CN103992956A - 一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法。本发明利用食用菌糠发酵木霉，制备生防菌剂，通过该方法发酵木霉可减少生产工艺环节，使用本发明中的方法固体发酵木霉，可产生大量的分生孢子，发酵单位高，生产过程环保无污染。本发明技术方案不仅为食用菌糠的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的木霉生防菌剂可用于田间施用，起到防治多种植物病原真菌、促进农作物生长和改良土壤的多重功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种木霉生防菌剂的制备方法，具体为一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法。
背景技术
随着我国食用菌产业化、工业化的蓬勃发展，食用菌生产后栽培废料的处理问题越来越受到人们的关注。食用菌生产后栽培废料又叫食用菌糠、食用菌渣、食用菌下脚料等，是栽培蘑菇过程中产生的有机固体废物，蘑菇菌丝有较强的纤维分解能力，其菌丝体在生长过程中会分泌一些激素物质和一系列的酶，在这些酶的作用下，能使粗硬的大纤维变得疏松。因此，废料中的粗纤维降低了50%，木质素降低了30%，粗蛋白含量由原来的2%增加到7.83%，相当玉米蛋白质的含量，有毒物质棉酚由0.58%变为无毒。各种秸秆菌料经过菌丝分解转化后含有18种氨基酸、糖类，以及钙、铁、锰、钾等营养物质和丰富的微量元素。因此，食用菌糠是不可忽视的可再生资源。
木霉（Trichoderma sp.）在自然界中分布广泛，是一种重要的生防菌，对多种植物病原菌均有较好的防治作用。山东省应用微生物重点实验室保存的一株哈茨木霉菌株，分离自山东省济南市的蔬菜田土壤中，具有很好的生防作用。该菌株对多种植物病原真菌具有强烈的拮抗作用，对禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、立枯丝核菌（R. solani）、苹果链格孢菌（Alternaria mali）、轮纹大茎点菌（Macrophoma kawatsukai）、芸薹链格孢菌（A. brassica）、麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokinana）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、大丽花轮枝孢菌（Verticillium dahliae）的抑制率分别为89.2、87.4、84.9、78.2、74.4、61.2、54.8、50.2%，对植物根结线虫也具有一定的防治效果。
如何降低木霉生防菌剂的生产成本，同时为高效处理食用菌糠找到有效的处理方法，减少环境污染，是本发明需要解决的问题。
文献报道的木霉的生产方法多采用的培养基以粮食及其副产品为主要营养物质来源，或以食用菌糠为主要原料，再添加其它物质进行固体发酵。如：公开号：CN 102524305A和公开号：CN 102613252A的专利中公开了一种哈茨木霉的生产方法，以蘑菇渣为支持物，按比例添加甘蔗渣，制成固体培养基，然后按照比例添加进甘薯/马铃薯淀粉废水制作的木霉液体种子，获得的哈茨木霉菌剂中的孢子数量最高为50亿/g。而仅以食用菌糠为固体培养基大批量固体发酵木霉方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种仅利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法。本发明利用食用菌糠发酵木霉，制备生防菌剂，通过该方法发酵木霉可减少生产工艺环节，使用本发明中的方法固体发酵木霉，可产生大量的分生孢子，发酵单位高，生产过程环保无污染。本发明技术方案不仅为食用菌糠的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的木霉生防菌剂可用于田间施用，起到防治多种植物病原真菌、促进农作物生长和改良土壤的多重功效。
本发明的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法技术方案为，包括以下步骤：
（1）食用菌糠处理；
（2）孢子悬浮液制备;
（3）种子液制备；
（4）固体发酵获得木霉分生孢子初产物；
（5）后处理。
步骤（1）具体为：将新鲜的食用菌糠烘干，粉碎，备用。
步骤（2）具体为：将木霉菌置于20-35℃培养3-10d，加入适量溶液，洗下木霉分生孢子，制成木霉分生孢子悬浮液。
步骤（3）具体为：加入经过步骤（1）处理的食用菌糠，加水，使其含水量达到60%（w/w）以上，混匀，湿热灭菌，冷却后接种木霉分生孢子悬浮液，混匀后，于20-35℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在60%以上，3-10d后水洗培养物获得分生孢子液，即为木霉种子液，分装并放于-80℃保存备用。
步骤（4）具体为：将发酵培养基湿热灭菌，冷却后再进行二次灭菌，冷却后将木霉种子液添加到该固体培养基中，搅拌均匀，20-35℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在60%以上，3-10d后即得到木霉分生孢子初产物。
步骤（5）具体为：按照产品需求将木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，同时加入黄原胶、黄腐酸钠、SDS、几丁质，充分混匀，制成木霉生防菌剂，密封包装。
步骤（5）中，将木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，加入硅藻土重量的0.5-2%黄原胶、0.1-0.3%黄腐酸钠、0.5-2%SDS、0.1-0.5%几丁质。
