CN112752505A - 用于细胞和/或组织的运输和/或冷冻保存的组合物 - Google Patents

Abstract

在许多方面，提供用于细胞、组织或器官的运输和/或冷冻保存的组合物。运输和/或冷冻保存组合物包括至少柚皮素、缓冲系统和糖组分。在一些实施方案中，细胞、组织或器官是人毛囊、来源于人毛囊的细胞或来源于尿的细胞。

Description

用于细胞和/或组织的运输和/或冷冻保存的组合物

在先申请的交叉引用

本申请要求于2018年7月30日提交且名称为“用于细胞和/或组织的运输和/或冷冻保存的组合物”的美国临时专利申请号62/711,808(其内容通过引用被整体并入本文)的优先权。

发明的领域

本说明书大体上涉及用于活细胞、组织和器官的运输和/或冷冻保存的组合物。特别地，本说明书涉及包括柚皮素、缓冲系统和糖组分的组合物，该组合物用于从非侵入性来源收集的活的人和动物细胞、组织和器官的运输和/或冷冻保存。

发明的背景

目前存在许多用于细胞、组织和器官的运输和冷冻保存的组合物。例如，已经在低温温度(例如，4-8℃)在液体组合物中进行活细胞、组织和器官的运输和存储，该液体组合物被配制以在运输过程中保持渗透平衡，最小化温度压力，并且降低细胞凋亡和/或坏死性细胞死亡。用于细胞的低温存储的组合物的现有技术实例包含HypoThermosol^TM、AQIX^TM和Viaspan^TM。虽然这些以及其他现有技术组合物可能已经有效地用作许多不同细胞、组织和器官类型的存储介质，但这些组合物并未针对运输(尤其是通过邮递服务或邮政服务)进行优化。运输挑战可能包含(除其他之外)：温度波动，暴露于极端温度范围，颠簸和振动，邮递、邮政和信使递送的延迟；进口/出口延迟；海关延迟；以及物流挑战(例如，递送至边远地区)。从非侵入性来源获取的细胞、组织和器官(如毛囊、来源于毛囊的细胞和尿源性细胞)受到这样的运输挑战的影响。这些运输挑战通常造成次优的细胞活力(特别是在大于24小时的时间段的运输后)。通常，运输将降低或破坏细胞、组织和器官对于冷冻保存、移植和/或治疗用途的适用性。特别地，现有技术组合物不旨在与小细胞和组织(尤其是毛囊)使用。此外，最初的Hypothermosol^TM(US005405742A和US006045990A)和AQIX^TM(EP2175718B1)专利组合物旨在用作低温血液替代品，以最小化血容量减少和再灌注损伤(包含在静脉内和血管外输注程序中的使用)。

细胞、组织和器官可以被运输以用于冷冻保存。冷冻保存是极低温度(低至-196℃(利用例如液氮))以便以生物非活性状态存储细胞、组织和器官以保存它们以供将来使用的应用。在现有技术中，保护细胞免于冷冻的液体组合物已经用于在这些低温下存储细胞、组织和器官。现有技术中存在这些冷冻保存组合物的许多变型，并且许多含有用于防护细胞的生物构建体免于冰晶损伤的冷冻保护剂。此外，现有技术的冷冻保存溶液还含有有助于生物材料从解冻中恢复的成分(如细胞凋亡调节剂)。现有技术中的冷冻保存溶液的实例包含CryoStor^TM、CELLBANKER^TM、Syth-a-Freeze^TM和mFreSR^TM。

尽管CryoStor^TM、CELLBANKER^TM、Syth-a-Freeze^TM和mFreSR^TM具有可行地冷冻保存细胞、组织和器官的能力，但目前可用的组合物尚未针对从非侵入性细胞来源获取的细胞、组织和器官(如毛囊、来源于毛囊来源的细胞和尿源性细胞)的冷冻保存进行优化。目前可用的组合物产生次优的解冻后活力(尤其是如果细胞、组织和器官在冷冻保存之前经历了通过邮递服务或邮政服务运输超过24小时的话)。

除上述之外，现有技术中用于细胞、组织和器官的运输和冷冻保存的组合物通常含有作为关键营养物质(如脂质、维生素、激素和微量元素)来源的化学上未定义的血清和/或动物组分。已经报道，与这样的组合物中的化学上未定义的血清和/或动物组分的使用相关的风险包含病原体污染和批次可变性。此外，如果将在人中使用这样的组合物中含有的细胞、组织和器官，则可以发生免疫应答或免疫排斥，从而使细胞、组织和器官在治疗上不可用，并且可能对人受者造成损伤。降低运输和冷冻保存组合物中化学上未定义的血清和/或动物组分的存在对于帮助保持细胞、组织和器官的治疗和临床相关性而言是重要的。

此外，现有技术运输和冷冻保存组合物含有10％(v/v)二甲基亚砜(“DMSO”)作为冷冻保护剂是常见的。虽然DMSO是有效的冷冻保护剂，但还已知其在这样的浓度下对细胞、组织和器官具有毒性。降低运输和冷冻保存组合物中使用的DMSO的量可以有助于降低毒性并且避免折损细胞、组织和器官。此外，降低这些组合物中的DMSO的量可以有助于避免破坏这些细胞、组织和器官对于移植应用和/或治疗应用的适用性。

发明的概述

在许多方面，实施方案涉及包括柚皮素、缓冲系统和糖组分的组合物，其中组合物用于细胞、组织或器官的运输。在一些实施方案中，细胞、组织或器官是人毛囊、来源于人毛囊的细胞或来源于尿的细胞。

根据一些实施方案，运输组合物中柚皮素的浓度为约0.01μM至约10μM。根据其他实施方案，运输组合物中柚皮素的浓度为约0.01μM至约0.25μM。

根据一些实施方案，运输组合物的缓冲系统包括：约15mM至约45mM的合成生物缓冲液；约2mM至约20mM的碳酸氢盐；约6mM至约25mM的磷酸氢盐；或其组合。根据其他实施方案，运输组合物的缓冲系统包括：约15mM至约45mM的合成生物缓冲液；约3mM至约9mM的碳酸氢盐；约10mM至约15mM的磷酸氢盐；或其组合。

根据一些实施方案，运输组合物的糖组分包括约2mM至约25mM的D-葡萄糖。根据其他实施方案，运输组合物的糖组分包括约9mM至约15mM的D-葡萄糖。

根据一些实施方案，运输组合物还包括：约20mM至约120mM的钠离子；约0.01mM至约1mM的钙离子；约10mM至约70mM的氯离子；约2mM至约12mM的钾离子；约0.1mM至约1mM的镁离子；约0.2mM至约10mM的丙氨酰-谷氨酰胺；约0.01μM至约10μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；或其组合。根据一些实施方案，运输组合物包括：约70mM至约90mM的钠离子；约0.03mM至约1mM的钙离子；约40mM至约60mM的氯离子；约2mM至约5mM的钾离；约0.4mM至约0.7mM的镁离子；约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺；约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；或其组合。

根据一些实施方案，运输组合物还包括：约0.1μg/mL至约20μg/mL的胰岛素；约1μg/mL至约20μg/mL的转铁蛋白；约5nM至约50nM的亚硒酸钠；或其组合。根据一些实施方案，运输组合物包括：约8μg/mL至约12μg/mL的胰岛素；约3μg/mL至约7μg/mL的转铁蛋白；约20nM至约40nM的亚硒酸钠；或其组合。

