CN110760450A - 一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法 - Google Patents

一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法 Download PDF

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CN110760450A CN201911224338.4A CN201911224338A CN110760450A CN 110760450 A CN110760450 A CN 110760450A CN 201911224338 A CN201911224338 A CN 201911224338A CN 110760450 A CN110760450 A CN 110760450A
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Abstract

一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，属于木霉菌技术领域。长枝木霉孢子的培养方法包括将木霉菌种接种于培养基，在预设温度下培养预设时间。培养基的原料包括草炭、蛭石、牛粪和菌糠，培养基中草炭、蛭石、牛粪和菌糠的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。上述培养方法长枝木霉产孢量较高，培养效率较高。长枝木霉水分散粒剂的制备方法通过将长枝木霉孢子与各种助剂搭配使用，使制备得到的长枝木霉水分散粒剂能够长期储存，提高了长枝木霉的可储存性。

Description

一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制 备方法
技术领域
本申请涉及木霉菌技术领域，具体而言，涉及一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法。
背景技术
我国的黄瓜面积已达125.3万hm2，占全国蔬菜面积的10％。黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的一种严重的真菌土传病害。近年来，随着设施蔬菜的生产发展，黄瓜枯萎病己成为保护地黄瓜的主要病害。黄瓜枯萎病从植物苗期到结果期均会发生，开花结果期发病最重，防治不及时则会造成大幅度减产。在露地和保护地各茬黄瓜上都可发生，一般以温室、大棚黄瓜发生较重。此病是黄瓜种植上比较难防治的病害之一，病原菌可在土壤中存活5～6年，常造成较大的损失，发病率一般为20％～30％，受害重的地区发病率高达80％～90％以上，甚至绝产。如何有效防治黄瓜枯萎病是生产上急待解决的难题。
木霉菌作为一种重要的生防菌，腐生性强、适应范围广、生长繁殖快速，可迅速占领空间并获得营养，已被广泛应用于植物病害的生物防治，同时木霉菌还可促进植物生长、提高植物抗性。因此，优化木霉菌剂发酵条件，发展微生物菌剂正成为国内外研究的热点和重点。
但是木霉菌培养效率不高，且储存难度较大。筛选出优良的木霉菌菌株以及选择合适的培养方法、提高木霉菌的储存效果制备得到一种长枝木霉水分散粒剂对于农业生产是具有显著意义的。
发明内容
本申请提供了一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，其能够提高长枝木霉的培养效率，制备得到一种储存较好的长枝木霉水分散粒剂。
本申请的实施例是这样实现的：
在第一方面，本申请示例提供了长枝木霉孢子的培养方法，其包括将木霉菌种接种于培养基，在预设温度下培养预设时间；
培养基的原料包括草炭、蛭石、牛粪和菌糠，培养基中草炭、蛭石、牛粪和菌糠的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。
在上述技术方案中，本申请采用包括草炭、蛭石、牛粪和菌糠的原料制作培养基，并且在培养基中草炭、蛭石、牛粪和菌糠的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2的情况下，长枝木霉产孢量较高，培养效率较高。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第一种可能的示例中，上述培养基通过以下方法制得：
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠按照质量比混合均匀，加入水，在预定压强下灭菌处理制得培养基；
可选地，培养基中水的质量百分数为50～70％。
可选地，水为蒸馏水。
在上述示例中，通过上述方法制得的培养基用于培养长枝木霉孢子时，培养效率较高，培养效果较好。
