BR112021001820A2

BR112021001820A2 - composições para transporte e/ou criopreservação de células e/ou tecidos

Info

Publication number: BR112021001820A2
Application number: BR112021001820-4A
Authority: BR
Inventors: Patrick G. Pumputis; Steven Ten Holder; Drew W. Taylor
Original assignee: Acorn Biolabs, Inc.
Priority date: 2018-07-30
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2021-04-27
Also published as: AU2019316505A1; CN112752505A; JP2021532833A; CA3107967A1; EP3829296A4; US20210289770A1; EP3829296A1; KR20210052451A; MX2021001205A; WO2020024045A1

Abstract

Em vários aspectos, são fornecidas composições usadas para o transporte e/ou criopreservação de células, tecidos ou órgãos. As composições de transporte e/ou criopreservação compreendem pelo menos naringenina, um sistema tampão e um componente de açúcar. Em algumas modalidades, as células, tecidos ou órgãos são folículos capilares humanos, células derivadas de folículos capilares humanos ou células derivadas de urina.

Description

“COMPOSIÇÕES PARA TRANSPORTE E/OU CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS E/OU TECIDOS” REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS ANTERIORES

[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido de patente provisório dos EUA No 62/711.808 depositado em 30 de julho de 2018 e intitulado “COMPOSIÇÕES PARA TRANSPORTE E/OU CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS E/OU TECIDOS”, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] O relatório descritivo se refere geralmente às composições para o transporte e/ou criopreservação de células vivas, tecidos e órgãos. Em particular, o relatório descritivo se refere a composições compreendendo naringenina, um sistema tampão e um componente de açúcar que são usados para o transporte e/ou criopreservação de células humanas e animais vivas, tecidos e órgãos coletados de fontes não invasivas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Muitas composições existem atualmente para o transporte e criopreservação de células, tecidos e órgãos. Por exemplo, o transporte e armazenamento de células vivas, tecidos e órgãos foram realizados em temperaturas hipotérmicas de, por exemplo, 4 a 8 °C em composições líquidas formuladas para manter o equilíbrio osmótico, minimizar o estresse de temperatura e reduzir a apoptose e/ou morte celular necrótica durante o transporte. Exemplos do estado da técnica de composições usadas para o armazenamento hipotérmico de células incluem HypoThermosolTM, AQIXTM e ViaspanTM. Embora essas e outras composições do estado da técnica tenham sido eficazmente usadas como um meio de armazenamento para muitos tipos diferentes de célula, tecido e órgão, essas composições não são otimizadas para transporte, especialmente por correspondência ou serviços postais. Os desafios do transporte podem incluir, entre outras coisas:

flutuações na temperatura, exposição a faixas de temperatura extremas, colisões e vibrações, atrasos na liberação da correspondência, postal e correio; atrasos na importação/exportação; atrasos na alfândega; e desafios logísticos (e.g. liberação para locais remotos). Células, tecidos e órgãos recuperados de fontes não invasivas, tais como folículos capilares, células derivadas de folículos capilares e células derivadas de urina, são afetados por esses desafios no transporte. Esses desafios no transporte frequentemente resultam em viabilidade celular abaixo do ideal, particularmente após o transporte por períodos de tempo maiores que 24 horas. Frequentemente, o transporte vai comprometer ou prejudicar a adequação das células, tecidos e órgãos para criopreservação, transplante e/ou uso terapêutico. Em particular, as composições do estado da técnica não são intencionadas a serem usadas com pequenas células e tecidos, especialmente folículos capilares. Adicionalmente, as composições patenteadas iniciais HypoThermosolTM (US005405742A e US006045990A) e AQIXTM (EP2175718B1) foram destinadas ao uso como um substituto de sangue hipotérmico para minimizar a hipovolemia e lesão por reperfusão incluindo usos em procedimentos de infusão intravenosos e extravasculares.

[004] Células, tecidos e órgãos podem ser transportados para criopreservação. A criopreservação é a aplicação de temperaturas extremamente baixas, tão baixas quanto -196 °C com, por exemplo, nitrogênio líquido, para armazenar células, tecidos e órgãos em um estado biologicamente inativo, para preservá-los para uso futuro. No estado da técnica, as composições líquidas que protegem as células do congelamento têm sido usadas para armazenar células, tecidos e órgãos nessas baixas temperaturas. Muitas variações dessas composições de criopreservação existem no estado da técnica, e muitas contêm crioprotetores para proteger os construtos biológicos de células contra danos por cristais de gelo. Além disso, as soluções de criopreservação do estado da técnica também contêm componentes, tais como reguladores apoptóticos que ajudam os materiais biológicos se recuperarem do descongelamento. Exemplos de soluções de criopreservação no estado da técnica incluem, CryoStorTM, CELLBANKERTM, Syth-a-FreezeTM e mFreSRTM.

[005] Apesar da capacidade do CryoStorTM, CELLBANKERTM, Syth-a- FreezeTM e mFreSRTM de criopreservar células, tecidos e órgãos, as composições atualmente disponíveis não foram otimizadas para a criopreservação de células, tecidos e órgãos recuperados de fontes não invasivas de células, tais como folículos capilares, células derivadas de folículos capilares e células derivadas de urina. As composições atualmente disponíveis rendem viabilidade pós descongelamento abaixo do ideal, especialmente se as células, tecidos e órgãos experimentaram transporte por mais de 24 horas por correspondência ou serviços postais antes da criopreservação.

[006] Além do acima, as composições usadas para o transporte e criopreservação de células, tecidos e órgãos no estado da técnica frequentemente contêm soro quimicamente indefinido e/ou componentes animais como uma fonte de nutrientes críticos como lipídeos, vitaminas, hormônios e elementos vestigiais. Foi relatado que os riscos associados ao uso de soro quimicamente indefinido e/ou componentes animais nessas composições incluem contaminação por patógenos e variabilidade do lote. Além disso, se as células, tecidos e órgãos contidos nessas composições forem usados em humanos, pode ocorrer resposta imune ou rejeição, que torna as células, tecidos e órgãos terapeuticamente inutilizáveis e potencialmente causando danos ao receptor humano. A redução da presença de soro quimicamente indefinido e/ou componentes animais em composições de transporte e criopreservação é importante para ajudar a manter a relevância terapêutica e clínica das células, tecidos e órgãos.

[007] Adicionalmente, é comum que as composições do estado da técnica de transporte e criopreservação contenham dimetil sulfóxido a 10 % (v/v) (“DMSO”) como um crioprotetor. Embora o DMSO seja um crioprotetor eficaz, também é conhecido por ser tóxico para as células, tecidos e órgãos nessas concentrações. A redução da quantidade de DMSO usada em composições de transporte e criopreservação pode ajudar a reduzir e evitar a toxicidade compreendendo as células, tecidos e órgãos. Além disso, a redução da quantidade de DMSO nessas composições pode ajudar a evitar o comprometimento da adequação dessas células, tecidos e órgãos para transplante e/ou uso terapêutico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Em vários aspectos, as modalidades se referem a uma composição compreendendo naringenina, um sistema tampão e um componente de açúcar, em que a composição é usada para o transporte de células, tecidos ou órgãos. Em algumas modalidades, as células, tecidos ou órgãos são folículos capilares humanos, células derivadas de folículos capilares humanos ou células derivadas de urina.

[009] De acordo com algumas modalidades, a concentração de naringenina na composição de transporte é de cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM. De acordo com outras modalidades, a concentração de naringenina na composição de transporte é de cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM.

[010] De acordo com algumas modalidades, o sistema tampão da composição de transporte compreende: cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético; cerca de 2 mM a cerca de 20 mM de bicarbonato de hidrogênio; cerca de 6 mM a cerca de 25 mM de fosfato de hidrogênio; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com outras modalidades, o sistema tampão da composição de transporte compreende: cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético; cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio; cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio; ou uma combinação dos mesmos.

[011] De acordo com algumas modalidades, o componente de açúcar da composição de transporte compreende cerca de 2 mM a cerca de 25 mM de D-glicose. De acordo com outras modalidades, o componente de açúcar da composição de transporte compreende cerca de 9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose.

