FI119597B

FI119597B - Stabiilit mikrobisiirrosteet ja menetelmät niiden valmistamiseksi

Info

Publication number: FI119597B
Application number: FI20041704A
Authority: FI
Inventors: Pekka Seiskari
Original assignee: Verdera Oy
Priority date: 2004-12-31
Filing date: 2004-12-31
Publication date: 2009-01-15
Also published as: JP2008526190A; WO2006070061A1; CA2589857A1; EP1831346A1; FI20041704A; US20080107689A1; FI20041704A0; JP5329092B2

Description

STABIILIT MIKROBISIIRROSTEET JA MENETELMIÄ NIIDEN VALMISTAMISEKSI

KEKSINNÖN ALA

5

Keksinnön kohteena ovat stabiilit, vettä sisältävät mikrobisiirrosteet ja menetelmät vettä sisältävien, pastan muodossa olevien mikobisiirrosteiden valmistamiseksi, joilla on erinomainen varastointistabiilisuus.

10 Mikrobisiirrosteiden toiminta perustuu niissä olevien elävien mikro-organismien aktiivisuuteen. Tällaiset tuotteet käsittävät biologiset torjunta-aineet, mykorritsasiir-rosteet, typpeä sitovien bakteerien siirrosteet, probiootit, leivinhiivan, viljelysienten kylvörihmastot ja rehunsäilönnässä käytettävät maitohappobakteerit.

KEKSINNÖN TAUSTA

15

Mikrobisiirrosteille on olennaisen tärkeää hyvä varastointikestävyys. Esimerkiksi maataloussovelluksiin tarkoitetun tuotteen hyllyjän pitäisi olla vähintään 3 kuukautta, mieluiten 12 kuukautta.

20 Mikrobisiirrosteet stabiloidaan tavallisesti kuivaamalla, mikä on hyvä menetelmä pitkän hyllyjän saamiseksi itiöitä muodostaville mikrobeille. Monet mikro-organismit tai nematodit eivät kuitenkaan muodosta kestäviä itiöitä ja siksi niiden kuivaaminen voi olla hyvin hankalaa ja kallista tai jopa mahdotonta. Elävien mikro-organismien kuivaaminen on erittäin vaativa yksikköoperaatio ja yleensä elävyys kärsii aina 25 jonkin verran kuivausmenetelmästä riippuen. Kuivaus on myös hyvin altis kontaminaatioille prosesseissa, joissa vaaditaan tiukkaa aseptiikkaa.

Eläviä mikro-organismeja voidaan säilöä myös kuivaamattomassa muodossa lisäämällä suoja-aineita, jotka stabiloivat solumembraanit, pysäyttävät metabolian, 30 säätävät osmoottista painetta tai toimivat kryoprotektantteina. Mikrobikantako-koelmissa mikro-organismeja varastoidaan yleisesti glyseroliliuoksessa hyvin matalissa lämpötiloissa. Tällaiset säilöntämenetelmät eivät ole kannattavia siirrostei-den kaupallisissa sovelluksissa.

2

Kun mikrobisiirrosteita tuotetaan kaupallisessa mittakaavassa, formulaattien on oltava loppukäyttäjälle edullisia ja helppokäyttöisiä. Esimerkiksi biologisia torjunta-aineita käytetään yleensä vesisuspensioina ruiskuttamalla, kastelujärjestelmien 5 kautta, sekoittamalla kasvien kasvualustaan tai upottamalla kasvien juuret suspensioon. Myös siementen peittaus tai pinnoitus on yleistä.

Yleisin kaupallisesti käytetty menetelmä minkä tahansa mikro-organismin kasvattamiseksi on submerssikasvatus nestemäisessä alustassa. Mikrobisiirrosteet valio mistetaan erottamalla solumassa ja submerssi-itiöt kasvualustastaan. Submerssi-kasvatuksilla on kuitenkin tiettyjä yleisesti tunnettuja haittapuolia. Koska solut on erotettava kasvuliuoksesta, muodostuu aina suuria määriä jäteliuosta. Lisäksi kasvun morfologia nestekasvatuksissa ei välttämättä suosi mikrobien kestomuoto-jen, kuten itiöiden muodostumista, mikä olisi tärkeää stabiilien tuotteiden aikaan- .1 15 saamiseksi.