所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，具体包括以下步骤：
（1）食用菌糠处理：将新鲜的食用菌糠90℃烘干12h，粉碎至粒度为0.2-0.6cm，备用；
（2）木霉分生孢子悬浮液制备
将木霉菌块置于28℃培养5d，将无菌生理盐水加入平板中，洗下木霉分生孢子，制成木霉分生孢子悬浮液；
（3）木霉种子液制备
将步骤（1）中已处理好的食用菌糠，加自来水，使其含水量达到65%，混匀，121℃湿热灭菌20min，冷却至30℃后接种木霉分生孢子悬浮液，接种浓度为1??107 cfu/g培养干料，混匀后，于28℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在65%，5d后在无菌条件下水洗培养物获得分生孢子液，即为木霉种子液，分装并放于-80℃保存备用；
（4）固体发酵获得木霉分生孢子
将发酵培养基分装，培养基厚度为5cm，121℃湿热灭菌60min，冷却至30℃后再进行二次灭菌，冷却至30℃后将木霉种子液添加到该固体培养基中，搅拌均匀，28℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在65%，5d后即得到木霉分生孢子初产物；
（5）后处理：按照产品需求将木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，同时加入硅藻土重量的1.0%的黄原胶、0.1%的黄腐酸钠、1%的SDS、0.3%的几丁质，制成不同有效杀菌成分含量的木霉生防菌剂，密封包装。
本发明的有益效果为：本发明利用食用菌糠发酵木霉，制备生防菌剂，通过该方法发酵木霉可减少生产工艺环节，使用本发明中的方法固体发酵木霉，可产生大量的分生孢子，发酵单位高，生产过程环保无污染。本发明技术方案不仅为食用菌糠的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的木霉生防菌剂可用于田间施用，起到防治多种植物病原真菌、促进农作物生长和改良土壤的多重功效。
本发明的木霉生防菌剂中木霉分生孢子为有效杀菌成分，硅藻土为载体，黄原胶为防脱水，防紫外线，稳定剂，乳化剂，润湿剂，十二烷基苯磺酸钠为润湿剂，乳化剂，紫外线防护剂，黄腐酸钠为紫外线防护剂，几丁质为木霉菌提供营养，该菌剂可以直接用于农田土壤，既能增加土壤肥力，又能改良土壤，有效防治多种植物病原真菌，促进农作物生长。
附图说明：
图1所示为实施例1 哈茨木霉在食用菌糠固体培养基上发酵正交试验产孢率曲线。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
采用的菌种为山东省应用微生物重点实验室保存的一株哈茨木霉菌株，分离自山东省济南市的蔬菜田土壤中，具有很好的生防作用。该菌株对多种植物病原真菌具有强烈的拮抗作用，对禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、立枯丝核菌（R. solani）、苹果链格孢菌（Alternaria mali）、轮纹大茎点菌（Macrophoma kawatsukai）、芸薹链格孢菌（A. brassica）、麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokinana）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、大丽花轮枝孢菌（Verticillium dahliae）的抑制率分别为89.2、87.4、84.9、78.2、74.4、61.2、54.8、50.2%，对植物根结线虫也具有一定的防治效果。
（1）食用菌糠处理
将新鲜的食用菌糠（蘑菇废料）90℃烘干12h，最佳粉碎粒度为0.2-0.6cm，备用。
（2）哈茨木霉分生孢子悬浮液制备
从菌种保存管中挑取一个哈茨木霉菌块，放在PDA平板上，置于28℃培养5d，将无菌生理盐水加入平板中，洗下哈茨木霉分生孢子，制成哈茨木霉分生孢子悬浮液。
（3）哈茨木霉种子液制备
在罐头瓶中加入5g已处理的食用菌糠，加自来水，使含水量达到65%，混匀，121℃湿热灭菌20min，冷却至30℃后接种哈茨木霉菌分生孢子悬浮液，接种浓度为1??107 cfu/g培养干料，于28℃静态培养5d，无菌条件下水洗培养物获得分生孢子液（1??106cfu/mL），即为种子液，分装并放于-80℃保存备用。
（4）固体发酵获得哈茨木霉分生孢子
选择接种量、食用菌糠的含水量、培养温度3个因素进行L25(53)正交试验，试验因素水平见表1，在罐头瓶中加入5g已处理的食用菌糠，按不同含水量添加自来水，混匀，121℃湿热灭菌20min。冷却至30℃后按不同接种量添加哈茨木霉种子液，搅拌均匀，在不同温度下静态培养5d即得到哈茨木霉分生孢子初产物，每克干料的分生孢子产量最高可达到86亿，将哈茨木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，并加入黄原胶（1.0%）、黄腐酸钠（0.1%）、SDS（1%）、几丁质（0.3%）后，产品最高浓度可达到55亿/g。分析3种不同因素对固体发酵分生孢子产量的影响，具体如表1所示。
表1、固体发酵因素水平表
。
通过比较分生孢子产量，发现蘑菇废料中含水量达到65%时，接种量为11 mL/g干料，静态培养温度为28℃时，分生孢子产量最高（86.0亿cfu/g干料），具体见说明书附图图1：哈茨木霉在食用菌糠固体培养基上发酵正交试验产孢率曲线。
实施例2
利用食用菌糠生产哈茨木霉生防菌剂
（1）食用菌糠处理
将新鲜的食用菌糠90℃烘干12h，最佳粉碎粒度为0.2-0.6cm，备用。
（2）哈茨木霉分生孢子悬浮液制备
从菌种保存管中挑取一个哈茨木霉菌块，放在PDA平板上，置于28℃培养5d，将无菌生理盐水加入平板中，洗下木霉分生孢子，制成哈茨木霉分生孢子悬浮液。