根据一些实施方案，运输组合物还包括：约10单位/mL至约200单位/mL的青霉素；约0.01mg/mL至约1mg/mL的链霉素；或其组合。根据一些实施方案，运输组合物包括：约80单位/mL至约120单位/mL的青霉素；约0.08mg/mL至约0.2mg/mL的链霉素；或其组合。

在一方面，运输组合物包括：约0.01μM至约0.25μM的柚皮素；约15mM至约45mM的合成生物缓冲液；约3mM至约9mM的碳酸氢盐；约10mM至约15mM的磷酸氢盐；约9mM至约15mM的D-葡萄糖；约70mM至约90mM的钠离子；约0.03mM至约1mM的钙离子；约40mM至约60mM的氯离子；约2mM至约5mM的钾离子；约0.4mM至约0.7mM的镁离子；约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺；以及约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸。

在一些实施方案中，运输组合物可以在细胞、组织或器官被冷冻保存之前用于细胞、组织和器官的运输。

在许多方面，实施方案涉及包括柚皮素、缓冲系统和糖组分的组合物，其中组合物用于细胞、组织或器官的冷冻保存。在一些实施方案中，细胞、组织或器官是人毛囊、来源于人毛囊的细胞或来源于尿的细胞。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物中柚皮素的浓度为约0.01μM至约10μM。根据其他实施方案，冷冻保存组合物中柚皮素的浓度为约0.01μM至约0.25μM。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物的缓冲系统包括：约15mM至约45mM的合成生物缓冲液；约2mM至约20mM的碳酸氢盐；约6mM至约25mM的磷酸氢盐；或其组合。根据其他实施方案，冷冻保存组合物的缓冲系统包括：约15mM至约45mM的合成生物缓冲液；约3mM至约9mM的碳酸氢盐；约10mM至约15mM的磷酸氢盐；或其组合。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物的糖组分包括约2mM至约25mM的D-葡萄糖。根据其他实施方案，冷冻保存组合物的糖组分包括约9mM至约15mM的D-葡萄糖。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物还包括：约20mM至约120mM的钠离子；约0.01mM至约1mM的钙离子；约10mM至约70mM的氯离子；约2mM至约12mM的钾离子；约0.1mM至约1mM的镁离子；约0.2mM至约10mM的丙氨酰-谷氨酰胺；约0.01μM至约10μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；或其组合。根据一些实施方案，冷冻保存组合物包括：约70mM至约90mM的钠离子；约0.03mM至约1mM的钙离子；约40mM至约60mM的氯离子；约2mM至约5mM的钾离子；约0.4mM至约0.7mM的镁离子；约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺；约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；或其组合。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物还包括：约0.1μg/mL至约20μg/mL的胰岛素；约1μg/mL至约20μg/mL的转铁蛋白；约5nM至约50nM的亚硒酸钠；或其组合。根据一些实施方案，冷冻保存组合物包括：约8μg/mL至约12μg/mL的胰岛素；约3μg/mL至约7μg/mL的转铁蛋白；约20nM至约40nM的亚硒酸钠；或其组合。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物还包括：约10单位/mL至约200单位/mL的青霉素；约0.01mg/mL至约1mg/mL的链霉素；或其组合。根据一些实施方案，冷冻保存组合物包括：约80单位/mL至约120单位/mL的青霉素；约0.08mg/mL至约0.2mg/mL的链霉素；或其组合。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物还包括：约0.001g/mL至约0.2g/mL的葡聚糖40；约10mM至约60mM的蔗糖；约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的二甲基亚砜；或其组合。根据一些实施方案，冷冻保存组合物包括：约0.03g/mL至约0.07g/mL的葡聚糖40；约20mM至40mM的蔗糖；约2.5％(v/v)至约10％(v/v)的二甲基亚砜；或其组合。

在一方面，冷冻保存组合物包括：约0.01μM至约0.25μM的柚皮素；约15mM至约45mM的合成生物缓冲液；约3mM至约9mM的碳酸氢盐；约10mM至约15mM的磷酸氢盐；约9mM至约15mM的D-葡萄糖；约70mM至约90mM的钠离子；约0.03mM至约1mM的钙离子；约40mM至约60mM的氯离子；约2mM至约5mM的钾离子；约0.4mM至约0.7mM的镁离子；约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺；约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸；约0.03g/mL至约0.07g/mL的葡聚糖40；约20mM至40mM的蔗糖；以及少于约5％(v/v)的二甲基亚砜。

在一些实施方案中，冷冻保存组合物可以在细胞、组织或器官已经被运输之后用于细胞、组织和器官的冷冻保存。

附图的简要说明

为了更好地理解本文所描述的各种实施方式并且更清楚地示出它们如何被实施，现在将参考附图(仅作为示例)，其中：

图1描绘了流程图，该流程图示说明根据非限制性实施方案的可以用于运输和冷冻保存细胞、组织和器官的流水线的实例。

图2描绘了图示说明在各种运输组合物中运输两天之后人拔除的毛囊的百分比活力的图。

图3描绘了图示说明随着时间推移在各种运输组合物中人拔除的毛囊的相对活力(相比于新鲜对照)的图。

图4描绘了图示说明在各种冷冻保存组合物中冷冻保存五天之后人拔除的毛囊的百分比活力的图。

图5描绘了图示说明在各种组合物中运输两天且冷冻保存五天之后人拔除的毛囊的百分比活力(相对于新鲜对照)的图。

图6描绘了含有在化学上定义的无血清条件下从新鲜毛囊中长出的角化细胞的实例的相片。

发明的详细说明

通过举例说明本发明的原理和方面的特定实施方案的一个或多个实施例来提供以下说明及其中描述的实施方案。提供这些实施例是出于解释而非限制本发明的这些原理的目的。除非另有定义，否则本文所使用的全部术语和短语包含该术语和短语在本领域中已经获得的含义，除非从使用该术语或短语的上下文中清楚地表明相反的含义或者相反的含义从使用该术语或短语的上下文中是显然显而易见的。

如本文所使用的，相关领域的技术人员通常可以理解术语“包括”意为权利要求中提及的所述特征、组分或组的存在，但并不排除一个或更多个其他特征、组分或组的存在或增加。

如本文所使用的，相关领域的技术人员通常可以理解术语“运输”意为物品(如细胞器、细胞、组织、细胞外基质、器官、或易受到由不受调控的化学动力学引起的损伤影响的其他生物构建体)从一个位置到另一个位置的运动。本文所使用的术语“运输”还可以包含物品(如细胞器、细胞、组织、细胞外基质、器官、或易受到由不受调控的化学动力学引起的损伤影响的其他生物构建体)的短期存储。运输可以包含通过邮递运输。在运输过程中可能面临许多挑战，挑战包含(除其他之外)：温度波动，暴露于极端温度范围，颠簸和振动，邮递、邮政和信使递送的延迟；进口/出口延迟；海关延迟；以及物流挑战(例如，递送至边远地区)。根据一些实施方案，提供可以用于细胞、组织和器官的运输的组合物。术语“运输组合物”可以(但无需必须)在本文中用于指代这样的组合物。