Submerssikasvatuksen vaihtoehtona on kasvatus kiinteällä alustalla (solid state fermentation SSF). Kyseessä on alan asiantuntijan hyvin tuntema mikro-organismien kasvatusmenetelmä, jossa vesi on impregnoitu kiinteään kantajaan. Vapaan 20 veden määrä on hyvin pieni päinvastoin kuin submerssikasvatuksissa ja mikro-organismien kasvun morfologia kiinteiden partikkelien pinnalla on erilainen.

Markkinoilla on joitain vesipitoisia mikrobisiirrosteita. Tavallisesti mikrobisiirrosteita i säilytetään kuivina tai puolikuivina ja käytetään nestemuodossa.

25

Torres et ai. (J. Appi. Microbiol. 94 (330-339) 2003) valmistivat nesteformulaatin biologiseen torjuntaan käytettävästä Candida sake hiivasta. Glyserolia tai polyety-leeniglykolia (PEG) sekoitettiin submerssikasvatuksessa saatuun solumassaan muuttamaan veden aktiivisuutta (aw) ja erilaisia sokereita sekä polyoleja lisättiin 30 suoja-aineiksi. Lopputuote on neste, joka varastoidaan sellaisenaan ja joka ei sisällä kiinteää kantajaa.

Wall ja Prasad julkaisussa US5587158 esittävät Chondrostereum purpureum preparaatin, joka on tuotettu kiinteän alustan kasvatuksella, pulverimaista talkkia ja 35 kaoliinia sisältävällä kantajalla. Kolonisoitunut alusta varastoidaan jäähdytettynä aseptisissa olosuhteissa. Puun kantojen käsittelyyn tehdään formulaatio sekoittamalla alustaa laimeaa sokeriliuosta, kasviöljyä, munankeltuaista ja pulveroitua sei- 3 luloosaa. Tässä patentissa kuvattu lopputuote on siis käytännössä vettyvä jauhe (wettable powder). Pasta tehdään tuotteen levittämiseksi eikä tuotteessa olevan mikro-organismin stabiloimiseksi varastointia varten.

5 WO0182704 kuvaa kiinteän alustan kasvatuksella (SSF) valmistettuja ruiskutettavia formulaatteja. Mikro-organismeja kasvatetaan partikkelimuotoisella kantajalla kuten hienojakoisella turpeella ja varastoidaan tässä muodossa. Juuri ennen ruis-kutuskäyttöä kiinteä kantaja suspendoidaan veteen, joka sisältää mahdollisen sa-keutusaineen. Tässä menetelmässä tuote varastoidaan kuivassa muodossa, ei 10 suspensiona. Tälläkin menetelmällä saadut tuotteet ovat vettyviä jauheita, jotka on käytön yhteydessä suspendoitava nesteeseen ruiskutuksen mahdollistamiseksi.

Blachere et ai. (Ann. Zool. Ecol. Anim. 5, 69-79, 1973) kasvattivat Beauveria brongniartii -sientä nestemäisellä submerssifermentoinnilla, erottivat solumassan 15 setrifugoimalla ennen kuin sekoittivat siihen silika-pulveria, osmoottisesti aktiivisia aineita (kuten sakkaroosia ja natriumglutamaattia), antioksidantteja (natriumaskor- ; baatti) sekä nestemäisen parafiinin ja polyoksietyleeniglyseriinioleaatin seosta.

Tuote kuivattiin tuuletetussa kuivauskaapissa +4 °C:ssa. Näin kuivatut itiöt (blasto- * sporit) säilyivät elävinä 8 kuukautta 4 °C:ssa. Tässä menetelmässä kuvataan ta-20 vanomainen nestefermentointiprosessi, jota seuraa solujen erotus ja kuivaus. For- ·, mulointi tehdään tuotteen stabiilisuuden parantamiseksi kuivauksessa. Tuotetta ei esitetä voitavan varastoida pastana.