培养基中的水能够为培养长枝木霉孢子提供必要的水分以及提供潮湿条件。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第二种可能的示例中，上述培养前采用透气结构对培养容器封口，透气结构包括纱布，采用纱布封口时纱布的层数为7～9。
在上述示例中，保持一定的透气性能够提高长枝木霉的孢子萌发率，提高培养效率。并且纱布能够防止一定的外物进入培养容器。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第三种可能的示例中，上述木霉菌种的接种量为23～27％。
可选地，木霉菌种的接种量为24～26％。
可选地，木霉菌种的接种量为25％。
在上述示例中，当木霉菌种的接种量在23～27％时长枝木霉的培养效率较高，产孢量较高。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第四种可能的示例中，上述木霉菌种接种于培养基后，在25～32℃的温度下培养6～8天。
在上述示例中，上述培养天数能够使长枝木霉培育完成，制得含量较多的长枝木霉培养液。
结合第一方面，在本申请的第一方面的第五种可能的示例中，上述培养时保持恒温光照。
在上述示例中，恒温光照有利于长枝木霉孢子的繁殖，使其繁殖速率加快，繁殖速率加快。
在第一方面，本申请示例提供了长枝木霉水分散粒剂的制备方法，其包括根据上述的长枝木霉孢子的培养方法培养得到长枝木霉孢子和制备长枝木霉水分散粒剂，制备长枝木霉水分散粒剂包括将长枝木霉孢子和助剂混合，其中长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为7×108～10×108cfu·g-1。在上述技术方案中，将长枝木霉和助剂混合制得长枝木霉水分散粒剂有利于提高木霉菌的储存效果，使木霉菌的储存时间更长，有利于扩大其应用范围和应用场景。
结合第二方面，在本申请的第二方面的第一种可能的示例中，上述按照重量份数计，助剂包括以下成分：0.4～0.6份羧甲基纤维素、4～4.5份硝酸钾、4.5～5.5份聚乙烯基吡络烷酮、4.5～5.5份尿素、4.5～5.5份硅藻土、4.5～5.5份十二烷基硫酸钠、0.5～0.65份保护剂卵磷脂和70～80份亚甲基双荼磺酸钠。
在上述示例中，按照上述配方配制得到的长枝木霉水分散粒剂稳定性较好，能够较长时间使长枝木霉保持活性，提高了长枝木霉的储存性。
结合第二方面，在本申请的第二方面的第二种可能的示例中，上述长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为3～5％。
在上述示例中，长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为3～5％既有利于保持长枝木霉的活性，又有利于使其较长时间处于稳定的状态。
在第三方面，本申请示例提供了一种长枝木霉水分散粒剂，其根据上述的长枝木霉水分散粒剂的制备方法制备得到。
在上述技术方案中，水分散粒剂为一种干悬浮剂或粒型可湿性粉剂，可使长治木霉菌稳定保存，水分散粒剂遇水后激活，能够自动崩解，分散成悬浮液后使用。
此长枝木霉水分散粒剂在储存时稳定性较好，可较长时间储存；遇水后能够迅速得到激活应用于农业生产中。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
目前黄瓜枯萎病的防控措施多样，但存在普遍弊端或难以操控的因素。(1)熏蒸：在密闭条件下药物熏蒸，需要持续一定的时间并且对温度有一定的要求，此外，药物用量也需根据种植面积、苗木大小、植株长势酌情定夺；若任一因素把握不当，就会大面积发生药害。(2)管理：枯萎病菌对温湿度的要求是“高温高湿”。目前，蔬菜大面积种植地区管理粗放，连作现象显著，在施肥灌水不当，氮肥施用过多，土壤酸化明显，枝叶过密，通风不良，光照不足等情况下枯萎病极易迅速发病、传播。自然气候条件很难把握。(3)育种：控制病害发生最为经济、有效、环保的措施是选育和应用抗病品种，但是据文献报道，黄瓜高抗白粉病品种较少。目前在我国推广的及引入的种资中枯萎病的品种所占比例极小。利用传统的育种方法选育一个优良品系或自交系一般需要至少3年的时间，而成功育成一个品种最短也需要5～8年，这在很大程度上制约着新品种选育的速度。目前，转基因技术发展迅速，据此可以实现抗病性、产量等优良性状的突破，并且可以缩短育种周期、节约生产成本、极大地提高生产效率，但是其生态安全性有待考究。此外，由于黄瓜育种不可能同时兼顾早熟和抗病两性状，因此保护地黄瓜抗病能力普遍较差。同时，保护地条件通常比较适宜，有利于病害发生，因此黄瓜病害(尤其是叶部病害)发生严重。(4)化学试剂：目前生产上主要靠化学药剂来控制枯萎病、白粉病，但病原菌对常规化学药剂的抗性逐渐增强，且频繁用药造成残毒较大，效果却不够理想，急需筛选更有效的药剂。(5)嫁接：是现阶段防治黄瓜枯萎病的有效方式，但是操作困难，难以进行大规模操作。总之，在黄瓜枯萎病的防治工作上，方法很多，但是效果却都不够理想，而且化学农药用量在逐年增大，但防效却不断下降。
