CN111278966A - 液体和固体木霉产品的大规模生产 - Google Patents

液体和固体木霉产品的大规模生产 Download PDF

Info

Publication number
CN111278966A
CN111278966A CN201880062764.XA CN201880062764A CN111278966A CN 111278966 A CN111278966 A CN 111278966A CN 201880062764 A CN201880062764 A CN 201880062764A CN 111278966 A CN111278966 A CN 111278966A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trichoderma
alginate
liquid
agar
inoculant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880062764.XA
Other languages
English (en)
Inventor
肖恩·法默
肯·阿里贝克
夏米萨·马赞德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Locus Agriculture IP Co LLC
Original Assignee
Locus Agriculture IP Co LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Locus Agriculture IP Co LLC filed Critical Locus Agriculture IP Co LLC
Publication of CN111278966A publication Critical patent/CN111278966A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/38—Trichoderma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Abstract

本发明提供了一种工业化规模生产木霉菌的方法。在具体实施方式中，本发明提供了从相同的起始种子培养物和接种剂生产液态基于木霉的产品和固态基于木霉的产品的方法。

Description

液体和固体木霉产品的大规模生产
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年9月28日提交的美国临时申请号62/564,683的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
背景技术
土传致病真菌可对农作物造成广泛危害。例如，这些寄生虫会导致多种寄主植物的猝倒病、根腐病、冠腐病和颈腐病。这类最常见的致病真菌是丝核菌(Rhizoctonia)、腐霉属(Pythium)、镰刀菌属(Fusarium)、植原体(Phytophotora)、麦角菌硬粒(Sclerotia)、尾孢属(Cercospora)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、草莓属(Fragaria)、根霉属(Rhizopus)、葡萄孢菌(Botrytis)、炭疽菌属(Colletotrichum)、稻瘟菌(Magnaporthe)等。丝核菌、腐霉属和麦角菌硬粒的寄主范围非常广泛，能够攻击许多常见的经济作物，如豆类、西红柿、棉花、花生、土豆、莴苣(lettuce)和观赏性开花植物。
控制这些致病真菌的最常见方法涉及使用化学控制剂；然而，这些化学物质可能很昂贵，并且可能对公众健康和环境有害。此外，它们还可以通过例如改变周围的生态系统来破坏植物的微环境。
除了使用化学物质之外，另一种方法是使用生物控制剂，生物控制剂是在生态系统中天然发现的。例如，某些木霉菌(Trichoderma)真菌对各种害虫具有拮抗作用。这些真菌中的一些添加到土壤中时是有用的，在土壤中它们可以繁殖并与植物的根紧密结合生长。它们除了有助于刺激植物生长外，还能部分地保护根系免受其他植物致病真菌和其他微生物及动物害虫的侵袭。
木霉能在根表面建立强大而持久的定殖作用，穿透表皮和浅表下层细胞。这些根-微生物的结合引起了植物蛋白质组和代谢的重大变化。它们产生和/或释放多种化合物，诱导局部或系统的抗性反应，导致对植物缺乏致病性。
此外，植物通过类似于系统获得性抗性和根际细菌诱导的系统抗性的反应，免受多种植物致病菌的侵害。木霉能有效地减少一些土传植物致病菌引起的病害。例如，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)和绿色木霉(Trichodermaviride)对菌核菌属(Sclerotium spp)、丝核菌(Rhizoctonia)、镰刀菌(Solani)、腐霉属(Pythium spp)、镰刀菌属(Fusarium spp)、尾孢属(Cercospora spp)、罗尔斯通菌属(Ralstonia spp)、草莓属(Fragaria spp)、根霉属(Rhizopus spp)、葡萄孢菌(Botrytisspp)、炭疽菌属(Colletotrichum spp)、稻瘟菌属(Magnaporthe spp)等具有杀菌活性。此外，部分木霉菌株能够有效地抑制一些病毒和细菌植物和土壤致病菌的生长，并产生一些显著的杀线虫作用。
木霉菌属的根定殖除了保护植物免受病虫害的侵扰外，还可以促进根系的生长发育，提高作物的生产力，对非生物胁迫的抗性，以及营养物质的生物利用度。
尽管木霉菌株有可能有效地用于增强植物健康，但缺乏高效的大规模生产技术，对这些生物的商业化造成了一定的障碍。木霉最常见的生长方法是在传统的固体培养基上生长，目前的方法成本太高，不适合商业化应用。另一方面，在液体培养基中生长木霉的方法，即液态培养，是实验室或小规模的工艺，木霉的生产量不足以使其在商业上可行(例如，处理成百上千甚至数百万英亩的作物)。
木霉菌的大型液态培养法，或液态培养和固态培养相结合的方法，最适合商业化生产；然而，这种商业化的方法在大规模生产和低成本上是未知的。因此，有必要改进生产木霉真菌的方法，使其可放大用于商业用途。
发明简述
本发明涉及用于商业用途的基于液体和干燥微生物的产品的大规模生产。具体而言，本发明提供了大规模有效培养真菌(例如木霉)和/或其生长副产物的材料和方法。还提供了使用这些基于微生物的产品的方法。有利的是，本发明可以作为大规模、低成本生产微生物的“绿色”工艺，而不会向环境中释放有害化学物质。
本发明提供了有效生产和使用有益微生物的系统，以及用于生产和使用从这些微生物和生产这些微生物的发酵培养基衍生的物质(例如代谢物)的系统。根据本发明的生物体包括例如酵母、真菌、细菌、古细菌和植物细胞。在优选实施方式中，微生物是真菌。更优选地，所述微生物是木霉真菌，包括但不限于哈茨木霉、绿色木霉和/或钩状木霉。
在具体实施方式中，本发明提供了基于微生物的组合物，其包含木霉分支真菌和/或其生长副产物。基于木霉的产品可以是，例如，液态或干态。有利的是，在一个实施方式中，基于微生物的产品可以是接种剂的形式，接种剂可以被放大到工业规模的浓度，用于使用液态发酵、固态发酵和/或其组合或混合的商业应用。
基于木霉的产品可包括微生物本身和/或其生长副产物。微生物可以是活的、活性的或非活性的形式。它们可以是营养细胞、孢子、分生孢子、菌丝体、菌丝和/或其组合的形式。任选地，所述组合物可包括产生所述微生物的发酵培养基以及用于微生物生长的残余营养物和/或添加的营养物。
此外，可将本发明的基于木霉的产品配制成例如生物肥料和/或生物杀虫剂，其可用于包括例如园艺(gardening)、园艺(horticulture)、温室生产以及大规模农业和再造林作业的应用。该产品也可用于种子处理、土壤复垦、提高产量、增强植物根系健康和/或促进植物生长刺激。
在优选实施方式中，本发明提供了从一种种子培养物中培养液态基于微生物的产品和固态基于微生物的产品的培养方法。在具体实施方式中，根据本发明，基于微生物的产品是基于木霉的产品。
生产微生物的方法可以包括液态发酵或固态发酵，或者混合和/或其组合。在一个实施方式中，所述方法可用于生产用于工业规模生产基于微生物的产品的接种剂。