[012] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte compreende ainda: cerca de 20 mM a cerca de 120 mM de íons sódio; cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio; cerca de 10 mM a cerca de 70 mM de íons cloreto; cerca de 2 mM a cerca de 12 mM de íons potássio; cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM de íons magnésio; cerca de 0,2 mM a cerca de 10 mM de alanil-glutamina; cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2- carboxílico; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte compreende: cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio; cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio; cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto; cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio; cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio; cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil-glutamina; cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico; ou uma combinação dos mesmos.

[013] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte compreende ainda: cerca de 0,1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de insulina; cerca de 1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de transferrina; cerca de 5 nM a cerca de 50 nM de selenito de sódio; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte compreende: cerca de 8 µg/mL a cerca de 12 µg/mL de insulina; cerca de 3 µg/mL a cerca de 7 µg/mL de transferrina; cerca de 20 nM a cerca de 40 nM de selenito de sódio; ou uma combinação dos mesmos.

[014] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte compreende ainda: cerca de 10 unidades/mL a cerca de 200 unidades/mL de penicilina; cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 1 mg/mL de estreptomicina; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte compreende: cerca de 80 unidades/mL a cerca de 120 unidades/mL de penicilina; cerca de 0,08 mg/mL a cerca de 0,2 mg/mL de estreptomicina; ou uma combinação dos mesmos.

[015] Em um aspecto, a composição de transporte compreende: cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM de naringenina; cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético; cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio; cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio; cerca de 9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose; cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio; cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio; cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto; cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio; cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio; cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil- glutamina; e cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico.

[016] Em algumas modalidades, a composição de transporte pode ser usada para o transporte de células, tecidos e órgãos antes das células, tecidos ou órgãos serem criopreservados.

[017] Em vários aspectos, as modalidades se referem uma composição compreendendo naringenina, um sistema tampão e um componente de açúcar, em que a composição é usada para a criopreservação de células, tecidos ou órgãos. Em algumas modalidades, as células, tecidos ou órgãos são folículos capilares humanos, células derivadas de folículos capilares humanos ou células derivadas de urina.

[018] De acordo com algumas modalidades, a concentração de naringenina na composição de criopreservação é de cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM. De acordo com outras modalidades, a concentração de naringenina na composição de criopreservação é de cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM.

[019] De acordo com algumas modalidades, o sistema tampão da composição de criopreservação compreende: cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético; cerca de 2 mM a cerca de 20 mM de bicarbonato de hidrogênio; cerca de 6 mM a cerca de 25 mM de fosfato de hidrogênio; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com outras modalidades, o sistema tampão da composição de criopreservação compreende: cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético; cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio; cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio; ou uma combinação dos mesmos.

[020] De acordo com algumas modalidades, o componente de açúcar da composição de criopreservação compreende cerca de 2 mM a cerca de 25 mM de D- glicose. De acordo com outras modalidades, o componente de açúcar da composição de criopreservação compreende cerca de 9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose.

[021] De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende ainda: cerca de 20 mM a cerca de 120 mM de íons sódio; cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio; cerca de 10 mM a cerca de 70 mM de íons cloreto; cerca de 2 mM a cerca de 12 mM de íons potássio; cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM de íons magnésio; cerca de 0,2 mM a cerca de 10 mM de alanil-glutamina; cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2- carboxílico; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende: cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio; cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio; cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto; cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio; cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio; cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil-glutamina; cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico; ou uma combinação dos mesmos.

[022] De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende ainda: cerca de 0,1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de insulina; cerca de 1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de transferrina; cerca de 5 nM a cerca de 50 nM de selenito de sódio; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende: cerca de 8 µg/mL a cerca de 12 µg/mL de insulina; cerca de 3 µg/mL a cerca de 7 µg/mL de transferrina; cerca de 20 nM a cerca de 40 nM de selenito de sódio; ou uma combinação dos mesmos.

[023] De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende ainda: cerca de 10 unidades/mL a cerca de 200 unidades/mL de penicilina; cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 1 mg/mL de estreptomicina; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende: cerca de 80 unidades/mL a cerca de 120 unidades/mL de penicilina; cerca de 0,08 mg/mL a cerca de 0,2 mg/mL de estreptomicina; ou uma combinação dos mesmos.

[024] De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende ainda: cerca de 0,001 g/mL a cerca de 0,2 g/mL de dextrano 40; cerca de 10 mM a cerca de 60 mM de sacarose; cerca de 0,1 % (v/v) a cerca de 20 % (v/v) de dimetilsulfóxido; ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende: cerca de 0,03 g/mL a cerca de 0,07 g/m de dextrano 40; cerca de 20 mM a 40 mM de sacarose; cerca de 2,5 % (v/v) a cerca de 10 % (v/v) de dimetilsulfóxido; ou uma combinação dos mesmos.

[025] Em um aspecto, a composição de criopreservação compreende: cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM de naringenina; cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético; cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio; cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio; cerca de 9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose; cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio; cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio; cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto; cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio; cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio; cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil- glutamina; cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8-

tetrametilcromano-2-carboxílico; cerca de 0,03 g/mL a cerca de 0,07 g/m de dextrano 40; cerca de 20 mM a 40 mM de sacarose; e menos de cerca de 5 % (v/v) de dimetilsulfóxido.

[026] Em algumas modalidades, a composição de criopreservação pode ser usada para a criopreservação de células, tecidos e órgãos depois das células, tecidos ou órgãos serem transportados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[027] Para uma melhor compreensão das várias implementações aqui descritas e mostrar mais claramente como elas podem ser realizadas, será feita agora referência, apenas a título de exemplo, aos desenhos anexos em que:

[028] A FIG. 1 retrata um fluxograma ilustrando um exemplo de um tubo que pode ser usado para transportar e criopreservar células, tecidos e órgãos de acordo com modalidades não limitativas.

[029] A FIG. 2 retrata um gráfico ilustrando a viabilidade porcentual de folículos capilares retirados de humanos depois de dois dias de transporte em várias composições de transporte.

[030] A FIG. 3 retrata um gráfico ilustrando a viabilidade relativa de folículos capilares retirados de humanos, comparados aos controles frescos, em várias composições de transporte com o passar do tempo.

[031] A FIG. 4 retrata um gráfico ilustrando a viabilidade porcentual de folículos capilares retirados de humanos depois de cinco dias de criopreservação em várias composições de criopreservação.

[032] A FIG. 5 retrata um gráfico ilustrando a viabilidade porcentual de folículos capilares retirados de humanos, em relação aos controles frescos, depois de dois dias de transporte e cinco dias de criopreservação em várias composições.

[033] A FIG. 6 retrata fotografias contendo um exemplo de crescimento de queratinócitos de um folículo capilar fresco em condições livres de soro quimicamente definidas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[034] A descrição que se segue, e as modalidades nela descritas, é fornecida a título de ilustração de um exemplo, ou exemplos, de modalidades particulares dos princípios e aspectos da presente invenção. Esses exemplos são fornecidos para fins de explicação, e não de limitação, desses princípios e da invenção. A menos que definido de outro modo, todos os termos e frases aqui usados incluem os significados que os termos e frases atingiram na técnica, a menos que o contrário seja claramente indicado ou claramente evidente a partir do contexto em que o termo ou frase é usado.

[035] Como aqui usado, um especialista na técnica relevante pode geralmente entender o termo “compreendendo” como significando a presença das características, componentes ou grupos estabelecidos como referido nas reivindicações, mas que não exclui a presença ou adição de uma ou mais outras características, componentes ou grupos dos mesmos.

[036] Como aqui usado, um especialista na técnica relevante pode geralmente entender o termo “transporte” como significando o movimento de mercadorias, tais como organelas, células, tecidos, matriz extracelular, órgãos ou outros construtos biológicos suscetíveis a danos causados por cinética química desregulada, de um local para outro. O termo “transporte” como é aqui usado, também pode incluir o armazenamento a curto prazo de mercadorias, tais como organelas, células, tecidos, matriz extracelular, órgãos ou outros construtos biológicos suscetíveis a danos causados por cinética química desregulada. O transporte pode incluir transporte por correspondência. Muitos desafios podem ser enfrentados durante o transporte, que incluem, entre outras coisas: flutuações na temperatura, exposição a faixas de temperatura extremas, colisões e vibrações, atrasos na liberação da correspondência, postal e correio; atrasos na importação/exportação; atrasos na alfândega; e desafios logísticos (e.g. liberação para locais remotos). De acordo com algumas modalidades,

são fornecidas composições que podem ser usadas para o transporte de células, tecidos e órgãos. O termo “composição de transporte” pode, mas não necessariamente, ser aqui usado para se referir a tais composições.