木霉菌作为一种重要的植病生防菌一直受到普遍关注。研究木霉菌对黄瓜枯萎病的拮抗作用，筛选优良的菌株，选择合适的生产工艺，对黄瓜的生产具有明显的现实意义。
本申请以木霉为研究对象，就生产中的废弃物为固体培养基质，对其生防菌剂进行研究。以期筛选出最佳固体培养基质、最优发酵条件；通过筛选最适助剂配方，测定相关指标及贮存稳定性，以期研制出水分散粒剂；同时在盆栽试验中对该制剂的促生防病效果进行研究。以下针对本申请实施例的一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法进行具体说明：
本申请提供一种长枝木霉孢子的培养方法，其包括将木霉菌种接种于培养基，在预设温度下培养预设时间。
Ⅰ-1、拮抗木霉菌株的筛选
通过对木霉生长速度、产孢量及与病菌对峙抑制率指标进行初筛，然后通过对非挥发性物质和挥发性物质检测、几丁质酶活性检测对初筛木霉进行复筛，最后通过活体接菌防效试验确定最终优选菌株。
Ⅰ-2、木霉孢子悬浮液的制备
温保存的木霉菌种活化后，打成直径为3～7mm的菌块，接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基，于25～30℃培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养3～5d后，加入10mL已灭菌的蒸馏水并滴入0.05mL吐温-80，缓慢摇晃，使分生孢子充分脱落，用无菌水将洗脱液稀释成浓度为107cfu·g-1溶液，备用。
Ⅰ-3、培养基的制备
将培养基的原料以一定比例混合置于培养容器中，使其厚度/高度为4～6cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为50～70％，于相对大气压0.8*105～1.2*105Pa的预定压强下高温灭菌40～80min，待冷却后制得培养基。
可选地，培养基的原料包括草炭、蛭石、牛粪和菌糠，培养基中草炭、蛭石、牛粪和菌糠的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。
可选地，培养基的pH为5～6。长枝木霉在pH为5～6的培养基中产孢量较高。
Ⅰ-4、优化木霉培养发酵条件
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用透气结构对培养容器封口，在25～32℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养6～8天后，置于25～35℃干燥箱中烘干。
其中，透气结构包括纱布，采用纱布封口时纱布的层数为7～9。
保持一定的透气性能够提高长枝木霉的孢子萌发率，提高培养效率。并且纱布能够防止一定的外物进入培养容器。
木霉菌种的接种量为23～27％。
可选地，木霉菌种的接种量为24～26％。
可选地，木霉菌种的接种量为25％。
接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。
但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。
采用上述方法培养长枝木霉的产孢量较高，可达到8.24*108cfu·g-1以上方法，培养效率较高。
本申请还提供一种长枝木霉水分散粒剂的制备方法，其包括根据上述的长枝木霉孢子的培养方法培养得到长枝木霉孢子和制备长枝木霉水分散粒剂，制备长枝木霉水分散粒剂包括将长枝木霉孢子和助剂混合，其中长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为7×108～10×108cfu·g-1。
按照重量份数计，助剂包括以下成分：0.4～0.6份羧甲基纤维素、4～4.5份硝酸钾、4.5～5.5份聚乙烯基吡络烷酮、4.5～5.5份尿素、4.5～5.5份硅藻土、4.5～5.5份十二烷基硫酸钠、0.5～0.65份保护剂卵磷脂和70～80份亚甲基双荼磺酸钠。
可选地，按照重量份数计，助剂包括以下成分：0.5份羧甲基纤维素、4.2份硝酸钾、5份聚乙烯基吡络烷酮、5份尿素、5份硅藻土、5份十二烷基硫酸钠、0.58份保护剂卵磷脂和74.72份亚甲基双荼磺酸钠。
将制得的长枝木霉孢子干燥后制成长枝木霉粉末，向长枝木霉粉末中按照上述配比添加羧甲基纤维素、硝酸钾、尿素、硅藻土、十二烷基硫酸钠、保护剂卵磷脂和亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加聚乙烯基吡络烷酮，使混合物中水的质量百分数为30～40％，然后造粒、干燥制得长枝木霉水分散剂。
