JP2001327280A - 菌用凍結保存液 - Google Patents
菌用凍結保存液Info
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- JP2001327280A JP2001327280A JP2000190271A JP2000190271A JP2001327280A JP 2001327280 A JP2001327280 A JP 2001327280A JP 2000190271 A JP2000190271 A JP 2000190271A JP 2000190271 A JP2000190271 A JP 2000190271A JP 2001327280 A JP2001327280 A JP 2001327280A
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- bacterium
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、凍結菌を融解後、前培養なしで直
ちに保存効力試験、殺菌力試験、抗菌力試験等に供する
ための、保存後の菌生存率、活性が良好な菌用凍結保存
液を提供する。 【解決手段】 トレハロース及び／又はポリエチレング
リコールを有効成分として含有することを特徴とする菌
用凍結保存液とする。
ちに保存効力試験、殺菌力試験、抗菌力試験等に供する
ための、保存後の菌生存率、活性が良好な菌用凍結保存
液を提供する。 【解決手段】 トレハロース及び／又はポリエチレング
リコールを有効成分として含有することを特徴とする菌
用凍結保存液とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトレハロース又はポリエ
チレングリコール（好ましくはポリエチレングリコール
６００）を有効成分とする凍結保存用溶液に関する。さ
らに詳細には、緑膿菌、腸内細菌等グラム陰性菌を凍結
するときに起こる凍結障害を抑制し、生残率および活性
を維持したまま凍結保存が可能であり、融解後に培養す
ることなくそのまま試験に使用することができる凍結保
存液及びその方法に関する。
チレングリコール（好ましくはポリエチレングリコール
６００）を有効成分とする凍結保存用溶液に関する。さ
らに詳細には、緑膿菌、腸内細菌等グラム陰性菌を凍結
するときに起こる凍結障害を抑制し、生残率および活性
を維持したまま凍結保存が可能であり、融解後に培養す
ることなくそのまま試験に使用することができる凍結保
存液及びその方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】微生
物の貯蔵・保存には手間と時間がかかり、また、貯蔵・
保存中にその形態、活性が変化してくる。特に薬品、化
粧品、日用品等の保存効力試験、殺菌力試験、抗菌力試
験等では、生菌数だけでなく活性をも維持し、長期間試
験の再現性を維持し続けることが困難である微生物がし
ばしば認められる。微生物の生菌数、活性共に安定に保
存することは、これらの業務に携わる者にとって重要な
課題となっている。更には、これらの製品の試験では、
使用時に菌の前培養から始めるため、即日試験を開始す
るのは困難であるのが現状である。長期貯蔵・保存のた
めの一般的な手段として、まず凍結乾燥法がある。この
方法は、菌の安定性確保のためには有用な手法であると
言われているが、保存試料の調製に手間がかかり、多検
体処理には適さない、あるいは試験を行うときには、前
に述べた様に菌の前培養から始めなければならないとい
うような煩雑さある。凍結乾燥法と同様に有力な手法と
して、凍結保存法がある。しかしながら、凍結は微生物
にとって過酷であり、凍結および融解過程で障害を受
け、その生残率及び活性が低下することが多い。例え
ば、一般的に塩の配合は、微生物の安定性に悪影響を及
ぼすため好ましくないと言われており、また培地成分の
配合は、たとえ生残率及び活性を安定に維持出来たとし
ても、我々が目的としている保存効力試験、殺菌力試
験、抗菌力試験等の試験結果に直接影響を及ぼす場合が
あることから、これについても望ましいものではない。
そこで、微生物の凍結障害を抑制するための保護剤及び
凍結方法の開発が行われ、グリセリンが有用であること
が見出された（Ｐｏｌｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、１６４巻、
６６６頁、１９４９）。その後も凍害を抑制するための
保護剤の検討が行われている。例えば、特表平４−５０
１１１２では、動物細胞の凍結保存のため、保護剤とし
てトレハロースを用いているが、保存方法が凍結保存法
ではなく、凍結乾燥法である。特開平５−７４８９また
は特開平６−４６８４０は共に、動物細胞を対象とし、
保存方法は凍結保存であり、保護剤としてトレハロース
等またはポリエチレングリコール等を使用しているもの
の、共に基礎培地中にこれらの保護剤を添加したもので
ある。また微生物を対象としたものでは、特開平７−９
