の培地に曝露された植物組織サンプルを示す。これはメチロバクテリアの増殖のためである。特に、図２のパネル「ａ」は根のサンプルを、パネル「ｂ」は茎のサンプルを、パネル「ｃ」は葉のサンプルを示す。培地に入れた組織サンプルを２８℃で７日間培養した。 コロニーの成長は、Leica Wetzlar社製のステレオ顕微鏡で観察し、Leica Wetzlar社製カメラM C170Hで写真を撮った。植物は、分析のために、初日の１－２４時間、および接種（灌漑および葉面）または発芽（コーティング） 後２－１０日の間に収穫された。３つの生物学的レプリカが、分析された３つの処理と時間のそれぞれに使用された。

＊得られた結果の統計分析
実験結果の統計分析を得るために、使用された方法は単純なAN O V Aであった。これにはｐ＜０．０５の有意水準での最小有意差のフィッシャーの直接確率検定を伴う。
ソフトウェアSTATGRAPH ICS Centurion18が使用され、データ処理とグラフィック表現にはMicrosoft社のExcelが使用された。

＊結果
本発明の菌株の適用の効果：植物の感染およびコロニー形成。

ａ）シードドレッシング
コーティングにより接種した処理植物の細菌コロニーを検出する最初の評価は、４８時間経過時に行われ、これは種子の発芽時（time of germination）と一致していた。
分析により解ったことは、２日後に本発明の菌株は内部組織に存在し、４日後にそれらは茎内にあり、６日後にそれらは葉に現れたことである。従って、植物が発育するにつれて、細菌の新しい構造への通過が起こった。

ｂ）灌漑
灌漑による接種の場合、細菌は、根の内部組織に１時間経過時に存在し、処理後４－８日の間に茎に上昇し、葉に１０日で到達した。この場合、全てのレプリカで均一ではなかったことは強調すべきである。

ｃ）葉状ルート
葉の経路では、細菌は、接種後１時間で葉の内部組織に見られ、処理の６時間後には茎と根の両方で検出された。
図３は、本発明の菌株で処理し、メチロバクテリア用の特定の栄養培地への曝露された植物の組織サンプルの画像を示す。同図は、種子ドレッシング（ａ－ｃ）、灌漑（ｄ－ｆ）および葉面散布（ｇ－ｉ）を示す。

表１は、本発明の菌株の植物の異なる部分での１０日間に渡るコロニーの検出に関連するデータを示す。
凡例、Ｈ：時間、ｄ：日、細菌の存在が２０－４０％は＋、５０－８０％は＋＋、９０－１００％は＋＋＋、Stem A：アピカルステム（Apical Stem）、Stem B：ベーサルステム（Basal Stem）。

＊結論
この試験では、微生物の侵入は根域と地上部分の両方で効果的であると判断される。従って、どんな方法で処理された植物でも本発明の菌株のコロニーが特定された。これは、このエンドファイト微生物（endophyte microgram）が根から葉にそしてその逆に輸送されることを示している。

例２試験２：長周期のトウモロコシの栽培における窒素肥料の４０％の削減における本発明の菌株の使用の有効性。
＊目的。
コーン（トウモロコシ）の発育に対する本発明の菌株の有効性を知ること。これは、従来の栽培条件での窒素被覆施肥の４０％の削減に対する効果であり、葉の緑色 （ＳＰＡＤ） の進化、植生指数、植物の窒素レベル、葉の微生物濃度、生産量を介して行われた。

＊材料および方法
試験場と施肥。
この試験は、スペインのウエスカ（Huesca）にある３つの農場で実施された。
ウエスカのモンテスシン（Montesusin）にある第１の農場は、北緯４１°５２′１２．７″西経０°２３′１１．１″にある。
ウエスカのベルバー・デ・シンカ（Belver de cinca）にある第２の農場は、北緯４１°４０′４７．６″西経０°１７′０９．５″にある。
ウエスカのタメリテ・デ・リテラ（Tamarite de litera）にある第３の農場は、北緯４１°４７′５８．１″西経０°２３′５６．０″にある。

推奨される施肥は、従来の施肥と窒素を４０％削減した処理であった。この目的のために肥料は、表２に指定された量を肥料散布機で配布された。
表２は、各区画の各肥料で使用された肥料の量、種類、窒素肥料単位（NFU）を示す。

＊農場での処理の分布。
農場の面積は、農場１（５．４３ｈａ）、農場２（３．２８ｈａ）、農場３（２．３４ｈａ）であった。幅１６ｍの２つの隣接する領域が設けられ、パラメータの評価が行われた。「１」の印の領域は処理済み領域であり、「２」の印の領域は対照領域である。図４は、本発明の菌株による処理１（領域１）と対照である処理２（領域２） でのテストの分布を示す。特に、図４のパネル「ａ」は農場１を、パネル「ｂ」は農場２を、パネル「ｃ」は農場３を示す。