如本文所使用的，相关领域的技术人员通常可以理解术语“冷冻保存”意为其中通过冷却至极低的温度(通常-80℃(使用固态二氧化碳)或-196℃(使用液氮))保存细胞器、细胞、组织、细胞外基质、器官、或易受到由不受调控的化学动力学引起的损伤影响的其他生物构建体的过程。根据一些实施方案，提供可以用于细胞、组织和器官的冷冻保存的组合物。术语“冷冻保存组合物”可以(但无需必须)在本文中用于指代这样的组合物。

如本文所使用的，术语“细胞、组织和器官”可以指细胞器、细胞、组织、细胞外基质、器官或其他活的生物构建体。根据一些实施方案，细胞、组织和器官可以是人。根据其他实施方案，细胞、组织和器官可以是非人的细胞、组织和器官。非人的细胞、组织和器官可以包含哺乳动物细胞、组织和器官，并且特别地可以来源于啮齿动物。根据一些实施方案，细胞、组织和器官从非侵入性来源获取，并且可以包含人拔除的毛囊、来源于毛囊的细胞(如角化细胞)、尿源性细胞和颊细胞。根据一些实施方案，已经在本发明的运输和/或冷冻保存组合物中运输和/或冷冻保存的细胞、组织和器官可以用于研究和/或临床和治疗用途。在本发明的一些实施方案中，运输和/或冷冻保存组合物的使用造成良好的回收率和健康的细胞群体以供将来使用(例如，在研究应用中或者作为基于细胞的治疗剂的起始材料)。

如本文所使用的，相关领域的技术人员通常可以将术语“有效量”理解为足以保持细胞、组织或器官的活力或者限制细胞、组织或器官的活力降低的量。在本发明的实施方案的情况下，有效量可以包含(但不限于)保持已经经历运输和/或冷冻保存的细胞、组织或器官的活力或者限制已经经历运输和/或冷冻保存的细胞、组织或器官的活力降低的量。

本发明涉及以下发现：柚皮素可以有助于保持运输和/或冷冻保存组合物中的细胞、组织和器官的活力或者限制运输和/或冷冻保存组合物中的细胞、组织和器官的活力降低。柚皮素是主要发现于柑橘类水果中的黄烷酮。本领域技术人员可以理解，柚皮素显示出一些抗氧化活性，这可以有助于向细胞、组织和器官提供免于损伤自由基的保护。柚皮素可以具有非常适合于细胞、组织和器官的运输和/或冷冻保存的附加性质。例如，柚皮素已经被报道展现出抗真菌性质、抗细菌性质和抗病毒性质(参见，例如，参考文献[4]和参考文献[5])，这对于防止不期望的外部污染并且减少运输和/或冷冻保存组合物中对于抗生素的需要而言是有用的。本领域技术人员可以理解，在组合物中，低浓度的柚皮素可以诱导角化细胞增殖(参见，例如，参考文献[6])，从而允许从运输和冷冻保存更快地恢复。此外，柚皮素被报道为热休克蛋白的诱导剂(参见，例如，参考文献[7])，从而潜在地在运输和冷冻保存过程中生成免于温度突然变化(热或冷)的保护。已经在临床试验中显示出柚皮素的有前景的药物用途(参见，例如，参考文献[21])。

根据本发明的一些实施方案，提供包括柚皮素、缓冲系统和糖组分的组合物。这些组合物可以用于细胞、组织和器官的运输和/或冷冻保存。优选地，本发明的组合物被配制以模拟细胞环境，保护细胞、组织和器官免于损伤，并且改善运输和/或冷冻保存之后细胞、组织和器官的活力、恢复和/或可用性。在本发明的一些实施方案中，以使角化细胞的活力最优的浓度提供化合物的组合物。所公开的运输和/或冷冻保存组合物的全部单独的组分优选地(但无需必须)为药用级别的和/或不含动物组分的。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物包含浓度为从约0.01μM至约10μM的柚皮素。根据一些实施方案，组合物包含浓度为从约0.01μM至约0.25μM的柚皮素。根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物可以含有与柚皮素组合的至少一种其他类黄酮。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物包含缓冲系统。根据一些实施方案，缓冲系统将使组合物能够在低温条件下在CO₂孵育器外部保持大约7.4的生理相关性pH。在一方面，缓冲系统可以包括合成生物缓冲液(如HEPES或BES)。预期具有与HEPES相似的pH的任何适合的合成生物缓冲液。合成生物缓冲液的浓度可以为约15mM至约45mM。

根据一些实施方案，所描述的运输和/或冷冻保存的缓冲系统可以可替代地或还包括浓度为约2mM至约20mM的碳酸氢盐。优选地，碳酸氢盐的浓度为约3mM至约9mM。

根据一些实施方案，所描述的运输和/或冷冻保存的缓冲系统可以可替代地或还包括浓度为约6mM至约25mM的磷酸氢盐。优选地，磷酸氢盐的浓度为约10mM至约15mM。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物包含糖组分。预期任何适合类型的糖。本领域技术人员可以理解，适合的糖组分可以包含(但不限于)葡萄糖、甘露糖醇和蔗糖。根据一些实施方案，糖组分是葡萄糖(优选D-葡萄糖)。本领域技术人员可以理解，葡萄糖充当能量源。葡萄糖有助于产生ATP和其他储能核苷酸三磷酸、以及NADP和NAD的富能氢。此外，细胞中适当的能量代谢可以取决于葡萄糖参与的多个途径(如糖酵解途径、戊糖磷酸途径和三羧酸循环)。根据一些实施方案，葡萄糖的浓度为约2mM至约25mM，更优选地，从约9mM至约15mM。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物还可以包括提供ATP来源的腺苷。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物包含基于在细胞、组织和器官的环境中发现的正常细胞外液值的钠、钙、钾、氯、镁或其组合的离子浓度，并且可以优选地(但无需必须)类似于克雷布斯-林格(Krebs-Ringer)平衡盐溶液。根据其他实施方案，与正常的细胞外环境相比，组合物含有较低量的钠、氯、钙或其组合。本领域技术人员可以理解，盐可以在保持细胞、组织和器官的生理相关性渗透平衡中起作用。离子和阳离子可以分别通过质膜中的溶质泵活性在对信号传导途径必要的生物化学功能中起作用。例如，角化细胞可能对钙敏感，使得大于1mM的浓度诱导终末分化和/或细胞死亡。

在运输和/或冷冻保存组合物的一些实施方案中，钠离子的浓度为约20mM至约120mM。更优选地，钠离子的浓度为约70mM至约90mM。

在一些实施方案中，运输和/或冷冻保存组合物，钙离子浓度为约0.01mM至约1mM。更优选地，钙离子的浓度为约0.03mM至约1mM。在优选的实施方案中，组合物含有约0.06mM的钙，以降低或防止角化细胞终末分化。本领域技术人员可以理解，钙调控角化细胞分化。已经报道，等于或大于约1mM的钙浓度诱导角化细胞的分层和终末分化。此外，还已经报道，增殖的细胞来源(尤其是对于角化细胞从拔除的毛囊中的长出)终末分化的角化细胞效果较差，并且在一些情况下不可用(参见，例如，参考文献[1])。

在运输和/或冷冻保存组合物的一些实施方案中，氯离子的浓度为约10mM至约70mM。更优选地，氯离子的浓度为约40mM至约60mM。

在运输和/或冷冻保存组合物的一些实施方案中，钾离子的浓度为约2mM至约12mM。更优选地，钾离子的浓度为约2mM至约5mM。

在运输和/或冷冻保存组合物的一些实施方案中，镁离子的浓度为约0.1mM至约1mM。更优选地，镁离子的浓度为约0.4mM至约0.7mM。优选地，可以使用盐形式的任何组合(例如，KCl相比于NaCl)。优选地，最终离子浓度相同。