[037] Como aqui usado, um especialista na técnica relevante pode geralmente entender o termo “criopreservação” como significando um processo em que organelas, células, tecidos, matriz extracelular, órgãos ou outros construtos biológicos vivos suscetíveis a danos causados por cinética química desregulada são preservados por arrefecimento a temperaturas muito baixas (tipicamente -80 °C usando dióxido de carbono sólido ou usando nitrogênio líquido a -196 °C). De acordo com algumas modalidades, são fornecidas composições que podem ser usadas para a criopreservação de células, tecidos e órgãos. O termo “composição de criopreservação” pode, mas não necessariamente, ser aqui usado para se referir a tais composições.

[038] Como aqui usado, o termo “células, tecidos e órgãos” pode referir a organelas, células, tecidos, matriz extracelular, órgãos ou outros construtos biológicos vivos. De acordo com algumas modalidades, as células, tecidos e órgãos podem ser humanos. De acordo com outras modalidades, as células, tecidos e órgãos podem ser células, tecidos e órgãos não humanos. As células, tecidos e órgãos não humanos podem incluir células, tecidos e órgãos de mamífero e, em particular, podem ser derivados de roedores. De acordo com algumas modalidades, as células, tecidos e órgãos são recuperados de fontes não invasivas, e podem incluir folículos capilares retirados de humanos, células derivadas de folículos capilares (tais como queratinócitos), células derivadas de urina e células bucais. De acordo com algumas modalidades, as células, tecidos e órgãos que foram transportados e/ou criopreservados nas composições de transporte e/ou criopreservação da presente invenção podem ser usados para pesquisa e/ou uso clínico e terapêutico. Em algumas modalidades da presente invenção, o uso da composição de transporte e/ou criopreservação resulta em boas taxas de recuperação e populações de células saudáveis para uso futuro, por exemplo, em aplicações de pesquisa ou como um material de partida para terapêuticas com base em células.

[039] Como aqui usado, um especialista na técnica relevante pode geralmente entender o termo “quantidade eficaz” como sendo uma quantidade suficiente para manter a viabilidade ou limitar a redução da viabilidade de células, tecidos ou órgãos. No caso das modalidades da presente invenção, uma quantidade eficaz pode incluir, mas não é limitada a uma quantidade para manter a viabilidade ou limitar a redução da viabilidade de células, tecidos ou órgãos que experimentaram transporte e/ou criopreservação.

[040] A presente invenção se refere à descoberta de que a naringenina pode ajudar a manter a viabilidade ou limitar a redução de viabilidade de células, tecidos e órgãos em composições de transporte e/ou criopreservação. A naringenina é uma flavanona que é predominantemente encontrada em frutas cítricas. Os especialistas na técnica podem apreciar que a naringenina demonstra algumas atividades antioxidantes, que podem ajudar fornecer proteção às células, tecidos e órgãos contra radicais livres prejudiciais. A naringenina pode ter propriedades adicionais bem adequadas para o transporte e/ou criopreservação de células, tecidos e órgãos. Por exemplo, foi relatado que a naringenina exibe propriedades antifúngicas, antibacterianas e antivirais (Ver, por exemplo, Referências [4] e [5]), que são úteis para prevenir contaminação externa indesejável e diminuir a necessidade de antibióticos nas composições de transporte e/ou criopreservação. Os especialistas na técnica podem apreciar que em uma composição, baixas concentrações de naringenina podem induzir a proliferação de queratinócitos (Ver, por exemplo, Referência [6]), permitir uma recuperação mais rápida do transporte e criopreservação. Adicionalmente, a naringenina é relatada como um indutor de proteínas de choque térmico (Ver, por exemplo, Referência [7]), potencialmente gerando proteção contra mudanças repentinas na temperatura (quente ou frio) durante o transporte e criopreservação. Os usos farmacêuticos promissores da naringenina foram mostrados em ensaios clínicos (Ver, por exemplo, Referência [21]).

[041] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, são fornecidas composições que compreendem naringenina, um sistema tampão e um componente de açúcar. Essas composições podem ser usadas para o transporte e/ou a criopreservação de células, tecidos e órgãos. Preferivelmente, as composições da presente invenção são formuladas para imitar o ambiente celular, proteger as células, tecidos e órgãos de danos e melhorar a viabilidade, recuperação e/ou usabilidade das células, tecidos e órgãos depois do transporte e/ou criopreservação. Em algumas modalidades da presente invenção, a composição de compostos é fornecida em concentrações para otimizar a viabilidade de células de queratinócitos. Todos os componentes individuais das composições de transporte e/ou criopreservação divulgadas são preferivelmente, mas não necessariamente, de grau farmacêutico e/ou sem componentes de origem animal.

[042] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação inclui naringenina em uma concentração de cerca de 0,01 μM a cerca de 10 μM. De acordo com algumas modalidades, a composição inclui naringenina em uma concentração de cerca de 0,01 μM a cerca de 0,25 μM. De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação pode conter pelo menos um outro flavonoide em combinação com a naringenina.

[043] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação inclui um sistema tampão. De acordo com algumas modalidades, o sistema tampão permitirá que a composição mantenha um pH fisiologicamente relevante em torno de 7,4 fora de uma incubadora de CO2 em condições hipotérmicas. Em um aspecto, o sistema tampão pode compreender um tampão biológico sintético, tal como HEPES ou BES. Qualquer tampão biológico sintético adequado com um pH semelhante ao HEPES é considerado. O tampão biológico sintético pode estar em uma concentração de cerca de 15 mM a cerca de 45 mM.

[044] De acordo com algumas modalidades, o sistema tampão de transporte e/ou criopreservação descrito pode, alternativamente ou adicionalmente, compreender bicarbonato de hidrogênio em uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 20 mM. Preferivelmente, a concentração de bicarbonato de hidrogênio é de cerca de 3 mM a cerca de 9 mM.

[045] De acordo com algumas modalidades, o sistema tampão de transporte e/ou criopreservação descrito pode, alternativamente ou adicionalmente, compreender fosfato de hidrogênio em uma concentração de cerca de 6 mM a cerca de 25 mM. Preferivelmente, a concentração de fosfato de hidrogênio é de cerca de 10 mM a cerca de 15 mM.

[046] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação inclui um componente de açúcar. Qualquer tipo adequado de açúcar é considerado. Os especialistas na técnica podem apreciar que componentes de açúcar adequados podem incluir, mas não são limitados a glicose, manitol e sacarose. De acordo com algumas modalidades, o componente de açúcar é glicose, e preferivelmente D-glicose. Os especialistas na técnica podem apreciar que a glicose age como uma fonte de energia. A glicose auxilia na produção de ATP e outros trifosfatos de nucleotídeos que armazenam energia, bem como hidrogênios ricos em energia de NADP e NAD. Além disso, o metabolismo energético apropriado nas células pode depender de múltiplas vias com as quais a glicose está envolvida, tais como a via glicolítica, a via de pentose fosfato e o ciclo de ácido cítrico. De acordo com algumas modalidades, a glicose está em uma concentração de cerca de 2 mM a cerca de 25 mM e, mais preferivelmente, de cerca de 9 mM a cerca de 15 mM.

[047] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação pode compreender ainda adenosina, que fornece uma fonte de ATP.

[048] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação inclui concentrações iônicas de sódio, cálcio, potássio, cloreto, magnésio ou uma combinação dos mesmos, que são fundamentados em valores normais de fluido extracelular encontrados no ambiente de células, tecidos e órgãos e pode, preferivelmente, mas não necessariamente, ser semelhante à solução salina balanceada de Krebs-Ringer. De acordo com outras modalidades, a composição contém baixas quantidades de sódio, cloreto, cálcio ou uma combinação dos mesmos em comparação com um ambiente extracelular normal. Os especialistas na técnica podem apreciar que os sais podem desempenhar um papel na manutenção do equilíbrio osmótico fisiologicamente relevante para células, tecidos e órgãos. Individualmente, íons e cátions podem desempenhar um papel em funções bioquímicas necessárias por meio da atividade de bomba de soluto na membrana plasmática para sinalizar as vias de transdução. Por exemplo, os queratinócitos podem ser sensíveis ao cálcio, de modo que uma concentração maior que 1 mM induz a diferenciação terminal e/ou morte celular.

