WO2021133218A1 - Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур - Google Patents

Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур Download PDF

Info

Publication number
WO2021133218A1
WO2021133218A1 PCT/RU2020/000743 RU2020000743W WO2021133218A1 WO 2021133218 A1 WO2021133218 A1 WO 2021133218A1 RU 2020000743 W RU2020000743 W RU 2020000743W WO 2021133218 A1 WO2021133218 A1 WO 2021133218A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacillus subtilis
strain
growth
bacterial
bacteria
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/000743
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Кузьмич ЧЕБОТАРЬ
Сергей Викторович ЕРОФЕЕВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Бисолби-Интер"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=73460695&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2021133218(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Бисолби-Интер" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Бисолби-Интер"
Publication of WO2021133218A1 publication Critical patent/WO2021133218A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Definitions

  • the invention relates to biotechnology and agriculture and is the use of a known bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 as a means for stimulating the growth of agricultural crops.
  • the invention relates to agricultural microbiology and geochemistry.
  • Strain Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM B-2357D is capable of leaching phosphorus and silicon from objects of the lithosphere and is resistant to polyhexamethylene guanidine.
  • the strain can be used to obtain a bacterial preparation that increases the survival rate in the soil and the yield of agricultural crops, for the reclamation of technologically contaminated lands.
  • the described strain of spore bacteria Bacillus megaterium 501 GR has a growth-stimulating effect, improves phosphorus nutrition of plants, and also promotes bioremediation of pesticide-contaminated soils.
  • the use of the Bacillus megaterium 501 GR strain allows increasing the productivity of plants, as well as protecting them from phytopathogenic fungi and microorganisms that cause root diseases.
  • Known RF patent JNfs 2649359 with priority from 13.12.2016. for the invention “Strain of endophytic bacteria Bacillus megaterium V3 as a means to improve nutrition, accelerate growth and increase productivity of grain, vegetable, industrial and wood crops” IPC A01N 63/00, C12N 1/20, published 02.04.2018.
  • the high growth-stimulating activity of the Bacillus megaterium V3 strain is caused by the ability to create a plant-microbial system with a plant by colonizing the root system and internal tissues of the plant with endophytic bacteria.
  • the strain can be used as a part of various microbial preparations, for the effective use of which the titer of bacteria Bacillus megaterium V3 should be 10 5 -10 9 cells / ml of culture fluid.
  • the bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 is used in the production of microbiological fertilizers to increase the productivity of vegetable, grain and industrial crops in the peat form "Bisolbi”, dry form “BisolbiFit” and liquid form “Extrasol” (Certificate of state registration - tion N o 0680-07-2018-216-0-0-0-1 from 29.03.2007).
  • This method consists in combining granular mineral fertilizers with microbial biomass in the form of a bacterial preparation based on the bacterial strain "Bacillus subtilis 4-13", which has antagonistic properties to phytopathogenic microflora in the soil, Combination is carried out by dusting or spraying with a bacterial preparation surface of granules of mineral fertilizers, or in the form of a liquid fraction in the composition of moisture-protective compositions of mineral fertilizers.
  • the granules of mineral fertilizers are enriched with a biopreparation, which contributes to a more efficient assimilation of mineral substances from these fertilizers by plants.
  • the mineral elements in the composition of the granules treated with the biological product are in a more stable physicochemical state, less susceptible to leaching and transition into a gaseous state (most of all, this concerns mineral nitrogen).
  • the method provides for the combination of dry or liquid mineral fertilizers (ameliorants) with a microbiological preparation based on agronomically beneficial microorganisms: in the 1st variant - in the form of a dry fine powder with a titer of 10 2 - 10 5 cells / g at the rate of 2-6 kg / t, and in the 2nd variant - in liquid form with a titer of 10 4 -10 7 cells / g, which is applied to a dry mineral fertilizer or ameliorant by fine spraying, or applied to a liquid mineral fertilizer, at the rate of 1-4 kg / t.
  • the specified strain has high fungicidal and bactericidal activity.
  • a high growth-stimulating activity of the Bacillus subtilis 8A strain and a biological product based on it was also established, which leads to an increase in plant productivity.
  • the objective of the invention is to identify a new strain or new properties in a known strain suitable for use in agriculture as a means to stimulate the growth and increase the productivity of vegetable and grain crops, as well as to expand the arsenal of such means.
  • This problem is solved due to the fact that the bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 is used as a means to stimulate the growth of agricultural crops, in which the ability to stimulate the growth of agricultural crops has been identified and experimentally confirmed by the production of plant growth hormones on the roots of plants and vitamins.
  • the strain of rhizospheric spore bacteria “Bacillus subtilis 4-13” was isolated from the chernozem soil of the Republic of Moldova and deposited under the registration number VNIISKhM D-606 from 10.09.1998. in the group of epiphytic microorganisms, as well as in the international body for depositing the VKM IBPM RAS under the number VKM ⁇ -3513D from 17.12.
  • the strain is characterized by the following morphological, cultural and physiological and biochemical characteristics.
  • the cells are in the form of regular rods with rounded ends and a monopolar peritrichous arrangement of flagella.
  • Cell size 1.0x2.0 ⁇ m.
  • the strain forms spores located in the center of the cell and is positively Gram stained. After 24 hours of growth on a liquid nutrient medium, the accumulation of poly- ⁇ -hydroxybutyrate was observed. Growth in a liquid and semi-liquid nutrient medium is microaerophilic, the metabolism is respiratory and fermentative. On meat-peptone agar, it forms dry, cream-colored colonies of pasty consistency with uneven cut edges. The diameter of the colonies is 20-40 mm.
  • the optimum temperature for growth is 37 ° C. At temperatures over 45 ° C and less than 15 ° C, growth is slow.
  • the optimum pH of the medium is 6.8; growth also occurs at a pH of 4.5 to 8.0.
  • the Bacillus subtilis 4-13 strain hydrolyzes casein, gelatin, starch and litmus milk. Litmus was discolored at the same time.
  • the strain has strong catalase activity and does not possess lipase activity.
  • the strain is able to grow at a temperature of 40C, in the presence of 7% NaCl and 0.001% lysozyme.
  • the strain uses arabinose, xylose, mannitol, glucose, galactose, fructose, maltose, sorbitol, glycerin, dextrin, starch to form acid, and rhamnose and dulcite to form an alkali.
  • the bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 is grown on an available nutrient medium consisting of molasses and corn extract, which is an advantage over, for example, the method of cultivating pseudomonads, which uses scarce and expensive nutrient media.
  • Bacillus amiloliqufaciens [1] and Bacillus velezensis [2].
  • Bacillus subtilis 4-13 strain The ability of the Bacillus subtilis 4-13 strain to produce plant growth hormones - auxins and vitamins - in a nutrient medium for growing bacteria has been identified and experimentally established.
  • phytohormones is one of the main mechanisms for stimulating plant growth by various associated bacteria, including species of the genus Bacillus [3]. HPLC studies have shown that the supernatant is a supernatant (the liquid phase that remains after insolubles are precipitated by centrifugation or sedimentation).
  • IAA indole-3-acetic acid
  • Bacillus subtilis 4-13 grown on a medium with tryptophan, contains indole-3-acetic acid (IAA) and several related compounds [4].
  • IAA is the most biologically active member of the auxin family. It is assumed that the effect of bacterial IAA is based on an increase in the total absorbing root area, which leads to an increase in the absorption of water and nutrients and stimulates plant growth [5].