在某些实施方式中，本发明提供了从一种种子培养物以工业化规模数量生产液态和固态基于微生物的产品(例如，基于木霉的产品)的方法，所述方法包括：
(a)由木霉种子培养物制备海藻酸盐-琼脂珠接种剂；
(b)在在反应器的液体营养培养基中，培养海藻酸盐-琼脂珠接种剂，以产生珠中所需的微生物密度；
(c)从液体培养基中收获海藻酸盐-琼脂珠接种剂；
(d)制备液态基于木霉的产品，其中所述培养的海藻酸盐-琼脂珠接种剂用于接种液体发酵反应器，和/或制备固态基于木霉的产品，其中所述培养的海藻酸盐-琼脂珠接种剂用于接种固态发酵反应器。
更具体地说，在一个实施方式中，所述方法包括(a)制备海藻酸珠形式的木霉接种剂，所述木霉接种剂包括预先制备的种子培养物、营养成分、海藻酸钠和琼脂。通过将无菌液体营养培养基与1％琼脂和2％海藻酸钠的无菌混合物及5％均匀的种子培养悬浮液混合产生接种液从而制备海藻酸珠状接种剂。
然后使用滴淋装置和蠕动泵将接种液滴入其中含有1％氯化钙溶液的混合容器中。在滴注过程中，接种液滴形成凝胶珠，凝胶珠包括包埋在海藻酸盐-琼脂块中的营养成分和木霉培养物。在形成珠状物后，混合容器中的残余液体可被排放并处置到废液系统中。
在一个实施方式中，所述方法包括(b)，在液体营养培养基中培养海藻酸盐-琼脂珠接种剂至所需的在珠内和/或珠上的微生物密度。在某些实施方式中，从混合容器中收集海藻酸盐-琼脂珠接种剂，然后在含有足够体积的合适液体营养培养基的反应器中培养，以允许高浓度的木霉菌丝在每个海藻酸盐-琼脂珠的内部和整个表面分散。在某些实施方式中，一些木霉也从珠子产生到液体营养培养基中。
在一个示例性实施方式中，用于生产接种珠的种子培养物可以从在合适的液体培养基在连续的通风和搅拌下中使用液体发酵产生的培养物中获得。在整个步骤中，温度和pH值保持恒定或基本恒定水平(即温度在大约28℃到大约30℃之间；pH值在大约5.0到大约6.5之间)。种子培养物可以生长足够达到所需微生物浓度和/或密度的任何时间段，并且均匀化以产生种子培养悬浮液。
在一个实施方式中，该方法包括(c)在达到所需菌丝密度后从液体培养基中收获海藻酸盐-琼脂珠接种剂。这些接种珠的内部和表面可以包含高浓度的木霉。珠子可以在收获后立即用于种子放大培养，或者珠子可以被加工以短期和/或长期储存。
在某些实施方式中，该方法还包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前处理珠子以供储存。这可以包括将收获的海藻酸盐-琼脂珠接种剂放入低温保存溶液中，以便接种剂可以在不丧失微生物活性的情况下储存在冰箱或冷藏室中。优选地，所述低温保存溶液包括其比例例如为50％的水和甘油。将珠状接种剂置于该溶液中，可在例如-80℃至-10℃的温度下长期保存，或在例如-10℃至4.0℃的标准冰箱中短期保存，而不影响接种剂培养物的效力。在某些实施方式中，珠子以例如1-50珠子一组储存在密封烧瓶中。
在一个实施方式中，所述方法还包括(d)，制备大规模液体形式的基于木霉的产品和/或制备大规模干燥、或固体形式的基于木霉的产品。在某些实施方式中，(d)包括使用接种剂珠在液体发酵反应器、固态发酵反应器或其混合或改良形式中接种大规模的培养物，这取决于是否需要液体或固体产品。
在某些实施方式中，液态产品的制备包括将本发明的海藻酸盐-琼脂接种剂珠接种在具有液态营养培养基的液体发酵反应器中。
在特定实施方式中，接种剂珠被添加到液体营养培养基中，例如，在200-250加仑(工作容积)的反应器中，在大约28℃到大约30℃的温度下进行基本恒定的混合和通风。整个发酵过程中培养基的pH值保持在大约5.0到大约6.5。培养保持3-10天，或直到接种剂产生的分生孢子密度不少于5×108个分生孢子/ml液体培养基。
在一些实施方式中，液体形式产品的制备可包括根据步骤(c)收获接种剂珠后，简单地培养留在步骤(b)的液体培养基中的任何残留微生物。残留的微生物可以在第二个反应器中培养，或者在步骤(b)发生的同一个反应器中培养。
在一个实施方式中，液体基于微生物的产品的制备还包括将微生物浓度增加到每毫升10亿个繁殖体，并根据需要添加更多添加剂、防腐剂和/或pH调节剂。然后，“现成”液体产品可以装入容器(例如1加仑的容器)，密封并贴上各种用途的标签，包括在商业环境中。
在某些实施方式中，该方法包括使用固态发酵或其混合或改良制备大规模的固态基于木霉的产品。海藻酸盐-琼脂珠接种剂可与固体或半固体基质(例如蛭石(vermiculate)或食品(例如玉米粉、大米、面食或豆类))混合。优先地，基质在适当的营养培养基中湿润，然后混合物可在培养箱中培养约3至约10天或更长时间，或5至约6天。然后，可以将基质和培养物混合和/或研磨和干燥，以制备粉末状的基于木霉的产品，用于多种用途，包括商业环境中。
在一些实施方式中，本发明还提供了产生真菌的代谢物和/或生长副产物的方法，其中该方法包括在有利于生长和代谢物和/或生长副产物产生的条件下培养真菌，并且可选地纯化代谢物和/或生长副产物。在特定实施方式中，代谢物和/或生长副产物是酶、生物聚合物、酸、溶剂、生物表面活性剂、氨基酸、核酸、肽、蛋白质、脂质和/或碳水化合物。
发明详述
本发明涉及用于商业用途的液体和干燥基于微生物的产品的大规模生产。具体而言，本发明提供了有效大规模培养真菌(例如木霉)和/或其生长副产物的材料和方法。还提供了使用这些基于微生物的产品的方法。
本发明提供了有效生产和使用有益微生物的系统，以及用于生产和使用从这些微生物和生产这些微生物的发酵培养基衍生的物质(例如代谢物)的系统。根据本发明的生物体包括例如酵母、真菌、细菌、古细菌和植物细胞。在优选实施方式中，微生物是真菌。更优选地，所述微生物是木霉真菌，包括但不限于哈茨木霉、绿色木霉和/或钩状木霉。
在具体实施方式中，使用液体发酵、固态发酵或其混合和/或组合，提供了用于培养液态和固态基于微生物的产品的材料和方法，所述液态和固态基于微生物的产品包括木霉分支真菌和/或木霉生长副产物。在一个实施方式中，所述方法可用于生产用于在工业规模上生产这些基于微生物的产品的接种剂。
选定的定义
如本文所用，提及“基于微生物的组合物”是指包含因微生物或其他细胞培养物的生长而产生的成分的组合物。因此，基于微生物的组合物可以包括微生物本身和/或微生物生长的副产物。微生物可能处于营养状态、孢子形态、菌丝形态、微生物繁殖体的任何其他形式或它们的混合物。这些微生物可能是浮游生物，也可能是生物膜形式，或者两者的混合物。生长的副产物可以是例如代谢物(例如生物表面活性剂)、细胞膜成分、表达蛋白和/或其他细胞成分。这些微生物可能是完整的，也可能是裂解的。细胞可以完全不存在，或以例如每毫升组合物中1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或更多细胞或繁殖体的浓度存在。如本文所用，繁殖体是微生物的任何部分，新的和/或成熟的有机体可以从繁殖体发育，包括但不限于细胞、菌丝(mycelia)、菌丝(hyphae)、包囊、孢子(例如生殖孢子、分生孢子、内孢子和/或外孢子)、芽和种子。
本发明还提供了“基于微生物的产品”，这些产品是将在实践中应用以实现期望结果的产品。基于微生物的产品可以简单地是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。或者，基于微生物的产品可进一步包含已添加的其它成分。这些额外的成分可以包括，例如稳定剂、缓冲液、载体(例如水或盐溶液)、添加的营养物质以支持进一步的微生物生长、非营养生长促进剂和/或有助于跟踪微生物的制剂和/或其应用环境中的组合物。基于微生物的产品还可以包括基于微生物的组合物的混合物。基于微生物的产品还可以包括以某种方式(例如包括但不限于过滤、离心、溶解、干燥、纯化等)处理的基于微生物的组合物的一种或多种成分。
如本文所使用的，术语“接种物”或“接种剂”(复数“接种物”)可包含在术语“基于微生物的产品”内。如本文所使用的，接种物是指可作为种子培养物用于接种更大规模发酵系统或工艺的基于微生物的产品。接种物可以在这样的发酵系统中放大以产生所需数量的基于微生物的组合物和产品。