[049] Em algumas modalidades da composição de transporte e/ou criopreservação, a concentração de íons sódio é de cerca de 20 mM a cerca de 120 mM. Mais preferivelmente, a concentração de íons sódio é de cerca de 70 mM a cerca de 90 mM.

[050] Em algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação, a concentração de íons cálcio é de cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM. Mais preferivelmente, a concentração de íons cálcio é de cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM. Em uma modalidade preferida, a composição contém cerca de 0,06 mM de cálcio para reduzir ou prevenir a diferenciação terminal de queratinócito. Os especialistas na técnica podem apreciar que o cálcio regula a diferenciação de queratinócito. Foi relatado que as concentrações de cálcio iguais ou maiores que cerca de 1 mM induzem a estratificação e diferenciação terminal de queratinócitos.

Além disso, também foi relatado que uma fonte de propagação de células - especialmente para o crescimento de queratinócitos de um folículo retirado - queratinócitos terminalmente diferenciados são menos eficazes e, em alguns casos, inutilizáveis (Ver, por exemplo, Referência [1]).

[051] Em algumas modalidades da composição de transporte e/ou criopreservação, a concentração de íons cloreto é de cerca de 10 mM a cerca de 70 mM. Mais preferivelmente, a concentração de íons cloreto é de cerca de 40 mM a cerca de 60 mM.

[052] Em algumas modalidades da composição de transporte e/ou criopreservação, a concentração de íons potássio é de cerca de 2 mM a cerca de 12 mM. Mais preferivelmente, a concentração de íons potássio é de cerca de 2 mM a cerca de 5 mM.

[053] Em algumas modalidades da composição de transporte e/ou criopreservação, a concentração de íons magnésio é de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM. Mais preferivelmente, a concentração de íons magnésio é de cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM. Preferivelmente, qualquer combinação de formas de sal pode ser usada (por exemplo, KCl vs NaCl). Preferivelmente, a concentração final de íons é a mesma.

[054] Especialistas na técnica podem apreciar que a glutamina é importante para o crescimento de células como uma fonte de nitrogênio. A glutamina também é importante para a síntese de múltiplos reguladores e portadores de energia nas vias metabólicas, tais como NAD, NADH, e nucleotídeos de purina (Ver, por exemplo, Referência [2]). A glutamina também pode ser usada como uma fonte de energia quando os níveis de glicose estão baixos (Ver, por exemplo, Referência [2]). Entretanto, a glutamina foi relatada como sendo instável para armazenamento a longo prazo. Com o passar do tempo, a glutamina pode se decompor facilmente e não enzimaticamente em amônia e piroglutamato, formando um ambiente tóxico para células, tecidos e órgãos. De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação da presente invenção inclui alanil-glutamina, uma forma estável de glutamina compreendendo L-glutamina e L-alanina que pode facilitar o armazenamento a longo prazo de células, tecidos e órgãos. De acordo com algumas modalidades, a concentração de alanil-glutamina na composição é de cerca de 0,2 mM a cerca de 10 mM e, mais preferivelmente, de cerca de 1 mM a cerca de 5 mM.

[055] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação compreende ainda o ácido antioxidante (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico (e.g. TROLOXTM), um análogo da vitamina E. Os especialistas na técnica podem apreciar que o ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico é especialmente relevante com o uso de queratinócitos para reduzir a morte celular de H2O2 induzido por ultravioleta B e melhorar as taxas de sobrevivência (Ver, por exemplo, Referência [3]). O uso de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico pode reduzir o estresse oxidativo que resulta do processo de transporte e/ou criopreservação (e.g., durante o descongelamento). De acordo com algumas modalidades, a concentração de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico é de cerca de 0,01 μM a cerca de 10 μM e, mais preferivelmente, a concentração é de cerca de 0,05 μM a cerca de 0,25 μM.

[056] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação podem compreender vitamina E em vez de ácido (±)-6-hidróxi- 2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico.

[057] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação não contém soro ou quaisquer componentes animais. Os especialistas na técnica podem apreciar que o soro e outros componentes animais são tradicionalmente usados em muitos meios de crescimento e composições de transporte e criopreservação como uma fonte de aminoácidos, lipídeos, hormônios,

vitaminas e elementos vestigiais. Entretanto, os riscos, tais como contaminação por patógenos e incompatibilidade entre lotes, podem estar associados com seu uso. Além disso, foi relatado que os xenocompostos encontrados no soro e outros componentes animais podem causar reações imunes prejudiciais em ambientes clínicos e terapêuticos humanos.

[058] Progressos foram feitos nos últimos anos para desenvolver alternativas livres de soro quimicamente definidas. Três compostos úteis para células, tecidos e órgãos que foram identificados no soro são insulina, transferrina e selênio (na forma de selenito de sódio). Os especialistas na técnica podem apreciar que a insulina regula a captura e utilização de glicose e aminoácidos, a transferrina é um portador iônico importante para manter a homeostase celular e o selenito de sódio é, preferivelmente, um elemento vestigial para a manutenção apropriada de queratinócitos. Em quantidades vestigiais, o selênio, um constituinte de selenoproteínas, pode ser necessário para a saúde celular apropriada por uma infinidade de elementos enzimáticos e estruturais. Foi relatado que em queratinócitos, o selênio pode ser necessário para a função e saúde celular apropriadas, prevenindo a apoptose da radiação ultravioleta B, promovendo a proliferação de queratinócitos, preservando a haste, prevenindo a senescência celular e mantendo a homeostase durante o envelhecimento, aumentando sua vida-útil replicativa (Ver, por exemplo, Referência

[8]). De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação pode compreender ainda insulina, transferrina, selênio (na forma de selenito de sódio), ou uma combinação dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, a composição pode compreender insulina em uma concentração de cerca de 0,1 μg/mL a cerca de 20 μg/mL e, mais preferivelmente, em uma concentração de cerca de 8 μg/mL a cerca de 12 μg/mL. De acordo com algumas modalidades, a composição pode compreender transferrina em uma concentração de cerca de 1 μg/mL a cerca de 20 μg/mL, e mais preferivelmente, em uma concentração de cerca de 3 μg/mL a cerca de 7 μg/mL. De acordo com algumas modalidades, a composição pode compreender selenito de sódio em uma concentração de cerca de 5 nM a cerca de 50 nM e, mais preferivelmente, de cerca de 20 nM a cerca de 40 nM.

[059] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação pode compreender ainda inibidores da capase para minimizar a morte celular a partir de apoptose.

[060] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação pode compreender ainda pelo menos um antibiótico, para ajudar a minimizar a contaminação bacteriana na composição. Qualquer antibiótico ou combinação de antibióticos adequada para ajudar a minimizar a contaminação bacteriana é considerado. De acordo com algumas modalidades, a composição contém penicilina, estreptomicina ou uma combinação das mesmas. De acordo com algumas modalidades, a composição pode incluir o antibiótico penicilina em uma concentração de cerca de 10 unidades/mL a cerca de 200 unidades/mL ou, mais preferivelmente, em uma concentração de cerca de 80 unidades/mL a cerca de 120 unidades/mL. De acordo com modalidades alternativas ou adicionais, a composição pode incluir o antibiótico estreptomicina em uma concentração de cerca de 0,01mg/mL a cerca de 1 mg/mL ou, mais preferivelmente, em uma concentração de cerca de 0,08 mg/mL a cerca de 0,2 mg/mL.