９９６５があるが、乳酸菌や大腸菌、枯草菌、酵母等の
生残率を向上させるために添加する保護剤としてイヌリ
ン型フルクタンを用いる方法が確立されている。以上従
来技術について述べてきたが、これらの方法はいずれ
も、生残率の向上は確認しているものの、長期保存によ
る活性の安定化についての検討、更には凍結菌を融解
後、前培養なしで直ちに保存効力試験、殺菌力試験、抗
菌力試験等に供するための検討が十分になされていな
い。
物の貯蔵・保存には手間と時間がかかり、また、貯蔵・
保存中にその形態、活性が変化してくる。特に薬品、化
粧品、日用品等の保存効力試験、殺菌力試験、抗菌力試
験等では、生菌数だけでなく活性をも維持し、長期間試
験の再現性を維持し続けることが困難である微生物がし
ばしば認められる。微生物の生菌数、活性共に安定に保
存することは、これらの業務に携わる者にとって重要な
課題となっている。更には、これらの製品の試験では、
使用時に菌の前培養から始めるため、即日試験を開始す
るのは困難であるのが現状である。長期貯蔵・保存のた
めの一般的な手段として、まず凍結乾燥法がある。この
方法は、菌の安定性確保のためには有用な手法であると
言われているが、保存試料の調製に手間がかかり、多検
体処理には適さない、あるいは試験を行うときには、前
に述べた様に菌の前培養から始めなければならないとい
うような煩雑さある。凍結乾燥法と同様に有力な手法と
して、凍結保存法がある。しかしながら、凍結は微生物
にとって過酷であり、凍結および融解過程で障害を受
け、その生残率及び活性が低下することが多い。例え
ば、一般的に塩の配合は、微生物の安定性に悪影響を及
ぼすため好ましくないと言われており、また培地成分の
配合は、たとえ生残率及び活性を安定に維持出来たとし
ても、我々が目的としている保存効力試験、殺菌力試
験、抗菌力試験等の試験結果に直接影響を及ぼす場合が
あることから、これについても望ましいものではない。
そこで、微生物の凍結障害を抑制するための保護剤及び
凍結方法の開発が行われ、グリセリンが有用であること
が見出された（Ｐｏｌｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、１６４巻、
６６６頁、１９４９）。その後も凍害を抑制するための
保護剤の検討が行われている。例えば、特表平４−５０
１１１２では、動物細胞の凍結保存のため、保護剤とし
てトレハロースを用いているが、保存方法が凍結保存法
ではなく、凍結乾燥法である。特開平５−７４８９また
は特開平６−４６８４０は共に、動物細胞を対象とし、
保存方法は凍結保存であり、保護剤としてトレハロース
等またはポリエチレングリコール等を使用しているもの
の、共に基礎培地中にこれらの保護剤を添加したもので
ある。また微生物を対象としたものでは、特開平７−９
９９６５があるが、乳酸菌や大腸菌、枯草菌、酵母等の
生残率を向上させるために添加する保護剤としてイヌリ
ン型フルクタンを用いる方法が確立されている。以上従
来技術について述べてきたが、これらの方法はいずれ
も、生残率の向上は確認しているものの、長期保存によ
る活性の安定化についての検討、更には凍結菌を融解
後、前培養なしで直ちに保存効力試験、殺菌力試験、抗
菌力試験等に供するための検討が十分になされていな
い。
【０００３】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記凍結・融解過程における微生物の死滅を抑制し、なお
かつ活性をも維持する凍害防止剤の探索を行った結果、
トレハロース又はポリエチレングリコール（好ましくは
ポリエチレングリコール６００）を希釈液中の凍害防止
剤として使用することにより、微生物特にグラム陰性菌
（好ましくは緑膿菌、腸内細菌）に対して、凍結保存・
融解時における微生物の死滅及び活性の低下を著しく抑
制し、また融解後に微生物を培養することなく懸濁液を
そのまま試験に使用可能であることを見出し、本発明を
完成させた。
記凍結・融解過程における微生物の死滅を抑制し、なお
かつ活性をも維持する凍害防止剤の探索を行った結果、
トレハロース又はポリエチレングリコール（好ましくは
ポリエチレングリコール６００）を希釈液中の凍害防止
剤として使用することにより、微生物特にグラム陰性菌
（好ましくは緑膿菌、腸内細菌）に対して、凍結保存・
融解時における微生物の死滅及び活性の低下を著しく抑
制し、また融解後に微生物を培養することなく懸濁液を
そのまま試験に使用可能であることを見出し、本発明を
完成させた。
【０００４】すなわち、本発明は、トレハロース及び／
又はポリエチレングリコール（好ましくはポリエチレン
グリコール６００）を有効成分として含有することを特
徴とする微生物特にグラム陰性菌（好ましくは緑膿菌、
腸内細菌）のための凍結保存液及び保存方法を提供する
ものである。
又はポリエチレングリコール（好ましくはポリエチレン
グリコール６００）を有効成分として含有することを特
徴とする微生物特にグラム陰性菌（好ましくは緑膿菌、
腸内細菌）のための凍結保存液及び保存方法を提供する
ものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明に於ける凍結保存液は、ト
レハロース及び／又はポリエチレングリコールを、凍害
防止剤として含有する。 ポリエチレングリコールは、
平均分子量が２００〜２、０００のものが好ましく、最
も好ましくは平均分子量６００のもの（ＰＥＧ６００）
である。これらの含有量は、好ましくは凍結保存液中５
〜１５質量％、特に好ましくは１０質量％である。この
範囲で、本発明の効果が良好に得られる。本発明の残部
は、水であることが好ましい。 水は、精製水を用いる
ことが好ましい。
レハロース及び／又はポリエチレングリコールを、凍害
防止剤として含有する。 ポリエチレングリコールは、
平均分子量が２００〜２、０００のものが好ましく、最
も好ましくは平均分子量６００のもの（ＰＥＧ６００）
である。これらの含有量は、好ましくは凍結保存液中５
〜１５質量％、特に好ましくは１０質量％である。この
範囲で、本発明の効果が良好に得られる。本発明の残部
は、水であることが好ましい。 水は、精製水を用いる
ことが好ましい。
【０００６】本発明の凍結保存液には、通常の凍結保存
液に含有される他の凍害防止剤、グリセリンやエチレン
グリコール、ジエチレングリコールなどの多価アルコー
ル等を、本発明の効果を損なわない程度に含有して良い
が、好ましくはトレハロース及び／又はポリエチレング
リコール、及び水のみからなる組成物である。本発明の
凍結保存液を用いて凍結保存する菌としては、特に制限
はないが、グラム陰性菌、好ましくは緑膿菌、腸内細菌
に対して優れた効果が得られる。凍結保存液に添加する
菌は、平板培地などで培養された対数増殖期にあるコロ
ニーを用いることが好ましい。保存液に添加する量は、
好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬであ
る。
液に含有される他の凍害防止剤、グリセリンやエチレン
グリコール、ジエチレングリコールなどの多価アルコー
ル等を、本発明の効果を損なわない程度に含有して良い
が、好ましくはトレハロース及び／又はポリエチレング
リコール、及び水のみからなる組成物である。本発明の
凍結保存液を用いて凍結保存する菌としては、特に制限
はないが、グラム陰性菌、好ましくは緑膿菌、腸内細菌
に対して優れた効果が得られる。凍結保存液に添加する
菌は、平板培地などで培養された対数増殖期にあるコロ
ニーを用いることが好ましい。保存液に添加する量は、
好ましくは１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬであ
る。
【０００７】次に、凍結保存菌の調製方法について説明
する。菌は、任意の平板培地で培養した対数増殖期にあ
るコロニーを使用し、予め滅菌した凍害防止剤を含む凍
結保存液に菌を懸濁させ、１×１０８〜１×１０１０Ｃ
ＦＵ／ｍＬとなる様に菌液を調製する。これを−８０℃
以下のフリーザーで急速凍結し、凍結保存菌とする。凍
結保存菌はそのまま−８０℃以下で保管する。使用する
際は、凍結保存液を３０℃〜４０℃の温浴中で軽く振り
ながら急速融解させ、前培養を行わずに各種試験に供す
る。
する。菌は、任意の平板培地で培養した対数増殖期にあ
るコロニーを使用し、予め滅菌した凍害防止剤を含む凍
結保存液に菌を懸濁させ、１×１０８〜１×１０１０Ｃ
ＦＵ／ｍＬとなる様に菌液を調製する。これを−８０℃
以下のフリーザーで急速凍結し、凍結保存菌とする。凍
結保存菌はそのまま−８０℃以下で保管する。使用する
際は、凍結保存液を３０℃〜４０℃の温浴中で軽く振り
ながら急速融解させ、前培養を行わずに各種試験に供す
る。
【０００８】
【実施例】次に、本発明の実施例を示すが、これはあく
までも例示であって、本発明はこれに限定されるもので
はない。
までも例示であって、本発明はこれに限定されるもので
はない。
【０００９】（実施例１）環境から分離した緑膿菌（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）あるい
は発酵研究所から入手した緑膿菌標準菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ１３２７
５）をＴＳＡ（トリフ゜トソイカンテン）平板培地に塗
抹し、３０℃、２４〜４８時間前培養を行った。培養
後、そのコロニーをかきとり、滅菌済みの凍結保存液に
微生物の濃度が１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ
となるように均一に懸濁させ、以下の実験に供した。 （イ）生残菌数測定；まず凍結前の菌懸濁液の生菌数を
測定した。次に、懸濁液を各２ｍｌずつクライオバイア
ル（ＩＷＡＫＩ ＧＬＡＳＳ製）に分注し、ディープフ
リーザーにて−９０℃で６カ月間凍結保存した。保存
後、それぞれ３７℃で急速融解し、その生菌数を測定し
た。緑膿菌（分離菌）の結果は表１に、緑膿菌（標準
菌）の結果は表２に示した。各保存液において、生残率