＊長周期のトウモロコシにおける本発明の菌株の培養と施肥の特徴。
トウモロコシの種子（Zea mays）は、品種「４０Ｆ」の穀物用に選択された。植え付け比は３００ｋｇ／ｈａで、播種は、深さ３ｃｍ、列の間が７５ｃｍ、同一列の間隔は１５ｃｍで行われた。各播種レーンの幅は、スプリンクラーの間の１６ｍである。播種日は２０１８年５月１日から５日の間で、５日後に茎が出現し、本発明の菌株の散布日は、播種後４０日の２０１８年６月１２日であった。スペインのトウモロコシ栽培の代表的な地域である農場（農民によって指示された畑）でシードドリルを使用して播種された。ランダムな設計が、各処理用の農場のプロットを選択して行われた。

本発明の菌株は、葉面散布によって３３３ｇ／ｈａ（３ｘ１０^７ＣＦＵ／ｇ） の用量で散布し、窒素施肥を４０％減少させた。結果を従来の施肥処理と比較した。葉面散布は、１ヘクタール（ｈａ）あたり３００－４００リットルのブロス（broth）を噴霧する噴霧器で行った。これが行われたのは、植物がＢＢＣＨスケールのステージ１３～１４にあり、気温が１７℃、相対湿度が５２％、北方向に風速が２．３ｍｐｓで、葉に露がなく６０％の曇りの時であった。

＊パラメータと評価方法
葉１グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）のカウント
このパラメータは、微生物が、培養サイクル全体を通して存在し、葉にどのくらいの量があるかを確認するために測定された。これは、２０本未満の植物の４番目の葉から１グラムの葉を取り、段階希釈（serial dilution）により測定された。この段階希釈は、それらを窒素不含有で炭素源としてのメタノールを含有する選択培地に播種することによって行われた。

ＳＰＡＤ （葉のクロロフィル・レベル（chlorophyll level））
このパラメータは、植物の良好な栄養状態の指標であり、窒素と鉄のレベルと密接に関連している。このために、ＳＰＡＤ（Soil Plant Analysis Development）として知られるパラメータを使用し、各処理の１００本未満の植物の４番目の葉を１００回測定した。

葉、茎、穂軸の穀物中の窒素
このパラメータは、収穫時に蓄積された各植物組織の窒素量の指標である。１００個の植物から葉、茎、穂軸の穀物を採取して、ケルダール法（kjeldahl’s method）で総窒素を分析した。

ドローンの写真（異なる指数を得るためのドローンの飛行）
ＮＤＶＩ（Normalized Difference Vegetation Index:正規化された植生差指数）：植物の葉に反射する赤色光と近赤外光の帯域を対比したものである。これは林冠／キャノピー密度（canopy density）の一般的な指標であり、生きている緑の植生と、クロロフィルが多いほど青く見える土壌とを区別するためによく使用される。
複合ＣＲＩ（カラー赤外線）：ＮＩＲ（近赤外線）、赤、緑の帯域を組み合わせた赤外線合成色である。健康な植生は、高レベルのＮＩＲ（近赤外線）を反映し赤く見える。潜在的な（休眠中の）植生はしばしば緑または青銅色である。砂質土壌は薄茶色であり、粘土質土壌は暗褐色または青緑色である。

収率。
収穫の収量を評価するために、ランダムに６個のブロックが取られ、３０平方メートルの表面領域が収穫される。得られた穀物は、各ゾーンの湿度による損失を割り引いて計量される。

統計分析。
因子 （ＳＰＡＤとパフォーマンス） とそれらの相互作用は、各パラメータについてANOVAによって分析された。これは、Windows 5.１用のStatgraphics Plusソフトウェア（Manugistics、Inc. USA）を使用して行われた。

＊結果。
コロニー形成単位 （Colony forming units ＣＦＵ） のカウント。
表３は、処理後（2018年６月４日）および処理から１か月後（2018年７月４日）における、葉１グラムあたりおよび散布タンク内のコロニー形成単位（CFU） に関連するデータを示す。
散布タンク内では、製品の均一な混合物があり、植物への正しい散布が行われた。トウモロコシの葉に１か月散布した後、個体群は維持され、全ての区画で見られるように成長が増加した。

ＳＰＡＤ。
図５は、本発明の菌株の適用から３０日後のＳＰＡＤ測定を示す。
適用から１か月後、植物は全ての農場で有意差なしに対照と同等のＳＰＡＤレベルを維持した。以下を確認した。化学窒素肥料の減少が植物に悪影響を及ぼさないが、これは細菌による寄与のためであること。

葉、茎、穂軸の窒素
表４は、収穫時にトウモロコシ植物のさまざまな組織で見つかった窒素濃度（g/植物） に関するデータを示す。
ドローンの写真 （45日）
図6は、農場１ （パネル「a」）、農場2（パネル「ｂ」）、および農場３ （パネル 「c」 ） のＮＤＶＩ指数の決定に使用されたドローンの写真を示す。
図7は、農場１ （パネル「a」）、農場2（パネル「b」）、および農場３ （パネル 「c」 ） の複合（combined）ＣＲＩ指数の決定に使用されたドローンの写真を示す。
ＮＤＶＩと複合ＣＲＩの指数を考慮すると、対照と比較して、どの農場（農場３を除く）でも、植物キャノピーの密度、葉緑素、および植物の健康状態（青色と赤色の強度）に違いは見られなかった。 農場３では、灌漑用水の圧力の問題があり、スプリンクラーが適切に水を与えなかった場所では色の違いが作物に見られた。