  • Salkovsky reaction [6] the auxin content in the culture liquid of the Bacillus subtilis 4-13 strain was determined. For this, the strain was grown in a liquid medium 1/20 TSB (manufactured by Sigma, USA), with the addition of L-tryptophan 500 kg / ml, at 200 rpm, at room temperature for 2 days.
  • the resulting suspension was centrifuged at 4000 rpm for 2 minutes. The supernatant was used for analysis.
  • the Salkovsky reaction was used for preliminary determination of the content of indole compounds (including bacterial auxins).
  • the test sample was mixed 1: 1 with Salkovsky's reagent (50 ml of 35% perchloric acid and 1 ml of 0.5 M ferric sulfate), left for 30-40 minutes, after which the optical density was measured at 530 nm.
  • 1/20 TSB was used as a control, with the addition of L-tryptophan 500 ⁇ g / ml, as a positive control - 1/20 TSB, with the addition of heteroauxin 100 ⁇ g / ml.
  • the production of bacterial auxins in the nutrient medium for growing bacteria in the bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 was 3-5 ⁇ g / ml.
  • Vitamins from group B have a significant effect on plants, accelerate metabolism, strengthen roots, under their influence, plants grow and develop better. Vitamins are important micronutrients produced by many plants and bacteria [7].
  • vitamins The main physiological role of vitamins is that they serve as cofactors in numerous metabolic pathways and are also antioxidants.
  • Vitamin B1 thiamine helps plants cope with stressful conditions and also stimulates their growth.
  • Vitamin B3 nicotinic acid and its second form - nicotinamide
  • Vitamin B6 or pyridoxine
  • Vitamin B 12 cyanocobalamin
  • Bacillus subtilis 4-13 has a growth-stimulating effect in relation to various agricultural crops.
  • Bacillus subtilis strain Ch-13 and the prototype strain Bacillus subtilis 8 A were carried out in a laboratory experiment according to the original method using lettuce plants of the Yeralash variety and spring wheat of the Trizo variety. For this, plant seeds were first sterilized for 2 minutes in 70% ethanol and washed in sterile tap water. Then the seeds were soaked for 20 min in a bacterial suspension with a cell titer of 10 7 CFU / ml and placed in sterile humid chambers, 25 pieces each. in 4-fold repetition. In the control, seeds were soaked in sterile tap water. Then the seeds were incubated in a phytotron for 96 h at a temperature of (25 + 1) ° C.
  • Microvegetation experiments were carried out, in which the influence of Bacillus subtilis bacteria on the development of the root system and green mass of spring barley plants of the Vakula variety, on the biomass of watercress of the Vesenny variety and on the biomass of Dobrynya corn, was determined.
  • the sand was sterilized for an hour at 1.5 atm., Cooled and the vessels were filled by weight.
  • a mineral solution PNS was used containing (mg / l): Ca (Oz) x4HgO - 972; MgS0 4 x7H 2 0-616; NaNCh 140; KN 2 PO 4 - 170; NH4N03 55; Fe-EDTA - 20; ZnS0 4 x7H 2 0 - 1.7; B 4 Na 2 0 7 x 7H 2 0 - 3.35; CUSO 4X 5H 2 O - 0.25 and agMoO 4 x2H 2 0 - 0.12 mg / l.
  • barley seeds were placed in a Petri dish and soaked for 30 min. in a working solution of a bacterial suspension with a known titer, after which it was planted in sand. 7 barley seeds were planted on the vessel, soaked in a suspension of the studied strains for 30 minutes, without prior germination.
  • Barley plants were grown for 16 days, after which the root system was washed from sand and the total root length and plant biomass were analyzed using the Image J 1.50b program.
  • the data of Table 3 confirm a more effective growth-stimulating effect of the Bacillus subtilis 4-13 strain in comparison with the prototype Bacillus subtilis 8A strain using the example of spring barley plants of the Vakula variety.
  • To determine the growth-stimulating activity of bacteria of the Bacillus subtilis 4-13 strain and the prototype Bacillus subtilis 8A strain on cress plants of the "Spring" variety 0.1%, 1% and 10% solutions of bacterial suspensions of the studied strains with the initial bacterial titer 1.0x10 9 CFU / ml. Watercress seeds were placed in sterile test tubes, filled with prepared solutions of the studied strains, and soaked for 10 min. In the control, seeds were soaked in sterile tap water.
  • “Wet chambers” were prepared: filter paper was laid out in sterile Petri dishes and moistened with sterile tap water (5 ml) per chamber. Watercress seeds were placed with sterile tweezers on the surface of the wet chambers, 25 seeds per dish (at least 3 times). The humid chambers were placed in a phytotron and incubated for 5 days at t ° 28 ° C, after which the length of the shoot and root of the seedlings was measured. The data obtained were processed using the Excel program.
  • 0.1-10% solutions of the bacterial suspension of Bacillus subtilis 4-13 influenced the length of cress shoots, the length of which increased by 9.1-13.4% compared to the control, which is more than the effect of a bacterial suspension of the prototype Bacillus subtilis 8A strain (an increase of 0.5-6.6%).
  • the data of Table 5 confirm, using the example of Dobrynya corn variety, a more effective growth-stimulating effect of the Bacillus subtilis 4-13 strain as compared to the Bacillus subtilis 8 A. prototype strain. Field experiments on the effect of the microbiological preparation Extrasol containing the bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 on the yield of spring barley, winter wheat, sunflowers, peas and potatoes were carried out.
  • the experiment was carried out according to the following scheme: in the control, the disinfectant Vial Trust was used, and in the experiment, in addition to the disinfectant, the barley seeds were treated with Extrasol at a dose of 0.25 l / t + spraying of barley crops with Extrasol at a dose of 1 l / ha.
  • the day before sowing the barley seeds were treated with Extrasol in accordance with the officially recommended standards.
  • the seeds were treated in a shaded place with their full wetting with the working solution.
  • the working solution was prepared on the day of treatment.
  • the treated seeds were dried in the shade and the next day sowing was carried out at a rate of 5 million pcs / ha and or 230 kg / ha in physical weight.
  • Bacillus subtilis 4-13 on the yield of peas and sunflower in the Stavropol Territory From the data presented in Table 8, it follows that the use of the microbiological fertilizer Extrasol based on the Bacillus subtilis 4-13 strain for the treatment of seeds and plants during the growing season of peas and sunflower in various agricultural zones of the Stavropol Territory increased the grain yield of peas by 2-7 centners / ha or by 7.1-33.3% in comparison with the control and the yield of sunflower grain by 2-3 centners / ha or by 10.8-14%.
  • Extrasol in the experimental version took place against the background of all the protective measures against diseases, pests and weeds, which were carried out by the farm in this field of potatoes.
  • tubers Treatment of tubers: a disinfectant with fungicidal and insecticidal properties Prestige 1 l / t + humic fertilizer Lignohumate 0.2 kg / ha [8] when planting to protect tubers from soil-dwelling diseases and pests.
  • Weed control Hurricane Forte, BP (500 g / l glyphosate to-you) - 2.5-3 l / ha in the autumn after the predecessor, Titu with STS (250 g / kg rim-sulfuron) twice: 30 g / ha for the 1st wave of weeds, 20 g / ha for the 2nd wave.