[061] De acordo com algumas modalidades, a composição de criopreservação compreende ainda pelo menos um crioprotetor. Os especialistas na técnica podem apreciar que os crioprotetores ajudam a modificar o comportamento de congelamento de células, ajudando assim a prevenir os danos às células, tecidos e órgãos que podem ocorrer durante o processo de criopreservação. Durante o processo de criopreservação existe um risco de que as células experimentem uma lesão por arrefecimento devido à formação de cristais de gelo dentro ou fora das células. Por exemplo, se células são congeladas muito prontamente, mais água pode permanecer nas células, que pode se agregar em cristais de gelo maiores que podem causar danos mecânicos às células. O arrefecimento lento pode permitir que as células percam água rapidamente e prevenir o congelamento interno, mas pode fazer com que o volume das células diminua drasticamente. Os problemas intracelulares também podem resultar do processo de criopreservação. Foi relatado que o encolhimento da célula durante o arrefecimento lento pode distorcer a membrana nuclear e causar a quebra de DNA se o DNA estiver compactado em torno da cromatina (Ver, por exemplo, Referência [9]). Também foi relatado que o aglomerado de macromoléculas como um resultado da diminuição do tamanho da célula, pode inibir os mecanismos de reparo de DNA resultando em danos genéticos (Ver, por exemplo, Referência [9]). Durante o arrefecimento lento, as células podem experimentar estresse hiperosmótico como um resultado de sua rápida perda de água. Foi relatado que os crioprotetores podem afetar a taxa de transporte de água e crescimento de cristal de gelo, os quais ajudam a proteger as células, tecidos e órgãos contra a formação de cristal de gelo estabilizando as proteínas dentro das células, tecidos e órgãos (Ver, por exemplo, Referência [10]).

[062] A escolha de um crioprotetor eficaz pode ser essencial para a criopreservação apropriada de células, tecidos e órgãos. De acordo com algumas modalidades, a composição pode compreender pelo menos um dos seguintes crioprotetores: Dextrano 40, sacarose e DMSO. Os especialistas na técnica podem apreciar que o Dextrano 40 é um polissacarídeo de unidades de glicose em um peso molecular médio de cerca de 40.000 geralmente usado como um importante composto em expansores de volume do plasma sanguíneo. Em outras aplicações, o Dextrano 40 pode atuar como um crioprotetor seguro e/ou eficaz, contribuindo para uma formação controlada de cristal de gelo. De acordo com algumas modalidades, a composição pode compreender Dextrano 40 como um crioprotetor em uma concentração de cerca de 0,001 g/mL a cerca de 0,2 g/mL, e mais preferivelmente,

em uma concentração de cerca de 0,03 g/mL a cerca de 0,07 g/mL. A sacarose também pode ser usada como um crioprotetor não penetrante. De acordo com algumas modalidades, a composição pode compreender sacarose como um crioprotetor em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 60 mM e, mais preferivelmente, de cerca de 20 mM a cerca de 40 mM.

[063] De acordo com algumas modalidades, a composição pode compreender DMSO como um crioprotetor. Os especialistas na técnica podem apreciar que o DMSO é um crioprotetor comumente usado que tem demonstrado por muitos anos ser eficaz sobre uma ampla faixa de diferentes tipos de célula, tecido e órgão. Embora tenha sido relatado que atravessa prontamente a membrana celular para fornecer proteção à célula, essa entrada pode causar mudanças no volume de água da célula que podem resultar em danos. Também, como o DMSO foi relatado como sendo tóxico para as células na temperatura ambiente e pode causar reações adversas em animais e humanos, tanto quanto possível o DMSO deve ser removido das células, tecidos e órgãos antes de serem usados em aplicações clínicas ou terapêuticas (Ver, por exemplo, Referência [11]). No estado da técnica, o DMSO é tipicamente usado em concentrações de 10 % (vol/vol). Pode ser desejável reduzir a quantidade de DMSO usada em composições de transporte e/ou criopreservação devido ao potencial relatado de dano celular. De acordo com algumas modalidades, a composição compreende DMSO em uma concentração de cerca de 0,1 % (vol/vol) a cerca de 20 % (vol/vol) e, mais preferivelmente, em uma concentração de cerca de 2,5 % (vol/vol) a cerca de 10 % (vol/vol). De acordo com uma modalidade preferível, a concentração de DMSO é de cerca de 5 % (vol/vol).

[064] De acordo com algumas modalidades, a composição de transporte e/ou criopreservação tem uma osmolalidade final de cerca de 190 mOsm/kg a cerca de 380 mOsm/kg e um pH de cerca de 6,9 a 7,5.

[065] De acordo com algumas modalidades, uma composição de criopreservação é primeiramente usada para armazenar células, tecidos ou órgãos, e então uma composição de transporte é usada para transportar e/ou armazenar as mesmas células, tecidos ou órgãos. De acordo com outras modalidades, uma composição de transporte é primeiramente usada para transportar e/ou armazenar as células, tecidos ou órgãos em curto prazo, e então uma composição de criopreservação é usada para o armazenamento a longo prazo das mesmas células, tecidos ou órgãos. A atenção é dirigida à Figura 1, que retrata um exemplo de um tubo de transporte e criopreservação que pode ser usado com várias modalidades não limitativas das composições de transporte e criopreservação da presente invenção. De acordo com algumas modalidades da presente invenção, células, tecidos e órgãos de interesse podem ser adicionados a uma composição de transporte e transportados de forma viável de um primeiro local para um segundo local (e.g., um laboratório, clínica, etc.) para experimentação, análise, terapêutica e/ou criopreservação. Em algumas modalidades, as células, tecidos e órgãos são então colocados em uma composição de criopreservação antes de serem submetidos a um processo de criopreservação. De acordo com uma modalidade preferida, as células, tecidos e órgãos podem ser criopreservados por uma quantidade indefinida de tempo sem uma redução significativa na viabilidade até que haja necessidade de futura experimentação, análise e/ou terapêutica. O presente exemplo é para fins demonstrativos e não deve ser considerado limitante para o uso da invenção de qualquer forma.

[066] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, uma composição de transporte é formulada para manter uma viabilidade maior que cerca de 50 % depois do transporte de uma duração predeterminada (e.g., dois dias) a cerca de 25 °C e, mais preferivelmente, cerca de 80 %, depois do transporte de uma duração predeterminada (e.g., dois dias) a cerca de 4 °C. Essa composição de transporte é preferivelmente, mas não necessariamente, mais eficaz que outras composições atualmente disponíveis, tais como, por exemplo, HypoThermosol. A atenção é dirigida à Figura 2, que retrata a viabilidade porcentual de folículos capilares retirados de humanos depois de dois dias de transporte em várias composições de transporte. Como uma primeira etapa, os folículos capilares humanos foram retirados e colocados em três meios de transporte diferentes: 1) meio de transporte de acordo com a presente invenção; 2) HypoThermosol como um comparador meio de transporte; e 3) Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (“DPBS”) sem magnésio ou cálcio como um controle. Como uma segunda etapa, os folículos capilares foram então colocados em um transporte simulado de cerca de dois dias mantendo uma temperatura de cerca de 25 °C ou cerca de 4 °C. Depois de dois dias, a viabilidade do folículo capilar em relação aos controles frescos foi medida pelo ensaio de AlamarBlue. As análises por um teste ANOVA de uma via e Tukey post-hoc obtêm significância estatística de p < 0,05 ao comparar a composição de transporte da presente invenção com o comparador HypoThermosol e DPBS controle. O ensaio anterior foi repetido cinco vezes.

[067] A Figura 3 retrata a viabilidade relativa de folículos capilares retirados de humanos com o passar do tempo em Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (“DPBS”) sem magnésio ou cálcio como um controle livre de nutriente, HypoThermosol FRS como uma composição de transporte comparadora, e uma composição de transporte de acordo com uma modalidade da presente invenção. A temperatura de transporte foi definida para 4 °C. A temperatura de transporte foi fixada em 4 °C. A viabilidade relativa foi calculada comparando a viabilidade dos folículos capilares humanos que foram transportados com a viabilidade dos controles de folículos capilares humanos recém-colhidos que não foram transportados. Em cada ponto no tempo, a viabilidade foi medida pelo ensaio AlamarBlue. O ensaio anterior foi repetido três vezes. Nesta figura é mostrado como os folículos capilares humanos na composição de transporte de acordo com uma modalidade da presente invenção podem manter valores de viabilidade relativamente mais elevados após 24 horas em comparação com outros tipos de composições. Isto é importante em relação ao transporte de células, tecidos e órgãos pelo correio, onde a maioria das entregas em função da localização, atrasos no correio, atrasos na importação/exportação, atrasos na alfândega, podem levar a tempos de transporte superiores a 24 horas.