本领域技术人员可以理解，谷氨酰胺作为氮来源对于细胞的生长而言是重要的。谷氨酰胺对于代谢途径中的多种调节剂和能量载体(如NAD、NADH和嘌呤核苷酸)的合成而言也是重要的(参见，例如，参考文献[2])。当葡萄糖水平低时，谷氨酰胺也可以用作能量来源(参见，例如，参考文献[2])。然而，谷氨酰胺已经被报道对于长期存储是不稳定的。随着时间推移，谷氨酰胺可以容易且非酶地分解成氨和焦谷氨酸盐，从而形成对于细胞、组织和器官有毒的环境。根据一些实施方案，本发明的运输和/或冷冻保存组合物包含丙氨酰-谷氨酰胺(可以便利细胞、组织和器官的长期存储的包括L-谷氨酰胺和L-丙氨酸的稳定形式的谷氨酰胺)。根据一些实施方案，组合物中丙氨酰-谷氨酰胺的浓度为从约0.2mM至约10mM，并且更优选从约1mM至约5mM。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物还包括抗氧化剂(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(例如，TROLOX^TM)(一种维生素E类似物)。本领域技术人员可以理解，(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸与角化细胞用于降低起因于紫外线B诱导的H₂O₂的细胞死亡并且提高存活率的应用尤其相关(例如，参见，参考文献[3])。(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸的使用可以降低由于运输和/或冷冻保存过程(例如，在解冻过程中)造成的氧化应激。根据一些实施方案，(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸的浓度为约0.01μM至约10μM，并且更优选地，浓度为约0.05μM至约0.25μM。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物可以包括维生素E，而非(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物不含有血清或任何动物组分。本领域技术人员可以理解，血清和其他动物组分传统上在许多生长培养基以及运输和冷冻保存组合物中用作氨基酸、脂质、激素、维生素和微量元素的来源。然而，风险(如病原体污染和批次间不一致性)可能与其使用相关。此外，已经报道，在血清和其他动物组分中发现的异种化合物可以在人临床环境和治疗中引起有害的免疫反应。

近年来，已经在开发化学定义的无血清替代品方面取得了进展。已经在血清中鉴别的对于细胞、组织和器官有用的三种化合物为胰岛素、转铁蛋白和硒(亚硒酸钠的形式)。本领域技术人员可以理解，胰岛素调控葡萄糖和氨基酸的摄取和利用，转铁蛋白是对于保持细胞内稳态重要的离子载体，并且亚硒酸钠优选为用于适当的角化细胞保持的微量元素。依靠多种酶和结构元素的适当的细胞健康可能需要微量的硒(一种硒蛋白的成分)。已经报道，在角化细胞中，适当的细胞功能和健康可能需要硒，从而防止起因于紫外线B辐射的细胞凋亡、促进角化细胞增殖、保存干细胞特性(stemness)、防止细胞衰老、以及在老化过程中保持内稳态(从而增加其复制寿命)(参见，例如，参考文献[8])。根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物还可以包括胰岛素、转铁蛋白、硒(亚硒酸钠的形式)、或其组合。根据一些实施方案，组合物可以包括浓度为约0.1μg/mL至约20μg/mL(并且更优选地，浓度为约8μg/mL至约12μg/mL)的胰岛素。根据一些实施方案，组合物可以包括浓度为约1μg/mL至约20μg/mL(并且更优选地，浓度为约3μg/mL至约7μg/mL)的运铁蛋白。根据一些实施方案，组合物可以包括浓度为约5nM至约50nM(并且更优选地，从约20nM至约40nM)的亚硒酸钠。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物还可以包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(capase)抑制剂，以最小化起因于细胞凋亡的细胞死亡。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物还可以包括至少一种抗生素，以帮助最小化组合物中的细菌污染。预期有助于最小化细菌污染的任何适合的抗生素或抗生素的组合。根据一些实施方案，组合物含有青霉素、链霉素或其组合。根据一些实施方案，组合物可以包含浓度为约10单位/mL至约200单位/mL或更优选地浓度为约80单位/mL至约120单位/mL的抗生素青霉素。根据替代性实施方案或另外的实施方案，组合物可以包含浓度为约0.01mg/mL至约1mg/mL或更优选地浓度为约0.08mg/mL至约0.2mg/mL的抗生素链霉素。

根据一些实施方案，冷冻保存组合物还包括至少一种冷冻保护剂。本领域技术人员可以理解，冷冻保护剂有助于改变细胞的冷冻行为，从而有助于防止在冷冻保存过程中可能发生的对细胞、组织和器官的损伤。在冷冻保存过程中，由于细胞内部或外部冰晶的形成，存在细胞将经历低温冷害(cooling injury)的风险。例如，如果细胞冷冻太快，则细胞中可能保留更多的水，这可能聚集成可以对细胞造成机械损伤的更大的冰晶。缓慢冷却可以允许细胞快速地失水并且防止内部冷冻，但可能使细胞体积大幅缩小。细胞内问题也可以由冷冻保存过程造成。已经报道，如果DNA在染色质周围紧密包裹，则在缓慢冷却过程中的细胞收缩可能使核膜变形并且引起DNA断裂(参见，例如，参考文献[9])。还已经报道，起因于减小的细胞尺寸的大分子的群集可能抑制DNA修复机制，从而造成遗传损伤(参见，例如，参考文献[9])。在缓慢冷却过程中，由于细胞快速失水，细胞可能经历高渗应激。已经报道，冷冻保护剂可以影响水运输速率和冰晶生长速率，水运输速率和冰晶生长速率两者都通过使细胞、组织和器官内的蛋白质稳定来帮助保护细胞、组织和器官免于形成冰晶(参见，例如，参考文献[10])。

有效冷冻保护剂的选择对于细胞、组织和器官的适当冷冻保存可以是至关重要的。根据一些实施方案，组合物可以包括以下冷冻保护剂中的至少一种：葡聚糖40、蔗糖和DMSO。本领域技术人员可以理解，葡聚糖40是通常用作血浆体积膨胀剂中的重要化合物的平均分子量为约40000的葡萄糖单元的多糖。在其他应用中，葡聚糖40可以充当安全和/或有效的冷冻保护剂，从而有助于受控的冰晶形成。根据一些实施方案，组合物可以包括浓度为约0.001g/mL至约0.2g/mL(并且更优选地，浓度为约0.03g/mL至约0.07g/mL)的作为冷冻保护剂的葡聚糖40。蔗糖也可以用作非渗透性冷冻保护剂。根据一些实施方案，组合物可以包括浓度为约10mM至约60mM(并且更优选地，从约20mM至约40mM)的作为冷冻保护剂的蔗糖。

根据一些实施方案，组合物可以包括DMSO作为冷冻保护剂。本领域技术人员可以理解，DMSO是多年来已经证明在许多各种不同的细胞、组织和器官类型范围内有效的常用的冷冻保护剂。虽然可能已经报道了它容易穿过细胞膜为细胞提供保护，但这样的进入可能引起细胞的水容量变化，这可以造成损伤。此外，由于DMSO已经被报道在室温对细胞具有毒性并且可能在动物和人中引起不良反应，因此在将DMSO用于临床或治疗应用之前，应当从细胞、组织和器官中去除尽可能多的DMSO(参见，例如，参考文献[11])。在现有技术中，通常以10％(vol/vol)的浓度使用DMSO。由于所报道的对于细胞损伤的可能性，可能期望的是降低在运输和/或冷冻保存组合物中使用的DMSO的量。根据一些实施方案，组合物包括浓度为约0.1％(vol/vol)至约20％(vol/vol)(并且更优选地，浓度为约2.5％(vol/vol)至约10％(vol/vol))的DMSO。根据优选的实施方案，DMSO的浓度为约5％(vol/vol)。