  • STS 250 g / kg rim-sulfuron
  • Experiment scheme Treatment of tubers in a potato planter when planting with a consumption rate of Extrasol 1 l / t (10% working solution). Spraying potatoes during the growing season in tank mixtures with fungicides with a consumption rate of Ex-trasol 2 l / ha (1% working solution): the first spraying in the budding phase - the beginning of flowering - (Shirlan 0.4 l / ha + Extrasol 2 l / ha); the second spraying before wilting (dying off) of the tops - (Ridomil Gold MC, VDG 2.5 kg / ha + Extrasol 2 l / ha);
  • a culture of bacteria Bacillus subtilis 4-13 is grown in a sterile liquid nutrient medium containing:
  • a liquid form of a microbiological preparation is obtained in the following way: 20% of the culture liquid and 80% of water are mixed (the titer of the preparation is not less than 1.5x10 8 cells / ml).
  • a culture of bacteria Bacillus subtilis 4-13 is grown in a sterile liquid nutrient medium of the following composition: Molasses - 25 g / l, corn extract - 12.5 g / l,
  • a liquid form of a microbiological preparation is obtained by mixing 20% of the culture liquid and 80% of water (the titer of the preparation is not less than 1.5x10 8 cells / ml).
  • Bacillus subtilis 4-13 the ability of the bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 to stimulate the growth of agricultural crops due to the production of plant growth hormones on their roots - auxins and B vitamins was revealed and experimentally confirmed. Bacillus subtilis 4-13 bacteria, various biological products can be obtained, which makes it possible to expand the arsenal of existing similar means.
  • Bacillus subtilis 4-13 06- develop spores, which allows these preparations to be preserved without losing the viability of bacteria for a long period of time, at least 12 months.
  • the number of viable cells and spores of the bacterial strain Bacillus subtilis 4-13 for its effective use in the composition of various microbiological preparations should be 10 4 - 10 9 cells per 1 ml of culture fluid. It has been experimentally established that the use of a strain at a concentration of less than 10 4 cells / ml leads to a decrease in the effect of stimulating the growth of agricultural crops, and an increase in the concentration above 10 10 cells / ml does not lead to an increase in the efficiency of their growth stimulation.
  • Bacillus velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum and ‘Bacillus oryzicola’ are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based on phylogenomics. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology / 2016, 66, 1212-1217 DOI 10.1099 / ijsem. 0.000858.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Применение штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13, депонированного под регистрационным номером ВНИИСХМ Д-606, а также в международном органе по депонированию В КМ ИБФМ РАН под регистрационным номером VKM B-3513D, в качестве средства, обладающего способностью продуцировать растительные гормоны роста - ауксины и витамины группы В, для расширения арсенала биопрепаратов, стимулирующих рост сельскохозяйственных культур.

Description

СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ
КУЛЬТУР
Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и пред- ставляет собой применение известного штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13 в качестве средства для стимуляции роста сельскохозяйственных культур.
Известен патент РФ N° 2327737 с пр. 01.08.2006г. на изобретение «Штамм бактерий Bacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину», МПК C12N 1/20, C05F 11/08, C12R 1/11, опубликовано 27.06.2008г.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и геохи- мии. Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к поли- гексаметиленгуанидину. Штамм может быть использован для получения бак- териального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожай- ность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загряз- ненных земель.
Известен патент РФ N° 2558291 с пр. 24.12.2013г. на изобретение «Поли- функциональное средство для растениеводства», МПК C12N 1/20, A01N 63/00, опубликовано: заявка 27.062015г., опубликовано 27.07.2015г.
Описанный штамм споровых бактерий Bacillus megaterium 501 GR обла- дает ростостимулирующим эффектом, улучшает фосфорное питание расте- ний, а также способствует биоремедиации загрязненных пестицидами почв. Использование штамма Bacillus megaterium 501 GR позволяет повысить про- дуктивность растений, а также защитить их от фитопатогенных грибов и мик- роорганизмов, вызывающих заболевания корней. Известен патент РФ JNfs 2649359 с приоритетом от 13.12.2016г. на изобре- тение «Штамм эндофитных бактерий Bacillus megaterium V3 в качестве сред- ства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых, овощных, технических и древесных культур» МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликовано 02.04.2018г.
Высокая ростостимулирующая активность штамма Bacillus megaterium V3 вызвана способностью создавать с растением растительно-микробную си- стему путем колонизации эндофитными бактериями корневой системы и внутренних тканей растения.
Штамм может быть использован в составе различных микробных препара- тов, для эффективного использования которых титр бактерий Bacillus megaterium V3 должен составлять 105-109 кл/мл культуральной жидкости.
Известны также зарубежные публикации, в которых описано использова- ние бактерий вида Bacillus megaterium в качестве средства стимуляции роста растений и/или их корней (например, в патенте KR 20100963774 В1 от 14.06.2010г. на штамм Bacillus megaterium KNUC 251 или в заявке США20130014434, опубликованной 17.01.2013г., в которой питательная ком- позиция для корней пересаживаемого растения содержит в числе других мик- роорганизмов бактерии Bacillus megaterium ).
Известна группа изобретений «Способ предпосевной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обра- ботки семян овощных культур» по патенту РФ JV 2140138 с приоритетом от 13.11.98г., авторов Чеботаря В.К., Быковой Н.В., Темновой О.В., Орловой Н.А. и Хотяновича А.В. Эти способы осуществляются с помощью биофун- гицидного препарата, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis 4-13. Изобретения позволяют повысить эффективность защиты овощных культур от фитопатогенных грибов при предпосевной обработки семян. Известно также изобретение «Средство для защиты зерновых сельскохо- зяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микро- организмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий» по патенту РФ N° 2259397 с пр. от 02.04.2003г., авторы Чеботарь В. К., Быкова Н.В., Темнова О.В., Орлова Н.А., Хотянович А.В., МПК C12N 1/20, C12R 1:125, А01С 1/06, опубликовано 27.08.2005г.
Штамм бактерий Bacillus subtilis 4-13 используют при производстве мик- робиологического удобрения для увеличения продуктивности овощных, зер- новых и технических культур в торфяной форме «Бисолби», сухой форме «БисолбиФит» и жидкой форме «Экстрасол» (Свидетельство о гос. регистра- ции No 0680-07-2018-216-0-0-0-1 от 29.03.2007).
Известно изобретение «Способ получения биоудобрений» по патенту РФ N° 2241692 с приоритетом от 11.10.2002г. авторов Чеботаря В.К., Козакова А.Е., Ерофеева С.В., МПК C05G 1/0, C12N 1/20, C12R 1:125, опубликовано 10.12.2004г.
Этот способ заключается в совмещении гранулированных минеральных удобрений с микробной биомассой в виде бактериального препарата на ос- нове штамма бактерий «Bacillus subtilis 4-13», обладающего антагонистиче- скими свойствами к фитопатогенной микрофлоре в почве, Совмещение про- изводят путем опудривания или опрыскивания бактериальным препаратом поверхности гранул минеральных удобрений, либо в виде жидкой фракции в составе влагозащитных композиций минеральных удобрений.
При этом кроме тотального санирующего эффекта от фитопатогенной микрофлоры, происходит обогащение гранул минеральных удобрений био- препаратом, что способствует более эффективному усвоению растениями минеральных веществ из этих удобрений, т.к. минеральные элементы в со- ставе обработанных биопрепаратом гранул находятся в более стабильном фи- зико-химическом состоянии, менее подвержены вымыванию и переходу в га- зообразное состояние (более всего это касается минерального азота). Известно изобретение «Способ получения биоминеральных удобрений и мелиорантов (варианты)» по патенту РФ N° 2512277 с приоритетом от 10.10.2012г., авторов Чеботаря В.К. и Ерофеева С.В., МПК C05F 11/08, опуб- ликовано 10.04.2014г.