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为3～5％。此水分含量既有利于保持长枝木霉的活性，又有利于使其较长时间处于稳定的状态。
可选地，长枝木霉水分散剂的粒子的直径为1～500mm。
本申请还提供一种长枝木霉水分散粒剂，其根据上述的长枝木霉水分散粒剂的制备方法制备得到。
长枝木霉水分散粒剂在4±2℃的温度下的稳定性明显高于室温(25℃左右)。
水分散粒剂为一种干悬浮剂或粒型可湿性粉剂，可使长治木霉菌稳定保存，水分散粒剂遇水后激活，能够自动崩解，分散成悬浮液后使用。
此长枝木霉水分散粒剂在储存时稳定性较好，可较长时间储存；遇水后能够迅速得到激活应用于农业生产中。
以下结合实施例对本申请的一种长枝木霉水分散粒剂及其制备方法作进一步的详细描述。
实施例1
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为1：1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为60％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用8层纱布培养容器封口，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
实施例2
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为0.8：1.2：0.8：1.2混合置于培养容器中，使其高度为4cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为50％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用7层纱布培养容器封口，在25℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养6天后，置于25℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为27％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.4重量份羧甲基纤维素、4重量份硝酸钾、4.5重量份尿素、4.5重量份硅藻土、4.5重量份十二烷基硫酸钠、0.5重量份保护剂卵磷脂和70重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加4.5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为3％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为7×108cfu·g-1。
实施例3
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为1.2：0.8：1.2：0.8混合置于培养容器中，使其高度为6cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为70％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用9层纱布培养容器封口，在32℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养6天后，置于35℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为23％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.6重量份羧甲基纤维素、4.5重量份硝酸钾、5.5重量份尿素、5.5重量份硅藻土、5.5重量份十二烷基硫酸钠、0.65重量份保护剂卵磷脂和80重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为5％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为10×108cfu·g-1。
实施例4
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为1：1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为60％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用8层纱布培养容器封口，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
实施例5