収率
表５は、各農場の収量に関するデータを示す。
表5では、異なる文字が後に続く平均は互いに大幅に異なる。
農場１では、対照の収量は１688１kg/haであり、本発明の菌株の適用では１75１１kg/haの収量が得られ、これは４％の増産を意味する。
農場2では、対照の収量は１4３46kg/haであり、本発明の菌株の適用では１8３３5kg/haの収量が得られ、これは28％の増産を意味する。
農場３では、対照の収量は１4３１2kg/ｈａであり、本発明の菌株の適用では１75３9kg/haの収量が得られ、これは22.5％の増産を意味する。
表6は、窒素収支（Nitrogen balance）に関するデータを示す。これは、施肥によって提供された （投入） 窒素（第１欄）、抽出後に植物によって同化された窒素（第２欄）、植物への投入と植物で抽出された同化の収支（第３欄）、穀物１トンあたり窒素要件（つまり必要とされる窒素投入）（第４欄） および穀物１トンあたりの窒素抽出（第５欄）に関するデータである。

結論
本発明の菌株は、トウモロコシの栽培および植物における微生物の持続において効率的な用途即ち施肥を有する。
本発明の菌株は、より大量の窒素肥料が使用される従来の施肥と同等レベルのＳＰＡＤ（クロロフィル）、植物の健康および植物の樹冠密度（ＮＤＶＩ指数および合成ＣＲＩ指数）を維持する。
本発明の菌株は、総窒素肥料ユニットの４０％を提供するが、これはカバーの施肥を減少させ、４－２７％の間の生産量を増加させる。植物は植物毎に１つの穂軸（cob）しか持っていなかったので、この増加は穀物の比重又は施肥の施行回数に関連する。
実施された施肥と植物の窒素抽出による窒素肥料の単位の収支を観察すると、１ｈａあたり６６～１１１ｋｇの窒素が増加している。これは、この数十ｋｇ程度の窒素が培養サイクル中に本発明の菌株によって固定されたことを意味する。この結果は、本発明の菌株による処理済み植物で生産された穀物１トン当たりの窒素必要量で間接的に観察される。これは、１トンの穀物を生産するための窒素必要量は対照よりも少ないからである。処理済み穀物を１トン生産する窒素必要量は、穀物１トンを生産するために行われた窒素の抽出よりも低いことにも留意する必要がある。これは対照では反対であり、これは同量の対照の穀物を生産するにはより多くの窒素が必要だからからである。

例３
試験３.トウモロコシの短周期栽培における窒素肥料の３０％の削減における本発明の菌株の使用の有効性。
＊目的。
葉の緑色 （ＳＰＡＤ） の進化を通じて、従来の栽培条件での窒素被覆施肥の３０％の削減に対する、コーン（トウモロコシ）の発育に対する本発明の菌株の有効性を知ること。即ち植生指数、植物の窒素レベル、葉の微生物濃度、生産量を知ること。

＊材料および方法
試験場と施肥。
この試験は、スペインにある２つの農場で実施された。
ウエスカのポマー・デ・シンカにある第１の農場は北緯４１°５０′１３．８″西経０°０５′３８．０″にある。
アルバセト フィンカ・オランにある第２の農場は北緯３８°４９′５５．３″西経１°５０′２７．１″にある。

推奨される施肥は、従来の施肥で窒素を３０％削減した処理であった。この目的のために肥料は表７に指定された量の肥料散布機で配布された。
表７は各区画の各肥料で使用された肥料の量、種類、窒素肥料単位（NFU）を示す。

＊農場での処理の分布。
農場の面積は、農場１（７４ｈａ）、農場２（３．６７ｈａ）であった。パラメータの評価のために、幅１６ｍの２つの隣接する領域が設けられた。「１」の印の領域は処理済み領域であり、「２」の印の領域は対照領域である。
図８は、本発明の菌株による処理１（領域１）と対照である処理２（領域２）でのテストの分布を示す。特に、図８のパネル「ａ」は農場１を、図８のパネル「ｂ」は農場２を示す。

＊本発明の菌株の培養と施肥の特徴。
品種「Guasi」のトウモロコシの種子が農場１用に、品種「ＤＫＣ５０３２ＹＧ」が農場２用に選択された。植え付け比は３００ｋｇ／ｈａで、播種は深さ３ｃｍ、列の間が７５ｃｍ、同一列で１５ｃｍの間隔を空けて行われた。各播種レーンの幅は１６ｍである。播種日は農場１が２０１８年６月２０日で、農場２が６月３０日である。１０日後に茎が出現し、本発明の菌株の散布日は、それぞれ播種後２２日と２０日で、同年７月１２日（農場１）と７月２０日（農場２）であった。

本発明の菌株は、葉面散布によって３３３ｇ／ｈａ（３ｘ１０^７ＣＦＵ／ｇ） の用量で散布された。
葉面散布は、１ヘクタール（ｈａ）あたり３００－４００リットルのブロスを噴霧する噴霧器で行った。これが行われたのは、植物がＢＢＣＨスケールのステージ１３～１４にあり、それぞれ、気温が２２℃と２０℃で、相対湿度が７２％と５８％で、北方向と北西方向に風速が２．３ｍｐｓと１２ｍｐｓで、葉に露がなく０％と１５％の曇りの時であった。