Способ предусматривает совмещение сухих или жидких минеральных удобрений (мелиорантов) с микробиологическим препаратом на основе аг- рономически полезных микроорганизмов: в 1-м варианте - в виде сухого мелкодисперсного порошка с титром 102- 105 кл/г из расчета 2-6 кг/т, а во 2- м варианте - в жидком виде с титром 104-107 кл/г, который наносят на сухое минеральное удобрение или мелиорант путем мелкодисперсного распыле- ния, либо вносят в жидкое минеральное удобрение, из расчета 1-4 кг/т.
Это увеличивает коэффициент использования питательных веществ из удобрений и мелиорантов (КИУ) на 10-50 %, что приводит к увеличению про- дуктивности сельскохозяйственных растений на 12-40 %.
Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопато-ген- ных микроорганизмов» по патенту РФ Ns 2495119 с приоритетом от 29.11.2012г., авторов Чеботаря В.К. и др., МПК С 12N 1/20, C12N 1/125, A01N 63/00, опубликовано 10.10.2013г. (прототип).
Указанный штамм обладает высокой фунгицидной и бактерицидной ак- тивностью. Установлена также высокая ростостимулирующая активность штамма Bacillus subtilis 8А и биопрепарата на его основе, что приводит к по- вышению урожайности растений.
Задачей изобретения является выявление нового штамма или новых свойств у известного штамма, пригодного для использования в сельском хо- зяйстве в качестве средства для стимуляции роста и увеличения продуктив- ности овощных и зерновых культур, а также позволяющего расширить арсе- нал подобных средств. Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства для сти- муляции роста сельскохозяйственных культур применен штамм бактерий Bacillus subtilis 4-13, у которого выявлена и экспериментально подтверждена способность стимулировать рост сельскохозяйственных культур за счет про- дуцирования на корнях растений растительных гормонов роста и витаминов.
Штамм ризосферных споровых бактерий «Bacillus subtilis 4-13» был вы- делен из черноземной почвы Республики Молдова и депонирован под реги- страционным номером ВНИИСХМ Д-606 от 10.09.1998г. в группе эпифит- ных микроорганизмов, а также в международном органе по депонированию ВКМ ИБФМ РАН под номером VKM В-3513D от 17.12.2020г.
Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.
Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и монополярным перитрихиальным расположением жгутиков. Размер клеток 1 ,0x2,0 мкм. Штамм образует споры, расположенные в центре клетки, поло- жительно окрашивается по Граму. Через 24 часа роста на жидкой питатель- ной среде наблюдалось накопление поли- -оксибутирата. Рост в жидкой и полужидкой питательной среде микроаэрофильный, метаболизм дыхатель- ный и бродильный. На мясо-пептонном агаре образует сухие колонии кремо- вого цвета, пастообразной консистенции с неровными изрезанными краями. Диаметр колоний 20-40 мм. Оптимальная температура для роста 37°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значе- ние pH среды 6,8 , рост происходит также при pH от 4,5 до 8,0. Штамм Ва- cillus subtilis 4-13 гидролизует казеин, желатин, крахмал и лакмусовое мо- локо. Лакмус при этом обесцвечивался. Штамм обладает сильной каталазной активностью и не обладает липазной активностью. Штамм способен расти при температуре 40С, наличии 7% NaCl и 0,001% лизоцима. В качестве един- ственного источника углерода штамм использует с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, маннит, глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбит, глицерин, декстрин, крахмал и с образованием щелочи рамнозу и дульцит. Штамм бактерии Bacillus subtilis 4-13 выращивают на доступной пита- тельной среде, состоящей из мелассы и кукурузного экстракта, что является преимуществом по сравнению, например, со способом культивирования псевдомонад, в котором используют дефицитные и дорогие питательные среды.
В соответствии с «Методическими указаниями Минздрава СССР» N°2620-82 и N»4263-87 экспериментально определено, что штамм Bacillus subtilis 4-13 является невирулентным, нетоксичным и нетоксигенным, отно- сится к 4-му классу опасности.
Штамм ризосферных споровых бактерий « Bacillus subtilis 4-13» на ос- новании современных методов может быть идентифицирован также как Ва- cillus amiloliqufaciens [1] и Bacillus velezensis [2].
Выявлена и экспериментально установлена способность штамма Bacillus subtilis 4-13 продуцировать гормоны роста растений - ауксины и витамины в питательной среде для выращивания бактерий.
Продукция фитогормонов является одним из главных механизмов стиму- ляции роста растений различными ассоциированными с ними бактериями, включая виды рода Bacillus [3]. Исследования с использованием ВЭЖХ по- казали, что супернатант - надосадочная жидкость (жидкая фаза, остающаяся после того, как нерастворимые вещества осаждаются в процессе центрифу- гирования или осаждения).
Bacillus subtilis 4-13, выращиваемый на среде с триптофаном, содержит индол-3 -уксус-ную кислоту (ИУК) и несколько родственных ей соединений [4]. ИУК является самым биологически активным членом семейства аукси- нов. Предполагается, что действие бактериальной ИУК основано на увеличе- нии общей поглощающей площади корней, что ведет к увеличению погло- щения воды и питательных веществ и стимулирует рост растений [5]. При помощи реакции Сальковского [6] определяли содержание ауксина в культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 4-13. Для этого штамм выращивали в жидкой среде 1/20 TSB (производитель Sigma, USA), с добав- лением L-триптофана 500 кг/мл, при 200 об/мин, при комнатной температуре 2 суток. Полученную суспензию центрифугировали при скорости 4000 об/мин в течение 2 мин. Супернатант использовали для анализа. Для предваритель- ного определения содержания индольных соединений (в том числе, бактери- альных ауксинов) использовали реакцию Сальковского. Исследуемый обра- зец смешивали 1:1 с реактивом Сальковского (50 мл 35% хлорной кислоты и 1 мл 0,5М сернокислого железа), оставляли на 30-40 минут, после чего изме- ряли оптическую плотность при 530 нм. В качестве контроля использовали 1/20 TSB, с добавлением L-триптофана 500 мкг/мл, в качестве положитель- ного контроля - 1/20 TSB, с добавлением гетероауксина 100 мкг/мл. Проду- цирование бактериальных ауксинов в питательной среде для выращивания бактерий у штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13 составило 3-5 мкг/мл.
Витамины из группы В оказывают значительное влияние на растения, ускоряют обмен веществ, укрепляют корни, под их воздействием растения лучше растут и развиваются. Витамины - важные микропитательные веще- ства, продуцируемые многими растениями и бактериями [7].
Главная физиологическая роль витаминов заключается в том, что они служат кофакторами в многочисленных метаболических путях, а также явля- ются антиоксидантами.
Витамин В1 (тиамин) помогает растениям пережить стрессовые условия, а также стимулирует их рост. Витамин ВЗ (никотиновая кислота и его вторая форма - никотинамид) отлично подходит для реанимации растений. Витамин В6 (или пиридоксин) стимулирует иммунную систему растений. Витамин В 12 (цианокобаламин) участвует в выработке хлорофилла, активизирует рост и обмен веществ растений. Анализ культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13, вы-ращенного в жидкой среде 1/20 TSB (72 ч при 28°С), показал наличие в ней витамина ВЗ (никотиновой кислоты в количестве 0,0475 мкг/мл, никотина- мида-0,0146 мкг/мл) и витамина В6 (пиридоксина) в количестве 0,072 мкг/мл.