如本文所用，“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质、诸如小分子的有机化合物(例如下面所述的那些)或基本上不含其它化合物例如细胞材料的其它化合物，细胞材料与这些化合物天然相关。例如，纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含在其自然发生状态下两侧的基因或序列。纯化或分离的多肽不含在其自然发生的状态下两侧的氨基酸或序列。纯化或分离的微生物菌株从其存在于自然界的环境中除去。因此，所分离的菌株可以作为例如生物纯培养物或作为孢子(或菌株的其他形式)与载体联合存在。
在某些实施方式中，纯化化合物至少为感兴趣化合物的60％(按重量计，干重)。优选地，按重量计，所述制备物为感兴趣化合物的至少75％、更优选地为至少90％且最优选地为至少99％。例如，纯化化合物是指按重量计至少为所需化合物的90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。纯度通过任何适当的标准方法来测量，例如，柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱(HPLC)分析法。
“代谢物”是指由代谢产生的任何物质(如生长副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是一种有机化合物，它是代谢的起始物质(例如葡萄糖)、中间产物(例如乙酰辅酶A)或最终产物(例如正丁醇)。代谢物的例子包括但不限于酶、毒素、酸、溶剂、醇、蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸、聚合物和表面活性剂。
如本文中所使用的，短语“放大”、“大规模”、“商业规模”和“工业规模”可以互换使用，并且是指根据其体积、浓度、量、含量和/或效力，能够在工业和/或商业应用中使用的产品。例如，溶解在液体载体中的液体基于微生物的产品或干燥基于微生物的产品的工业规模量可包括100加仑到10,000加仑或更多。工业和/或商业应用可包括，例如园艺(gardening)、园艺(horticulture)、温室生产、农业、土壤复垦、生物修复、再造林和害虫抑制。
如本文所使用，“收获”是指从生长容器中移除部分或全部基于微生物的组合物。
过渡术语“包含(comprising)”，与“包括(including)”或“包含(containing)”同义，是包含的或开放的，不排除附加的、未列举的元素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由……组成”不包括权利要求中未指明的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤上“以及那些不实质上影响要求保护的发明的基本特性和新颖特性的材料或步骤”。
除非上下文特别说明或显而易见，否则此处使用的术语“或”应理解为包含在内。除非文中特别说明或显而易见，否则术语“a”、“an”和“the”应理解为单数或复数。
除非上下文中特别说明或显而易见，如本文所使用的，否则术语“大约”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。大约可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％范围内。
本文中任何变量定义中列出的化学物质组的叙述包括将该变量定义为任何单个组或所列组的组合。本文中针对变量或方面的实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式全部纳入。
基于木霉的产品的生产方法
本发明提供了木霉微生物的培养方法以及微生物代谢产物和/或其他微生物生长副产物的生产方法。在一些实施方式中，提供了用于生产干燥和液态基于木霉的产品的方法。产生微生物的方法可以包括液体培养、固态发酵或其混合和/或组合。如本文所使用的“发酵”是指在受控条件下培养和/或生长细胞。生长可以是有氧的或厌氧的。
在一个实施方式中，本发明提供用于生产生物质(例如，活细胞材料)、细胞外代谢物(例如，小分子和分泌的蛋白质)、残余营养物和/或细胞内成分(例如，酶和其他蛋白质)的材料和方法。
根据本发明使用的微生物生长容器(例如，反应器)可以具有功能控制/传感器，或者可以连接到功能控制/传感器以测量培养过程中的重要因素，例如pH、氧、压力、温度、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。
反应器容器可接种选择的微生物。优选地，该容器接种根据本发明生产的接种剂，例如，如本文所述的海藻酸盐-琼脂接种剂珠。根据容器的大小，为大规模生产而接种容器所需的接种剂数量可以从1个接种剂珠到40或50个或更多珠不等。
在另一实施方式中，该容器还可以监测容器内微生物的生长(例如，测量细胞数量和生长阶段)。或者，可以从容器中提取每日样品，并通过本领域已知的技术(例如稀释平板技术)进行计数。稀释平板是一种简单的技术，用于估计样品中的微生物数量。该技术还可以提供一个指标，用以比较不同的环境或处理。
该方法可为生长培养提供氧气。一个实施方式利用空气的缓慢运动去除低含氧空气并引入含氧空气。在液体发酵的情况下，含氧空气可以是每天通过机械搅拌液体的叶轮和供应气泡到液体中用于溶液氧气的空气喷射器等机制补充的环境空气。
在一个实施方式中，该方法包括用氮源补充培养物。氮源可以是，例如硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用，也可以两种或两种以上的组合使用。
在一个实施方式中，该方法还可以包括用碳源补充培养物。碳源通常是碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、麦芽糖、马铃薯葡萄糖、纤维素、淀粉和/或海带多糖；有机酸，例如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇，例如乙醇、丙醇，丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；脂肪和油，如大豆油、米糠油、橄榄油、菜籽油、植物油、玉米油、芝麻油和/或亚麻籽油等。这些碳源可以单独使用，也可以两种或两种以上的组合使用。
在一个实施方式中，培养基中包括微生物的生长因子和微量营养素。当生长的微生物无法产生所需的所有维生素时，这是特别优选的。无机营养素，包括微量元素，如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴也可包括在培养基中。此外，可以包括维生素、必需氨基酸和微量元素的来源，例如，以面粉或膳食的形式，例如玉米粉，或以提取物的形式，例如酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等，或以纯化形式。例如，也可以包括那些对蛋白质生物合成有用的氨基酸。
在一个实施方式中，也可以包括无机盐。可用无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用，也可以两种或两种以上的组合使用。
在一些实施方式中，培养方法还可包括在培养过程之前和/或期间在液体培养基中添加额外的酸和/或抗菌剂，以保护培养物免受不合需要的微生物的污染。此外，还可添加消泡剂，以防止培养过程中产生气体时泡沫的形成和/或积聚。
混合物的pH值应适合真菌的生长，特别是木霉菌的生长。在某些实施方式中，pH值约为5.0至约7.0，优选约为5.0至约6.5。缓冲液和pH调节剂(如碳酸盐和磷酸盐)可用于稳定pH值接近优选值。当金属离子以高浓度存在时，可能需要在液体培养基中使用螯合剂。
木霉微生物的培养和微生物副产物的生产的方法和设备可以批式、准连续或连续过程进行。
在一个实施方式中，培养方法在约5℃至约100℃、优选15℃至60℃、更优选25℃至30℃下进行。在另一个实施方式中，培养可在恒定温度下连续进行。在另一实施方式中，培养可在变化的温度下进行。
