CN111296412A

CN111296412A - 一种无血清低dmso细胞冻存液及其应用

Info

Publication number: CN111296412A
Application number: CN202010307890.6A
Authority: CN
Inventors: 张众; 尚世旺; 张鹏
Original assignee: Celruicheng Beijing Life Science And Technology Co ltd
Current assignee: Celruicheng Beijing Life Science And Technology Co ltd
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-04-17
Also published as: CN111296412B

Abstract

本发明提供一种无血清低DMSO细胞冻存液及其应用。具体地说，本发明提供了一种无血清细胞冻存液或试剂盒，包含如下组分或者由如下组分组成：无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸等组分。本发明还涉及采用所述试剂盒配制所述冻存液的方法以及采用所述冻存液冻存细胞的方法。本发明细胞冻存液不含任何血清和其它蛋白，极大避免了细胞保存过程中的污染风险；而且含有很低浓度的DMSO，极大降低了对细胞潜在的毒性作用。本发明的冻存液冻存效果好，细胞冻存1个月后存活率甚至可达到95％以上；不需要程序降温，操作简单，可原位冻存细胞，广泛用于各种动物细胞、杂交瘤细胞及人细胞株的冷冻保存。

Description

一种无血清低DMSO细胞冻存液及其应用

技术领域

本发明涉及生命科学细胞培养及保存技术领域，尤其涉及无血清低DMSO快速细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

细胞培养技术创建于二十世纪初，历经一个多世纪的发展，现在已成为生命科学领域越来越重要的实验技术之一。由于细胞的特殊性，在细胞培养过程中，或在细胞建株和建系过程中，随着传代次数的增加，细胞的各种生物特性都会逐渐发生变化。因此，原始细胞种子的及时保存就显得尤为必要。在杂交瘤单抗的制备过程中，杂交瘤细胞以及克隆化得到的亚克隆细胞的冻存，是必不可少的操作。因为在没有建立一个稳定的细胞系或稳定分泌抗体的细胞系的时候，在细胞的培养过程中随时可能因细胞的污染、分泌抗体能力的丧失或遗传变异等等缘故而导致实验失败，如果没有原始细胞的冻存，则将因为上述的意外而前功尽弃。除此之外，购买、交换和运送某些细胞也需要利用细胞冻存的形式来进行。因此，及时方便地进行细胞的冻存在实际工作中显得十分必要。

目前，最成熟和最稳定的冻存细胞技术是将加有保护剂的细胞悬液置于-196℃液氮中，这样可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞的特性，在需要的时候经过复苏程序，使得细胞重新生长增殖以用于实验。细胞储存在-196℃液氮中，理论上储存时间是无限的。

细胞在冷冻过程中，特别需要防止溶液结冰对细胞的破坏，从而导致细胞不可逆的失活。1972年，Mazur等人根据对中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出冷冻损伤的两因素假说，即冰晶损伤假说和溶液损伤假说。

冰晶损伤假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰形成的冰晶会破坏细胞膜和细胞器，从而引起细胞死亡。这种因细胞内水分结冰而导致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。一般认为，冰晶损伤是由于冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。

溶液损伤假说认为随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时间暴露在高浓度溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在细胞复苏时短时间内大量水分渗入细胞内而造成细胞死亡。这种因溶液中溶质浓度增高而导致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由于冷冻速度过慢，使细胞在高浓度溶质的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，损伤越严重。

因此，目前细胞冻存及复苏的基本原则普遍遵循的是慢冻快融的方式，实践证明这样可以最大限度的保存细胞活力。但是，无论采用什么方式冻存细胞，都必须加入一种或多种保护剂类物质，以避免细胞以上述两种假说中所描述的方式致使结构受到破坏而死亡。

目前，细胞冻存要取得好的效果，多采用血清、甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作为保护剂。这些物质有些能提高细胞膜对水的通透性，在缓慢冷冻过程中可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。同时，有些保护剂在细胞外也能减轻溶液中高浓度溶质对细胞的损伤，进一步避免细胞在冷冻和复苏过程中受到损伤。

细胞冻存时向培养基中加入的保护剂，一般是终浓度5％-15％的甘油和/或10％二甲基亚砜(DMSO)和/或者10％-90％的牛血清。这些物质可使溶液冰点降低，能提高细胞膜对水的通透性，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/分钟，当温度低于-25℃时可加速，到-70℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。