Анализ культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13, выращенного на картофельно-декстрозной среде (PDB, Sigma, USA) в течение 7 дней при 30°С в стационарной фазе, выявил в ней наличие витамина В 1 (ти- амина) в количестве 0,0091 мкг/мл и витамина В 12 (цианокобаламина) в коли- честве 0,0045 мкг/мл.
Таким образом, результаты опытов с культуральной жидкостью штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13, подтверждают наличие в ней витаминов группы В, а именно: В 1 , ВЗ, В6 и В 12, которые способны оказывать влияние на имму- нитет растений, их устойчивость к стрессовым факторам и в конечном счете - на продуктивность растений.
Экспериментально установлено, что штамм бактерий Bacillus subtilis 4-13 обладает ростостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам.
Анализ ростостимулирующей активности бактерий: штамма Bacillus sub- tilis Ч- 13 и штамма - прототипа Bacillus subtilis 8 А проводили в лабораторном опыте по оригинальной методике с использованием растений салата сорта «Ералаш» и яровой пшеницы сорта «Тризо». Для этого семена растений сна- чала стерилизовали в течение 2-х минут в 70% этаноле и отмывали в стериль- ной водопроводной воде. Затем семена замачивали на 20 мин в суспензии бактерий с титром клеток 107 КОЕ/мл и раскладывали в стерильные влажные камеры по 25 шт. в 4-х кратной повторности. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Далее семена инкубировали в фитотроне 96 ч при температуре (25+1) °С. После инкубирования измеряли длину ко- решков и побегов, а ростостимулирующую активность тестируемых штам- мов бактерий рассчитывали по отношению к контрольным проросткам. Ре- зультаты представлены в таблицах 1, 2. Таблица 1. Ростостимулирующая активность штаммов бактерий Bacillus subtilis на проростках салата с. «Ералаш»
Figure imgf000010_0001
Из данных, приведенных в Таблице 1 видно, что изучаемый штамм бак- терий Bacillus subtilis 4-13 обладает более сильной ростостимулирующей ак- тивностью по отношению к проросткам салата по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8А, увеличивая среднюю длину корня в 1 ,2 раза, а среднюю длину зеленой части ростка в 1,18 раза.
Таблица 2. Ростостимулирующая активность штаммов бактерий
Bacillus subtilis на проростках яровой пшеницы «Тризо»
Figure imgf000010_0002
Из данных, приведенных в Таблице 2 видно, что изучаемый штамм бак- терий Bacillus subtilis 4-13 обладает более сильной ростостимулирующей ак- тивностью по отношению к проросткам пшеницы по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus subtilis 8 А, увеличивая среднюю длину корня в 1 ,4 раза, а среднюю длину зеленой части ростка в 1,37 раза. Экспериментально также установлено, что штамм Bacillus subtilis 4-13 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сель- скохозяйственным культурам, в частности, к ячменю, кресс-салату и куку рузе. Были проведены микровегетационные опыты, в которых определяли вли- яние бактерий Bacillus subtilis на развитие корневой системы и зеленой массы растений ярового ячменя сорта «Вакула», на биомассу кресс-салата сорта «Ве- сенний» и на биомассу кукурузы сорта «Добрыня».
Опыты по влиянию бактерий штамма Bacillus subtilis 4-13 и бактерий штамма - прототипа Bacillus subtilis 8А на развитие корней и биомассу ячменя сорта «Вакула», в зависимости от концентрации изучаемых штаммов прово- дили в вегетационном боксе с 16 часовым световым днем, температурой 22°С и интенсивностью света 5000-6000 лк.
В качестве субстрата использовали предварительно просеянный и отмы- тый от глинистых и иных примесей кварцевый песок с фракцией 0,6- 1,0 мм. Песок стерилизовали в течение часа при 1,5 атм., остужали и набивали сосуды по весу. Для полива и питания растений применяли минеральный раствор PNS содержащий (мг/л): Са( Оз)х4НгО — 972; MgS04x7H20 — 616; NaNCh — 140; КН2РО4 — 170; NH4N03 — 55; Fe-EDTA — 20; ZnS04x7H20 — 1,7; B4Na207x7H20 — 3,35; CUSO4X5H2O — 0,25 и агМо04х2Н20 — 0,12 мг/л.
Инокуляцию проростков проводили ночной (20-ти час.) культурой штам- мов бактерий, выращенных на жидкой среде LB следующего состава (г/л): триптон -10,0, дрожжевой экстракт -5,0, Mg2SC>4 -2,5, рН=7,2. Для этого семена ячменя помещали в чашку Петри и замачивали на 30 мин. в рабочем растворе бактериальной суспензии с известным титром, после чего высаживали в песок. На сосуд высаживали по 7 семян ячменя, замоченных в суспензии изучаемых штаммов в течение 30 мин., без предварительного проращивания.
Растения ячменя выращивали в течение 16 дней, после чего корневую си- стему отмывали от песка и анализировали общую длину корней и биомассу растений в программе Image J 1.50b.
Для анализа из каждого варианта отбирали по 5 типичных растений. Ре- зультаты опытов представлены в Таблице 3. Таблица 3. Эффективность влияния штаммов бактерий Bacillus subtilis на развитие корневой системы и зеленой массы ярового ячменя с. «Вакула» в зависимости от титра бактерий
Figure imgf000012_0001
Таким образом, из данных Таблицы 3 видно, что растворы бактериальной суспензии Bacillus subtilis 4-13 с титром 105- 107 КОЕ/мл оказывают суще- ственное влияние на общую длину зародышевых корней ячменя с. «Вакула», увеличивая ее на 35-54% по сравнению с контролем, а также на биомассу рас- тений, увеличивая ее на 20-32% по сравнению с контролем. При этом штамм Bacillus subtilis 4-13 оказывает большее стимулирующее влияние на общую длину зародышевых корней ячменя по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 8А, используемым в растениеводстве в качестве средства для повышения продуктивности растений. То есть данные Таблицы 3 подтверждают на примере растений ярового яч- меня сорта «Вакула» более эффективное ростостимулирующее влияние штамма Bacillus subtilis 4-13 по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 8А. Для определения ростостимулирующей активности бактерий штамма Ва- cillus subtilis 4-13 и штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А на растениях кресс- салата сорта «Весенний» были приготовлены 0,1%, 1% и 10% растворы бак- териальных суспензий исследуемых штаммов с изначальным титром бакте- рий 1,0x109 КОЕ/мл. Семена кресс-салата помещали в стерильные пробирки, заливали приготовленными растворами исследуемых штаммов и замачивали на 10 мин. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Подготавливали «влажные камеры»: в стерильные чашки Петри расклады- вали фильтровальную бумагу и увлажняли стерильной водопроводной водой объёмом 5 мл на камеру. Семена кресс-салата стерильным пинцетом поме- щали на поверхность влажных камер по 25 штук на чашку (как минимум в 3-х кратной повторности). Влажные камеры помещали в фитотрон и инкуби- ровали 5 суток при t° 28°С, после чего измеряли длину побега и корня про- ростков. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Excel.
