CN112760234B - 一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法 - Google Patents

一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法，是将菌糠、水、尿素、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁和氯化钙混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水5～20ml，每克菌糠中加入尿素0.01‑0.10g，每克菌糠中加入硫酸镁0.01～0.08g，每克菌糠中加入硫酸铜0.005～0.030g，每克菌糠中加入硫酸亚铁0.005～0.030g，每克菌糠中加入氯化钙0.01～0.08g，将哈茨木霉接种液和绿色木霉接种液按照按体积比1：1‑5混合后接入液体培养基收获哈茨木霉与绿色木霉菌剂。本发明减少了发酵时间，并且增加了产孢量。

Description

一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉 菌剂制备方法
技术领域
本发明属于发酵培养技术领域，尤其涉及一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法
背景技术
菌糠是代料栽培收货后的剩余物，是食用菌残体及经食用菌酶解，结构发生质变的等成分的复合物。菌糠中含有大量的粗蛋白、糖类、有机酸类、粗脂肪及无机离子。随着食用菌种植范围扩大，环境问题日渐突出。食用菌菌糠大量堆积，对环境造成压力。为了解决菌糠随意丢弃导致的资源浪费环境污染问题，尝试对废弃菌糠重复利用，合理开发利用食用菌菌糠使其资源化高效利用，不仅可以解决环境污染问题，还可以变废变宝，从而促进食用菌产业的可持续发展。
哈茨木霉和绿色木霉是高效纤维素降解菌，能够向细胞外分泌多种木质纤维素降解酶和细胞壁水解酶，可以有效利用木质纤维进行生长、产孢。哈茨木霉和绿色木霉是应用成熟的生物农药，可以有效的防治多种土传性植物病害。
发明内容
本发明的目的是提供一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基，解决菌糠资源的浪费及生物农药生产的不足的问题，其是将菌糠、水、尿素、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁和氯化钙混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水5~20ml，每克菌糠中加入尿素0.01-0.10g，每克菌糠中加入硫酸镁0.01~0.08g，每克菌糠中加入硫酸铜0.005~0.030g，每克菌糠中加入硫酸亚铁0.005~0.030g，每克菌糠中加入氯化钙0.01~0.08g。
作为本发明更优的技术方案，所述的菌糠为以木屑为基质的木耳菌糠、滑子菇菌糠、平菇菌糠、香菇菌糠、金针菇菌糠、杏鲍菇菌糠中的一种或是几种。
作为本发明更优的技术方案，所述的每克菌糠中加入水5ml，每克菌糠中加入尿素0.10g，每克菌糠中加入硫酸镁0.01g，每克菌糠中加入硫酸铜0.005g，每克菌糠中加入硫酸亚铁0.005g，每克菌糠中加入氯化钙0.01g。
作为本发明更优的技术方案，所述的高压蒸汽温度为121℃，水蒸汽压力为0.11MPa。
作为本发明更优的技术方案，所述的高压蒸汽灭菌时间30min。
本发明还有一个目的是提供一种哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法，生产成本较低并且周期较短，实现哈茨木霉与绿色木霉菌大量培养，具体步骤如下：将哈茨木霉接种液和绿色木霉接种液按照体积比1：1-5混合后接入哈茨木霉与绿色木霉液体培养基，按每克菌糠加入0.14~0.28ml混合接种液，密封后在28°C摇床中以150rpm速度培养1-10d后收获。
作为本发明更优的技术方案，所述的哈茨木霉接种液和绿色木霉接种液按体积比1：1混合。
作为本发明更优的技术方案，所述的哈茨木霉接种液通过将哈茨木霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在29℃培养箱中培养3-5天后冲洗平板，得到浓度为107孢子/ml的接种液。
作为本发明更优的技术方案，所述的绿色木霉接种液将绿色木霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在29℃培养箱中培养3-5天后冲洗平板，得到浓度为107孢子/ml的接种液。
有益效果如下：
本申请以较低浓度107个孢子/mL的接种液，较短的发酵时间3天左右，达到最大产孢量为59.2×108个孢子/mL，产孢量达到接种量的592倍。
本发明的液体培养基能为哈茨木霉和绿色木霉生长提供大部分的营养物质，尿素、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁、氯化钙作为菌糠培基的补充物质，为哈茨木霉和绿色木霉的产孢提供N源和生长所需的无机盐成分，同时菌糠作为食用菌培养的废弃物，其经济易得。使用菌糠培养哈茨木霉和绿色木霉，在获得生防菌的同时也提高了菌糠的利用价值。
本发明的哈茨木霉和绿色木霉的培养方法，操作简单，流程清晰，对生产设备要求不高，周期短，成本低，对环境友好，在培养过程中使用空气摇床进行混合培养，在增加其供氧量的同时，也减少了生产中杂菌的污染问题，非常适合小型企业和生产单位快速生产哈茨木霉和绿色木霉。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施列来进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容不仅仅限于下面的实施例，不能理解为对发明保护范围的限制。
本发明所述的哈茨木霉和绿色木霉木霉购自上海瑞楚生物科技有限公司微生物菌种保藏中心。
实施例1：
A、菌糠培养基的制备
按照权利要求1制备菌糠培养基：菌糠加入5g，料水比为1g：（按质量体积比）5ml、尿素（0.01g/每克干菌糠）硫酸镁（0.01g/每克干菌糠）、硫酸铜（0.005g/每克干菌糠）、硫酸亚铁（0.005g/每克干菌糠）、氯化钙（0.01g/每克干菌糠），将配置好的菌糠培养基混匀高压蒸汽灭菌30min得到。
B、哈茨木霉接种液的制备
将哈茨木霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在29℃培养箱中培养3-5天后，冲洗长有哈茨木霉的平板，得到浓度为107孢子/ml的哈茨木霉接种液。
C、绿色木霉接种液的制备
将绿色木霉木霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，放置在29℃培养箱中培养3-5天后，冲洗长有绿色木霉的平板，得到浓度为107孢子/ml的绿色木霉木霉接种液。
D、哈茨木霉和绿色木霉混合接种液的制备
使用无菌操作将a中哈茨木霉接种液和b中的绿色木霉按照1:1混合，得到哈茨木霉和绿色木霉混合接种液
E、在灭菌的装有菌糠培养基的50ml锥形瓶中加0.7ml的哈茨木霉和绿色木霉混合接种液接种液，瓶口用封口膜封口，放在28℃的摇床中培养1d后收获。