KEKSINNÖN LYHYT YHTEENVETO

25 Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada mikrobisiirrosteista stabiili varas-topasta, joka on helppokäyttöinen ja jota voidaan varastoida pitkä aika ilman elävyyden merkittävää heikentymistä. Tuotteiden hyllyjän pitäisi olla vähintään 2 kuukautta, edullisesti 6 kuukautta ja edullisimmin 12 kuukautta.

3 0 Keksinnön toisena tarkoituksena on esittää yksinkertainen menetelmä eläviä mikro-organismeja sisältävän, varastointia kestävän siirrostepastan valmistamiseksi.

Yllättäen havaittiin, että sekoitettaessa kiinteää kantajaa sisältävää kasvualustaa, jolla oli kasvatettu mikro-organismeja, erilaisia suoja-aineita sisältävien liuosten 35 kanssa, saatiin pastamaisia, viskooseja suspensioita, joissa elävien yksiköiden pitkäaikainen stabiilisuus oli erinomainen.

4 Näin mikrobisiirrosteita voidaan valmistaa ilman solujen tai itiöiden erottamista kasvualustasta ja ilman mikrobisolujen tai itiöiden kuivaamista. Mikro-organismit, jotka eivät muodosta itiöitä ja joita ei näin ollen voi lainkaan kuivata, voidaan hel-5 posti stabiloida tämän keksinnön mukaisesti.

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Kiinteän alustan kasvatusta (solid state fermentation, SSF) käytetään yleisesti mikrobisiirrosteiden, erityisesti biologisten torjunta-aineiden valmistukseen, koska 10 se on tehokas tapa tuottaa kestäviä itiöitä suurina pitoisuuksina. Jos kantaja on sopivasti valittu, ei solujen tai itiöiden erottaminen kasvualustasta ole tarpeen, mikä tekee jälkikäsittelyn erittäin yksinkertaiseksi submerssikasvatuksiin verrattu na. Tällaisia kehittyneitä kantajia on kuvattu patentissa W09218623, jonka koko sisältöön tässä keksinnössä viitataan. Viime aikoina on kehitetty uusia tekniikoita, 15 joiden avulla voidaan täysin hyödyntää SSF:n edut ja saada mikrobisiirrosteista käyttökelpoisempia. Tällaisia tekniikoita on kuvattu ei-julkisessa patenttihakemuksessa FI20041253, jonka koko sisältöön tässä keksinnössä viitataan.

Mikro-organismien kasvattamiseksi kiinteillä kasvualustoilla on kehitetty monen-20 tyyppisiä reaktoreita SSF:ää varten (Mitchell et ai., Process Biochemistry 35 (2000) 1211-1225). Näihin sisältyvät pakattu-peti reaktorit, pyörivät rumpureaktorit, kaasu-kiinteä leijupetireaktorit ja reaktorit, joissa on käytetty erilaisia sekoittajia (katso US-patenttijulkaisu 2002031822).

25 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään kiinteää kantajaa, joka käsittää yhtä tai useampaa orgaanista tai epäorgaanista kantajaa tai molempia. Epäorgaaniset kantajat ovat edullisesti sellaisia kuten kaoliini, bentoniitti, talkki, kipsi, kitosaani, vermikuliitti, perliitti, amorfinen silika, rakeinen savi tai näiden seos. Tämän tyyppisiä materiaaleja käytetään yleisesti, koska ne muodostavat 30 rakenteen, joka on kuohkea, ilmava ja rakeinen, jonka hiukkaskoko on edullisesti 0,5-50 mm ja jolla on suuri pinta-ala. Orgaaniset kantajat ovat edullisesti sellaisia kuten selluloosa, viljan jyvät, akanat, sahajauho, turve, puuhake tai niiden seos.