根据一些实施方案，运输和/或冷冻保存组合物具有从约190mOsm/kg至约380mOsm/kg的最终重量摩尔渗透压浓度和约6.9-7.5的pH。

根据一些实施方案，首先将冷冻保存组合物用于存储细胞、组织或器官，并且然后将运输组合物用于运输和/或存储相同的细胞、组织或器官。根据其他实施方案，首先将运输组合物用于在短期内运输和/或存储细胞、组织或器官，并且然后将冷冻保存组合物用于相同细胞、组织或器官的长期存储。将注意指向图1，图1描绘了可以与本发明的运输和冷冻保存组合物的各种非限制性实施方案使用的运输和冷冻保存流水线的实例。根据本发明的一些实施方案，感兴趣的细胞、组织和器官可以被添加至运输组合物，并且从第一位置可行地运输至第二位置(例如，实验室、诊所等)以供实验、分析、治疗和/或冷冻保存。在一些实施方案中，然后在经受冷冻保存过程之前，将细胞、组织和器官放置在冷冻保存组合物中。根据优选的实施方案，可以将细胞、组织和器官冷冻保存不确定的时间量而不具有显著的活力降低，直至存在对于将来实验、分析和/或治疗的需要。本实例是出于说明的目的，而不应当被视为以任何方式限制本发明的应用。

根据本发明的一些实施方案，运输组合物被配制以在约25℃运输预定的持续时间(例如，两天)之后保持大于约50％的活力，并且更优选地在约4℃运输预定的持续时间(例如，两天)之后保持大于约80％的活力。该运输组合物优选地(但无需必须)比其他目前可用的组合物(如，例如，HypoThermosol)更有效。将注意指向图2，图2描绘了在各种运输组合物中运输两天之后人拔除的毛囊的百分比活力。作为第一步骤，拔除人毛囊，并且放置在三种不同的运输介质中：1)根据本发明的运输介质；2)作为比较剂运输介质的HypoThermosol；以及3)作为对照的不具有镁或钙的达尔伯克氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline)(“DPBS”)。作为第二步骤，然后将毛囊放置在保持约25℃或约4℃温度的约两天的模拟运输中。在两天之后，通过阿尔玛蓝(AlamarBlue)测定测量相对于新鲜对照的毛囊活力。当将本发明的运输组合物与HypoThermosol比较剂和DPBS对照进行比较时，借助于单向方差分析和事后图基检验(post-hoc Tukey test)的分析获得p＜0.05的统计学显著性。前述试验重复五次。

图3描绘了在作为无营养物质对照的不具有镁或钙的达尔伯克氏磷酸盐缓冲液(“DPBS”)、作为比较剂运输组合物的Hypothermosol FRS、以及根据本发明的实施方案的运输组合物中随时间的推移人拔除的毛囊的相对活力。运输温度被设置成4℃。通过对经历运输的人毛囊的活力与未经历运输的新近拔除的人毛囊对照的活力进行比较来计算相对活力。在每个时间点处，通过阿尔玛蓝测定测量活力。前述试验重复三次。在该图中，示出与其他类型的组合物相比，根据本发明实施方案的运输组合物中的人毛囊如何能够在24小时后保持相对较高的活力值。这对于通过邮递运输细胞、组织和器官(其中取决于位置、邮递延迟、进口/出口延迟、海关延迟的大多数递送可能导致大于24小时的运输时间)而言是重要的。

图4描绘了在冷冻保存五天之后人拔除的毛囊的百分比活力。拔除人毛囊，并且放置在四种不同的冷冻保存组合物中：1)根据本发明实施方案的含有5％DMSO的冷冻保存组合物；2)根据本发明实施方案的冷冻保存组合物(除不具有DMSO之外)；3)含有5％DMSO的CryoStor CS5；以及4)在DMEM中包括5％DMSO和10％FBS的标准冷冻保存组合物。在冷冻保存之前，使用CoolCell LX冷冻容器以每分钟约1℃的恒定速率将这些不同组合物中的毛囊冷却至约-80℃。然后，将含有毛囊的瓶放置在气相液氮冷冻保存罐中五天。在冷冻保存五天之后，将含有毛囊的瓶在37℃水浴中快速解冻。然后，使用阿尔玛蓝测定测量相对于新鲜非冷冻保存的毛囊的毛囊活力。当对根据本发明实施方案的具有5％DMSO的冷冻保存组合物与CryoStor CS5和标准冷冻保存组合物进行比较时，借助于单向方差分析和事后图基检验的分析获得p＜0.05的统计学显著性。在根据本发明实施方案的不具有5％DMSO的冷冻保存组合物与CryoStor CS6之间未达到统计学显著性。N＝6。

图5描绘了在两天运输然后五天冷冻保存过程之后人拔除的毛囊的百分比活力。拔除人毛囊，并且放置在三种不同的运输组合物中：1)根据本发明实施方案的运输组合物；2)作为竞争剂运输组合物的HypoThermosol；以及3)作为标准组合物的不具有镁或钙的达尔伯克氏磷酸盐缓冲液(“DPBS”)。然后，将毛囊放置在保持约25℃或约4℃温度的两天的模拟运输中。在两天之后，通过阿尔玛蓝测定测量相对于新鲜对照的毛囊运输活力(V_t)。为了评估冷冻保存之后的活力，拔除人毛囊，并且放置在四种不同的冷冻保存组合物中：1)根据本发明实施方案的含有5％DMSO的冷冻保存组合物；2)根据本发明实施方案的冷冻保存组合物(除不具有DMSO之外)；3)含有5％DMSO的CryoStor CS5；以及4)在DMEM中包括5％DMSO和10％FBS的标准冷冻保存组合物。在冷冻保存之前，使用CoolCell LX冷冻容器以每分钟约1℃的递减速率将这些不同组合物中的毛囊冷却至约-80℃。然后，将含有毛囊的瓶放置在气相液氮冷冻保存罐中五天。在冷冻保存五天之后，将含有毛囊的瓶在约37℃在水浴中快速解冻。然后，使用阿尔玛蓝测定测量冷冻保存之后的毛囊相对于新鲜非冷冻保存的毛囊的活力(V_c)。当对根据本发明实施方案的具有5％DMSO的冷冻保存组合物和不具有5％DMSO的冷冻保存组合物的组合使用与HypoThermosol+CryoStor CS5组合使用以及标准运输和冷冻保存介质组合进行比较时，借助于单向方差分析和事后图基检验的分析获得p＜0.05的统计学显著性。N＝6。

图4和图5证明了与含有5％DMSO的CryoStor CS5相比，具有DMSO的本发明的运输和/或冷冻保存组合物以及不具有DMSO的本发明的运输和/或冷冻保存组合物的有效性。

根据本发明的一些实施方案，所公开的组合物对于运输和冷冻保存组合物而言可以彼此相似，因为二者可以优选地(但无需必须)一起用于(如图1中所示)细胞、组织、和/或器官的运输和/或冷冻保存。