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为1：1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为80％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用8层纱布培养容器封口，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
实施例6
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为1：1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为80％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为20％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
实施例7
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为1：1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为80％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
实施例8
本申请实施例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为1：1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为80％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
对比例1
本申请对比例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石和牛粪以质量比为1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为60％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用8层纱布培养容器封口，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
对比例2
本申请对比例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和秸秆以质量比为1：1：1：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为60％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用8层纱布培养容器封口，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
对比例3
本申请对比例提供一种长枝木霉孢子的培养方法、长枝木霉水分散粒剂及其制备方法，包括以下步骤：
1、培养长枝木霉孢子
将草炭、蛭石、牛粪和菌糠以质量比为0.5：1：0.5：1混合置于培养容器中，使其高度为5cm，加入蒸馏水，混合均匀，使培养基中蒸馏水的质量百分数为60％，高温高压灭菌后制得培养基；
将木霉菌种接种于培养基，搅拌均匀，采用8层纱布培养容器封口，在28℃的温度的培养箱中恒温光照(24h,10000lx)培养7天后，置于30℃干燥箱中烘干制得长枝木霉孢子。
木霉菌种的接种量为25％。
2、制备长枝木霉水分散粒剂
将干燥的长枝木霉粉末与0.5重量份羧甲基纤维素、4.2重量份硝酸钾、5重量份尿素、5重量份硅藻土、5重量份十二烷基硫酸钠、0.58重量份保护剂卵磷脂和74.72重量份亚甲基双荼磺酸钠后，搅拌均匀，再向混合物中添加5重量份聚乙烯基吡络烷酮，干燥后制得长枝木霉水分散粒剂；
长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为4％；
长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为8.4×108cfu·g-1。
试验例1
分别测得实施例1～8和对比例1～3培养长枝木霉孢子的产孢量，如表1所示。
表1实施例1～8和对比例1～3培养长枝木霉孢子的产孢量
Figure BDA0002300958990000161
Figure BDA0002300958990000171
由表1可知，由实施例1可知，当培养基的原料为草炭、蛭石、牛粪和菌糠，且其质量比为1：1：1：1时，长枝木霉的培养效率较高，产孢量较高，可达到8.78*108cfu·g-1；
由对比例1～3可知，培养基的原料只包括草炭、蛭石和牛粪，或用秸秆替代菌糠，或其质量比不为1：1：1：1时，长枝木霉的培养效率不高。
由实施例4～5可知，培养基中的水分高于70％或低于50％时，长枝木霉的培养效率一般，低于实施例1的培养效率；