Edullinen kiinteä kantaja on amorfinen silika, joka pystyy imemään kosteutta 35 enemmän kuin kaksi kertaa oman painonsa. Kostean silika-alustan rakeinen, ilmava ja kuohkea rakenne on erinomainen kiinteiden alustojen kasvatuksiin. Muita 5 inerttejä, hiukkaskooltaan pieniä jauhemaisia kantajia kuten kaoliinia, bentoniittia, talkkia, kipsiä, kitosaania tai selluloosaa voidaan myös lisätä alustaan yhdessä silikan kanssa, 5 Kiinteä kasvualusta voi myös sisältää lisäravinteita mikro-organismeille. Tyypillisesti näihin sisältyvät hiililähteet kuten hiilihydraatit (sokerit, tärkkelys), valkuaisaineet tai rasvat, typpilähteet orgaanisessa muodossa (valkuaisaineet, aminohapot) tai epäorgaanisina suoloina (ammonium- ja nitraattisuolat, urea) ja hivenaineet tai muut kasvutekijät (vitamiinit, pH-sääteet). Kiinteä kasvualusta voi sisältää myös 10 rakennetta parantavia apuaineita kuten superabsorbentteja esim. polyakryyliami-dit. Kiinteä alusta voi myös sisältää lopputuotteen käytettävyyttä parantavia ainesosia kuten öljyjä, emulgaattoreita ja dispergointiaineita.

Siirrosteisiin kasvatettavia mikro-organismeja ovat sienet, mukaan lukien hiivat, 15 esimerkiksi Phlebiopsis gigantea, Gliocladium sp., Nectria pityrodes, Chondros-tereum purpureum, Pseudozyma flocculosa, Coniothyrium minitans, Trichoderma sp., Metarrhizium sp., Verticillium sp., Myrothecium sp. tai Beauveria bassiana. Edullisesti sienet ovat Phlebiopsis gigantea, Gliocladium catenulatum, Nectria pityrodes, Myrothecium sp. tai Chondrostereum purpureum. Sienet sisältävät li-2 0 säksi viljelysienet kuten herkkusieni (Agaricus bisporus), shiitake (Lentinus edo-des) tai osterivinokas (Pleurotus ostreatus). Keksinnön mukaisia mikro-organismeja voivat olla bakteerit kuten Streptomyces sp., Bacillus thuringiensis, muut Bacillus sp. tai Pseudomonas sp., edullisesti Streptomyces sp. Lisäksi nematodit (sukkulamadot) ovat mikro-organismeja, joita voidaan kasvattaa keksinnön mukai-25 sesti.

Siirroste viedään kasvualustaan nestemäisessä tai kiinteässä muodossa.

Mikäli käytetään nestemäistä siirrostetta, se voi olla esimerkiksi hiukkaskooltaan 30 pieniä partikkeleita sisältävänä suspensiona, jolloin voidaan käyttää ruiskutustek-niikoita.

Jos siirroste on kiinteä, se voidaan kuljettaa siirrostuskohtaan samoin kuin kiinteä kasvualusta. Edullisesti kiinteä siirroste kuljetetaan ruuvi-, täry- tai nauhakuljetinta 35 käyttäen. Tämä varmistaa, että mikro-organismi voidaan kuljettaa yhtä aseptisesti kasvatukseen.

6

Mikro-organismia inkuboidaan kiinteällä kasvualustalla yleensä 1-5 viikkoa kasvuolosuhteista, ravinteista ja mikrobista itsestään riippuen. Itiöiviä mikro-organismeja kasvatettaessa itiöt ovat useimmiten haluttu elävien yksiköiden muoto.