本领域技术人员可以理解，从毛囊分离的细胞可以在再生医学中具有许多潜在用途。可以直接从头皮拔除生长期毛发。这样的毛发拥有具有明显的毛球和外根鞘(其含有角化细胞以及具有再生毛发和愈合伤口的增强的能力的细胞)的蜡状角质层，(参见，例如，参考文献[12]、参考文献[13]、参考文献[14])。可以培养来源于毛囊的角化细胞(如图6中所示)，并且用于以接近于约1％的用OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC逆转录病毒转导的总体重编程效率(相比于当使用成纤维细胞培养时小于约0.01％的效率)生成iPSC系(参见，例如，参考文献[15]、参考文献[16])。

图6描绘了在化学定义的无血清条件下从新鲜毛囊中长出的角化细胞的实例。在Leica DMi 8相差显微镜上以100×放大率拍摄图片。到第八天，获得融合的单层角化细胞，并且可以用胰蛋白酶处理以供进一步培养和扩增。遵循的方案来自Hung et al.,2015(参见参考文献[20])。在本发明的优选实施方案中，在运输和冷冻保存之后也获得角化细胞长出。

本领域技术人员可以理解，可以从单个尿样品收集多种细胞类型(包含但未必是泌尿道上皮样细胞、平滑肌样细胞、内皮样细胞、间质样细胞、和/或被称为“尿源性干细胞”(“USC”)的显示出干细胞样特性的细胞亚群体)。USC可以优选地(但无需必须)占排尿中的细胞的大约0.2％(具有每100mL从5个至10个USC的平均收集)，并且已经被报道起源于肾小球中的壁干细胞(参见，例如，参考文献[17])。已经报道，USC是粘着性的并且可以以82％成功率在培养基中扩增(参见，例如，参考文献[18])。这些细胞在早期传代中展现出间充质干细胞标志物(CD117、CD73、CD90、CD105)，但对于造血干细胞标志物呈阴性(参见，例如，参考文献[18])。它们被认为是多能的，具有分化成泌尿道上皮细胞、平滑肌细胞、神经原细胞、骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的谱系的能力(参见，例如，参考文献[17，18])。此外，与角化细胞一样，已经报道，使用USC作为iPSC生成的前体细胞被证明比利用成纤维细胞的传统方法更短(12天)并且更有效(参见，例如，参考文献[19])。除了在USC中观察到的较高的端粒酶活性之外，IPSC生成效率还可能是两个重编程因子c-myc和klf4的内在表达的结果(参见，例如，参考文献[19])。因此，USC在再生医学(尤其是关于尿路和/或肾脏修复的再生医学)中具有许多潜在应用。

上述说明意在仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到，在不脱离所公开的本发明的范围的情况下，可以对所描述的实施方案进行改变。根据对本公开的回顾，落入本发明范围内的修改对于本领域技术人员将是显而易见的，并且这样的修改旨在落入所附权利要求书内。

到此结束对本发明的当前优选实施方案的说明。前述说明已经出于说明的目的而被呈现，并且不旨在为详尽的或者将本发明限制成所公开的精确形式。根据上述教导，其他修改、变化和变更是可能的，并且对于本领域技术人员将是显而易见的，并且可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在根据本发明的其他实施方案的设计和制造中使用。本发明的范围旨在不受该说明的限制，而仅受形成其一部分的权利要求书的限制。

实施例

将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。这些实施例被示出以帮助理解本发明，但并不旨在且不应当被解释为以任何方式限制其范围。实施例不包含本领域普通技术人员公知的常规方法的详细说明。

实施例1-运输组合物的配制

该实施例阐述用于运输细胞、组织和器官的根据本发明一方面的运输组合物的优选配方。

在本发明的优选实施方案中，将柚皮素和TROLOX^TM原料在DMSO中制备成100mM的最终浓度。然后，起始于原料，通过在无内毒素的milliQ水中将原料稀释成0.4mM的最终浓度(0.4％(v/v)DMSO)来配制柚皮素的工作溶液和TROLOX ^TM的工作溶液。

将氯化钠、氯化钾、氯化钙、六水氯化镁、碳酸氢钠、无水磷酸氢二钠、HEPES、D-葡萄糖和丙氨酰-谷氨酰胺添加到500mL无内毒素的milli-Q纯化水中，同时搅拌以产生10×溶液。

10×溶液含有：

a.485mM NaCl

b.40mM KCl

c.0.6mM CaCl₂

d.5mM六水MgCl₂

e.60mM Na₂CO₃

f.120mM Na₂HPO₄

g.230mM HEPES

h.110mM D-(+)-葡萄糖

i.20mM Ala-Gln。

一旦完全溶解，就通过一次性无菌0.22μM过滤器系统对溶液进行过滤灭菌。对于长期存储，可以从10×溶液中省略碳酸氢钠，而是向1×溶液添加新鲜的碳酸氢钠。将10×溶液存储在4-8℃。

通过在45mL无内毒素的milli-Q纯化水中稀释5mL 10×溶液来配制1×溶液。充分混合1×溶液。

在1×溶液中将柚皮素工作溶液和TROLOX^TM工作溶液分别稀释成0.05μM和0.1μM。

最终的1×溶液含有：

a.48.5mM NaCl

b.4mM KCl

c.0.06mM CaCl₂

d.0.5mM六水MgCl₂

e.6m M Na₂CO₃

f.12mM Na₂HPO₄

g.23mM HEPES

h.11mM D-(+)-葡萄糖

i.2mM Ala-Gln

j.0.05μM柚皮素

k.0.1μM TROLOX^TM[(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸]

l.0.0005％(v/v)DMSO(用于柚皮素和Trolox的溶剂，最终浓度不应当超过0.0005％(v/v))。

充分混合最终的1×溶液，然后通过一次性无菌0.22μM过滤器系统进行过滤灭菌，并且在4℃存储。

实施例2-冷冻保存组合物的配制

以下实施例阐述用于细胞、组织和器官的冷冻保存的根据本发明一方面的冷冻保存组合物的优选配方。

在本发明的优选实施方案中，针对两种化合物制备在DMSO中包括柚皮素和TROLOX^TM原料的最终浓度为100mM的配方。然后，起始于原料，通过在无镁和钙的DPBS中将原料稀释成0.4mM的最终浓度来配制柚皮素的工作溶液和TROLOX ^TM的工作溶液。

将氯化钠、氯化钾、氯化钙、六水氯化镁、碳酸氢钠、无水磷酸氢二钠、HEPES、D-葡萄糖和丙氨酰-谷氨酰胺添加到500mL无内毒素的milli-Q纯化水中，同时搅拌以产生10×溶液。

10×溶液含有：

a.485mM NaCl

b.40mM KCl

c.0.6mM CaCl₂

d.5mM六水MgCl₂

e.60mM Na₂CO₃

f.120mM Na₂HPO₄

g.230mM HEPES

h.110mM D-(+)-葡萄糖

i.20mM Ala-Gln。

通过在45mL无内毒素的milli-Q纯化水中稀释5mL 10×溶液来配制1×溶液。充分混合1×溶液。

在1×溶液中将柚皮素工作溶液和TROLOX^TM工作溶液分别稀释成0.05μM和0.1μM。将葡聚糖40添加至1×溶液达到5％(w/v)的最终浓度，并且将蔗糖添加至1×溶液达到1％(w/v)的最终浓度。将DMSO添加至1×溶液达到5％(v/v)的最终浓度。