＊パラメータと評価方法
葉１グラムあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）のカウント
このパラメータは、微生物が、培養サイクル全体を通して存在し、葉にどのくらいの量があるかを確認するために測定された。これは、２０本未満の植物の４番目の葉から１グラムの葉を取り、段階希釈により測定された。この段階希釈は、それらを窒素不含有で炭素源としてのメタノールを含有する選択培地に播種することによって行われた。

ＳＰＡＤ （葉のクロロフィル・レベル）
このパラメータは、植物の良好な栄養状態の指標であり、窒素と鉄のレベルと密接に関連している。このために、ＳＰＡＤとして知られるパラメータを使用し、各処理の１００本未満の植物の４番目の葉を１００回測定した。

葉、茎、穂軸の穀物中の窒素
このパラメータは、収穫時に蓄積された各植物組織の窒素量の指標である。１００個の植物から葉、茎、穂軸の穀物を採取して、ケルダール法で総窒素を分析した。

衛星写真
ＥＳＡコペルニカス衛星からの写真がダウンロードされ、Q g isプログラムで処理されて、ＮＤＶＩ指数を得た。
ＮＤＶＩ：植物の葉に反射する赤色光と近赤外光の帯域を対比したものである。これは林冠／キャノピー密度（canopy density）の一般的な指標であり、生きている緑の植生とクロロフィルが多いほど青く見える土壌とを区別するためによく使用される。

収率。
収穫の収量を評価するために、ランダムに６個のブロックが取られ、３０平方メートルの表面領域が収穫される。得られた穀物は、各ゾーンの湿度による損失を割り引いて計量される。

統計分析。
因子 （ＳＰＡＤと収率） とそれらの相互作用は、各パラメータについてANOVAによって分析された。これは、Windows 5.１用のStatgraphics Plusソフトウェア（Manugistics、Inc. USA）を使用して行われた。

＊結果。
コロニー形成単位（CFU）のカウント。
表８は、散布タンク内のコロニー形成単位（CFU）と、葉１ｇ当たりのコロニー形成単位（CFU）に関連するデータ（12-20/07/2018）と、処理から１か月後のデータ（15/8/2018）を示す。
散布タンク内では、製品の均一な混合物があり、植物への正しい散布が行われた。トウモロコシの葉に１か月散布した後、個体群は維持され、全ての区画で見られるように成長が増加した。

ＳＰＡＤ
図９は適用から３０日後のＳＰＡＤ測定値を示す。
適用から１か月後、植物は全ての農場で有意差なしに対照と同等のＳＰＡＤレベルを維持した。以下を確認した。化学窒素肥料の減少が植物に悪影響を及ぼさないが、これは細菌による寄与のためであること。

葉、茎、穂軸の窒素
表９は、収穫時にトウモロコシ植物のさまざまな組織の窒素量（g） に関するデータを示す。

衛星写真。
図１０は、４５日間の処理後の農場１のＮＤＶＩ指数決定（１５日毎に測定された）に使用された衛星写真を示す。
図１１は、４５日間の処理後の農場２のＮＤＶＩ指数決定（１５日毎に測定された）に使用された衛星写真を示す。
ＮＤＶＩ（緑色の強度）の値の均一性は、対照と本発明の菌株の処理（肥料の減少を伴う）を比較して、培養サイクル全体で観察された。

収率
表１０は、各農場の収率に関するデータを示す。
農場１では、対照の収量は１０５１５ｋｇ／ｈａだが、本発明の菌株を適用すると１１８２８ｋｇ／ｈａの収量が得られ、生産性が１２．５％向上した。
農場２では、対照の収量は１２５２５ｋｇ／ｈａだが、本発明の菌株を適用すると１２８６３ｋｇ／ｈａの収量が得られ、生産性が２．７％向上した。
表１１は、窒素収支に関するデータを示す。即ち、施肥によって提供された窒素（第１欄）、抽出後に植物によって同化された窒素（第２欄）、植物への投入と抽出された同化の収支（第３欄）、穀物１トンあたりの窒素要件（第４欄） および穀物１トンあたりの窒素抽出（第５欄）に関するデータである。

結論
本発明の菌株は、トウモロコシの栽培および植物における微生物の持続において効率的な用途即ち施肥を有する。
本発明の菌株は、従来の施肥（大量の窒素肥料を使用する）と同等レベルのＳＰＡＤ（クロロフィル）、植物の健康および植物の樹冠密度（ＮＤＶＩ指数）を維持する。
収率に関しては、本発明の菌株は、総窒素肥料ユニットの３０％を提供し、カバーの施肥を減少させ、生産量を２．７－１２．５％の間増加させる。植物は植物毎に１つの穂軸（cob）しか持っていなかったので、この増加は穀物の比重量又は施肥の実行回数に関連する。
実施された施肥と植物の窒素抽出による窒素肥料の単位の収支を観察すると、１ｈａあたり４３～５７ｋｇの窒素が増加している。これは、この数十ｋｇ程度の窒素が培養サイクル中に本発明の菌株によって固定されたことを意味する。この結果は、本発明の菌株による処理済み植物で生産された穀物１トン当たりの窒素必要量で間接的に観察される。これは、１トンの穀物を生産するための窒素必要量は対照よりも少ないからである。処理済み穀物を１トン生産する窒素必要量は、穀物１トンを生産するために行われた窒素の抽出よりも低いことにも留意する必要がある。これは対照では反対であり、これは、同量の対照の穀物を生産するにはより多くの窒素が必要だからからである。