5 Kun mikro-organismi on kasvanut kasvualustaan, alusta mikrobeineen sekoitetaan liuokseen, joka sisältää yhtä tai useampaa, esimerkiksi osmoottista painetta muuttavaa, suoja-ainetta. Suoja-aine voidaan valita osmoottisesti aktiivisista aineista, sokereista, polyoleista tai polymeereistä kuten sakkaroosi, fruktoosi, laktoosi, trehaloosi, glyseroli, sorbitoli, glysiinibetaiini, polyakryyliamidi, polyetyleeniglykoli, 10 polypropyleeniglykoli, karboksimetyyliselluloosa, tärkkelys, pektiini tai näiden seoksista. Edullisesti suoja-aine valitaan joukosta sakkaroosi, laktoosi, trehaloosi, sorbitoli, glysiinibetaiini, polyakryyliamidi. Seosta sekoitetaan, jotta saadaan aikaan homogeeninen, viskoosi, pastamainen suspensio, joka sisältää yli 35 paino-% vettä. Viskoosi pastamainen suspensio voi olla olomuodoltaan juoksevasta sus-15 pensiomaisesta pastasta jähmeään pastaan vesipitoisuudesta riippuen.

Keksinnön mukainen tuote on stabiilin, varastoitavan pastan muodossa oleva siir-roste, joka sisältää 0,25-5 p-% mikro-organismia, 5-25 p-% kiinteää kantajaa, 5-35 p-% suoja-ainetta ja vettä 35-90 %. Edullisesti siirrosteessa on 0,5-1 p-% mik-2 0 ro-organismia, 10-15 p-% kiinteää kantajaa, 5-15 p-% suoja-ainetta ja vettä 35- 90 %.

Tuotteen pH:ta voidaan helposti säätää tavallisilla hapoilla (esim. fosforihapolla), emäksillä tai puskureilla (esim. fosfaattipuskurit). Tuotteen pH on edullisesti alle 25 noin 4.

Pastamaiset suspensiot pakataan sopivan kokoisiin suljettuihin pakkauksiin ja varastoidaan edullisesti kylmässä +4 - +8 °C:ssa tai huoneenlämmössä. Varastoitava siirroste sisältää vettä 35-90 p-% vettä, edullisesti 70 p-%.

30

Keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavilla esimerkeillä kuitenkaan niihin rajoittumatta.

7 ESIMERKK11

Phlebiopsis giganteaa (Rotstop, Verdera Oy:n tavaramerkki) kasvatettiin silikapoh-jaisella kiinteällä kasvualustalla.

5 P. gigantealle sopiva ravinneliuos valmistettiin sekoittamalla 9 g tiivistettyä tärkke-lysrankkia (TTR, Altia Oyj) ja 33 g vesijohtovettä. Liuos sekoitettiin dekantterilasis-sa 15 g:aan amorfista silikapulveria (Degussa) rakeisen kasvualustan aikaansaamiseksi. Ennen sekoittamista lisättiin 700 mg kalkkia pH:n säätämiseksi. Alusta 10 steriloitiin autoklaavissa 30 min 121 °C:ssa.

Jäähtyneeseen alustaan siirrostettiin 1 ml itiösuspensiota, joka saatiin suspendoi-malla P. gigantea -itiöt PDA-maljalta (potato-dextrose-agar) steriiliin veteen. Sientä kasvatettiin 10 päivää 28 °C:ssa, kunnes koko alusta oli täyteen kasvanut ja itiöi-15 nyt.

10 g kolonisoitunutta kasvualustaa sekoitettiin 10 g:aan liuosta, joka sisälsi 2,5 g suoja-ainetta ja 7,5 g steriiliä vettä, jolloin muodostui viskoosi, pastamainen sus-pesio, vesipitoisuudeltaan noin 70 %. Suoja-aineet olivat 20 1) trehaloosi 2) sorbitoli 3) trehaloosi/sorbitoli (50/50) 4) trehaloosi/glysiinibetaiini (50/50) 25

Suspensiot laitettiin muovisiin näytepurkkeihin ja varastoitiin jääkaapissa +4 °C:ssa. Suspensioiden elävyydet määritettiin kuukausittain:

Taulukko 1 P. gigantean säilyvyys suspensioformulaateissa.