[068] A Figura 4 retrata a viabilidade percentual de folículos capilares colhidos humanos após cinco dias de criopreservação. Os folículos capilares humanos foram colhidos e colocados em quatro composições de criopreservação diferentes: 1) uma composição de criopreservação contendo DMSO a 5 % de acordo com uma modalidade da presente invenção; 2) uma composição de criopreservação de acordo com uma modalidade da presente invenção, exceto sem DMSO; 3) CryoStor CS5 contendo DMSO a 5 %; e 4) uma composição de criopreservação padrão compreendendo DMSO a 5 % e FBS a 10 % em DMEM. Antes da criopreservação, os folículos capilares nessas diferentes composições foram reduzidos a cerca de -80 °C a uma taxa consistente de cerca de 1 °C por minuto com o uso de um recipiente de congelamento CoolCell LX. Os frascos contendo folículos capilares foram colocados em um tanque de criopreservação de nitrogênio líquido em fase de vapor por cinco dias. Após cinco dias de criopreservação, os frascos contendo folículos foram rapidamente descongelados em banho-maria a 37 °C. A viabilidade dos folículos capilares foi então medida em relação aos folículos capilares frescos não criopreservados usando o ensaio AlamarBlue. As análises por ANOVA unilateral e teste post-hoc de Tukey obtiveram significância estatística de p <0,05 ao comparar a composição de criopreservação com DMSO a 5 % de acordo com uma modalidade da presente invenção para o CryoStor CS5 e a composição de criopreservação padrão. Nenhuma significância estatística foi alcançada entre a composição de criopreservação sem DMSO a 5 % de acordo com uma modalidade da presente invenção e CryoStor CS6. N = 6.

[069] A Figura 5 retrata a viabilidade percentual de folículos capilares humanos após um transporte de dois dias seguido por um processo de criopreservação de cinco dias.

Os folículos capilares humanos foram arrancados e colocados em três composições de transporte diferentes: 1) uma composição de transporte de acordo com uma modalidade da presente invenção; 2) HypoThermosol como uma composição de transporte concorrente; e 3) Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (“DPBS”) sem magnésio ou cálcio como uma composição padrão.

Os folículos capilares foram então colocados em um transporte simulado de dois dias mantendo uma temperatura de cerca de 25 °C ou cerca de 4 °C.

Após dois dias, a viabilidade de transporte do folículo capilar (Vt) em relação aos controles frescos foi medida pelo ensaio AlamarBlue.

Para avaliar a viabilidade após a criopreservação, os folículos capilares humanos foram colhidos e colocados em quatro composições de criopreservação diferentes: 1) a composição de criopreservação contendo DMSO a 5 % de acordo com uma modalidade da presente invenção; 2) uma composição de criopreservação de acordo com uma modalidade da presente invenção, exceto sem DMSO; 3) CryoStor CS5 contendo DMSO a 5 %; e 4) uma composição de criopreservação padrão compreendendo DMSO a 5 % e FBS a 10 % em DMEM.

Antes da criopreservação, os folículos capilares nestas diferentes composições foram resfriados a cerca de -80 °C a uma taxa decrescente de cerca de 1 °C por minuto com o uso de um recipiente de congelamento CoolCell LX.

Os frascos contendo folículos capilares foram colocados em um tanque de criopreservação de nitrogênio líquido em fase de vapor por cinco dias.

Após cinco dias de criopreservação, os frascos contendo folículos capilares foram rapidamente descongelados em banho- maria a cerca de 37 °C.

A viabilidade dos folículos capilares após a criopreservação (Vc) foi então medida em relação aos folículos não criopreservados frescos usando o ensaio AlamarBlue.

As análises por ANOVA unilateral e teste post-hoc de Tukey obtiveram significância estatística de p <0,05 ao comparar o uso combinatório da composição de criopreservação com e sem DMSO a 5 % de acordo com uma modalidade da presente invenção para uso combinatório de HypoThermosol + CryoStor CS5 e combinação de meio de transporte e criopreservação padrão. N = 6.

[070] As Figuras 4 e 5 demonstram a efetividade das composições de transporte e/ou criopreservação da presente invenção com e sem DMSO em comparação com CryoStor CS5 contendo DMSO a 5 %.

[071] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, as composições divulgadas podem ser semelhantes entre si no que diz respeito à composição de transporte e criopreservação uma vez que ambas podem preferivelmente, mas não necessariamente, ser usadas juntas (como mostrado na Figura 1) para o transporte e/ou criopreservação de células, tecidos e/ou órgãos.

[072] Os especialistas na técnica podem apreciar que as células isoladas de folículos capilares têm muitos usos potenciais em medicina regenerativa. Os cabelos da fase anágena podem ser colhidos diretamente do couro cabeludo. Esses cabelos possuem uma cutícula cerosa com um bulbo capilar distinto e uma bainha externa da raiz que contém queratinócitos e células com uma capacidade aumentada de regenerar o cabelo e curar feridas (ver, por exemplo, as referências [12], [13], [14]). Queratinócitos derivados de folículos podem ser cultivados (como mostrado na Figura 6) e usados para gerar linhas iPSC com uma eficiência de reprogramação geral de transdução retroviral com OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC de cerca de 1 % em comparação com uma eficiência de menos do que cerca de 0,01 % quando usando culturas de fibroblastos (ver, por exemplo, referências [15], [16]).

[073] A Figura 6 retrata um exemplo de crescimento de queratinócitos de um folículo capilar fresco em condições sem soro definidas quimicamente. As fotos foram tiradas com ampliação de 100x em um microscópio de contraste de fase Leica DMi 8. No oitavo dia, as monocamadas confluentes de queratinócitos foram obtidas e puderam ser tripsinizadas para posterior cultivo e expansão. O protocolo seguido foi de Hung et al., 2015 (ver referência [20]). O crescimento de queratinócitos também foi obtido após transporte e criopreservação nas modalidades preferidas da presente invenção.

[074] Os especialistas na técnica podem apreciar que a partir de uma única amostra de urina, uma variedade de tipos de células pode ser coletada, incluindo, mas não necessariamente células semelhantes a uroteliais, células semelhantes a músculo liso, células semelhantes a endoteliais, células semelhantes a intersticiais, e/ou uma subpopulação de células exibindo características semelhantes às células- tronco denominadas “células-tronco derivadas da urina” (“USCs”). As USCs podem preferencialmente, mas não necessariamente, compreender cerca de 0,2 % das células na urina anuladas com uma coleção média de 5 a 10 USCs por 100 mL e foi relatado que se originam de células-tronco parientais no glomérulo renal (Ver, por exemplo, Referência [17]). Foi relatado que as USCs são aderentes e podem ser expandidas em cultura com uma taxa de sucesso de 82 % (Ver, por exemplo, Referência [18]). Estas células exibem marcadores de células-tronco mesenquimais (CD117, CD73, CD90, CD105) em passagens iniciais, mas são negativas para marcadores de células-tronco hematopoiéticas (ver, por exemplo, Referência [18]). Eles são considerados multipotentes com capacidade de diferenciação em linhagens de células uroteliais, células musculares lisas, células neurogênicas, osteócitos, adipócitos e condrócitos (ver, por exemplo, Referências [17, 18]). Além disso, como acontece com os queratinócitos, foi relatado que o uso de USCs como células precursoras para geração de iPSC demonstrou ser mais curto (12 dias) e mais eficiente do que os métodos tradicionais com fibroblastos (ver, por exemplo, Referência [19]). A eficiência de geração de IPSC pode ser resultada da expressão intrínseca de dois fatores de reprogramação, c-myc e klf4, além da maior atividade telomerase observada em USCs (ver, por exemplo, Referência [19]). Como resultado, as USCs têm muitos usos potenciais na medicina regenerativa, especialmente em relação ao trato urinário e/ou reparo renal.

[075] A descrição acima destina-se a ser apenas exemplificativa e um especialista na técnica reconhecerá que alterações podem ser feitas nas modalidades descritas sem se afastar do escopo da invenção divulgada. Modificações que caem dentro do escopo da presente invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica, à luz de uma revisão desta divulgação, e tais modificações se destinam a cair dentro das reivindicações anexas.