例４
試験４-異なる用量の窒素施肥のためのイチゴ培養における本発明の菌株の評価。
＊目的。
本発明の菌株のイチゴ作物に対する有効性を知ることである。このイチゴ作物には、従来の施肥の０％、２５％、５０％、７５％、１００％の異なる用量の窒素を施肥し、葉の緑色（ＳＰＡＤ）の進展植物、窒素レベルの進展、葉の微生物の濃度と生産量の観点から評価した。

材料および方法
試験場と施肥。
この試験は、シンボルグ社（本出願人）の実験農場にある農場で実施された。この農場は、ムルシアのロス・マルティネス・デル・プエルト（Los Martinez del Puerto）にあり、北緯３７°４８′５９．６″西経１°０５′４３．６″にある。この農場は、１９２ｍ^２の広さで、幅８ｍで長さ２４ｍである。
灌漑と施肥の管理は、全ての処理で異なる。ミネラル施肥プログラムは、窒素含有量の異なる５種類の溶液で構成されている。
表１２はＵＦＮで測定された処理のさまざまな施肥を示す。

処理
表１３は、５つのレベルの施肥に基づく１０回の処理（Ｔ１－Ｔ１０）を示す。これらは次に、本発明の菌株で処理されたもの（Ｔ６－Ｔ１０）と未処理のもの（Ｔ１－Ｔ５）とに分けられる。

本発明の菌株の培養と適用の特徴。
植物材料。
品種「Fortuna」の裸根のイチゴ植物が、苗床から提供された。

植栽の大きさと密度。
植栽の大きさは、栽培列間２ｍ、植物間０．１ｍであり、植栽は１ｍｘ０．１８ｍｘ０．１５ｍのココナッツファイバーサックに五葉配列で（quincunx）行われた。これは、１ヘクタールあたり１００，０００個の植物即ち１ｍ^２あたり１０個の植物、農場は１９２ｍ^２で構成される。 その結果、試験全体で１９２０個の植物があることになる。

作物の植え付けと除去の日付。
イチゴの移植は２０１７年２月１１日に行われ、作物は２０１８年１月６日に取り除かれた。

水設計
３．５ｋｖの電動ポンプが使用された。このポンプは、３２ｍｍの二次パイプに接続され、この二次パイプは、３リットル／ｈの自己補償型外部ドリッパーを備えた１６ｍｍホースと接続された。

灌漑用水
試験の実施に使用された灌漑用水は、脱塩プラント（desalination plant）から供給され、試験全体で、プラントあたり１３０リットルの水が適用され、濃度は硝酸塩（nitrate）１リットルあたり０．１グラム（プラントあたり１３グラム）であった。上記の水の特性は、表１４にまとめられている。表１４は、灌漑用水の特性に関するデータを示す。
本発明の菌株は、葉面散布によって、３３３ｇ/ｈａ（３ｘ１０^７CFU/g）の用量で散布された。
葉面散布は、スプレーバックパック（spray backpack）で、植物がＢＢＣＨスケールでステージ１３～１４にある時に、１ｈａあたり２００リットルの割合で実行された。その時に天候は、気温２０℃相対湿度５０％葉に結露がなく１５％の曇りであった。

＊パラメータと評価方法
葉１グラムあたりのコロニー形成単位（CFU /g）のカウント
このパラメータは、微生物が培養サイクル全体に存在し葉にどのくらいの量があるかを確認するために測定された。これは、５０本の植物から１グラムの葉を取り、それらを窒素不含有で炭素源としてのメタノール含有の選択培地に播種することによる段階希釈法により測定される。

葉の中の窒素
このパラメータは、分析時に蓄積された各植物組織内の窒素量の指標である。１００個の植物から葉、茎、果実を採取して、ケルダール法で総窒素量を分析した。

収率。
収穫の収量を評価するために、３０個の作物が、各処理からランダムに選択され、作物サイクルで収穫された。
統計分析。
因子（収率）とそれらの相互作用は、各パラメータについてANOVAによって分析された。これは、Windows5.1用のStatgraphics Plusソフトウェア（Manugistics、Inc. USA）を使用して行われた。

＊結果。
コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ） のカウント。
表１５は、散布時から毎月測定された葉１ｇ当たりのコロニー形成単位に関連する結果を示す。
コロニー・サンプリングによる、本発明の菌株の永続性が、植物の培養サイクルを通して観察される。

総窒素量
表１６は、イチゴ作物の窒素濃度（ｇ／１００ｇの植物）、総窒素量（ｇ/植物）、植物の新鮮重量（ｇ）に関連するデータを示す。
表１６は、窒素施肥が増加するにつれて窒素濃度が増加することを示す。これは対照と本発明の菌株で処理したものの両方で見られる現象である。
総窒素の増加は、本発明の菌株で処理された植物において窒素肥料が７５％に達するまで観察された。最高値は窒素濃度が３．２８の時であり、本発明の菌株で処理された植物における窒素濃度の最高値である。本発明の菌株での施肥が１００％になると、処理された植物の窒素量は減少する。