（3）哈茨木霉种子液制备
在罐头瓶中加入5g已处理的食用菌糠，加自来水，使含水量达到65%（w/w），混匀，121℃湿热灭菌20min，冷却至30℃后接种哈茨木霉菌分生孢子悬浮液，接种浓度为1??107 cfu/g培养干料，于28℃静态培养5d，无菌条件下水洗培养物获得哈茨分生孢子液（1??106cfu/mL），即为种子液，分装并放于-80℃保存备用。
（4）固体发酵获得哈茨木霉分生孢子
将已处理的食用菌糠用不锈钢浅盘（30cm*24cm*2cm）分装，装料量为200g/盘，121℃湿热灭菌60min，冷却至30℃后再进行二次灭菌。冷却至30℃后按照11 mL/g干料的接种量添加哈茨木霉种子液，搅拌均匀，28℃静态培养5d即得到哈茨木霉分生孢子初产物，哈茨木霉分生孢子产量最高可达到75亿/g培养干料。
（5）哈茨木霉分生孢子生防菌剂的制备
将哈茨木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，同时加入硅藻土重量的黄原胶（1.0%）、黄腐酸钠（0.1%）、SDS（1%）、几丁质（0.3%）充分混匀，制成不同孢子含量的哈茨木霉生防菌剂，产品中分生孢子最高浓度可达到48亿/g。可以直接用于农田土壤，既能增加土壤肥力，又能改良土壤，有效防治多种植物病原真菌，促进农作物生长。
Claims (9)
1.一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，利用食用菌糠发酵木霉，制备生防菌剂。
2. 根据权利要求1所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）食用菌糠处理；
（2）孢子悬浮液制备；
（3）种子液制备；
（4）固体发酵获得木霉分生孢子初产物；
（5）后处理。
3. 根据权利要求2所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤（1）具体为：将新鲜的食用菌糠烘干，粉碎，备用。
4. 根据权利要求2所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤（2）具体为：将木霉菌置于20-35℃培养3-10d，加入适量溶液，洗下木霉分生孢子，制成木霉分生孢子悬浮液。
5. 根据权利要求2所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤（3）具体为：加入经过步骤（1）处理的食用菌糠，加水，使其含水量达到60%（w/w）以上，混匀，湿热灭菌，冷却后接种木霉分生孢子悬浮液，混匀后，于20-35℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在60%以上，3-10d后水洗培养物获得分生孢子液，即为木霉种子液，分装并放于-80℃保存备用。
6. 根据权利要求2所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤（4）具体为：将发酵培养基湿热灭菌，冷却后再进行二次灭菌，冷却后将木霉种子液添加到该固体培养基中，搅拌均匀，20-35℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在60%以上，3-10d后即得到木霉分生孢子初产物。
7. 根据权利要求2所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤（5）具体为：按照产品需求将木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，同时加入黄原胶、黄腐酸钠、SDS、几丁质，充分混匀，制成木霉生防菌剂，密封包装。
8. 根据权利要求7所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤（5）中，将木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，加入硅藻土重量的0.5-2%黄原胶、0.1-0.3%黄腐酸钠、0.5-2%SDS、0.1-0.5%几丁质。
9. 根据权利要求2所述的一种利用食用菌糠制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）食用菌糠处理：将新鲜的食用菌糠90℃烘干12h，粉碎至粒度为0.2-0.6cm，备用；
（2）木霉分生孢子悬浮液制备
将木霉菌块置于28℃培养5d，将无菌生理盐水加入平板中，洗下木霉分生孢子，制成木霉分生孢子悬浮液；
（3）木霉种子液制备
将步骤（1）中已处理好的食用菌糠，加自来水，使其含水量达到65%，混匀，121℃湿热灭菌20min，冷却至30℃后接种木霉分生孢子悬浮液，接种浓度为1??107 cfu/g培养干料，混匀后，于28℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在65%，5d后在无菌条件下水洗培养物获得分生孢子液，即为木霉种子液，分装并放于-80℃保存备用；
（4）固体发酵获得木霉分生孢子
将发酵培养基分装，培养基厚度为5cm，121℃湿热灭菌60min，冷却至30℃后再进行二次灭菌，冷却至30℃后将木霉种子液添加到该固体培养基中，搅拌均匀，28℃静态培养，期间空气的相对湿度控制在65%，5d后即得到木霉分生孢子初产物；
（5）后处理：按照产品需求将木霉分生孢子初产物添加到硅藻土中，同时加入硅藻土重量的1.0%的黄原胶、0.1%的黄腐酸钠、1%的SDS、0.3%的几丁质，制成不同有效杀菌成分含量的木霉生防菌剂，密封包装。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140820 |