在一个实施方式中，该方法和培养过程中使用的设备是无菌的。培养设备，如反应器/容器，可与灭菌装置(如高压灭菌器)分离，但连接至灭菌装置。该培养设备还可以具有在开始接种之前就地灭菌的灭菌装置。空气可以用本领域已知的方法灭菌。例如，环境空气在被引入容器之前可以通过至少一个过滤器。在其它实施方式中，可对该培养基进行巴氏杀菌，或任选地完全不添加热量，其中可利用低水活性和pH值来控制细菌生长。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种生产微生物代谢物的方法，例如乙醇、乳酸、β-葡聚糖、蛋白质、肽、代谢中间体、多不饱和脂肪酸和脂质，其中，所述方法包括在有利于生长和代谢产物表达的条件下培养微生物。在特定实施方式中，代谢物是酶、生物聚合物、酸、溶剂、生物表面活性剂、氨基酸、核酸、肽、蛋白质、脂质和/或碳水化合物。所述方法产生的代谢物含量可以是，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在液体发酵的情况下，发酵液的生物质含量可以是，例如从5g/l到180g/l或更多。在一个实施方式中，液体培养基的固体含量为10g/l到150g/l。
木霉产生的微生物生长副产物可保留在微生物中或分泌到生长培养基中。在另一实施方式中，产生微生物生长副产物的方法可进一步包括浓缩和纯化感兴趣的微生物生长副产物的步骤。在另一实施方式中，液体培养基可包含稳定微生物生长副产物活性的化合物。
在一个实施方式中，在培养完成时(例如，在达到所需的细胞密度或培养基中指定代谢物的密度时)移除所有微生物培养成分。在这个批处理过程中，一个全新的批次在第一批收获时开始。
在另一实施方式中，在任一时间仅移除发酵产物的一部分。在本实施方式中，具有活细胞的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。移除的成分可以是无细胞液体培养基或基质，也可以包含细胞。这样，就形成了准连续系统。
有利的是，该方法不需要复杂的设备或高能耗。木霉可在现场小规模或大规模培养利用，甚至仍与其培养基混合。同样，微生物代谢产物也可以在需要的地方大量产生。
可以使用本发明培养的生物体可以包括，例如，酵母、真菌、细菌、古细菌和植物细胞。在优选实施方式中，微生物是真菌。更优选地，所述微生物是木霉真菌，包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)、哈茨木霉(水仙木霉(Trichoderma narcissi))、绿色木霉和/或钩状木霉。
根据本发明还可以生产其他真菌，包括菌根(Mycorrhizae)、外生菌根真菌、酵母(如球拟假丝酵母(Starmerella bombicola))，甚至伞形真菌(mushroom-forming fungi)(如香菇(Lentinula edodes))的孢子。
根据本发明，有可能种植大规模的、商业化数量的基于木霉的产品。有利的是，木霉可在3至10天或5至6天内生长，使用200加仑的发酵反应器，每毫升液体培养物可产生5x108至5x109个分生孢子；在培养箱(如防护箱式反应器)中，每克干产品可产生1x109个分生孢子。
在某些实施方式中，本发明提供了从一种种子培养物中以工业规模量生产液态和固态基于微生物的产品(例如，基于木霉的产品)的方法。有利的是，使用根据本发明的海藻酸盐-琼脂珠接种剂(或“接种剂珠”、“珠接种剂”、“珠”或“接种剂”)允许比使用标准液体接种剂时可在接种的反应器中获得更高细胞浓度。“高浓度”是指，例如，每单位(重量或体积)至少101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个或更多个所需微生物的细胞或繁殖体。
在优选实施方式中，所述方法包括：
(a)由木霉种子培养物制备海藻酸盐-琼脂珠接种剂；
(b)在反应器中的液体营养培养基中，培养海藻酸盐-琼脂珠接种剂，以产生珠中所需的微生物密度；
(c)从液体培养基中收获海藻酸盐-琼脂珠接种剂；
(d)制备液态基于木霉的产品，其中所述培养的海藻酸盐-琼脂珠接种剂用于接种液体发酵反应器，和/或制备固态基于木霉的产品，其中所述培养的海藻酸盐-琼脂珠接种剂用于接种固态发酵反应器。
更具体地说，在一个实施方式中，所述方法包括(a)制备海藻酸盐-琼脂珠形式的木霉接种剂，所述木霉接种剂包括预先制备的种子培养物、营养成分、海藻酸钠和琼脂。种子培养物(例如，5％均匀的种子培养悬浮液)可溶解于无菌营养培养基中，并与琼脂和海藻酸钠的混合物结合以产生接种液。
接种液中海藻酸盐的浓度可约为0.1至约3.0％，优选约为0.5至约2.5％，更优选约为2.0％。琼脂的浓度可为约0.1％至约2.0％，优选约0.5％至约1.5％，更优选约1.0％。在一个实施方式中，在与种子培养物混合之前，可以蒸压和/或加热海藻酸盐-琼脂。
然后使用滴淋装置和蠕动泵将接种液滴入其中含有氯化钙溶液的混合容器中。在滴注过程中，接种液滴形成凝胶珠，其包含营养成分和嵌入海藻酸盐-琼脂块中的木霉真菌颗粒。在某些实施方式中，从一批中生产约5至10kg海藻酸盐珠接种剂。在形成珠状物后，混合容器中的残余液体可被排放并处置到废液系统中。
在某些实施方式中，CaCl2溶液可以是约1.0％到约5.0％的溶液，优选约1％到2％的溶液。
在一个实施方式中，混合容器是配备有电机的移动旋转罐。罐的体积可以是约2至约4立方英尺，或约6立方英尺或更多，由聚乙烯、任何其他聚合源或金属制成。例如，旋转罐可包含5至10加仑1％氯化钙溶液。
在一个示例性实施方式中，用于生产接种剂珠的种子培养物可从在适当液体培养基中并在持续通气和搅拌下使用液体发酵生产的培养物中获得(参见，例如，Elad等，(1982年)，通过引用并入本文)。在整个步骤中，温度和pH值保持恒定或基本恒定(即温度在大约28℃到大约30℃之间；pH值在大约5.0到大约6.5之间)。种子培养物可以生长足够达到所需微生物浓度和/或密度的任何时间段，并且均匀化以产生种子培养悬浮液。
在一个实施方式中，所述方法包括(b)，在液体营养培养基中培养海藻酸盐-琼脂珠接种剂至珠内和/或珠上所需的微生物密度。在某些实施方式中，从混合容器中收集海藻酸盐-琼脂珠接种剂，然后在含有适当液体营养培养基的反应器中培养，以允许高浓度的木霉菌丝在每个海藻酸盐-琼脂珠内生长并分散在每个珠的表面上。在某些实施方式中，步骤(b)的培养参数，例如温度、培养基和pH，可以与用于产生初始种子培养物的相同。在某些实施方式中，一定量的木霉细胞也生长在液体营养培养基中，与接种剂珠分离。
在一个实施方式中，该方法包括(c)，其中从液体培养基中收获包含高浓度木霉的海藻酸盐-琼脂接种珠。这些接种珠的内部和/或表面可包含高浓度木霉。珠子可以在收获后立即用于种子放大培养，或者珠子可以加工用于短期和/或长期储存。在一些实施方式中，珠子在收获时被放置在容器中，例如管或烧瓶中。
在某些实施方式中，该方法还可包括在步骤(c)之后和步骤(d)之前处理珠子以供储存。这可以包括将收获的海藻酸盐-琼脂珠接种剂悬浮在低温保存溶液中，以便接种剂可以在不丧失微生物活性的情况下储存在冰箱或冷藏室中。优选地，储存在管、烧瓶、量筒(cylinder)、小瓶或盘或其他类似的标准实验室容器中。
在某些实施方式中，低温保存液包括水和低温保护剂物质。低温保护剂是众所周知的防冻化合物，能够保护细胞和其他生物组织免受由于冰冻和结冰造成的损害。许多原产于寒冷气候区的动植物物种生产天然的低温保护剂来保护它们的身体和细胞。分离和合成的低温保护剂也用于生物研究和食品中的生物材料的保存。
根据本发明有用的示例性低温保护剂包括但不限于乙二醇、丙二醇和甘油等二醇、二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)和蔗糖。
在优选实施方式中，低温保存液包括水和甘油，其中甘油的百分比为35％到75％，优选约50％。
将珠接种剂置于其中的该溶液可在设定为例如约-80℃至约0℃、优选为约-80℃至约-20℃的冷冻柜中长期保存。在这些温度下的储存可根据需要持续较长时间，同时保持生物材料的功效和活性，例如，长达1个月、6个月，或1年、2年、3年、4年、5年，甚至10年或更长时间。
在某些实施方式中，当需要短期储存时(例如，1个月或更短时间)，具有悬浮在甘油溶液中的接种剂珠的容器可被储存在设定为约-15℃至约4℃或约-10℃至约4℃或约0℃至4℃的冰箱中。
在某些实施方式中，珠分储存在包含低温保存溶液的组中，例如，每个密封容器1-50个珠子。
在其他实施方式中，不根据(c)从发酵反应器收获珠，而是将低温保存溶液直接倒入步骤(b)中使用的发酵反应器中，并且反应器本身用于储存和保存整批珠子。反应器内的温度可以相应地调整。