由实施例6～7可知，培养基的接种量低于23％或高于27％时，长枝木霉的培养效率一般，低于实施例1的培养效率；
由实施例8可知，没有采用纱布封口的培养基的培养效率一般，低于实施例1的培养效率。
试验例2
试验采用盆栽方式，完全随机排列，试验共设5个处理，将消毒后的土壤分成5组，第1组的土壤中不施任何肥料，第2组的土壤与实施例1制得的长枝木霉水分散粒剂按照质量比为25：1混合均匀，第3组的土壤与实施例1制得的长枝木霉水分散粒剂按照质量比为50：1混合均匀，第4组的土壤与实施例1制得的长枝木霉水分散粒剂按照质量比为100：1混合均匀，第5组的土壤与培养基按照质量比为50：1混合均匀。
将第1组～第5组的土壤装入直径为10cm的花盆，700g·盆-1，每组土壤分装到5个花盆中，一共25盆。之后将催芽后的黄瓜种子均匀穴播在塑料钵中，6粒.盆-1，定期浇水，生长期间不施加任何肥料，出苗后挑去弱势幼苗，留苗5株.盆-1。
待黄瓜植株生长60d后每组土壤随机选取5株，洗净吸干水分，测定其株高、地上鲜重、根系长度、根系鲜重、基部茎粗等指标。然后将其置于105℃下杀青30min，70℃烘干至恒重，并称其干重，其结果如表2～11所示。
生理指标测定：叶绿素含量采用分光光度计法1，可溶性糖含量采用葱酮法，测定蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法1；测定POD活性采用愈创木酚法，测定PAL活性采用紫外分光光度法。
表2第1组～第5组的黄瓜株高
Figure BDA0002300958990000181
表3第1组～第5组的黄瓜茎粗
Figure BDA0002300958990000182
表4第1组～第5组的地上鲜重
Figure BDA0002300958990000183
表5第1组～第5组的根系长度(cm)
表6第1组～第5组的根系鲜重
表7第1组～第5组的叶绿素
表8第1组～第5组的可溶性蛋白质
表9第1组～第5组的过氧化物酶
Figure BDA0002300958990000202
表10第1组～第5组的苯丙氨酸解氨酶
Figure BDA0002300958990000203
表11第1组～第5组的黄瓜干重
Figure BDA0002300958990000204
Figure BDA0002300958990000211
第3组与第1组和第5组对比可知，长枝木霉水分散粒剂能够显著的提高与作物生长和抗性相关的物质含量和酶活性，黄瓜株高、基部茎粗、地上鲜重、根系长度、根系鲜重、叶绿素和可溶性蛋白质含量的相对增长较多，第3组的过氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶两种酶的活性均显著高于第1组、第5组，木霉制剂处理的植株粗壮高大，叶片深绿，根系发达，且有明显的增长效果。
并且，由第3组与第2组和第4组对比可知，过多或过少的施加长枝木霉水分散粒剂效果也一般，需要适量的施加长枝木霉水分散粒剂。
试验例3
黄瓜白粉病菌孢子悬浮液：采集自然发病的黄瓜植株上的白粉病菌，小心保存，然后转接在温室盆栽黄瓜植株叶片上，在25℃恒温培养备用。将发病黄瓜植株叶片上新鲜的分生孢子用无菌水轻轻刷取，然后将其稀释成浓度为108cfu/L分生孢子悬浮液，备用。
立枯丝核菌菌丝体悬浮液：低温保存立枯丝核菌的菌种活化后，将其打成菌块(直径为5mm)，以每瓶5块的接种量加入70mL-1液体培养基中，于25℃、180r/min摇床上培养5d，之后用匀浆机(1500r/min)匀浆30s，制成菌丝悬浮液，备用。
尖孢镰刀菌孢子悬浮液：低温保存的尖孢镰刀菌的菌种活化后，将其打成菌块(直径为5mm)，按每瓶5块的接种量加入到70mL-1液体培养基中，于25℃、180r/min摇床上培养5d，制成浓度为108cfu/L分生孢子悬浮液，备用。
黄瓜白粉病
将土样装入直径为10cm的花盆，700g·盆-1。之后将催芽后的黄瓜种子均匀穴播在塑料钵中，定期浇水，生长期间不施加任何肥料，出苗后挑去弱势幼苗，留苗5株·盆-1。待黄瓜幼苗长到30d后，做3个处理，进行3次平行试验。处理1：不做任何处理；处理2：接种病害前喷施长枝木霉T6水分散粒剂，喷施量30ml/株；处理3：接种病菌前喷施800倍液的多菌灵菌液，喷施量30m/株。隔天在叶面喷施108cfu·g-1黄瓜白粉病菌的孢子悬浮液。60d后测定白粉病的发生状况，计算相对防效，其结果如表12所示。
表12第1组～第3组的黄瓜白粉病病情指数和生防效果
Figure BDA0002300958990000221
黄瓜立枯病
消毒后的土壤，设3个处理，进行3次平行试验。处理1：土壤中不施任何肥料；处理2：土壤与长枝木霉T6水分散粒剂按50：1配比；处理3：土壤中不施任何肥料，但接种病菌前喷施800倍液的多菌灵菌液。配比后的土样装入直径为10cm的花盆，700g·盆-1，经催芽后的黄瓜种子均匀穴播在塑料盆中，5粒·盆-1，处理后的土壤定期浇灌，待黄瓜长到30d后，刺伤根部，在根部喷施108cfu·g-1立枯丝核菌的菌丝体悬浮液。60d后测定立枯病的发生状况，计算相对防效，其结果如表13所示。