充分混合1×溶液，然后通过一次性无菌0.22μM过滤器系统进行过滤灭菌，并且在4℃存储。

在其他实施方案中，将葡聚糖40、蔗糖和DMSO添加至实施例1中描述的1×溶液。添加葡聚糖40达到5％(w/v)的最终浓度，添加蔗糖达到1％(w/v)的最终浓度，并且添加DMSO达到5％(v/v)的最终浓度。

解释

还应当理解的是，出于本申请的目的，“X、Y和Z中的至少一个(种)”或“X、Y和Z中的一个(种)或更多个(种)”语言可以被解释为仅X、仅Y、仅Z、或者两个(种)或更多个(种)项目X、Y和Z的任何组合(例如，XYZ、XYY、YZ、ZZ)。

本申请中对“一个实施方案”、“实施方案”、“实施方式”、“变形”等的提及指的是，所描述的实施方案、实施方式或变形可以包含特定的方面、特征、结构、或特性，但并非每个实施方案、实施方式或变形都必须包含该方面、特征、结构、或特性。此外，这样的短语可以(但并非必须)指说明书的其他部分中提及的相同实施方案。此外，当结合实施方案描述特定的方面、特征、结构、或特性时，这样的模块、方面、特征、结构、或特性影响或关连到其他实施方案在本领域技术人员的知识范围内(无论是否明确描述)。换言之，除非存在明显的或固有的不相容性，或者被明确地排除，否则可以将任何要素或特征与不同实施方案中的任何其他要素或特征组合。

还应当注意的是，权利要求书可以被起草成排除任何可选的要素。照此，该陈述旨在用作排他性术语(如“仅仅(solely)”、“仅(only)”等)与权利要求要素的详述结合使用或者“否定性”限制的使用的在先基础。术语“优选地”、“优选的”、“优选”、“可选地”、“可以”以及类似的术语用于表示正在提及的项目、条件或步骤是本发明的可选的(非必需的)特征。

除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包含复数提及。术语“和/或”意为与该术语相关的项目中的任何一者、项目的任何组合、或者项目中的全部。短语“一个(种)或更多个(种)”是本领域技术人员容易理解的，特别是当在其使用的上下文中阅读时。

术语“约”可以指规定值的±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，在一些实施方案中，“约50％”可以具有从45％至55％的变化。对于整数范围，术语“约”可以在范围的每端包含大于和/或小于所列举的整数的一个或两个整数。除非本文另外指出，否则术语“约”旨在包含与所列举的范围接近的值和范围，所述值和范围在组合物的功能性或实施方案方面等同。

如本领域技术人员将理解的，出于任何目的和全部目的(特别是在提供书面说明方面)，本文列举的全部范围还涵盖任何和全部可能的子范围及其子范围的组合、以及组成范围的各个值(特别是整数值)。所列举的范围包含范围内的每个特定值、整数、小数或单位元素(identity)。任何列出的范围都可以容易地被认为充分描述，并且使相同的范围能够分解成至少两等份、三等份、四等份、五等份、或十等份。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。

如本领域技术人员还将理解的，全部语言(如“直至”、“至少”、“大于”、“小于”、“超过”、“或更多”等)包含所列举的数字，并且这样的术语指如上所述随后可以分解成子范围的范围。以相同的方式，本文列举的全部比率还包含落入较宽比率内的全部子比率。

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[15.]阿森·T和伊斯皮苏亚贝尔蒙特·J·C(2010)；“从皮肤或拔除的毛发中分离和培养人角化细胞以用于诱导性多能干细胞的生成”；自然，5:371-382(Aasen,T.andIzpisúaBelmonte,J.C.(2010).Isolation and cultivation of human keratinocytesfrom skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stemcells.Nature,5:371-382)。

[16.]佩蒂特·I，凯斯纳·N·S，卡里·R，罗比塞克·O，阿伯丹·E，穆勒·F·J，阿伯丹·D和本沙查尔·D(2012)；“来自毛囊的诱导性多能干细胞作为神经发育障碍的细胞模型”；干细胞研究，8:134-140(Petit,I.,Kesner,N.S.,Karry,R.,Robicsek,O.,Aberdam,E.,Müller,F.J.,Aberdam,D.&Ben-Shachar,D.(2012).Induced pluripotentstem cells from hair follicles as a cellular model for neurodevelopmentaldisorders.Stem Cell Research,8:134-140)。

[17.]巴拉德瓦杰·S，刘·G，师·Y，吴·R，杨·B，何·T，范·Y，陆·X，周·X，刘·H，阿塔拉·A，罗霍津斯基·J和张·Y(2013)；“人尿源性干细胞的多潜能分化：泌尿学中治疗应用的潜能”；干细胞，31:1840-1856(Bharadwaj,S.,Liu,G.,Shi,Y.,Wu,R.,Yang,B.,He,T.,Fan,Y.,Lu,X.,Zhou,X.,Liu,H.,Atala,A.,Rohozinski,J.&Zhang,Y.(2013).Multipotential Differentiation of Human Urine-Derived Stem Cells:Potentialfor Therapeutic Applications in Urology.Stem Cells,31:1840-1856)。

[18.]龙·T，吴·R，陆·X，邓·J，秦·D，张·Y(2015)；“用于泌尿生殖系统中组织修复的尿源性干细胞”；干细胞研究与治疗，5:317-321(Long,T.,Wu,R.,Lu,X.,Deng,J.,Qin,D.,Zhang,Y.(2015).Urine-Derived Stem Cells for Tissue Repair in theGenitourinary System.Stem Cell Research&Therapy,5:317-321)。

[19.]周·T，本达·C，邓青格·S，黄·Y，何·J·C，杨·J，王·Y，张·Y，庄·Q，李·Y，包·X，特斯·H，格里亚里·J，格里亚里伏格劳尔·R，佩·D和埃斯特班·M·A(2012)；“从尿样品生成人诱导性多能干细胞”；自然-实验指南，7:2080-2089(Zhou,T.,Benda,C.,Dunzinger,S.,Huang,Y.,Ho,J.C.,Yang,J.,Wang,Y.,Zhang,Y.,Zhuang,Q.,Li,Y.,Bao,X.,Tse,H.,Grillari,J.,Grillari-Voglauer,R.,Pei,D.&Esteban,M.A.(2012).Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.NatureProtocols,7:2080-2089)。

[20.]亨·S·C·S，佩贝·A和汪·R·C·B(2015)；“使用毛发源性角化细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞”；实验视频期刊，102:e53174(Hung,S.C.S.,Pébay,A.,&Wong,R.C.B.(2015).Generation of integration-free human induced pluripotentstem cells using hair-derived keratinocytes.Journal of VisualizedExperiments,102:e53174)。

[21.]萨利希·B，芙蔻·P·V·T，沙利菲拉德·M，祖卡·P，佩扎尼·R，马丁斯·N和沙利菲拉德·J(2019)；“柚皮素的治疗潜能：临床试验综述”；药学，12:10.3390/ph12010011(Salehi,B.,Fokou,P.V.T.,Sharifi-Rad,M.,Zucca,P.,Pezzani,R.,Martins,N.,&Sharifi-Rad,J.(2019).The Therapeutic Potential of Naringenin:A Review ofClinical Trials.Pharmaceuticals,12:10.3390/ph12010011)。