Результаты опыта представлены в Таблице 4.
Таблица 4. Эффективность влияния штаммов Bacillus subtilis на рост побегов и корней кресс-салата с. «Весенний» в зависимости от титра бактерий
Figure imgf000013_0001
Из данных, представленных в Таблице 4, видно, что 0,1%, 1% и 10% рас- творы бактериальной суспензии Bacillus subtilis Ч- 13 с изначальным титром бактерий 1,0x109 КОЕ/мл оказывали эффективное влияние на длину корней кресс-салата, увеличивая их на 40,9-73,1% по сравнению с контролем, а также большее стимулирующее влияние на длину корней кресс-салата по сравне- нию с влиянием штамма- прототипа Bacillus subtilis 8 А (увеличение на 13,3- 46,1%). Кроме того, 0,1-10% растворы бактериальной суспензии Bacillus sub- tilis 4-13 повлияли на длину побегов кресс-салата, длина которых увеличи- лась на 9,1-13,4% по сравнению с контролем, что больше, чем влияние бак- териальной суспензии штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А (увеличение на 0, 5-6, 6%).
То есть данные Таблицы 4 подтверждают на примере кресс-салата сорта «Весенний» более эффективное ростостимулирующее влияние штамма Bacil- lus subtilis 4-13 по сравнению со штаммом -прототип ом Bacillus subtilis 8 А.
Для определения ростостимулирующей активности бактерий штамма Ва- cillus subtilis 4-13 и штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А на растениях куку- рузы сорта «Добрыня» были приготовлены 0,1%, 1% и 10% растворы бактери- альных суспензий исследуемых штаммов с изначальным титром бактерий 1,0x109 КОЕ/мл. Семена кукурузы помещали в стерильные стаканчики, зали- вали приготовленными растворами исследуемых штаммов и замачивали на 10 мин. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Подго- тавливали «влажные камеры»: в стерильные чашки Петри раскладывали филь- тровальную бумагу и увлажняли стерильной водопроводной водой объёмом 5 мл на камеру. Семена кукурузы стерильным пинцетом помещали на поверх- ность влажных камер по 10 штук на чашку (как минимум в 3-х кратной по- вторности). Влажные камеры помещали в фитотрон и инкубировали 5 суток при t° 28°С, после чего измеряли длину побега и корня проростков. Получен- ные данные обрабатывали с помощью программы Excel.
Результаты опыта представлены в Таблице 5. Таблица 5. Эффективность влияния штаммов Bacillus subtilis на рост побегов и корней кукурузы с. «Добрыня» в зависимости от титра бактерий
Figure imgf000015_0001
Из данных, представленных в Таблице 5, видно, что 0,1%, 1% и 10% рас- творы бактериальной суспензии Bacillus subtilis 4-13 с изначальным титром бактерий 1,0x109 КОЕ/мл оказывали значительное влияние на длину побегов кукурузы, увеличивая их на 26-36,8% по сравнению с контролем, а также ока- зывали большее стимулирующее влияние на длину побегов кукурузы по сравнению с влиянием штамма-прототипа Bacillus subtilis 8А (увеличение на
13,3-23,5%). Результаты опытов показали, что 0,1-10% растворы бактериаль- ной суспензии Bacillus subtilis 4-13 существенно повлияли на длину корней кукурузы, длина которых увеличилась на 17,7-33,2% по сравнению с контро- лем, что было больше, чем влияние бактериальной суспензии штамма-прото- типа Bacillus subtilis 8 А (увеличение на 12, 1 - 16,6%).
То есть данные Таблицы 5 подтверждают на примере кукурузы сорта «Доб- рыня» более эффективное ростостимулирующее влияние штамма Bacillus sub- tilis 4-13 по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis 8 А. Проведены полевые опыты по влиянию микробиологического препарата Экстрасол, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis 4-13, на урожай- ность ярового ячменя, озимой пшеницы, подсолнечника, гороха и картофеля.
Полевой производственный опыт по изучению сравнительного действия микробиологического удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus sub- tilis 4-13 со стандартным протравителем семян Виал Траст проводился на поле ОАО «Агропромышленное объединение Элеком» Ромодановского р-на Республики Мордовия РФ. Изучаемая культура - яровой ячмень, сорт «За- озерский 85», ценный пивоваренный сорт белорусской селекции.
Опыт проводили по следующей схеме: в контроле - применяли протра- витель Виал Траст, а в опыте - дополнительно к протравителю осуществляли обработку семян ячменя Экстрасолом в дозе 0,25 л/т + опрыскивание посевов ячменя Экстрасолом в дозе 1 л/га. За день до посева семена ячменя обраба- тыли Экстрасолом согласно официально рекомендованным нормам. Семена обрабатывали в затененном месте при их полном смачивании рабочим рас- твором. Рабочий раствор готовили в день обработки. Обработанные семена высушивали в тени и на следующий день производили посев в норме 5млн шт/га и или 230 кг/га в физическом весе. Опрыскивание посевов ячменя Экс- трасолом проводили в рекомендованные сроки в вечерние часы при безвет- ренной погоде. Удобрение общим фоном вносили весной под культивацию в дозе N34, т.е. 0,1 т/га аммиачной селитры в физическом весе. Результаты опыта представлены в Таблице 6.
Таблица 6. Влияние микробиолог препарата Экстрасол на основе шт .Bacillus subtilis 4-13 на урожайность зерна и соломы ярового ячменя с. «Заозерский 85»
Figure imgf000016_0001
Из представленных в Таблице 6 данных следует, что микробиологиче- ское удобрение Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis 4-13 оказывает влияние как на повышение продуктивности биомассы соломы, так и на уве- личение урожайности зерна ярового ячменя сорта «Заозерский 85». При двукратном применении Экстрасола урожайность зерна повышалась на 16,4 %, а биомасса соломы повышалась на 20,6 %. Более высокий прирост урожайности ярового ячменя отмечен в варианте с двукратной обработкой семян и посевов микробиологическим удобрением Экстрасолом - 0,48 т/га.
Полевые производственные опыты по изучению эффективности дей- ствия удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis 4-13 на уро- жайность озимой пшеницы сортов Ростовчанка-5, Вита, Прикумская 141, Украинка одесская, Дока, Одесская 200, Иришка, Батько проводились в хозяйствах, расположенных в различных сельскохозяйственных зонах Став- ропольского края РФ: крайне засушливой, засушливой и неустойчивого увлажнения, где Экстрасолом обрабатывали семена и растения озимой пше- ницы по вегетации. В качестве контроля использовали вариант, где обработка Экстрасолом не проводилась. Результаты опытов представлены в Таблице 7.