在一个实施方式中，所述方法还包括(d)，制备大规模的液体形式的基于木霉的产品和/或制备大规模的干燥或固体形式的基于木霉的产品。在某些实施方式中，(d)包括使用接种剂珠在液体发酵反应器、固态发酵反应器或其混合或改良形式中接种大规模培养物，这取决于是需要液体产物还是固体产物。
在某些实施方式中，液态产品的制备包括将本发明的海藻酸盐-琼脂接种剂珠接种在具有液态营养培养基的液体发酵反应器中。在一些实施方式中，例如，使用甘油溶液保存接种剂珠时，珠可直接从储存它们的冷冻室或冰箱中取出并用于给反应器接种。有利的是，本发明方法允许从单个种子培养物接种多个大规模发酵反应器(例如，具有从100到2,000加仑、到10,000加仑或更大体积的发酵反应器)。
在优选实施方式中，在新的、便携式和可分配的反应器中进行大规模(放大)生产。使用该系统的发酵是作为批式工艺进行的，没有搅拌，但有混合和通风。在一个实施方式中，该系统包括一个大容量罐。反应器还可以包括混合系统，混合系统包括第一管道系统和第二管道系统，其中第一管道系统位于罐的垂直左侧，第二管道系统位于罐的垂直右侧。每个管道系统在罐底部和罐顶部都有接头。每个管道系统都可以配备泵，能够以高达每分钟200加仑的速度将培养液从罐底通过管道输送到罐顶。这些管道系统可以在整个发酵过程中连续运行，以混合培养物。
这种单罐反应器可以包括喷雾器，由鼓风机提供过滤空气，鼓风机能够每分钟每升培养液提供2升空气。用于喷射的过滤空气可通过大容量水上泵系统产生，该系统包括配备有附加过滤器的泵。
系统反应器的工作容积优选为200至2,000加仑，但可以更小(例如，100至200加仑)或更大(例如，高达10,000加仑或更大)。然而，反应器的大小和结构可能会有所不同(例如，取决于所需的工业规模基于微生物的产品的最终体积)。该系统可用于多种菌株和物种的微生物培养，几乎不限制可生产的基于微生物的产品的总量。
在一些实施方式中，为了降低培养物生产的成本并确保生产的可放大性，发酵系统不使用传统方法进行灭菌。取而代之的是使用空容器灭菌方法，包括用2％-3％过氧化氢处理内表面，用消毒剂和高压热水冲洗。此外，为了减少严重污染的可能性，用于制备培养物的水通过0.1微米过滤器过滤。培养基成分在85℃-90℃温度下去污，或溶解在3％过氧化氢中(干成分和H2O比为1:3v/v)。
在某些实施方式中，用于木霉规模化生产步骤的培养基是包含马铃薯葡萄糖液体培养基或葡萄糖作为碳源的液体基础营养培养基。该培养基还可以包括额外的碳源和氮源。额外的碳源可选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、纤维素、淀粉和海带多糖。该培养基还可以任选地包括麦芽提取物。
液体基础营养培养基中可以使用多种氮源，但优先使用硝酸盐或亚硝酸盐。在优选实施方式中，硝酸铵用作氮源。
液体基础营养培养基还可以含有适量的矿物质和微量元素，如MgSO4、FeCl2、MnSO4、ZnSO4、KCl和K2HPO4。还可以添加其他微量元素和矿物。
在一些实施方式中，液体基础营养培养基包含酵母提取物作为维生素源。为了开发一种“有机”产品，抗菌化合物，如抗生素，不应包括在营养培养基中。相反，应使用具有抗菌特性的天然化合物(例如，生物表面活性剂，如槐糖脂和鼠李糖脂；和/或酒花酸(hopacids)或酒花)，前提是它们不会对本发明方法产生的微生物(例如，木霉物种)产生不利影响。
在一个示例性实施方式中，用于在本发明反应器系统中大规模生产木霉的液体基础营养培养基包括以下实施例1的表1中所列数量的组分。
大规模生产基于木霉的产品的发酵温度应在约25℃至约32℃之间，最好在约28℃至30℃之间。pH值应在约5.0至约6.5之间，优先在约5.5至约6.0之间。发酵过程中的pH值稳定并不重要，但pH值不应低于4.5。如有必要，可使用本领域常规的手动或自动技术来完成发酵过程中pH值的控制或维护，例如使用自动pH控制器来添加基本成分。用于pH控制的优选碱包括但不限于NaOH和KOH。
优选地，将培养物保持3至10天或更长时间，或5至6天，直到由海藻酸盐接种剂珠产生的分生孢子的密度为每毫升液体培养物约5×108至5×109个分生孢子。
在一些实施方式中，液态产品的制备可包括根据步骤(c)收获接种剂珠后简单地培养残留在剩余液体培养基中的任何残留微生物。残留的微生物可以在第二个反应器中培养，或者在步骤(b)发生的相同反应器中培养。
在一个实施方式中，液体基于微生物的产品的制备还包括将微生物浓度增加到每毫升10亿个繁殖体，并根据需要添加其它添加剂、防腐剂和/或pH调节剂。然后，“现成”液体产品可以装入容器(例如1加仑的容器)，密封并贴上各种用途的标签，包括在商业环境中。
在某些实施方式中，该方法包括使用固态发酵或其混合或其改良制备放大的固态基于木霉的产品。海藻酸盐-琼脂珠接种剂可与固体或半固体基质(例如蛭石或食品(例如玉米粉、意大利面、大米或豆类))混合。基质优先在适当的营养培养基中湿润。例如，在整个培养过程中，可以定期(例如，每天一次，每隔一天一次，每周一次)用无菌营养培养基喷洒托盘。
混合物可在培养箱中培养约3至约10天或更长时间，或5至约6天。然后，可以将基质和培养物混合和/或研磨和干燥，以制备粉末状的基于木霉的产品，用于多种用途，包括商业环境中。
在一些实施方式中，例如，当使用甘油溶液保存接种剂珠时，接种珠剂可直接从储存它们的冷冻室或冰箱中取出，并用于接种固体或半固体基质。
在具体实施方式中，生产例如木霉的固态商业产品可包括将收集到的接种剂珠与基质和营养培养基混合并在托盘中培养混合物。在某些实施方式中，托盘在防护炉或类似加热装置中培养。
在示例性实施方式中，当使用蛭石(vermiculite)时，将蛭石在150℃下在烤箱中加热灭菌过夜。约3-4份灭菌蛭石与1份海藻酸盐-琼脂珠充分混合。混合物薄薄地摊在托盘上。然后，在环境空气的通气下，培养可以进行大约5到大约6天，到大约两周。
培养过程结束后，将培养箱中的温度提高到40℃左右，通过补充干燥空气和抽干湿润空气，干燥大约3-4天。干燥的基于微生物的产品可以磨碎、研磨或微粉化到所需的粒径。每克干燥产品的繁殖体浓度不应低于1×109个分生孢子，每克干燥产品的繁殖体浓度可达到1×1010、1×1011、1×1012甚至1×1013个。
然后，干燥微生物产品可以与干燥硅藻土和商业堆肥混合，以重新分配残余水分，并使最终产品标准化。混合后的繁殖体浓度可以是，例如，每克约1×106个分生孢子。最后，这种干燥的基于木霉的产品可以包装在贴有标签的塑料袋中，并密封以供商业使用。
在某些实施方式中，最终干燥基于木霉的产品可包含碳、蛋白质和/或矿物源。
基于微生物的产品的本地生产
在本发明的某些实施方式中，微生物生长设施以期望的规模生产新鲜的、高密度的感兴趣的微生物和/或微生物生长副产物。微生物生长设施可位于应用地点或其附近。该设施以批式、准连续或连续培养的方式生产高密度基于微生物的组合物。
本发明的微生物生长设施可以位于使用基于微生物的产品的位置(例如，养鱼场)。例如，微生物生长设施距离使用地点可能小于300、250、200、150、100、75、50、25、15、10、5、3或1英里。
由于基于微生物的产品是在现场或应用现场附近产生的，不需要常规生产的稳定、保存、长时间储存和广泛的运输过程，可以产生更高密度的活微生物，因此，在现场应用中需要更小体积的基于微生物的产品。这允许缩小生物反应器(例如，较小的发酵罐；较少的发酵原料、营养物质、pH控制剂和消泡剂等的供应)，从而使系统高效。此外，本地生产有助于产品的可携带性。
基于微生物的产品的本地生成也有助于将生长培养基包含在产品中。培养基可以包含发酵过程中产生的特别适合本地使用的试剂。
本地生产的在现场的高密度、健壮的微生物培养物比那些已经经历营养细胞稳定或在供应链中停留了一段时间的培养物更有效。与传统产品相比，本发明的基于微生物的产品尤其有利，传统产品中的细胞已从发酵生长培养基中的代谢物和营养物中分离出来。减少运输时间，可以在当地需求所需的时间和体积生产和运送新批次的微生物和/或其代谢物。
本发明的微生物生长设施产生新鲜的基于微生物的组合物，包括微生物本身、微生物代谢物和/或微生物生长培养基的其他成分。如果需要，所述组合物可以具有高密度的营养细胞、失活细胞或营养细胞、失活细胞、孢子、菌丝体和/或其他微生物繁殖体的混合物。有利的是，所述组合物可被调整以在指定位置使用。在一个实施方式中，微生物生长设施位于或靠近将使用基于微生物的产品的场所。