Claims (34)

1.一种组合物，所述组合物包括：

a.柚皮素，

b.缓冲系统，以及

c.糖组分，

其中所述组合物用于细胞、组织或器官的运输。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中柚皮素的浓度为约0.01μM至约10μM。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中柚皮素的浓度为约0.01μM至约0.25μM。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述缓冲系统包括：

a.约15mM至约45mM的合成生物缓冲液，

b.约2mM至约20mM的碳酸氢盐，

c.约6mM至约25mM的磷酸氢盐，

或其组合。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述缓冲系统包括：

a.约15mM至约45mM的合成生物缓冲液，

b.约3mM至约9mM的碳酸氢盐，

c.约10mM至约15mM的磷酸氢盐，

或其组合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述糖组分包括约2mM至约25mM的D-葡萄糖。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述糖组分包括约9mM至约15mM的D-葡萄糖。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约20mM至约120mM的钠离子，

b.约0.01mM至约1mM的钙离子，

c.约10mM至约70mM的氯离子，

d.约2mM至约12mM的钾离子，

e.约0.1mM至约1mM的镁离子，

f.约0.2mM至约10mM的丙氨酰-谷氨酰胺，

g.约0.01μM至约10μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，

或其组合。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约70mM至约90mM的钠离子，

b.约0.03mM至约1mM的钙离子，

c.约40mM至约60mM的氯离子，

d.约2mM至约5mM的钾离子，

e.约0.4mM至约0.7mM的镁离子，

f.约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺，

g.约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，

或其组合。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约0.1μg/mL至约20μg/mL的胰岛素，

b.约1μg/mL至约20μg/mL的转铁蛋白，

c.约5nM至约50nM的亚硒酸钠，

或其组合。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约8μg/mL至约12μg/mL的胰岛素，

b.约3μg/mL至约7μg/mL的转铁蛋白，

c.约20nM至约40nM的亚硒酸钠，

或其组合。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约10单位/mL至约200单位/mL的青霉素，

b.约0.01mg/mL至约1mg/mL的链霉素，

或其组合。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约80单位/mL至约120单位/mL的青霉素，

b.约0.08mg/mL至约0.2mg/mL的链霉素，

或其组合。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述细胞、组织或器官是人毛囊、来源于人毛囊的细胞或来源于尿的细胞。

15.一种组合物，所述组合物包括：

a.约0.01μM至约0.25μM的柚皮素，

b.约15mM至约45mM的合成生物缓冲液，

c.约3mM至约9mM的碳酸氢盐，

d.约10mM至约15mM的磷酸氢盐，

e.约9mM至约15mM的D-葡萄糖，

f.约70mM至约90mM的钠离子，

g.约0.03mM至约1mM的钙离子，

h.约40mM至约60mM的氯离子，

i.约2mM至约5mM的钾离子，

j.约0.4mM至约0.7mM的镁离子，

k.约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺，以及

l.约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，

其中所述组合物用于细胞、组织或器官的运输。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物在所述细胞、组织或器官被冷冻保存之前用于所述细胞、组织或器官的运输。

17.一种组合物，所述组合物包括：

a.柚皮素，

b.缓冲系统，以及

c.糖组分，

其中所述组合物用于细胞、组织或器官的冷冻保存。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中柚皮素的浓度为约0.01μM至约10μM。

19.根据权利要求17所述的组合物，其中柚皮素的浓度为约0.01μM至约0.25μM。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中所述缓冲系统包括：

a.约15mM至约45mM的合成生物缓冲液，

b.约2mM至约20mM的碳酸氢盐，

c.约6mM至约25mM的磷酸氢盐，

或其组合。

21.根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，其中所述缓冲系统包括：

a.约15mM至约45mM的合成生物缓冲液，

b.约3mM至约9mM的碳酸氢盐，

c.约10mM至约15mM的磷酸氢盐，

或其组合。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的组合物，其中所述糖组分包括约2mM至约25mM的D-葡萄糖。

23.根据权利要求17至21中任一项所述的组合物，其中所述糖组分包括约9mM至约15mM的D-葡萄糖。

24.根据权利要求17至23中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约20mM至约120mM的钠离子，

b.约0.01mM至约1mM的钙离子，

c.约10mM至约70mM的氯离子，

d.约2mM至约12mM的钾离子，

e.约0.1mM至约1mM的镁离子，

f.约0.2mM至约10mM的丙氨酰-谷氨酰胺，

g.约0.01μM至约10μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，

或其组合。

25.根据权利要求17至23中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约70mM至约90mM的钠离子，

b.约0.03mM至约1mM的钙离子，

c.约40mM至约60mM的氯离子，

d.约2mM至约5mM的钾离子，

e.约0.4mM至约0.7mM的镁离子，

f.约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺，

g.约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，

或其组合。

26.根据权利要求17至25中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约0.1μg/mL至约20μg/mL的胰岛素，

b.约1μg/mL至约20μg/mL的转铁蛋白，

c.约5nM至约50nM的亚硒酸钠，

或其组合。

27.根据权利要求17至26中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约8μg/mL至约12μg/mL的胰岛素，

b.约3μg/mL至约7μg/mL的转铁蛋白，

c.约20nM至约40nM的亚硒酸钠，

或其组合。

28.根据权利要求17至26中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约10单位/mL至约200单位/mL的青霉素，

b.约0.01mg/mL至约1mg/mL的链霉素，

或其组合。

29.根据权利要求17至28中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约80单位/mL至约120单位/mL的青霉素，

b.约0.08mg/mL至约0.2mg/mL的链霉素，

或其组合。

30.根据权利要求17至29中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约0.001g/mL至约0.2g/mL的葡聚糖40，

b.约10mM至约60mM的蔗糖，

c.约0.1％(v/v)至约20％(v/v)的二甲基亚砜，

或其组合。

31.根据权利要求17至29中任一项所述的组合物，所述组合物还包括：

a.约0.03g/mL至约0.07g/mL的葡聚糖40，

b.约20mM至40mM的蔗糖，

c.约2.5％(v/v)至约10％(v/v)的二甲基亚砜，

或其组合。

32.根据权利要求17至31中任一项所述的组合物，其中所述细胞、组织或器官是人毛囊、来源于人毛囊的细胞或来源于尿的细胞。

33.一种组合物，所述组合物包括：

a.约0.01μM至约0.25μM的柚皮素，

b.约15mM至约45mM的合成生物缓冲液，

c.约3mM至约9mM的碳酸氢盐，

d.约10mM至约15mM的磷酸氢盐，

e.约9mM至约15mM的D-葡萄糖

f.约70mM至约90mM的钠离子，

g.约0.03mM至约1mM的钙离子，

h.约40mM至约60mM的氯离子，

i.约2mM至约5mM的钾离子，

j.约0.4mM至约0.7mM的镁离子，

k.约1mM至约5mM的丙氨酰-谷氨酰胺，

l.约0.05μM至约0.25μM的(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，

m.约0.03g/mL至约0.07g/mL的葡聚糖40，

n.约20mM至40mM的蔗糖，以及

o.少于约5％(v/v)的二甲基亚砜，

其中所述组合物用于细胞、组织或器官的冷冻保存。

34.根据权利要求17至33中任一项所述的组合物，其中所述组合物在所述细胞、组织或器官已经被运输之后用于所述细胞、组织或器官的冷冻保存。

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