30

Varastointi aika, Elävyys, cfu/g kuukausia 1 2 3 4 0 4*107 4*107 4*107 4*107 1 5*107 4*107 4*107 3*107 3 5 2 6*107 3*107 3*107 2*107 4 4*107 3*107 2*107 2*107 5 4*107 1*107 2*107 2*107 8

Tulokset osoittavat, että P. gigantea säilyi elävänä suspensioformulaateissa vähintään 5 kuukautta.

5 ESIMERKKI 2

Chondrostereum purpureum - sientä kasvatettiin alustalla, joka sisälsi 0,8 g liukoista puutarhan täyslannosta 16-9-22 (Kemira GrowHow Oyj), 15 g mallasuutetta (Oy Maltax Ab), 359 g vettä ja 150 g amorfista silika-pulveria (Degussa). Alusta 10 sekoitettiin ja autoklavoitiin kuten esimerkissä 1. Sientä kasvatettiin 11 päivää 22 °C:ssa, kunnes alusta oli täysin kolonisoitunut.

10 g täyteen kasvanutta alustaa sekoitettiin 10 g:aan liuosta, joka sisälsi 2,5 g suoja-ainetta ja 7,5 g steriiliä vettä, viskoosin, pastamaisen suspension valmista-15 miseksi, joka sisältää 72 % vettä. Suoja-aineet olivat: 1) trehaloosi 2) sorbitoli 3) trehaloosi/sorbitoli (50/50) 20 4) sakkaroosi Näytteet varastoitiin ja niiden elävyydet määritettiin kuten esimerkissä 1.

Taulukko 2 C. purpureumin säilyvyys suspensioformulaateissa.

25

Varastointiaika, Elävyys, cfu/g kuukausia 12 3 4 0 6*105 6*105 6*105 2*106 1 6*105 3*105 9*105 1*106 3 0 2 5*105 7*105 6*105 3 4*105 7*105 8*105 5 9*105 9*105 1*106 6 9*105 5*105 1*106 8 9*105 8*105 1*106

Tulokset osoittivat, että C. purpureum säilyi pastaformulaateissa erinomaisesti vähintään 8 kuukautta.

35 9 ESIMERKKI 3

Myrothecium sp. sientä kasvatettiin alustalla, joka sisälsi 3,0 g tiivistettyä tärkke-5 lysrankkia, 34,5 g vettä, 0,6 g kalkkia ja 15 g amorfista silika-pulveria (Degussa). Alusta sekoitettiin ja autoklavoitiin kuten esimerkissä 1. Sientä kasvatettiin 15 päivää 18 °C:ssa, kunnes se oli kolonisoinut koko kasvualustan ja itiöinyt.

10 g täyteen kasvanutta alustaa sekoitettiin 10 g:aan liuosta, joka sisälsi 2,5 g 10 suoja-ainetta ja 7,5 g steriiliin veteen tehtyä 0,5 % polyakryyliamidi-liuosta viskoosin, pastamaisen suspension valmistamiseksi, joka sisältää 71 % vettä. Suoja-aineet olivat: 1) trehaloosi 2) sorbitoli 15 3) trehaloosi/glysiinibetaiini (50/50) Näytteet varastoitiin ja elävyydet määritettiin kuten esimerkeissä 1 ja 2.

Taulukko 3 Myrothecium sp:n säilyvyys suspensioformulaateissa.

20

Varastointiaika, Elävyys, cfu/g kuukautta 12 3 0 4*107 4*107 4*107 1 4*107 5*107 5*107 25 3 2*107 5*107 1Ί07

Myrothecium sp. säilyi pastaformulaateissa vähintään 3 kuukautta.

ESIMERKKI 4 30

Streptomyces sp. bakteeria (Mycostop, Verdera Oy:n tavaramerkki) kasvatettiin kiinteällä alustalla, joka sisälsi 5,2 g kuivattua maissinliotusvettä (CSS, Roquette, Ranska), 5,2 g laktoosia (Merck), 5,2 g kalkkia, 100 g amorfista silika-pulveria (Degussa) ja 240 g vesijohtovettä. Alusta sekoitettiin ja autoklavoitiin kuten esi-35 merkissä 1. Bakteeria kasvatettiin 7 päivää 28 °C:ssa.