有利的是，这些微生物生长设施提供了一个解决方案，解决了目前依赖遥远的工业规模生产商的问题，这些生产商的产品质量受到上游加工延迟、供应链瓶颈、不当储存和其他突发事件的影响，这些突发事件阻碍了诸如活的，高细胞和/或繁殖体计数产物以及相关培养基和微生物最初生长的代谢物的应用。
有利的是，在优选实施方式中，本发明的系统利用天然产生的本地微生物及其代谢副产物的能力来治疗植物致病细菌。例如，可以根据耐盐性、高温生长能力和序列的遗传鉴定来鉴定当地的微生物。此外，微生物生长设施通过其定制基于微生物的产品的能力以提高与目的地地理位置的协同作用，提供了制造的多功能性。
单个容器的培养时间可以是，例如，从1天到2周或更长。培养产品可以通过多种方式收获。
例如，发酵24小时内的本地生产和输送可产生纯的、高微生物密度组合物，并大大降低运输成本。鉴于在开发更有效和更强大的微生物接种剂方面的快速发展前景，消费者将从这种快速提供基于微生物的产品的能力中受益匪浅。
本发明的基于微生物的产品可用于各种独特的环境中，原因是，例如，能够有效地递送：1)含有活性代谢物的新鲜发酵液；2)微生物和发酵液的混合物；3)含有活细胞或孢子、菌丝体、分生孢子或其他微生物繁殖体的组合物；4)具有高密度微生物的组合物，包括活细胞和/或孢子、菌丝体、分生孢子或其他微生物繁殖体；5)快速的基于微生物的产品；6)偏远地区的基于微生物的产品。
实施例
通过举例说明，可以从以下示例进一步了解本发明及其许多优点。以下示例说明本发明的一些方法、应用、实施例和变体。它们不应被视为限制发明。可以对本发明进行许多改变和修改。
实施例1-种子培养物生产和繁殖体计数法
木霉种子培养物在5.5的pH值下制备，培养基组成见表1。
表1木霉生产用培养基组成
Figure BDA0002426817870000231
Figure BDA0002426817870000241
用真菌分生孢子接种烧瓶，并在平板上生长菌丝。为了制备均匀的种子培养物，用玻璃珠破碎菌丝球。摇瓶在30℃下以200转/分的速度培养3-4天。3-4天后，木霉形成菌丝球进行大规模发酵。将含有发酵基质和生物量的烧瓶的全部内容物用玻璃珠完全均匀化预定时间180秒，以获得分生孢子和菌丝碎片。均匀化后，制备系列稀释液，并估算微繁殖体计数。
实施例2-海藻酸盐-琼脂珠培养发育
含有木霉的海藻酸盐珠是由上表1的液体培养基与1％琼脂和2％海藻酸钠的混合物组合制备而成。该混合物与实施例1的5％均质种子培养悬浮液混合。混合好后，将整个混合物缓慢滴入高压灭菌的100mM氯化钙溶液中，持续搅拌。含有真菌颗粒的海藻酸盐珠立即形成。然后从溶液中收集海藻酸盐珠，并丢弃剩余的液体。
实施例3-液体培养物中的分生孢子生产
分生孢子是从生长在反应器中的哈茨木霉的生物纯培养物中获得的。营养培养基成分包括：葡萄糖(30g/L)、酵母提取物(2.8g/L)、KH2PO4(1.0g/L)、MgSO4.7H2O(0.5g/L)、KCl(0.5g/L)、FeSO4.7H2O(0.01g/L)、ZnSO4.7H2O(0.01g/L)、CuSO4.5H2O(0.005g/L)。培养物初始pH值为5.5，温度为25℃-28℃，培养量约为100加仑。培养5天后，每毫升液体培养的产量大于约5×108至5×109个分生孢子。
实施例4-木霉在蛭石基质中的固态培养
蛭石和硅藻土在150℃下在加热炉中加热灭菌过夜。3至4份蛭石与1份硅藻土和1份木霉接种剂珠或150毫升种子培养悬浮液混合。这些成分与1升营养培养基混合。将该混合物薄薄地摊铺在托盘上，并在30℃的条件下在环境空气通风的防护炉中培养4-6天。分生孢子在第4天开始观察。
在干燥和加工之前，一个托盘的产量约为652.60克。培养过程结束后，可将培养箱中的温度提高到大约40℃，通过补充干燥空气和抽干湿润空气，干燥约3-4天。干燥和彻底研磨后，每个托盘可生产4磅或更多木霉产品。干燥的基于微生物的产品可以磨碎、研磨或微粉化到所需的粒径，然后与干燥的硅藻土和商业堆肥混合，以重新分配残余水分并使最终产品标准化。每克干燥产品的繁殖体浓度不应小于1×106个分生孢子，优先不小于1×109。
最后，这种干燥的基于木霉的产品可以包装在贴有标签的塑料袋中，并密封以供商业使用。该产品可溶解在水中，用于多种用途。
实施例5-玉米粉基质中真菌孢子的固态发酵
对于生长真菌孢子，如木霉属，250克nixtamilized玉米粉与去离子水混合，在不锈钢蒸汽锅中灭菌，然后用盖子和锅带(pan bands)密封。玉米粉培养基平底锅无菌接种真菌种子培养物。然后在30℃的防护炉中将平底锅培养10天。10天后，收获约1×109个繁殖体/g。
实施例6–意大利面基质中真菌孢子的固态发酵
为了生长木霉，250克干玉米意大利面粉和1000升水混合涂布在不锈钢蒸锅上。蒸锅、意大利面粉和水随后经过高压灭菌，然后用灭菌盖子和锅带密封。然后将意大利面-水基质无菌接种木霉种子培养物。平底锅在30℃的防护炉中培养8天。8天后，收获大约1×109个繁殖体/g的木霉。

Claims (23)

1.一种生产液态基于木霉的产品和固态基于木霉的产品的方法，所述方法包括：
（a）由木霉种子培养物制备海藻酸盐-琼脂珠接种剂；
（b）将海藻酸盐-琼脂珠接种剂在在反应器中的液体营养培养基中培养，以产生所需的珠中微生物密度；
（c）从液体培养基中收获海藻酸盐-琼脂珠接种剂；
（d）制备液态基于木霉的产品，其中培养的海藻酸盐-琼脂珠接种剂用于接种液体发酵反应器，制备固态基于木霉的产品，其中培养的海藻酸盐-琼脂珠接种剂用于接种固态发酵反应器。
2.根据权利要求1所述的方法，其中木霉微生物选自里氏木霉、哈茨木霉、绿色木霉和钩状木霉。
3.根据权利要求1所述的方法，其中（a）包含将（a）的5%种子培养物均质悬浮液与无菌营养培养基、1%琼脂及2%海藻酸钠组合以产生接种液；并使用滴淋装置将接种液的液滴沉积于含有1%氯化钙的混合容器中，其中，液滴形成海藻酸盐-琼脂珠接种剂，所述接种剂包含嵌入在海藻酸盐-琼脂块中的营养成分和微生物颗粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其中（b）包括收集海藻酸盐-琼脂珠，然后将其培养在含有足够体积的合适液体营养培养基的反应器中，以允许高浓度的木霉菌丝分散在海藻酸盐-琼脂珠内部和整个表面。
5.根据权利要求1所述的方法，其中（b）在约28℃至约30℃的温度和约5.0至约6.5的pH值下，在连续通气和搅拌下进行约1至约10天。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所需的海藻酸盐珠的放大微生物密度为每克海藻酸盐珠1×109个分生孢子。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（c）之后但在步骤（d）之前，所述方法包括处理海藻酸盐-琼脂珠接种剂以供储存，其中所述处理包括从反应器收集海藻酸盐-琼脂珠接种剂并将所述海藻酸盐-琼脂珠接种剂放入包含比例为50%的甘油和水的低温保存溶液中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述低温保存溶液置于选自烧瓶、试管、小瓶和盘的容器中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述容器包含多达50个珠接种剂。
10.根据权利要求8所述的方法，其中使容器置于温度为-80℃至-10℃的冷冻柜中。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述容器被放置在-10℃至4℃的冰箱中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中制备液态基于木霉的产品包括在工作容积至少为200加仑的反应器系统中在持续通风和搅拌下，在温度约为28℃至约30℃，pH值约为5.0至约6.5，培养接种剂约1至约10天。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中木霉在液体培养物中的浓度增加到每毫升1 ×109个繁殖体，并且任选地添加防腐剂、添加剂和/或pH调节剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中制备固态基于木霉的产品包括将收获的海藻酸盐-琼脂珠接种剂与液体营养培养基及固体或半固体基质混合以形成混合物；将混合物薄薄地散布于耐热托盘上；将托盘上的混合物培养于30℃的培养箱中3至10天，环境空气持续通风。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在整个培养过程中向托盘定期喷洒无菌营养培养基。