[076] Isto conclui a descrição das modalidades atualmente preferidas da invenção. A descrição anterior foi apresentada com o propósito de ilustração e não se destina a ser exaustiva ou a limitar a invenção à forma precisa divulgada. Outras modificações, variações e alterações são possíveis à luz do ensinamento acima e serão evidentes para aqueles versados na técnica, e podem ser usadas no projeto e fabricação de outras modalidades de acordo com a presente invenção sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Pretende-se que o âmbito da invenção seja limitado não por esta descrição, mas apenas pelas reivindicações que fazem parte dela.

EXEMPLOS

[077] A invenção será ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos. Estes exemplos são apresentados para ajudar na compreensão da invenção, mas não se destinam a, e não devem ser interpretados como, limitar seu escopo de qualquer forma. Os exemplos não incluem descrições detalhadas de métodos convencionais que seriam bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplo 1 - Formulação de Composição de Transporte

[078] Este exemplo apresenta uma formulação preferida da composição de transporte de acordo com um aspecto da presente invenção para o transporte de células, tecidos e órgãos.

[079] Em modalidades preferidas da invenção, estoque de naringenina e TROLOXTM é preparado em DMSO para uma concentração final de 100 mM. Em seguida, a partir do estoque, uma solução de trabalho de naringenina e uma solução de trabalho de TROLOXTM são formuladas por diluição de estoque em água milliQ sem endotoxina para uma concentração final de 0,4 mM (0,4% (v/v) DMSO).

[080] Cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio hexa-hidratado, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio dibásico anidro, HEPES, D-glicose e alanil-glutamina são adicionados a 500 mL de água purificada milli-Q sem endotoxina enquanto se agita até criar uma solução 10X.

[081] A solução 10X contém: a. NaCl 485 mM b. KCl 40 mM c. CaCl2 0,6 mM d. MgCl2 Hexa-hidratado 5 mM e. Na2CO3 60 mM f. Na2HPO4 120 mM g. HEPES 230 mM h. D-(+)-glicose 110 mM i. Ala-Gln 20 mM

[082] Uma vez completamente dissolvida, a solução é esterilizada por filtração através de um sistema de filtro descartável estéril de 0,22 µm. Para armazenamento de longo prazo, o bicarbonato de sódio da solução 10X pode ser omitido e adicionado fresco à solução 1X. A solução 10X é armazenada entre 4 a 8 °C.

[083] Uma solução 1X é formulada diluindo 5 mL da solução 10X em 45 mL de água purificada milli-Q livre de endotoxina. A solução 1X é bem misturada.

[084] As soluções de trabalho naringenina e TROLOXTM são diluídas para 0,05 μM e 0,1 μM, respectivamente, na solução 1X.

[085] A solução 1X final contém: a. NaCl 48,5 mM b. KCl 4 mM c. CaCl2 0,06 mM d. MgCl2 Hexa-hidratado 0,5 mM e. Na2CO3 6 mM f. Na2HPO4 12 mM g. HEPES 23 mM h. D-(+)-glicose 11 mM i. Ala-Gln 2 mM j. Naringenina 0,05 µM k. TROLOXTM [ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico] 0,1 µM l. DMSO a 0,0005 % (v/v) (solvente usado para Naringenina e Trolox, concentração final não deve exceder 0,0005 % (v/v))

[086] A solução 1X final é bem misturada, em seguida, esterilizada por filtração por meio de um sistema de filtro estéril descartável de 0,22 μm e armazenada a 4 °C. Exemplo 2 - Formulação de Composição de Criopreservação

[087] O exemplo seguinte apresenta uma formulação preferida da composição de criopreservação de acordo com um aspecto da presente invenção para a criopreservação de células, tecidos e órgãos.

[088] Em modalidades preferidas da invenção, as formulações compreendendo naringenina e estoque de TROLOXTM em DMSO para uma concentração final de 100 mM são preparadas para ambos os compostos. Em seguida, a partir do estoque, uma solução de trabalho de naringenina e uma solução de trabalho de TROLOXTM são formuladas por diluição de estoque em magnésio e cálcio sem DPBS para uma concentração final de 0,4 mM.

[089] Cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio hexa-hidratado, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio dibásico anidro, HEPES, D-glicose e alanil-glutamina são adicionados a 500 mL de água purificada milli-Q sem endotoxina enquanto se agita para criar uma solução 10X.

[090] A solução 10X contém: a. NaCl 485 mM b. KCl 40 mM c. CaCl2 0,6 mM d. MgCl2 Hexa-hidratado 5 mM e. Na2CO3 60 mM f. Na2HPO4 120 mM g. HEPES 230 mM h. D-(+)-glicose 110 mM i. Ala-Gln 20 mM

[091] Uma solução 1X é formulada por diluição de 5 mL da solução 10X em 45 mL de água purificada milli-Q livre de endotoxina. A solução 1X é bem misturada.

[092] As soluções de trabalho naringenina e TROLOXTM são diluídas para 0,05 μM e 0,1 μM, respectivamente, na solução 1X. Dextrano 40 é adicionado à solução 1X para uma concentração final de 5 % (p/v), e sacarose é adicionada à solução 1X para uma concentração final de 1 % (p/v). DMSO é adicionado à solução 1X para uma concentração final de 5% (v/v).

[093] A solução 1X é bem misturada e, em seguida, esterilizada por filtração através de um sistema de filtro estéril descartável de 0,22 µm e armazenada a 4 °C.

[094] Em outras modalidades, Dextrano 40, sacarose e DMSO são adicionados à solução 1X descrita no Exemplo 1. Dextrano 40 é adicionado a uma concentração final de 5 % (p/v), a sacarose é adicionada a uma concentração final de 1 % (p/v) e DMSO são adicionados a uma concentração final de 5 % (v/v).

INTERPRETAÇÃO

[095] Também será entendido que, para os fins deste pedido, a linguagem “pelo menos um de X, Y e Z” ou “um ou mais de X, Y e Z” pode ser interpretada como apenas X, apenas Y, apenas Z ou qualquer combinação de dois ou mais itens X, Y e Z (por exemplo, XYZ, XYY, YZ, ZZ).

[096] As referências no pedido a “uma modalidade”, “uma implementação”, “uma variante”, etc., indicam que a modalidade, implementação ou variante descrita pode incluir um aspecto, recurso, estrutura, ou característica, mas nem toda modalidade, implementação ou variante inclui necessariamente esse aspecto, recurso, estrutura ou característica. Além disso, tais frases podem, mas não necessariamente, referir-se à mesma modalidade referida em outras partes do relatório descritivo. Além disso, quando um aspecto, recurso, estrutura ou característica particular é descrito em conexão com uma modalidade, está dentro do conhecimento de um especialista na técnica afetar ou conectar tal módulo, aspecto, recurso, estrutura ou característica com outras modalidades, descrito explicitamente ou não. Em outras palavras, qualquer elemento ou recurso pode ser combinado com qualquer outro elemento ou recurso em diferentes modalidades, a menos que haja uma incompatibilidade óbvia ou inerente, ou seja especificamente excluído.

[097] É ainda observado que as reivindicações podem ser elaboradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração se destina a servir como base antecedente para o uso de terminologia exclusiva, como “apenas” e semelhantes, em conexão com a recitação de elementos de reivindicação ou uso de uma limitação “negativa”. Os termos “prefererivelmente”, “preferível”, “preferir”, “opcionalmente”, “pode” e termos semelhantes são usados para indicar que um item, condição ou etapa sendo referido é uma característica opcional (não obrigatória) da invenção.

[098] As formas singulares “um/uma”, e “o/a” incluem a referência no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. O termo “e/ou” significa qualquer um dos itens, qualquer combinação dos itens ou todos os itens aos quais este termo está associado. A frase “um ou mais” é facilmente compreendida por um especialista na técnica, particularmente quando lida no contexto de seu uso.

[099] O termo “cerca de” pode se referir a uma variação de ± 5 %, ± 10 %, ± 20 % ou ± 25 % do valor especificado. Por exemplo, “cerca de 50” por cento pode, em algumas modalidades, apresentar uma variação de 45 a 55 por cento. Para intervalos de inteiros, o termo “cerca de” pode incluir um ou dois números inteiros maiores e/ou menores do que um número inteiro recitado em cada extremidade do intervalo. A menos que indicado de outra forma neste documento, o termo “cerca de” se destina a incluir valores e intervalos próximos ao intervalo recitado que são equivalentes em termos da funcionalidade da composição ou modalidade.