10 g kolonisoitunutta kasvualustaa sekoitettiin 10 g:aan 10 1) 10% sakkaroosiliuosta (noin 78 % vettä tuotteessa) 2) 20 % sakkaroosiliuosta (noin 73 % vettä tuotteessa) 5 Näytteitä varastoitiin muovisissa näyteastioissa inkubointikaapissa +28 °C:ssa.

Taulukko 4 Streptomyces sp:n. säilyvyys suspensioformulaateissa.

Varastointiaika, Elävyys, cfu/g 10 viikkoa 1 2 0 2*109 2*109 1 2*109 7*108 2 1*109 1*109 15 Streptomyces sp:n stabiilisuus pastaformulaateissa korotetussa lämpötilassa oli hyvä.

ESIMERKKI 5 20 Myrothecium sp. sientä kasvatettiin kolmella eri kasvualustalla:

Aine__1__2__3

Ravinneliuos: (7,8 % TTR-liuos) 37,5 34,5 36,0 kalkki 0,6 0,6 0,6 amorfinen silika 15 13,5 13,5 kaoliini* 1,5 selluloosa pulveri** __ 1,5 (* ECC International, ** Penwest Pharmaceuticals)

Alustat sekoitettiin ja autoklavoitiin kuten esimerkissä 1. Sientä kasvatettiin 15 2 5 päivää 18 °C:ssa, kunnes alustat olivat täysin kolonisoituneet.

10 g jokaista täyteen kasvanutta alustaa sekoitettiin 10 g:aan liuosta, joka sisälsi 2 g sokeria ja 8 g 0,5 % polyakryyliamidiliuosta suspension valmistamiseksi, joka sisältää noin 74 % vettä. Näytteet varastoitiin kuten esimerkissä 1.

30 11

Tulokset osoittivat, että Myrothecium sp. säilyi suspensioformulaateissa kuten esimerkissä 3 on esitetty.

ESIMERKKI 6 5

Gliocladium catenu/atum sientä (Prestop, Verdera Oy:n tavaramerkki) kasvatettiin alustalla, joka sisälsi 5,3 g tiivistettyä tärkkelysrankkia, 33,8 g vettä, 0,53 g kalkkia ja 15 g amorfista silikaa (Degussa). Kasvualusta sekoitettiin ja autoklavoitiin kuten esimerkissä 1. Sientä kasvatettiin 15 päivää 18 °C:ssa, kunnes alusta oli kasvanut 10 täyteen ja sieni itiöinyt.

10 g kolonisoitunutta alustaa sekoitettiin 10 g:aan 1) 10% sakkaroosiliuosta (noin 79 % vettä tuotteessa) 15 2) 20 % sakkaroosiliuosta (noin 74 % vettä tuotteessa) 3) 10 % laktoosiliuosta (noin 79 % vettä tuotteessa) 2) 20 % laktoosiliuosta (noin 74 % vettä tuotteessa) Näytteet varastoitiin ja elävyydet määritettiin kuten esimerkissä 1 20

Tulokset osoittivat, että G.catenulatumin säilyvyys pastaformulaateissa oli verrattavissa esimerkissä 3 esitettyyn Myrothecium sp:n säilyvyyteen.

Tarkoituksena ei ole rajoittaa yllä kuvattua keksintöä mainittuihin menetelmiin, 25 menettelytapoihin tai reagensseihin, jotka voivat vaihdella. Edellä käytetyllä terminologialla on ollut tarkoitus kuvata tiettyjä suoritusmuotoja eikä sitä ole tarkoitettu rajoittamaan keksinnön laajuutta, joka ilmenee oheisista patenttivaatimuksista.

