JP5548436B2 - 血液寒天培地及びその保存方法 - Google Patents
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血液寒天培地としては、例えばCW血液寒天培地、血液加ブルセラ培地、スキロー培地、バツラ培地、プレストン培地、カンピロバクター培地、ボルデー・ジャング培地、コロンビア・CNA培地、血液加トリプトソーヤ寒天培地等が挙げられる。
しかしながら、血液寒天培地は、離水がおこり易く長期間保存することが困難であり、大量にストックすることができず、作業効率が悪かった。
一方で、一般的に微生物の発育を抑制させるために食品に配合して用いられているショ糖よりも、食品の水分活性を効果的に低下させ、また離水を防ぐことができるため、優れた微生物発育抑制作用を有していることが知られている(特許文献4)。
しかしながら、微生物検出用の血液寒天培地へのトレハロースの使用については知られていなかった。
トレハロース20%以上の場合に、血液寒天培地の離水が抑制され、かつゲル強度が強く、微生物検出の際の取り扱い及び操作が容易であり、またトレハロース40%以下の場合に、微生物の発育が抑制されることなく幅広い微生物の検出が可能である。しかも、20〜40%と云う高濃度のトレハロースを含有させても血液成分に大きなダメージを与えることなく、長期間保存した際に血液成分の変質を抑制することが可能である。
好ましいトレハロースの培地中の含有量は、寒天のゲル強度が強く、かつ微生物の発育も良好なことから、使用最終濃度で20〜30%である。
尚、血液を1種で又は2種以上混合して血液寒天培地に含有させてもよい。
また、血液は、微生物検出の際の微生物汚染を防止するため、無菌保存血液又は脱繊維血液を使用するのが好ましい。
また、本発明の血液寒天培地に含有させる血液の量は、特に限定されないが、使用最終濃度で、好ましくは1〜20%、より好ましくは3〜10%、更に好ましくは5〜10%である。
pH調整剤としては、シュウ酸、炭酸水素ナトリウム、塩酸及び水酸化ナトリウム等が挙げられる。これらは単独で又は2種以上組み合わせて使用することができる。
抗生物質としては、カナマイシン、ポリミキシン、ノボビオシン及びゲンタマイシン等が挙げられる。これらは単独で又は2種以上組み合わせて使用することができる。
検出試薬としては、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、6-Chloro-3-indoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、N-Methylindoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、4-Methylumbelliferyl-beta-D-galacto-pyranoside、2-Nitrophenyl-beta-D-galacto-pyranoside、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acety-beta-D-galactosaminide、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acetyl-beta-D-glucosaminide、4-Methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D-gluco-pyranoside、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-phosphate、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-caprylate-nonanoate、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphate及び5-Bromo-3-indoxyl-phosphate等が挙げられる。これらは単独で又は2種以上組み合わせて使用することができる。
保存期間は、特に限定されないが、微生物検出の作業効率及びロットの均一化を考慮すると、大量に調製された血液寒天培地を長期間ストックすることが望ましく、一方で血液寒天培地の品質劣化が少ない状態が望ましいので、血液寒天培地調製後、1時間〜100日間、より1時間〜30日間、更に6時間〜3日間、より更に15時間〜48時間であるのが好ましい。
検出可能な微生物としては、特に限定されないが、嫌気又は好気の細菌、酵母及びカビ等が挙げられる。細菌としては、例えば、Bacillus属菌、Staphylococcus属菌、Escherichia属菌及びEnterobacter属菌、Bordetella属菌、Neisseria 属菌及びBranhamella属菌等が挙げられる。
微生物の検出は、各微生物のコロニー状態(発色や形状等)や検出試薬等による蛍光、発色や呈色状態等の観察や計測により行う。
〔培地組成〕
トレハロース: トレハロース100(Lot No.8H061)(株)林原生物化学研究所
基礎培地:トリプトソーヤ寒天培地(100mL組成)
カゼインペプトン 1.5g、ダイズペプトン 0.5g、 塩化ナトリウム 0.5g、寒天 1.5g、 pH 7.3±0.2
血液:馬、兎、牛、綿羊
〔各トレハロース含有の血液寒天培地の調製〕