Таблица 7. Влияние микробиологического препарата Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis 4-13 на урожайность озимой пшеницы в Ставропольском крае
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Из представленных в Таблице 7 данных следует, что применение микро- биологического удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis 4-13 для обработки семян и растений озимой пшеницы по вегетации в засушливых сельскохозяйственных зонах Ставропольского края и г. Краснодар оказывает влияние на повышение урожая зерна озимой пшеницы на 2, 5-6, 2 ц/га или на 5,4-23 % по сравнению с контролем. Полевые производственные опыты по изучению эффективности дей- ствия удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis 4-13 на уро- жайность гороха сортов Эйфель, Мультик, Мадонна, Феникс и подсолнеч- ника гибрида ПР63А90 и гибрида ПР64А15 проводились в хозяйствах, рас- положенных в различных сельскохозяйственных зонах Ставропольского края
РФ: засушливой, неустойчивого увлажнения и достаточного увлажнения. В качестве контроля использовали вариант, где обработка Экстрасолом не при- менялась. Результаты опытов представлены в Таблице 8. Таблица 8. Влияние микробиологического препарата Экстрасол на основе штамма
Bacillus subtilis 4-13 на урожайность гороха и подсолнечника в Ставропольском крае
Figure imgf000019_0001
Из представленных в Таблице 8 данных следует, что применение микро- биологического удобрения Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis 4-13 для обработки семян и растений по вегетации гороха и подсолнечника в различных сельскохозяйственных зонах Ставропольского края увеличи- вало урожай зерна гороха на 2-7 ц/га или на 7,1-33,3% по сравнению с конт- ролем и урожай зерна подсолнечника на 2-3 ц/га или на 10,8-14%.
Полевой производственный опыт испытаний микробиологического пре- парата Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis Ч- 13 проводился на кар- тофеле сорт «Удача» в ООО «Багаевск-Агро» Багаевского района Ростов- ской области. Обработка почвы: после предшественника безотвальная вспашка на глубину 33 см, выравнивание; весной - культивация, рыхление. Орошение: в среднем через 5-6 дней (из расчёта 4 м3/м2 за сезон). Внесение минеральных удобрений: осенью - азофоска 500 кг/га; весной - азофоска 100 кг/га, аммиачная селитра 100 кг/га; в период вегетации одновременно с поливом внекорневая подкормка аммиачной селитрой 100 кг/га.
Применение Экстрасола в опытном варианте происходило на фоне всех защитных мероприятии против болезней, вредителей и сорняков, которые проводились хозяйством на данном поле картофеля.
Обработка клубней: протравитель с фунгицидно-инсектицидными свой- ствами Престиж 1 л/т + гуминовое удобрение Лигногумат 0,2 кг/га [8] при посадке для защиты клубней от почвообитающих болезней и вредителей.
Борьба с сорняками: Ураган Форте, ВР (500 г/л глифосата к-ты) - 2,5-3 л/га в осенний период после предшественника, Титу с СТС (250 г/кг рим- сульфурона) двукратно: 30 г/га по 1-й волне сорняков, 20 г/га - по 2-й волне.
Борьба с болезнями: Ридомил Голд МЦ, ВДГ (640 г/кг манкоцеб + 40 г/кг мефеноксам) 2,5 кг/га опрыскивание (трёхкратно): 1-е профилактическое при высоте ботвы 10-12 см, затем опрыскивание Ширлан, СК (500 г/л флуа- зинама) 0,3-0, 4 л/га, в фазе смыкания рядков, интервал 7-10 дней. Борьба с вредителями: Актара, ВДГ (250 г/кг тиаметоксам) 60 г/га, опрыс- кивание в фазе образования соцветий против личинок колорадского жука I- IV возрастов - однократно.
Схема опыта: Обработка клубней в картофелесажалке при посадке с нор- мой расхода Экстрасола 1 л/т (10% рабочий раствор). Опрыскивание карто- феля по вегетации в баковых смесях с фунгицидами с нормой расхода Экс- трасола 2л/га (1% раб. раствор): первое опрыскивание в фазе бутонизации - начала цветения - (Ширлан 0,4 л/га + Экстрасол 2 л/га); второе опрыскива- ние перед увяданием (отмиранием) ботвы - (Ридомил Голд МЦ, ВДГ 2,5 кг/га + Экстрасол 2 л/га);
Эталон. Мероприятия по защите картофеля от сорняков, болезней и вре- дителей по схеме, принятой в хозяйстве.
Результаты опыта представлены в Таблице 9. Таблица 9. Влияние микробиологического препарата Экстрасол на основе штамма
Bacillus subtilis 4-13 на урожайность картофеля сорта Удача в Ростовской обл.
Figure imgf000021_0001
То есть, из представленных в Таблице 9 данных следует, что 3-х кратное применение биологического препарата Экстрасол на основе штамма Bacil- lus subtilis 4-13 при выращивании картофеля (обработка семенных клубней и две обработки по вегетации в период активного роста надземной части растений) в комплексе с защитными мероприятиями позволило увеличить урожайность культуры на 26 ц/га и получить прибавку урожая в 10% в срав- нении с контрольным вариантом (схема обработок, принятая в хозяйстве). При визуальных наблюдениях отмечено, что на опытном участке с при- менением Экстрасола всходы появились на 1 -2 дня раньше; быстрее завер- шилось цветение; средняя высота кустов была на 5,6% меньше; не было по- легания стеблей у основания куста как в эталоне; клубней образовалось на 27% меньше, но они были в среднем на 42% крупнее, чем в эталоне; на 5 дней позже началось усыхание ботвы. На хорошем агрофоне в комплексе с защитными мероприятиями препарат Экстрасол на основе штамма Bacillus subtilis 4-13 обеспечил получение прибавки урожая картофеля благодаря повышению устойчивости растений к неблагоприятным погодным усло- виям.
Ниже приведены примеры изготовления микробиологическ препаратов на основе штамма Bacillus subtilis 4-13.
Пример 1.
Выращивают культуру бактерий Bacillus subtilis 4-13 в жидкой стерильной пи- тательной среде, содержащей:
- 4% пшеничных отрубей и
- 0,3% мела, на качалке или в ферментере при 33 ± 1 °С в течение 24-36 часов до достиже- ния в культуральной жидкости титра не менее 1x109 клеток/мл и содержания спор не менеее 90%. Затем получают жидкую форму микробиологического препарата следующим путем: смешивают 20% культуральной жидкости и 80% воды (титр препарата - не менее 1,5x108 кл/мл).
Пример 2.
Выращивают культуру бактерий Bacillus subtilis 4-13 в жидкой стериль- ной питательной среде следующего состава: Меласса - 25 г/л, кукурузный экстракт - 12,5 г/л,
MgS04x7H20 - 0,25 г/л,
СаСЬх2 Н20 - 1 г/л,
M11SO4 - 0,1 г/л,
FeSC>4 - 0,0001 г/л,
CUSO4- 0,0001 г/л на качалке или в ферментере при 33 °С в течение 24-36 часов до достижения в культуральной жидкости титра не менее 1x109 кл/мл и содержания спор не менеее 90%. После чего получают жидкую форму микробиологического препарата, смешивая 20% культуральной жидкости и 80% воды (титр пре- парата - не менее 1,5x108 кл/мл).
Таким образом, в результате проведенных опытов, была выявлена и экс- периментально подтверждена способность штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13 стимулировать рост сельскохозяйственных культур за счет продуциро- вания на их корнях растительных гормонов роста - ауксинов и витаминов группы В. При этом на основе штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13 могут быть получены различные биопрепараты, что позволяет расширить арсенал существующих аналогичных средств.
Важным является также и то, что при использовании указанного штамма в составе микробиологических препаратов бактерии Bacillus subtilis 4-13 06- разуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспо- собности бактерий в течении длительного срока, не менее 12 месяцев.