[0100] Como será entendido por um especialista na técnica, para todos e quaisquer fins, particularmente em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas recitadas neste documento também abrangem qualquer e todas as possíveis subfaixas e combinações de subfaixas das mesmas, bem como os valores individuais que compõem o intervalo, particularmente valores inteiros. Um intervalo recitado inclui cada valor específico, inteiro, decimal ou identidade dentro do intervalo. Qualquer intervalo listado pode ser facilmente reconhecido como descrevendo suficientemente e permitindo que o mesmo intervalo seja dividido em pelo menos metades iguais, terços, quartos, quintos ou décimos. Como um exemplo não limitativo, cada faixa aqui discutida pode ser facilmente dividida em um terço inferior, terço médio e terço superior, etc.

[0101] Como também será entendido por um especialista na técnica, todas as linguagens, como “até”, “pelo menos”, “maior que”, “menor que”, “maior que”, “ou mais”, e semelhantes, incluem o número recitado e tais termos referem-se a intervalos que podem ser subsequentemente divididos em subfaixas conforme discutido acima. Da mesma maneira, todas as razões citadas neste documento também incluem todas as sub-razões que caem dentro da razão mais ampla.

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Pharmaceuticals, 12: 10.3390/ph12010011

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a. naringenina, b. um sistema tampão, e c. um componente de açúcar, em que a composição é usada para o transporte de células, tecidos ou órgãos.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração de naringenina é de cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração de naringenina é de cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o sistema tampão compreende: a. cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético, b. cerca de 2 mM a cerca de 20 mM de bicarbonato de hidrogênio, c. cerca de 6 mM a cerca de 25 mM de fosfato de hidrogênio, ou uma combinação dos mesmos.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o sistema tampão compreende: a. cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético, b. cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio, c. cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio, ou uma combinação dos mesmos.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente de açúcar compreende cerca de 2 mM a cerca de 25 mM de D-glicose.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente de açúcar compreende cerca de

9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 20 mM a cerca de 120 mM de íons sódio, b. cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio, c. cerca de 10 mM a cerca de 70 mM de íons cloreto, d. cerca de 2 mM a cerca de 12 mM de íons potássio, e. cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM de íons magnésio, f. cerca de 0,2 mM a cerca de 10 mM de alanil-glutamina, g. cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico, ou uma combinação dos mesmos.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio, b. cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio, c. cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto, d. cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio, e. cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio, f. cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil-glutamina, g. cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico, ou uma combinação dos mesmos.

10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 0,1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de insulina, b. cerca de 1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de transferrina,

c. cerca de 5 nM a cerca de 50 nM de selenito de sódio, ou uma combinação dos mesmos.

11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 8 µg/mL a cerca de 12 µg/mL de insulina, b. cerca de 3 µg/mL a cerca de 7 µg/mL de transferrina, c. cerca de 20 nM a cerca de 40 nM de selenito de sódio, ou uma combinação dos mesmos.

12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 10 unidades/mL a cerca de 200 unidades/mL de penicilina, b. cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 1 mg/mL de estreptomicina, ou uma combinação dos mesmos.

13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 80 unidades/mL a cerca de 120 unidades/mL de penicilina, b. cerca de 0,08 mg/mL a cerca de 0,2 mg/mL de estreptomicina, ou uma combinação dos mesmos.

14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que as células, tecidos ou órgãos são folículos capilares humanos, células derivadas de folículos capilares humanos ou células derivadas de urina.

15. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a. cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM de naringenina, b. cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético, c. cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio, d. cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio,

e. cerca de 9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose, f. cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio, g. cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio, h. cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto, i. cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio, j. cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio, k. cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil-glutamina, e l. cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico, em que a composição é usada para o transporte de células, tecidos ou órgãos.

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é usada para o transporte das células, tecidos ou órgãos antes das células, tecidos ou órgãos serem criopreservados.

17. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a. naringenina, b. um sistema tampão, e c. um componente de açúcar, em que a composição é usada para a criopreservação de células, tecidos ou órgãos.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração de naringenina é de cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a concentração de naringenina é de cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM.

20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, CARACTERIZADA pelo fato de que o sistema tampão compreende: a. cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético,

b. cerca de 2 mM a cerca de 20 mM de bicarbonato de hidrogênio, c. cerca de 6 mM a cerca de 25 mM de fosfato de hidrogênio, ou uma combinação dos mesmos.

21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, CARACTERIZADA pelo fato de que o sistema tampão compreende: a. cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético, b. cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio, c. cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio, ou uma combinação dos mesmos.

22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente de açúcar compreende cerca de 2 mM a cerca de 25 mM de D-glicose.

23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente de açúcar compreende cerca de 9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose.

24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 20 mM a cerca de 120 mM de íons sódio, b. cerca de 0,01 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio, c. cerca de 10 mM a cerca de 70 mM de íons cloreto, d. cerca de 2 mM a cerca de 12 mM de íons potássio, e. cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM de íons magnésio, f. cerca de 0,2 mM a cerca de 10 mM de alanil-glutamina, g. cerca de 0,01 µM a cerca de 10 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico, ou uma combinação dos mesmos.

25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23,

CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio, b. cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio, c. cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto, d. cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio, e. cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio, f. cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil-glutamina, g. cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico, ou uma combinação dos mesmos.

26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 25, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 0,1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de insulina, b. cerca de 1 µg/mL a cerca de 20 µg/mL de transferrina, c. cerca de 5 nM a cerca de 50 nM de selenito de sódio, ou uma combinação dos mesmos.

27. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 8 µg/mL a cerca de 12 µg/mL de insulina, b. cerca de 3 µg/mL a cerca de 7 µg/mL de transferrina, c. cerca de 20 nM a cerca de 40 nM de selenito de sódio, ou uma combinação dos mesmos.

28. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 10 unidades/mL a cerca de 200 unidades/mL de penicilina, b. cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 1 mg/mL de estreptomicina, ou uma combinação dos mesmos.

29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 28, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 80 unidades/mL a cerca de 120 unidades/mL de penicilina, b. cerca de 0,08 mg/mL a cerca de 0,2 mg/mL de estreptomicina, ou uma combinação dos mesmos.

30. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 29, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 0,001 g/mL a cerca de 0,2 g/mL de dextrano 40, b. cerca de 10 mM a cerca de 60 mM de sacarose, c. cerca de 0,1 % (v/v) a cerca de 20 % (v/v) de dimetilsulfóxido, ou uma combinação dos mesmos.

31. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 29, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda: a. cerca de 0,03 g/mL a cerca de 0,07 g/m de dextrano 40, b. cerca de 20 mM a 40 mM de sacarose, c. cerca de 2,5 % (v/v) a cerca de 10 % (v/v) de dimetilsulfóxido, ou uma combinação dos mesmos.

32. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 31, CARACTERIZADA pelo fato de que as células, tecidos ou órgãos são folículos capilares humanos, células derivadas de folículos capilares humanos ou células derivadas de urina.

33. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: a. cerca de 0,01 µM a cerca de 0,25 µM de naringenina, b. cerca de 15 mM a cerca de 45 mM de um tampão biológico sintético, c. cerca de 3 mM a cerca de 9 mM de bicarbonato de hidrogênio, d. cerca de 10 mM a cerca de 15 mM de fosfato de hidrogênio, e. cerca de 9 mM a cerca de 15 mM de D-glicose,

f. cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de íons sódio, g. cerca de 0,03 mM a cerca de 1 mM de íons cálcio, h. cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de íons cloreto, i. cerca de 2 mM a cerca de 5 mM de íons potássio, j. cerca de 0,4 mM a cerca de 0,7 mM de íons magnésio, k. cerca de 1 mM a cerca de 5 mM de alanil-glutamina, l. cerca de 0,05 µM a cerca de 0,25 µM de ácido (±)-6-hidróxi-2,5,7,8- tetrametilcromano-2-carboxílico, m. cerca de 0,03 g/mL a cerca de 0,07 g/m de dextrano 40, n. cerca de 20 mM a 40 mM de sacarose, e o. menos de cerca de 5 % (v/v) de dimetilsulfóxido, em que a composição é usada para a criopreservação de células, tecidos ou órgãos.

34. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 33, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é usada para a criopreservação das células, tecidos ou órgãos depois das células, tecidos ou órgãos serem transportados.