が４０％以上のものを○、それ以外を×とした。結果よ
り、緑膿菌の菌数低下を抑制出来る保護剤はポリエチレ
ングリコールあるいはトレハロースであることが明らか
である。
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）あるい
は発酵研究所から入手した緑膿菌標準菌（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ１３２７
５）をＴＳＡ（トリフ゜トソイカンテン）平板培地に塗
抹し、３０℃、２４〜４８時間前培養を行った。培養
後、そのコロニーをかきとり、滅菌済みの凍結保存液に
微生物の濃度が１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ
となるように均一に懸濁させ、以下の実験に供した。 （イ）生残菌数測定；まず凍結前の菌懸濁液の生菌数を
測定した。次に、懸濁液を各２ｍｌずつクライオバイア
ル（ＩＷＡＫＩ ＧＬＡＳＳ製）に分注し、ディープフ
リーザーにて−９０℃で６カ月間凍結保存した。保存
後、それぞれ３７℃で急速融解し、その生菌数を測定し
た。緑膿菌（分離菌）の結果は表１に、緑膿菌（標準
菌）の結果は表２に示した。各保存液において、生残率
が４０％以上のものを○、それ以外を×とした。結果よ
り、緑膿菌の菌数低下を抑制出来る保護剤はポリエチレ
ングリコールあるいはトレハロースであることが明らか
である。
【００１０】
【表１】
【００１１】
【表２】
【００１２】（ロ）活性評価；凍結前と保存後の菌につ
いて、活性の安定性を評価した。凍結前の菌懸濁液をモ
デル組成に対して１％接種し、以下日局保存効力試験に
準じて、１、４、７、１４日後にその生残菌数を測定し
た。次いで保存１２ヶ月後の凍結菌液を、３７℃の温浴
中で軽く振りながら急速融解し、速やかにモデル組成に
１％接種して、同様に経時で生残菌数を測定した。評価
は、菌の死滅日数即ち、検出限界以下（＜１０ｃｆｕ／
ｇ）となる日を比較した。モデル組成の組成表は、表３
に示した。活性評価結果（表４，５）及び生残率測定結
果（表１、２）を合わせて判断すると、両者共に問題の
認められない凍害防止剤は、ポリエチレングリコールま
たはトレハロースであることは明らかであり、これらの
凍結菌液では、前培養なしで各種試験に使用可能である
と判断出来る。
いて、活性の安定性を評価した。凍結前の菌懸濁液をモ
デル組成に対して１％接種し、以下日局保存効力試験に
準じて、１、４、７、１４日後にその生残菌数を測定し
た。次いで保存１２ヶ月後の凍結菌液を、３７℃の温浴
中で軽く振りながら急速融解し、速やかにモデル組成に
１％接種して、同様に経時で生残菌数を測定した。評価
は、菌の死滅日数即ち、検出限界以下（＜１０ｃｆｕ／
ｇ）となる日を比較した。モデル組成の組成表は、表３
に示した。活性評価結果（表４，５）及び生残率測定結
果（表１、２）を合わせて判断すると、両者共に問題の
認められない凍害防止剤は、ポリエチレングリコールま
たはトレハロースであることは明らかであり、これらの
凍結菌液では、前培養なしで各種試験に使用可能である
と判断出来る。
【００１３】
【表３】
【００１４】
【表４】
【００１５】
【表５】
【００１６】
【表６】
【００１７】（実施例２）環境から分離した腸内細菌
（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ
ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏ
ａｃａｅ）についても、実施例１と同様に試験を行っ
た。ただし菌液の調製は、まず各細菌について実施例１
に従い、その濃度が１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／
ｍｌとなるように均一に懸濁させた後、各菌液を等量混
合し、凍結保存に供した。緑膿菌だけでなく腸内細菌に
ついても、ポリエチレングリコールが凍害防止剤として
有用であることを明らかにすることが出来た。
（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ
ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏ
ａｃａｅ）についても、実施例１と同様に試験を行っ
た。ただし菌液の調製は、まず各細菌について実施例１
に従い、その濃度が１×１０８〜１×１０１０ＣＦＵ／
ｍｌとなるように均一に懸濁させた後、各菌液を等量混
合し、凍結保存に供した。緑膿菌だけでなく腸内細菌に
ついても、ポリエチレングリコールが凍害防止剤として
有用であることを明らかにすることが出来た。
【００１８】
【表７】
【００１９】
【表８】
【００２０】
【発明の効果】本発明の凍結保存液を用いれば、微生物
特にグラム陰性菌（好ましくは緑膿菌、腸内細菌）を凍
結保存する際に、凍結障害を抑制し、その生残率及び活
性（ここで活性とは、日本薬局方・参考情報・保存効力