动物血清因为有可能会引起病毒感染的潜在风险，而且非常昂贵，所以越来越多的细胞冻存液都会选择血清之外的物质作为保护剂。

总的来说，细胞冻存保护剂包括渗透性细胞膜内保护剂和非渗透性细胞保护剂，此外，还有细胞沉降稳定剂。渗透性细胞膜内保护剂、非渗透性细胞保护剂在溶液中同水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程，使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，能大大降低细胞在冻存过程中冰晶对于细胞的损伤，有效提高细胞复苏率和活力。细胞沉降稳定剂可防止或延缓细胞在冻存过程中的沉降，防止细胞互相挤压，影响细胞冻存效果。渗透性保护剂一般是能进入胞内的小分子物质，如DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、氨基酸等，这些物质的冷冻保护机理：在细胞冷冻悬液完全冻结之前进入胞内，降低细胞内外尚未结冰溶液的电解质浓度，以保护细胞免受高浓度电解质的损伤，减少冰晶的形成；同时，能使胞内水分不至于过多外渗，避免细胞过度脱水而皱缩。在细胞复苏时，可以促进细胞外水分进入胞内，缓解渗透性肿胀引起的损伤。渗透性保护剂是细胞冻存时必加的物质。非渗透性保护剂，分子量较大或不容易进入细胞内，一般在细胞外发挥作用，如海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白(血清的主要成分)、羟乙基淀粉等。非渗透性保护剂通过稀释降低胞外电解质的浓度，减少溶质损伤，结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。

在这些保护剂中，渗透性保护剂DMSO和非渗透性保护剂血清(主要含白蛋白)是使用最为广泛，效果最为稳定可靠的，但是，DMSO对细胞存在一定的毒性，用量受到限制，降低或者不使用DMSO，寻找其它替代物是最好的选择。但是目前，该技术领域还未发现冻存保护效果能与DMSO媲美的物质，因此，联合其它成分，形成新的配方，降低DMSO的含量就成了较为现实的选择。血清，即使是纯化的白蛋白，由于其动物来源的特性，会极大增加带来病毒等感染物质的可能，而且，血清来源受限，价格昂贵，所以其使用也必然会受到越来越多的限制。因此，寻找替代血清的非渗透性保护剂也显得尤为必要。

尽管上述这些保护剂在细胞冷冻保存过程中都能起到一定的保护作用，但任何一种保护剂无论含量多高，单独所起到作用还是非常有限的，这是由于这些物质的局限性和细胞活性的复杂性所决定的。所以，将多种保护剂进行组合，优化出一个合适的配方比例，就显得尤为必要。

本发明提供了一个完全不同的冻存液体系，不仅可以省却对血清的使用，而且还显著降低了DMSO的用量，从而为无血清低DMSO冻存液提供了更多的选择。

发明内容

在现有技术的基础上，发明人经过多方面试验和探索，发现在市售无血清细胞培养基的基础上，加上低浓度的DMSO、甘露糖、山梨醇和氨基酸等成分，可以在细胞冻存过程中起到很好的保护作用。传统上使用的细胞冻存保护剂是无血清细胞培养基加上血清和DMSO，这样的配方在细胞冻存过程中能起到非常好的保护效果。而发明人经过多方摸索试验得到的配方，比传统使用的冻存保护剂对细胞冷冻过程中的保护效果更好。其中，因为不需要使用动物血清，既避免了污染病毒的可能，也大幅度降低了成本；另外，由于使用较低浓度的DMSO，因此降低了对细胞生长的毒害。

本发明在第一方面提供了一种无血清细胞冻存液，所述冻存液包含如下组分或者由如下组分组成：无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸和水。

本发明第二方面提供了一种细胞冻存液试剂盒，所述试剂盒包含无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、苏氨酸和丝氨酸。