Количество жизнеспособных клеток и спор штамма бактерии Bacillus subtilis 4-13 для его эффективного использования в составе различных мик- робиологических препаратов должно составлять 104- 109 клеток на 1 мл куль- туральной жидкости. Экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 104 кл/мл ведет к снижению эффекта стимуля- ции роста сельскохозяйственных культур, а увеличение концентрации свыше 1010 кл/мл не приводит к увеличению эффективности их стимуляции роста. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Borriss R.,Chen X.H., Rueckert C., Blom J., Becker A., et al. 2011. Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens subsp. nov. and Bacil- lus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on complete genome sequence comparisons. Int J Syst Evol Microbiol 61: 1786-1801.
2. Christopher A. Dunlap, Soo-Jin Kim, Soon-Wo Kwon and Alejandro P. Rooney. Bacillus velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens; Ba- cillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum and ‘Bacillus oryzicola’ are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based on phylogenomics. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology/ 2016, 66, 1212-1217 DOI 10.1099 /ijsem. 0.000858.
3. Perez-Garcia A, Romero D, de Vicente A. 2011. Plant protection and growth stimulation by microorganisms: biotechnological applications of Bacilli in agriculture. Curr Opin Biotechnol.:22:187-193.
4. B.K. Чеботарь, Н.М.Макарова, А.И.Шапошников, Л. В. Кравченко. Антифун- гальные и фитостимулирующие свойства ризосферного штамма Bacillus subtilis 4-13- продуцента биопрепаратов. 2009.Прикладная биохимия и микробиология, т.45, JV 4, с.465-469.
5. Spaepen S, Vanderleyden J, Remans R. 2007. Indole-3 -acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol Rev 31:425-448.
6. Brick, J. M., Bostock, R. M., and Silverstone, S. E. 1991. Rapid in situ assay for indole acetic acid production by bacteria immobilized on nitrocellulose membrane. Ap- plied Environment Microbiology, 57, 535-538.
7. Palacios OA.,Bashan Y, de-Bashan LE. 2014. Proven and potential involvement of vit-amins in interactions of plants with plant growth-promoting bacteria: an overview. Bi-ol. Fertil. Soils 50: 415-432.
8. Справочник агронома по защите сельскохозяйственных культур от вреди- телей, болезней и сорняков на 2016г. Азов: ООО «АзовПечать», 2016, 260 с.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Применение штамма бактерий Bacillus subtilis 4-13, депонированного в ВНИИСХМ под номером Д-606, а также в международном органе по депо- нированию ВКМ ИБФМ РАН под номером VKM В-3513D в качестве сред- ства для стимуляции роста сельскохозяйственных культур.
PCT/RU2020/000743 2019-12-24 2020-12-22 Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур WO2021133218A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019144225A RU2736340C9 (ru) 2019-12-24 2019-12-24 Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур
RU2019144225 2019-12-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021133218A1 true WO2021133218A1 (ru) 2021-07-01

Family

ID=73460695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2020/000743 WO2021133218A1 (ru) 2019-12-24 2020-12-22 Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2736340C9 (ru)
WO (1) WO2021133218A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2764789C1 (ru) * 2021-05-24 2022-01-21 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО Волгоградский ГАУ) Способ биологической защиты в технологии возделывания картофеля на светло-каштановых почвах Нижнего Поволжья

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2259397C2 (ru) * 2003-04-02 2005-08-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Бисолби-Интер" Средство для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий
RU2478290C2 (ru) * 2011-11-11 2013-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия
EA031063B1 (ru) * 2009-05-06 2018-11-30 Байер Кропсайенс Лп Способ повышения жизнеспособности и/или урожайности сельскохозяйственных растений при практически несуществующем давлении патогенов

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2140138C1 (ru) * 1998-11-13 1999-10-27 Закрытое акционерное общество Сельскохозяйственное селекционно-производственное предприятие "СОРТСЕМОВОЩ" Способ предпосевной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур
RU2662992C1 (ru) * 2017-09-05 2018-07-31 Общество с ограниченной ответственностью "Базис" Способ предпосевной обработки семян сельскохозяйственных растений

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2259397C2 (ru) * 2003-04-02 2005-08-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Бисолби-Интер" Средство для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий
EA031063B1 (ru) * 2009-05-06 2018-11-30 Байер Кропсайенс Лп Способ повышения жизнеспособности и/или урожайности сельскохозяйственных растений при практически несуществующем давлении патогенов
RU2478290C2 (ru) * 2011-11-11 2013-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEBOTAR V.K., ZAVALIN A.A., KIPRUSHKINA E.I.: "Efficiency of application of biopreparation EXTRASOL", EFFEKTIVNOST' PRIMENENIYA BIOPREPARATA EKSTRASOL [EFFICIENCY OF APPLICATION OF BIOPREPARATION EXTRASOL], 1 January 2007 (2007-01-01), Moscow, Russia, pages 1 - 230, XP009529723 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2736340C9 (ru) 2021-03-01
RU2736340C1 (ru) 2020-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106591193B (zh) 一株具有广谱促生抗逆作用的解淀粉芽孢杆菌
JP2017534671A (ja) 微生物組成物及びその使用方法
RU2626543C2 (ru) Штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus, способ стимуляции роста и защиты растений от болезней и применение штамма бактерий Paenibacillus mucilaginosus в качестве удобрения и агента биологического контроля (противопатогенного средства) в профилактике и/или лечении заболевания растений
BG112709A (bg) Бактериалният щам bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum bs89 като средство за повишаване на продуктивността на растенията и тяхната защита срещу болести
KR20150050578A (ko) 식물의 비생물적 스트레스 저항성을 증가시키는 방법
EP2154121B1 (en) Biofertiliser composition
CN111670769A (zh) 一种提高水稻抗逆性的方法
CN106938942A (zh) 具有防控小白菜炭疽病功能的生物有机肥及其制备方法
US11674118B2 (en) PGPR compositions and methods for improved cultivation of tomato and potato species
RU2736340C9 (ru) Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур
RU2558291C2 (ru) Полифункциональное средство для растениеводства
JPH10276579A (ja) バチルス属微生物を用いた植物の生長促進剤および生長促進方法
RU2551968C2 (ru) ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus pumilus А 1.5, В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
RU2640286C1 (ru) Способ выращивания льна-долгунца
CN109414022B (zh) 用于改善植物发育的组合物和方法
CN110760450A (zh) 一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法
Nauanova et al. Enhancing Spring Barley Grain Yield with Local Biofertilizers in the Semi-Arid Steppe Zone of Northern Kazakhstan
CN109836190A (zh) 一种利用生防细菌制备生防菌肥及消除甜瓜连茬障碍的方法
ES2907599B2 (es) Cepa de rutstroemia calopus, composiciones y usos
RU2823059C1 (ru) Штамм бактерий bacillus pumilus bis88 в качестве универсального средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности сельскохозяйственных зерновых, овощных и технических культур, а также их защиты от болезней и стрессовых факторов хлоридного засоления
RU2760337C1 (ru) Препарат для увеличения урожайности яровой пшеницы
RU2800426C1 (ru) Штамм bacillus amyloliquefaciens в качестве средства для борьбы с ризоктониозом картофеля
RU2800426C9 (ru) Штамм bacillus amyloliquefaciens p20 в качестве средства для борьбы с ризоктониозом картофеля
RU2800418C1 (ru) Штамм бактерий paenibacillus xylanexedens w018 в качестве средства улучшения фосфорного питания и увеличения продуктивности зерновых и овощных культур
RU2803623C1 (ru) Штамм Phialocephala fortinii шт. F-833МКС661Ч1Н - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих рострегуляторными свойствами

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20906895

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20906895

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1