上述制备的哈茨木霉和绿色木霉培养基收获的培养液通过血球计数法进行测量：培养液使用4层无菌纱布过滤，得到滤液。通过25×16型的计数板，计数四个角和中央的五个中方格（即80个小方格）的孢子数，测量滤液中的孢子液，计算公式如下：孢子数/mL=80个小方格孢子总数/80×400×10000×稀释倍数采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例2：
本实施例与实施例1的区别仅在于：步骤a中所加入的尿素为0. 10g/每克干菌糠。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例3：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤a中所加入的料水比为1g：（按质量体积比）20ml。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例4：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤a中所加入的硫酸镁为0.08g/每克干菌糠。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例5：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤a中所加入的硫酸铜为0. 030g/每克干菌糠。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例6：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤a中所加入的硫酸亚铁为0. 030g/每克干菌糠。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例7：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤a中所加入的氯化钙为0. 08g/每克干菌糠。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例8：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤b中哈茨木霉的接种液浓度为105孢子/ml。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例9：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤c中绿色木霉的接种液浓度为105孢子/ml。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例10：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤d中哈茨木霉接种液和绿色木霉按照1:5混合，得到哈茨木霉和绿色木霉混合接种液。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例11：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤e中所加入的哈茨木霉和绿色木霉混合接种液为14ml。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
实施例12：
本实施例与实施例2的区别仅在于：步骤e中所用的培养时间为3天。采用各种菌糠制备哈茨木霉和绿色木霉菌剂的产孢量见表1。
各种菌糠发酵哈茨木霉和绿色木霉的产孢量（单位:108个孢子/mL）如表1所示，实施例12中金针菇菌糠作为培养基发酵的哈茨木霉和绿色木霉孢子液浓度最大，比同等条件下其他菌糠提高15.2-32.6%，与哈茨木霉和绿色木霉孢子液浓度最低的实施例9的杏鲍菇菌糠提高了96.7%。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
现有技术中固体发酵一般使用浓度为108个孢子/mL 的接种液培养5-7天，达到产孢量200×108个孢子/mL，产孢量为接种液的200倍。本申请使用107个孢子/mL 的接种液培养3天左右，达到最大产孢量为59.2×108个孢子/mL，产孢量达到接种量的592倍。
本申请提供的液体培养基及菌剂生产方法相对于现有的固体发酵减少了发酵时间，并且增加了产孢量。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多种实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基，其特征在于：将菌糠、水、尿素、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁和氯化钙混匀后经高压蒸汽灭菌得到，每克菌糠中加入水5~20ml，每克菌糠中加入尿素0.01-0.10g，每克菌糠中加入硫酸镁0.01~0.08g，每克菌糠中加入硫酸铜0.005~0.030g，每克菌糠中加入硫酸亚铁0.005~0.030g，每克菌糠中加入氯化钙0.01~0.08g；
所述的菌糠为以木屑为基质的木耳菌糠、滑子菇菌糠、平菇菌糠、香菇菌糠、金针菇菌糠、杏鲍菇菌糠中的一种或是几种。
2.如权利要求1所述的一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基，其特征在于：所述的每克菌糠中加入水5ml，每克菌糠中加入尿素0.10g，每克菌糠中加入硫酸镁0.01g，每克菌糠中加入硫酸铜0.005g，每克菌糠中加入硫酸亚铁0.005g，每克菌糠中加入氯化钙0.01g。
3.如权利要求1所述的一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基，其特征在于：所述的高压蒸汽温度为121℃，水蒸气压力为0.11MPa。
4.一种哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法，其特征在于：将哈茨木霉接种液和绿色木霉接种液按照体积比1：1-5混合后接入如权利要求1所述的哈茨木霉与绿色木霉液体培养基，按每克菌糠加入0.14~0.28ml混合接种液，密封后在28°C摇床中以150rpm速度培养1-10d后收获。
5.如权利要求4所述的一种哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法，其特征在于：所述的哈茨木霉接种液和绿色木霉接种液按照按体积比1：1混合。
6.如权利要求4所述的一种哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法，其特征在于：所述的哈茨木霉接种液是通过将哈茨木霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，在29℃培养箱中培养3-5天后收获得到的接种液。
7.如权利要求4所述的一种哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法，其特征在于：所述的绿色木霉接种液是将绿色木霉菌块使用无菌操作放置在装有灭菌PDA培养基的平板培养皿中，在29℃培养箱中培养3-5天后收获得到的接种液。
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