生産
生産を開始した瞬間から、３０個の植物が毎週収穫され、これらの植物は、培養サイクル全体で各処理からランダムに選択されたものである。
表１７は、各処理に対し植物当たりｋｇ表示の収穫量を示す。
最も生産量の多い処理はＴ９（窒素７５％＋本発明の菌株の適用）であり、１植物あたり１．４ｋｇであり、他の処理とは有意差があった。
ＵＦＮが０の処理は、１植物あたりのイチゴの生産量（ｋｇ）が最少の処理であり、有意差があった。
表１８は窒素収支に関するデータを示す。施肥で供与された窒素量と、抽出後の植物により同化された窒素量、植物への入力量（供与量）と抽出量の間の同化の収支を示す。

結論
葉１グラムあたりのコロニー形成単位 （葉のＣＦＵ／ｇ）
葉中に微生物の持続がイチゴの成長サイクル全体を通して観察される。
総窒素
本発明の菌株で処理された植物は、処理Ｔ９であるが、全ての対照処理と比較して葉中において最も高い窒素濃度を有する。
生産
本発明の菌株の適用である処理Ｔ９（５０３ＵＦＮ）は、対照処理Ｔ５（６７１ＵＦＮ）に対し２１％の生産増加、同族施肥処理Ｔ４（５０３ＵＦＮ）に対し３３％の生産増加を示した。

例５
試験５-ブドウ栽培における野外農場での検証試験
＊目的。
ブドウの発育に対する本発明の菌株の有効性を知ることである。このブドウは、従来の用量の窒素施肥を施したもので、この葉の緑色の進化（ＳＰＡＤ）、葉中の微生物の濃度、生産量の観点から判断したものである。

材料および方法
試験場と施肥。
試験は、JumillaとTomellosoにある２カ所の試験場で実施された。Jumillaは北緯３８°３３′１３．９″、西経１°２１′１６．５″にあり、Tomellosoは北緯３９°１１′２２．４″、西経２°５９′１５．８″にある。
推奨される施肥は、７００ｋｇ ＮＰＫ（１５－１５－１５）の背景施肥による従来の施肥であり、７００ｋｇ ＮＰＫは、培養サイクル全体で１０５ＵＦＮに相当する。

農場での処理の分布。
農場の広さは次のとおりである。農場１（１ｈａ）、農場２（２．２０ｈａ）、２つの隣接する間に１６ｍ幅のブロック （つまり、エリア）が、パラメータの評価のために採られた。

本発明の菌株の培養と応用の特徴。
農場１のブドウの品種はプチヴェルド（petit verdot）であり、農場２の品種はグルナッシュ（Grenashe）であった。本発明の菌株の適用日は２０１８年５月１０日（農場１） と２０１８年５月１５日（農場２）であった。
本発明の菌株は、葉面散布によって３３３ｇ／ｈａ（３ｘ１０^７ＣＦＵ／ｇ） の用量で行われた。
葉面散布は、１ｈａあたり３５０リットルのブロスのネブライザー（nebulizer）で行われた。これが行われた時は、植物がペッパーコーン（pepper corm）の段階にある時に、以下の気候条件のもとである。気温１７℃および２０℃、相対湿度が２０％および３８％、風速が南および北西方向に５．４ｍｐｓおよび９ｍｐｓで、葉上に露がなく、１０％および２５％の曇り状態であった。
図１２Ａは処理の適用時のネブライザーを、図１２Ｂは処理の適用時の粒子サイズを示す。

パラメータと評価方法
収率
作物の収穫量を評価するために、６つのブロックをランダムに採取し、広さ３０平方メートルを収穫し、植物で得られたブドウの重さを量った。
統計分析。
因子（収量）とそれらの相互作用は、各パラメータについて分析した。これは、Statgraphics Plusソフトウェアを使用してANOVAによって行った。

＊結果
収率
表１９Ａおよび表１９Ｂは、各処理の植物あたりの収量（ｋｇ）に関する結果を示す。
結論
農場１では、本発明の菌株の適用は未処理の対照に対して１８％の収量を増加させた。
農場２では、本発明の菌株の適用は未処理の対照に対して４１％の収量を増加させた。

例６
試験６―本発明の菌株のエスカロール作物 （Cichorium endivia latifolia、品種Lempika）の収量に関する評価。
次のテストは、ＧＥＰ試験の為の独立した認定機関（independent accredited entity）によって実施された。
この試験の設計、結果の分析と報告は、可能な限りＥＰＰＯガイドラインＰＰ１/１５２（４）、ＰＰ１３５（４）およびＰＰ１／１８１（４）に従って実施された。

実験の一般情報
実験は、スペインのジローナ県のビラサクラで２０１８年８月１７日に開始し、同年１１月１２日に終了した。移植日は２０１８年８月２１日であった。従来の施肥は２０１８年８月２３日に行われ、本発明の菌株の適用は２０１８年９月２８日であった。これは、培養物が適切な発達段階（ＢＢＣＨ１７－１９）に達した後である。
試験のデザイン
この試験は、４回の処理と５回の複製（replication）を伴うランダムなブロック・システムで構成された。各基礎農場（プロット）は、幅２．５ｍ、長さ７ｍで、面積１７．５ｍ^２である。植物の列は０．５６ｍ離し、列内の植物の間隔は０．３５ｍで、植物は４列で合計８０本になった。