16.根据权利要求14所述的方法，其中培养箱是防护炉。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述基质为蛭石，并且混合物中蛭石与海藻酸盐-琼脂珠的比率为3:1或4:1。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述基质是选自玉米粉、大米、豆类及意大利面的食品。
19.根据权利要求14所述的方法，还包括将培养箱的温度提高至40℃；使用干燥空气补充并抽干湿润空气将托盘干燥约3至约4天，以产生干燥产品；在研磨机中将干燥产品研磨至所需粒径；将研磨后的干燥产品与干燥硅藻土和商业堆肥混合。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括将与硅藻土和商业堆肥混合的干燥产品包装在密封袋中以供商用。
21.根据权利要求20所述的方法，其中经与硅藻土及商业堆肥混合后的干燥产品中木霉菌的浓度不小于每克1×106个分生孢子。
22.包含培养的木霉微生物和/或一种或多种微生物生长副产物的组合物，其中所述组合物通过根据权利要求1-21所述的方法生产。
23.根据权利要求22所述的组合物，其进一步包含产生微生物的培养基和/或用于微生物生长的营养物。
CN201880062764.XA 2017-09-28 2018-09-25 液体和固体木霉产品的大规模生产 Pending CN111278966A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762564683P 2017-09-28 2017-09-28
US62/564,683 2017-09-28
PCT/US2018/052516 WO2019067379A1 (en) 2017-09-28 2018-09-25 LARGE SCALE PRODUCTION OF LIQUID AND SOLID TRICHODERMA PRODUCTS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111278966A true CN111278966A (zh) 2020-06-12

Family

ID=65903085

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880062764.XA Pending CN111278966A (zh) 2017-09-28 2018-09-25 液体和固体木霉产品的大规模生产

Country Status (20)

Country Link
US (1) US11286456B2 (zh)
EP (1) EP3688138A4 (zh)
JP (1) JP7319254B2 (zh)
KR (1) KR20200050461A (zh)
CN (1) CN111278966A (zh)
AU (1) AU2018341264A1 (zh)
BR (1) BR112020006362A2 (zh)
CA (1) CA3076224A1 (zh)
CL (1) CL2020000768A1 (zh)
CO (1) CO2020002156A2 (zh)
CR (1) CR20200181A (zh)
EA (1) EA202090766A1 (zh)
IL (1) IL273024A (zh)
MX (1) MX2020003164A (zh)
MY (1) MY193446A (zh)
PE (1) PE20210474A1 (zh)
PH (1) PH12020500407A1 (zh)
SG (1) SG11202001935XA (zh)
WO (1) WO2019067379A1 (zh)
ZA (1) ZA202001335B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112760234A (zh) * 2021-02-02 2021-05-07 吉林农业大学 一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019265627A1 (en) 2018-05-08 2020-11-26 Locus Agriculture Ip Company, Llc Microbe-based products for enhancing plant root and immune health
WO2021007482A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Locus Agriculture Ip Company, Llc Use of soil and other environmental data to recommend customized agronomic programs
CN112457996A (zh) * 2020-10-29 2021-03-09 南京思农生物有机肥研究院有限公司 一种木霉菌扩繁生产菌肥的方法
EP4276170A1 (en) 2022-05-12 2023-11-15 Evologic Technologies GmbH Pseudo-solid state fermentation of filamentous fungi

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4803800A (en) * 1987-03-27 1989-02-14 Plant Genetics, Inc. Synthetic substrate for filamentous fungi
US5194258A (en) * 1990-11-13 1993-03-16 W. R. Grace & Co. - Conn. Production of enhanced biocontrol agents
US7422737B1 (en) * 2002-09-05 2008-09-09 Yissam Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Porous freeze-dried hydrocolloid beads containing viable microorganisms for biological control
CN102613252A (zh) * 2011-01-27 2012-08-01 中国科学院生态环境研究中心 利用马铃薯淀粉废水和蘑菇渣生产木霉生防剂
CN103409327A (zh) * 2013-08-23 2013-11-27 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4433531A (en) 1979-08-06 1984-02-28 International Harvester Co. Forage harvester corn snapping header
US5296369A (en) 1985-09-16 1994-03-22 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture Method and compositions for controlling round-leaved mallow using Colletotrichum gloeosporioides f. sp. malvae, A.T.C.C. 20767
DE69110470D1 (de) 1991-11-27 1995-07-20 Grace W R & Co Herstellung von erhöhten Biokontrollwirkstoffen.