使用最終濃度が0%,20%,30%,40%,50%,60%及び70%になるようにトレハロースを各トリプトソーヤ寒天培地に添加し、オートクレーブ滅菌(121℃、15分間)した後、50℃のウォーターバスで保温した。この加熱滅菌培地に各動物由来の脱繊維血液を5%の割合で添加攪拌後、各滅菌シャーレへ分注し、トレハロース含有量及び由来血液が異なる各血液寒天培地を各3枚ずつ作製した。
〔試験方法〕
作製した各血液寒天培地を、4℃、6℃、25℃及び35℃の保存温度条件に調整した各インキュベーター内に置いて保存し、0日目(作製直後)、7日目、12日目、18日目及び25日目毎に、各血液寒天培地を科学天秤にて測定し、「作製直後の血液寒天培地の質量−測定時の血液寒天培地の質量」から「各血液寒天培地の水分減量」を算出した。
何れの保存温度条件においても、トレハロース無添加の血液寒天培地の水分減量に比し、トレハロース20〜60%含有の血液寒天培地の水分減量が少なかった。すなわち、トレハロースを最終濃度20〜60%で血液寒天培地に含有させることによって、血液寒天培地の保水性が向上したこと、言い換えれば、血液寒天培地の離水が抑制されたことが認められた。
特に、保存温度25℃のような室温条件において、トレハロース無添加のものとトレハロース20〜60%含有のものとの差が大きかった。
血液寒天培地において、培地の離水が抑制されると、保水状態が製造直後と変わりなく培地表面が滑らかになり、微生物の検出がスムーズにできることから、微生物検出用培地の保存において培地の離水抑制が重要となる。更に、離水により培地表面が濡れている状態にならないために敢えて培地表面を乾燥させる必要がないことから、取り扱いも容易となる。
〔培地組成〕
トレハロース: トレハロース100(Lot No.8H061)(株)林原生物化学研究所
基礎培地:トリプトソーヤ寒天培地(試験例1と同様)
血液:羊脱繊維血液
〔各トレハロース含有の血液寒天培地の調製方法〕
試験例1と同様にして、各濃度(0,10,20,30,40,50及び60%)のトレハロース含有の羊血液寒天培地を、それぞれ3枚作製した。
〔試験方法〕
作製した各血液寒天培地を−20℃と−40℃の冷凍庫へ一晩(15h)放置し、凍結された血液寒天培地を調製した。凍結された血液寒天培地を室温に放置し、培地を完全に凍結がなくなった状態にし、レオメーター(装置名レオテックス:SD-700DP、会社名株式会社サン科学)で1mm侵入する強度を比較した。また、凍結前の血液寒天培地の強度も同様に測定した。このとき培地中のpHも測定した。
このことから、従来の血液寒天培地は長期間冷凍保存には適していなかったにも拘わらず、トレハロースを20〜60%で含有させることによって、長期間冷凍保存も可能となったことは、極めて重要である。
なお、何れの培地中のpHは約7付近で、トレハロース含有量の影響は少なく、安定的であった。
そして、試験例1の結果も考慮すると、トレハロースを10〜60%で血液寒天培地に含有させることによって、冷凍、低温及び室温の何れの保存温度条件でも保存が可能であると考えた。
更に、微生物検出の作業効率、ロットの均一化及び血液寒天培地の品質劣化を考慮すると、培地調製後1〜100日内に使用するのがよいと考えられる。
〔使用する微生物〕
(1)Bordetella septica ATCC 19395;Neisseria meningitidis 4;Branhamella catarrhalis ATCC 25238
(2)Bacillus cereus;Staphylococcus epidemidis;Staphylococcus aureus;Escherichia coli;Enterobacter intermedium
これら各微生物を、トリプトソイ液体培地に接種し、 35℃、48時間、前培養し、これを種菌とした。
〔使用する血液寒天培地〕
上記製造例1と同様にして、各濃度のトレハロースを含有する5%羊血寒天培地を調製し、25℃で3日間常温保存したものを使用した。
〔培養条件〕
各血液寒天培地に、上記種菌を「原液又はこの10倍希釈液を植菌後、好気培養又は嫌気条件下で、35℃、2日間培養して、コロニー数を目視にて測定した。
好気条件とは、窒素80%、酸素20%、嫌気条件とは、窒素80%、二酸化炭素10%、水素10%である。
微生物発育の評価基準は、微生物のコロニー数を計測し、コロニー数10以上の場合は「+」で示し、コロニー数1〜9の場合はコロニー数を「数」で示し、更に1未満の場合には「−」で示した。また、種菌の原液を「原液」と示し、原液の10倍希釈液を「−1」と示した。
また、本発明の血液寒天培地の保存温度条件は、血液寒天培地の品質劣化の抑制の点から、冷凍、低温及び室温の何れでもよいと考え、室温条件(特に20〜30℃)で血液寒天培地の離水抑制効果が高かった。また保存期間は、作業効率やロットの均一化の点から、1〜100日間であるのがよいと考えられた。
Claims (5)
- トレハロースを20〜40%(g/100mL)で含有する血液寒天培地。
- トレハロースの含有量が、20〜30%(g/100mL)である請求項1記載の血液寒天培地。
- トレハロースを20〜40%(g/100mL)で含有する血液寒天培地を−40℃〜40℃で保存することを特徴とする血液寒天培地の保存方法。
- 保存温度が、4〜35℃である請求項3記載の血液寒天培地の保存方法。
- 保存期間が、1〜100日間である請求項3又は4記載の血液寒天培地の保存方法。
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