栽培
本発明の菌株の効果は、エンダイブ作物 （Cichorium endivia latifolia、品種Lempika）で研究された。その地域農場の以前の作物は、２０１８年はタマネギで、２０１７年はヒマワリとレタスであった。

土壌
土壌は良好なレベルの施肥を示した。
％ＭＯ：２．０２
テクスチャー：クレイローム（clay loam）
ｐＨ：７．７０
ＣＥＣ；０．２２
土壌排水：良好

保守
培養サイクル全体を通して、植物の健康を維持するために必要な植物検疫処理（phytosanitary treatment）が適用された。

統計コメント
統計分析と報告は、農業調査マネージャー（ARM）（Gylling Dates Management Inc.によって開発された） のソフトウェアを使用して実現された。評価されたデータは、平均の比較のためにα＝５％でStudent-Newman-Keulsと組み合わせた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ） を使用して分析された。同じ文字が続く平均に大きな違いはない。

実験の目的
１． 通常の施肥率または減少した施肥が適用されたエスカロール作物の作物挙動および収量に関する本発明の菌株の効果を評価すること。
２． 標準的な商業的施肥と本発明の菌株の効果を比較すること。
３． 対象作物に対する本発明の菌株の予期せぬ効果を評価すること。

試験の概要
この試験の目的は、窒素（施肥）の投与量を減らした場合、本発明の菌株（３ｘ１０^７ＣＦＵ／ｇ）のエスカロール作物の収量に及ぼす影響を評価することである。この試験は、スペイン北東部のビラサクラ市 （ジローナ） の開放農場で、野菜栽培用の典型的な小さな地域で行われた。
この研究は、欧州連合の規則１１０７／２００９で決められているGood Experimental Practicesの原則に従って実施された。

本発明の菌株は、窒素施肥率が異なる（１００％（通常）、６０％、４０％）３つの領域で同じ率（３００ｇｆｐ／ｈａ）で試験された。「未処理」対照と比較評価された。この「未処理」対照は、１００％の窒素（Ｎ）施肥を行い、本発明の菌株を適用していない。
施肥は移植前に行われた（２０１８年８月２３日）。製品はナップザック型の校正済み噴霧器（HONDA WRJ2525）を使用して、ＢＢＣＨステージ１７－１９で適用された（２０１８年９月２８日）。

これらの評価は、作物の発育中の作物活力について、パーセントで行われた。収穫時または収穫間近に記録された。収量パラメータは、プロットの中央の２列をそれぞれ２０個の植物で評価した。但し２つの境界の列は評価の対象にはならなかった。植物の直径（ｃｍ）、存在する植物の数（市場性有り、市場性無し、枯死植物及び活性植物を区別する）、植物の重量と収量（中央の２列（７．８４ｍ^２）の数と重量（ｋｇ））を評価した。ｈａあたりの収量と、市場性の有る植物の数と、標準的な施肥なしの処理（処理１）と比較した増加率は、ARMソフトウェアを使用して自動的に計算された。植物毒性と活力の評価は、試験全体を通して実施された。
表２０に処理リス トを示す。
表２０では次の略字が使用されている。
ＵＴＣ：未処理の対照
ＵＦ：通常の施肥
Ｆ：施肥
Ｍ．ｓ.:メチロバクテリウム属菌株即ち本発明の菌株

結論
製品の効果
試験条件によれば、次のように結論付けることができる。窒素の投与量を減らした本発明の菌株は、従来の肥料（本発明の菌株を含まない）の１回だけの施用と比較して、平均植物重量（ｋｇ）と商業的収量（ヘクタールあたりの植物数）の数値的増加を得た。このことは、本発明の菌株は植物の正常な発育に必要な窒素を提供できたことを意味する。

処理３と４は、処理１と比較して、それぞれ３．８％と１３．８９％の収穫量の増加を達成し、統計的有意差異が得られた。異なる用量の窒素で処理した本発明の菌株の間では、評価されたパラメータの残りのパラメータにおいて有意差はなかった。但し得られた結果がより高い窒素削減で最良の結果を示唆してはいたが。

本発明の菌株は、作物が７～９枚の葉を有する時（ＢＢＣＨ１７～１９）に、３００ｇ／ｈａ（３ｘ１０^７ｃｆｕ／ｇ）の用量で適用された。
本発明の菌株は、従来の施肥（Ｎ＝４０％）で３００ｇ／ｈａ（３ｘ１０^７ｃｆｕ／ｇ）の用量で適用された時に、１３．８９％の収穫量の増加を伴う試験の最良の結果を示し、これには統計的有意差がある。
評価された他のパラメータに関しては、処理間で有意な統計的差異はない。このことは、本発明の菌株は、植物の正常な発育に必要な窒素を提供することを示す。

本発明の菌株の使用は、作物に必要な窒素施肥の量を減らす。これは評価されたパラメータの結果が従来の施肥で得られたものと類似またはさらに良好であったことから解る。

実施例７：本発明による例示的な組成物の生産方法
メチロバクテリウム属菌株ＮＦＢＧ培地 （グルコースを添加した窒素不含有細菌培地）を回収する。
成長パラメータ
成長温度：２０－３５℃
培養期間：５～７日