Claims

1. Stabiilin, varastoitavan pastan muodossa oleva mikrobisiirroste, joka sisältää (p-%) 5 a) 0,25-5 % mikro-organismia b) 5-25 % kinteää kantajaa c) 5-35 % suoja-ainetta d) 35-90 % vettä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mikrobisiirroste, joka sisältää (p-%): a) 0,5-1 % mikro-organismia b) 10-15% kiinteää kantajaa c) 5-15 % suoja-ainetta 15 d) 35-90 % vettä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mikrobisiirroste, tunnettu siitä, että mikro-organismi on sieni, hiivat mukaan lukien, bakteeri tai nematodi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen mikrobisiirroste, tunnettu siitä, että mikro- organismi on Phlebiopsis gigantea, Chondrostereum purpureum, Gliocladium catenulatum, Nectria pityrodes, Myrothecium sp. tai Streptomyces sp.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mikrobisiirroste, tunnettu siitä, että 25 kiinteä kantaja on jokin seuraavista: kaoliini, bentoniitti, talkki, kipsi, kitosaani, selluloosa, viljan jyvät, akana, sahajauho, turve tai puuhake, vermikuliitti, perliitti, amorfinen silika tai rakeinen savi tai näiden seos.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen mikrobisiirroste, tunnettu siitä, että kiinte-3 0 ässä kantajassa on amorfista silikaa.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen mikrobisiirroste, tunnettu siitä, että kiinteässä kantajassa on amorfisen silikan ja kaoliinin, bentoniitin, talkin, kipsin, kito-saanin tai selluloosan seosta. 35

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mikrobisiirroste, tunnettu siitä, että suoja-aine on jokin seuraavista: osmoottisesti aktiivinen aine, sokeri, polyoli tai polymeeri.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen mikrobisiirroste, tunnettu siitä, että suoja- aine on jokin seuraavista: sakkaroosi, fruktoosi, laktoosi, trehaloosi, glyseroli, sorbitoli, glysiinibetaiini, polyakryyliamidi, polyetyleeniglykoli, polypropyleeniglykoli, karboksimetyyliselluloosa, tärkkelys tai pektiini tai näiden seos.

10. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen stabiilin, varastoitavan pastan muodossa olevan mikrobisiirrosteen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a. mikro-organismia kasvatetaan kiinteällä kantajalla, b. eläviä mikro-organismeja ja/tai mikrobi-itiöitä sisältävä kiinteä kantaja vai- 15 heesta a sekoitetaan yhtä tai useampaa suoja-ainetta sisältävän liuoksen kanssa, c. seos homogenisoidaan varastoitavan pastan aikaansaamiseksi, joka sisältää yli 35 paino-% vettä. 2 0 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä kantaja on jokin seuraavista: kaoliini, bentoniitti, talkki, kipsi, kitosaani, selluloosa, viljan jyvät, akana, sahajauho, turve tai puuhake, vermikuliitti, perliitti, amorfinen silika tai rakeinen savi tai näiden seos. 2 5 12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteässä kantajassa on amorfista silikaa.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteässä kantajassa on amorfisen silikan ja kaoliinin, bentoniitin, talkin, kipsin, kitosaanin 3. tai selluloosan seosta.

14. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi on sieni, hiivat mukaan lukien, bakteeri tai nematodi. 3 5 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro- organismi on Phlebiopsis gigantea, Chondrostereum purpureum, Gliocladium catenulatum, Nectria pityrodes, Myrothecium sp. tai Streptomyces sp.

16. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoja-aine on jokin seuraavista: osmoottisesti aktiivinen aine, sokeri, polyoli tai polymeeri.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoja-aine 5 on jokin seuraavista: sakkaroosi, fruktoosi, laktoosi, trehaloosi, glyseroli, sorbitoli, glysiinibetaiini, polyakryyliamidi, polyetyleeniglykoli, polypropyleeniglykoli, karbok-simetyyliselluloosa, tärkkelys tai pektiini tai näiden seos.

10 Patentkrav