AU1703995A (en) 1994-03-15 1995-10-03 Philom Bios Inc. Methods for the production of fungal spores and compositions thereof
ES2109182B1 (es) * 1995-11-07 1998-07-01 Univ Salamanca Formulacion liquida a base de cepas de los hongos filamentosos trichoderma harzianum y trichoderma viride.
GB2357301A (en) 1999-12-16 2001-06-20 Cobble Blackburn Ltd Tufting machine with independent control of the needle bars
US7994138B2 (en) 2004-06-01 2011-08-09 Agscitech Inc. Microbial biosurfactants as agents for controlling pests
FI119597B (fi) 2004-12-31 2009-01-15 Verdera Oy Stabiilit mikrobisiirrosteet ja menetelmät niiden valmistamiseksi
US8715979B2 (en) 2005-10-05 2014-05-06 Asahi Breweries, Ltd. Method of producing filamentous fungus culture product
JP2010530350A (ja) 2007-06-20 2010-09-09 ウルトラ バイオテック リミテッド 微生物製剤および植物の成長促進にそれを使用する方法
CA2751694C (en) * 2009-02-06 2018-04-17 Cornell University Trichoderma strains that induce resistance to plant diseases and/or increase plant growth
FR2960551B1 (fr) 2010-05-27 2012-09-14 Comptoir Agricole Production de molecules d'interet en milieu solide
BR112013014429A2 (pt) 2010-12-10 2016-09-13 Dsm Ip Assets Bv composições de cultura iniciadora
FR3008696B1 (fr) 2013-07-19 2016-08-19 Ab7 Innovation Inoculum solide supporte dans un agrogranulat superabsorbant a volume variable fonctionnant en minifermenteur naturel et procede d'obtention
BR112016002818A2 (pt) 2013-08-06 2017-08-01 Prairie Aquatech métodos de produção de concentrado de proteína não baseado em animais; concentrados de proteína; composições; e método de produção de um ácido graxo poli-insaturado
CN103509712B (zh) 2013-08-07 2015-11-18 清华大学 一种具备自控系统的连续固态发酵制取乙醇的装置及工艺
WO2016014386A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Novozymes Bioag A/S Compositions containing lipo-chitooligosaccharide and microorganism for enhancing plant growth
AR105480A1 (es) 2015-04-22 2017-10-11 Monsanto Technology Llc Beneficios de rendimiento de plantas por microbianos
WO2017035101A1 (en) 2015-08-22 2017-03-02 Neozyme International, Inc. Non-toxic plant agent compositions and methods and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4803800A (en) * 1987-03-27 1989-02-14 Plant Genetics, Inc. Synthetic substrate for filamentous fungi
US5194258A (en) * 1990-11-13 1993-03-16 W. R. Grace & Co. - Conn. Production of enhanced biocontrol agents
US7422737B1 (en) * 2002-09-05 2008-09-09 Yissam Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Porous freeze-dried hydrocolloid beads containing viable microorganisms for biological control
CN102613252A (zh) * 2011-01-27 2012-08-01 中国科学院生态环境研究中心 利用马铃薯淀粉废水和蘑菇渣生产木霉生防剂
CN103409327A (zh) * 2013-08-23 2013-11-27 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CATHERINE BUYSENS ET AL.: "Inoculation of Medicago sativa cover crop with Rhizophagus irregularis and Trichoderma harzianum increases the yield of subsequently-grown potato under low nutrient conditions", 《APPLIED SOIL ECOLOGY 》 *
SANJAY KAR ET AL.: "Production of xylanase by immobilized Trichoderma reesei SAF3 in Ca-alginate beads", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112760234A (zh) * 2021-02-02 2021-05-07 吉林农业大学 一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法
CN112760234B (zh) * 2021-02-02 2023-01-31 吉林农业大学 一种哈茨木霉与绿色木霉液体培养基及哈茨木霉与绿色木霉菌剂制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CL2020000768A1 (es) 2020-08-07
BR112020006362A2 (pt) 2020-09-24
PE20210474A1 (es) 2021-03-08
EP3688138A1 (en) 2020-08-05
EA202090766A1 (ru) 2020-08-27
SG11202001935XA (en) 2020-04-29
KR20200050461A (ko) 2020-05-11
CA3076224A1 (en) 2019-04-04
CO2020002156A2 (es) 2020-04-01
JP2020534845A (ja) 2020-12-03
CR20200181A (es) 2020-07-11
WO2019067379A1 (en) 2019-04-04
US20200224149A1 (en) 2020-07-16
MX2020003164A (es) 2020-07-29
MY193446A (en) 2022-10-13
AU2018341264A1 (en) 2020-05-07
JP7319254B2 (ja) 2023-08-01
PH12020500407A1 (en) 2021-03-01
ZA202001335B (en) 2022-03-30
EP3688138A4 (en) 2021-06-30
US11286456B2 (en) 2022-03-29
IL273024A (en) 2020-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11286456B2 (en) Large scale production of liquid and solid trichoderma products
CN101864376B (zh) 一种荧光假单胞菌菌株、菌剂及其作为防治番茄青枯病的育苗基质的应用
KR20200094227A (ko) 미생물 기반 산물을 생산하기 위한 반응기 및 심부 발효법
US20190194600A1 (en) Novel cultivation system for the efficient production of microorganisms
CN107022355A (zh) 一种生物酵素土壤改良剂及其制备方法
KR20140019992A (ko) 항진균성 미생물 배양체를 포함하는 유기질비료 조성물 및 이의 제조방법
WO2019222168A1 (en) Production and preservation of bacillus reference culture for generating standardized and reliable inocula
US20190216025A1 (en) Enhanced production of arbuscular mycorrhizal fungi in a plant root culture
CN106011022B (zh) 一种玫瑰黄链霉菌固体发酵培养基及其制备和发酵方法
US20200002660A1 (en) Portable Device and Methods for Efficient Production of Microbes
CN101818125B (zh) 一种发根根瘤菌菌株、菌剂及其作为防治番茄青枯病的育苗基质的应用
CN108271785A (zh) 一种利用豆腐黄水发酵生产的生物农药及其制备方法
US20210371781A1 (en) Hybrid Solid State-Submerged Fermentation Using a Matrix
US11479749B2 (en) Production and cryopreservation of high concentration inocula
RU2551968C2 (ru) ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus pumilus А 1.5, В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
EA042631B1 (ru) Крупномасштабное производство жидких и твердых продуктов на основе trichoderma
CN104798819B (zh) 一种采用强化耐低温微生物菌剂提高草坪草抗低温能力的方法
US20220356441A1 (en) Reactor for Two-Stage Liquid-Solid State Fermentation of Microorganisms
CN106244465B (zh) 采用固体发酵生产木霉sqr-t037的方法
CN104774789B (zh) 垃圾堆肥中草坪耐低温强化复合微生物菌群的制备方法及应用
US20220062961A1 (en) Use of Peanut Hearts as a Fermentation Biostimulant
AGOSIN et al. Department of Chemical and Bioprocess Engineering, Pontifida Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200612