孤立したピンクレッドのコロニーを選択し、それをＭＭＭＮＦ（メタノールを添加した窒素不含有の最小培地）に再播種する。
成長パラメータ
成長温度：２０－３５℃
培養期間：５～７日

孤立したピンクレッドのコロニーを選択し、それをＭＭＭ（メタノール含有最小培地）に再播種し、液体培養で成長させ、事前接種物（pre-inoculum）として使用する。
発酵（fermentation）パラメータ
成長温度：２０－３５℃
撹拌速度：５０－２５０ｒｐｍ
発酵期間：５～７日

微生物の事前接種によるバイオリアクターの全量の接種。
発酵パラメータ
成長温度：２０－３５℃
撹拌速度：５０－２５０ｒｐｍ
曝気速度：０．３－３．２Ｎ*ｍ^３／ｈ
発酵期間：８０－１３０時間

担体と混合し噴霧乾燥で乾燥させる
微生物を含む発酵ブロス１リットルを農業上許容される担体と混合する。
混合物を噴霧乾燥した後、次の乾燥パラメータにより行われた。
供給流：７－１１ｍｌ／ｌ
圧縮空気流：２２５－３７５ｌ／ｈ
乾燥空気流：３５－５０ｍ^３／ｈ
入口温度：１００－１８０℃
サイクロンのパフォーマンス：２５－４０％

最終製品の処方のための生成物の混合
各１ｇの乾燥生成物（粉末+微生物）は、１ｈａの施肥に使用される１０１－５５０ｇの最終製品が得られるまで、次の配合剤と混合される。
＊１－５０ｇの農業的に許容される共製剤。
＊１００－５００ｇの農業的に許容される担体。
表２１は、生産プロセス全体で使用される培地のｇ／Ｌ単位の組成を示す。
ろ過滅菌した成分を、オー トクレーブ後、培地が６０℃未満に冷却されたら添加する。
表２２は、微量栄養素とビタミンのグラム単位の量を示す。

Claims (20)

1. 受付番号（accession number）CECT9580で寄託されたメチロバクテリウム属（Methylobacterium sp.nov.）の菌株。
2. 受付番号CECT9580で寄託されたメチロバクテリウム属（Methylobacterium sp.nov.の菌株を含む組成物。
3. 農業的に許容される担体または農業的に許容される共製剤のいずれか一方又は両方を含む
   ことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
4. 前記担体または共製剤は、タルク、粘土、マルトデキストリン、スキムミルク、グルコース、植物乾燥抽出物、茶、カッサバ、キノアからの抽出物、カオリン、コイル、珪藻土、キチン、CaCO₃、アルギン酸塩、カラゲン、サーファクチン、ラムノ脂質、ソホロ脂質、サポニン、オレイン酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される
   ことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
5. 前記組成物は、固体形態、水性液体形態、油性液体形態、エマルジョ ン形態、 半固体形態またはゲル形態から選択される形態である
   ことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
6. 前記組成物は、固体形態である
   ことを特徴とする請求項５に記載の組成物。
7. 前記組成物は、粉末形態である
   ことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
8. 種子コーティングとして、土壌施用、点滴灌漑システム、水浸し、または葉面施用によって施用される
   ことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
9. 請求項２に記載の組成物の製造方法において、
   （Ａ）受付番号CECT9580で寄託されたメチロバクテリウム属の菌株を提供するステップと、
   （Ｂ）前記メチロバクテリウム属の菌株を、メタノールを含む液体培地に接種するステップと、
   （Ｃ）前記メチロバクテリウム属の菌株を培養し、メチロバクテリア（mechylobacteria）を含む液体培養物を生成するステップと、
   （Ｄ）前記液体培養物を乾燥させ乾燥組成物を得るステップと、
   を含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物を製造する方法
10. 前記メチロバクテリウム属の菌株は、BCCM寄託番号（deposit number）54871で寄託された菌根菌グロムス イラニカム バー．テヌイハイファルム（Glomus iranicum var. tenuihypharum）の胞子の内部から分離されたものである
    ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. （Ｅ）農業的に許容される担体を、前記ステップ（Ｃ）で生成された前記メチロバクテリアを含む液体培養物に、前記ステップ（Ｄ）の前に、添加するステップ
    をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
12. （Ｆ）農業的に許容される共製剤を添加するステップ
    をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
13. （Ｇ）前記農業的に許容される共製剤を前記乾燥組成物に添加するステップ
    をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 植物における生物刺激剤としての請求項１に記載のメチロバクテリウム属の菌株の使用。
15. 前記植物が、園芸作物、草本作物、牧草作物、木材作物、ブドウ、ベリー、マメ科植物のいずれかである
    ことを特徴とする請求項１４に記載の使用。
16. 前記植物の収量を増加させるための請求項１４に記載の使用。
17. 窒素外部投入を60％まで減らすための請求項１に記載のメチロバクテリウム属の菌株の使用。
18. 植物における生物刺激剤としての請求項２に記載の組成物の使用。
19. 前記植物が、園芸作物、草本作物、牧草作物、木材作物、ブドウ、ベリー、マメ科植物のいずれかである
    ことを特徴とする請求項１８に記載の使用。
20. 前記植物の収量を増加させるための請求項１８に記載の使用。
    
    

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