表13第1组～第3组的黄瓜立枯病病情指数和生防效果
Figure BDA0002300958990000231
辣椒立枯病
消毒后的土壤，设3个处理，进行3次平行试验。处理1：土壤中不施任何肥料；处理2：土壤与长枝木霉T6水分散粒剂按50：1配比；处理3：土壤中不施任何肥料，但接种病菌前喷施800倍液的多菌灵菌液。配比后的土样装入直径为10cm的花盆，700g·盆-1，经催芽后的辣椒种子均匀穴播在塑料盆中，5粒·盆-1，处理后的土壤定期浇灌，待辣椒长到30d后，刺伤根部，在根部接种108cfu·g-1立枯丝核菌菌丝体悬浮液。60d后测定辣椒的发病情况，计算相对防效，其结果如表14所示。
表14第1组～第3组的辣椒立枯病病情指数和生防效果
Figure BDA0002300958990000241
白菜根腐病
消毒后的土壤，设3个处理，进行3次平行试验。处理1：土壤中不施任何肥料；处理2：土壤与长枝木霉T6水分散粒剂按50：1配比；处理3：土壤中不施任何肥料，但接种病菌前喷施800倍液的多菌灵菌液。配比后的土样装入直径为10cm的花盆，700g·盆-1，经催芽后的白菜种子均匀穴播在塑料盆中，5粒·盆-1，处理后的土壤定期浇灌，30d后的白菜幼苗接入108个/ml尖孢镰刀菌的孢子悬浮液，接种前先用小刀轻轻破坏根部，每株幼苗接入3ml菌液，3次重复，60d后测定根腐病的发生状况，计算相对防效，其结果如表15所示。
表15第1组～第3组的白菜根腐病病情指数和生防效果
在对植株病害防治试验中发现，长枝木霉水分散粒剂对黄瓜白粉病和黄瓜立枯病均具有较好的生防效果，可有效控制病害的蔓延，对辣椒立枯病和油菜根腐病具有明显的防治效果，且该菌剂对供试植株安全无害。施入木霉菌剂的黄瓜，植株不仅粗壮高大，叶片深厚嫩绿，根系发达，具明显增长效果，而且发病程度较轻。
以上所述仅为本申请的具体实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种长枝木霉孢子的培养方法，其特征在于，所述长枝木霉孢子的培养方法包括将木霉菌种接种于培养基，在预设温度下培养预设时间；
所述培养基的原料包括草炭、蛭石、牛粪和菌糠，所述培养基中所述草炭、所述蛭石、所述牛粪和所述菌糠的质量比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。
2.根据权利要求1所述的长枝木霉孢子的培养方法，其特征在于，所述培养基通过以下方法制得：
将所述草炭、所述蛭石、所述牛粪和所述菌糠按照质量比混合均匀，加入水，在预定压强下灭菌处理制得所述培养基；
可选地，所述培养基中所述水的质量百分数为50～70％；
可选地，所述水为蒸馏水。
3.根据权利要求1或2所述的长枝木霉孢子的培养方法，其特征在于，培养前采用透气结构对培养容器封口，所述透气结构包括纱布，采用所述纱布封口时纱布的层数为7～9。
4.根据权利要求1或2所述的长枝木霉孢子的培养方法，其特征在于，所述木霉菌种的接种量为23～27％；
可选地，所述木霉菌种的接种量为24～26％；
可选地，所述木霉菌种的接种量为25％。
5.根据权利要求1或2所述的长枝木霉孢子的培养方法，其特征在于，将所述木霉菌种接种于所述培养基后，在25～32℃的温度下培养6～8天。
6.根据权利要求1或2所述的长枝木霉孢子的培养方法，其特征在于，培养时保持恒温光照。
7.一种长枝木霉水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述长枝木霉水分散粒剂的制备方法包括根据权利要求1～6任一项所述的长枝木霉孢子的培养方法培养得到长枝木霉孢子和制备长枝木霉水分散粒剂，所述制备长枝木霉水分散粒剂包括将所述长枝木霉孢子和助剂混合，其中所述长枝木霉水分散粒剂中长枝木霉孢子的含量为7×108～10×108cfu·g-1。
8.根据权利要求7所述的长枝木霉水分散粒剂的制备方法，其特征在于，按照重量份数计，所述助剂包括以下成分：0.4～0.6份羧甲基纤维素、4～4.5份硝酸钾、4.5～5.5份聚乙烯基吡络烷酮、4.5～5.5份尿素、4.5～5.5份硅藻土、4.5～5.5份十二烷基硫酸钠、0.5～0.65份保护剂卵磷脂和70～80份亚甲基双荼磺酸钠。
9.根据权利要求7所述的长枝木霉水分散粒剂的制备方法，其特征在于，所述长枝木霉水分散粒剂中水的质量百分数为3～5％。
10.一种长枝木霉水分散粒剂，其特征在于，所述长枝木霉水分散粒剂根据权利要求1～9任一项所述的长枝木霉水分散粒剂的制备方法制备得到。
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