試験における菌の死滅速度のことをいう。）を維持し長
期保存することが可能であり、なおかつ融解後に微生物
特にグラム陰性菌（好ましくは緑膿菌、腸内細菌）を前
培養することなく、そのまま保存効力試験、殺菌力試
験、抗菌力試験等に使用することができる。
特にグラム陰性菌（好ましくは緑膿菌、腸内細菌）を凍
結保存する際に、凍結障害を抑制し、その生残率及び活
性（ここで活性とは、日本薬局方・参考情報・保存効力
試験における菌の死滅速度のことをいう。）を維持し長
期保存することが可能であり、なおかつ融解後に微生物
特にグラム陰性菌（好ましくは緑膿菌、腸内細菌）を前
培養することなく、そのまま保存効力試験、殺菌力試
験、抗菌力試験等に使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:37） Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:385） Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:37） Ｃ１２Ｒ 1:37） (72)発明者 田中 賢介 東京都墨田区本所一丁目３番７号 ライオ ン株式会社内 Ｆターム(参考） 4B065 AA40X AA42X BD09 BD12 BD26 BD27 BD36 CA46 CA60
Claims (5)
- 【請求項１】トレハロース及び／又はポリエチレングリ
コールを有効成分として含有することを特徴とする菌用
凍結保存液。 - 【請求項２】凍結保存された菌を、融解後培養すること
なく試験に使用するための菌用凍結保存液であって、該
凍結保存液がトレハロース及び／又はポリエチレングリ
コールを有効成分として含有することを特徴とする菌用
凍結保存液。 - 【請求項３】トレハロース及び／又はポリエチレングリ
コール、及び水のみからなる請求項１〜２に記載の菌用
凍結保存液。 - 【請求項４】トレハロース及び／又はポリエチレングリ
コールを有効成分とする凍結保存液に保存された菌であ
ることを特徴とする凍結保存菌。 - 【請求項５】菌がグラム陰性菌であることを特徴とする
請求項４の凍結保存菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000190271A JP2001327280A (ja) | 2000-05-23 | 2000-05-23 | 菌用凍結保存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000190271A JP2001327280A (ja) | 2000-05-23 | 2000-05-23 | 菌用凍結保存液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001327280A true JP2001327280A (ja) | 2001-11-27 |
Family
ID=18689768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000190271A Pending JP2001327280A (ja) | 2000-05-23 | 2000-05-23 | 菌用凍結保存液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001327280A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016521704A (ja) * | 2013-06-05 | 2016-07-25 | レビオティクス インコーポレイテッドＲｅｂｉｏｔｉｘ，Ｉｎｃ． | 微生物叢回復療法（ｍｒｔ）、組成物および製造方法 |
| JP2017110001A (ja) * | 2015-12-16 | 2017-06-22 | 株式会社 資生堂 | タブレット型凍結乾燥化粧料 |
| US11491193B2 (en) | 2010-08-04 | 2022-11-08 | Finch Therapeutics Holdings Llc | Compositions for fecal floral transplantation and methods for making and using them and devices for delivering them |
| US11642381B2 (en) | 2015-06-09 | 2023-05-09 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture |
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2000
- 2000-05-23 JP JP2000190271A patent/JP2001327280A/ja active Pending
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