本发明第三方面提供了一种无血清细胞冻存液的制备方法，所述方法采用本发明第二方面所述的试剂盒制备本发明第一方面所述的冻存液。

本发明在第四方面提供了一种细胞冻存方法，所述方法采用本发明第一方面所述的冻存液或者由本发明第二方面所述的试剂盒配制的冻存液进行冻存。

相对于现有技术，本发明具有如下技术效果：

(1)采用本发明的细胞冻存液无任何外源血清成分，减少细胞污染机会。

(3)采用本发明的细胞冻存液采用低的DMSO含量，一方面在保证冻存液可渗透成分能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度，另一方面又能极大降低了对细胞潜在的毒性作用。

(3)不含有血清或其它动物来源成分，DMSO含量较低，而且成本较低。

(4)采用本发明的细胞冻存液冻存的细胞悬液可以直接放置于温度-70℃以下冰箱，既不需要采用程序降温仪，更不需要放置在-196℃液氮中，无需繁琐的冻存步骤，节省了大量时间和精力。

(5)可以采取原位操作的方式用本发明的细胞冻存液冻存细胞。原位冻存方式在某些工作中，比如杂交瘤细胞的亚克隆非常有必要，可以大规模减少工作量，避免污染。

附图说明

图1为实施例5的部分冻存效果镜检图。

图2为实施例6的部分冻存效果镜检图。

图3为实施例7的部分冻存效果镜检图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如上所述，本发明在第一方面提供了一种无血清细胞冻存液，所述冻存液包含无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸和水。

优选的是，所述冻存液包含由如下组分组成：无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸和水组成。即，所述冻存液包含无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸和余量的水。

在一些优选的实施方式中，所述冻存液包含无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸、牛磺酸和水。

优选的是，所述冻存液包含由如下组分组成：无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸和水组成。即，所述冻存液包含无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸、牛磺酸和余量的水。

更优选的是，所述氨基酸为苏氨酸和/或丝氨酸，进一步优选的是，所述氨基酸为氨酸和丝氨酸。

本发明对无血清培养基没有特别的限定，前提是这些培养基为无血清培养基。但是，在一些优选的实施方式中，所述无血清培养基选自由RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、IMDM培养基和F12培养基组成的组中的一种；更优选选自由RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基和DMEM低糖培养基组成的组中的一种。这些培养基都是可以商购获得的基本培养基。

在本发明中，“v/v”表示体积/体积比；“w/v”表示重量/体积比。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含4％(v/v)至6％(v/v)的二甲基亚砜，例如为4.5、5.0或5.5％(v/v)，优选为5％(v/v)的二甲基亚砜。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含80％(v/v)至90％(v/v)，例如为81、82、83、84、85、86、87、88或89％(v/v)，优选85％(v/v)的无血清细胞培养基。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含0.2％(w/v)至1.0％(w/v)，例如为0.4、0.6、0.8％(w/v)，优选0.5％(w/v)的甘露糖。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含0.2％(w/v)至1.0％(w/v)，例如为0.4、0.6、0.8％(w/v)，优选0.5％(w/v)的山梨醇。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含0.05％(w/v)至0.3％(w/v)，例如为0.1、0.15、0.2或0.25％(w/v)，优选0.1％(w/v)的苏氨酸。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含0.05％(w/v)至0.3％(w/v)，例如为0.1、0.15、0.2或0.25％(w/v)，优选0.2％(w/v)的丝氨酸。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含0.05％(w/v)至0.15％(w/v)，优选0.10％(w/v)的牛磺酸。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含80％(v/v)至90％(v/v)的无血清细胞培养基、0.2％(w/v)至1.0％(w/v)的甘露糖、0.2％(w/v)至1.0％(w/v)的山梨醇、0.05％(w/v)至0.3％(w/v)的苏氨酸、0.05％(w/v)至0.3％(w/v)的丝氨酸、和0.05％(w/v)至0.15％(w/v))的牛磺酸。

在一些更优选的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清细胞培养基、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸。进一步更优选的是，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清细胞培养基、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸和余量的水。

在一个具体的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清培养基DMEM(高糖)、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸和余量的水。

在另一个具体的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清培养基DMEM(高糖)、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸和余量的水。

在一个特别优选的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清培养基RPMI-1640、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸和余量的水。

本发明第二方面提供了一种细胞冻存液试剂盒，所述试剂盒包含无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、苏氨酸和丝氨酸。优选的是，所述试剂盒由无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、苏氨酸和丝氨酸组成。

优选的是，所述试剂盒还包含牛磺酸。更优选的是，所述试剂盒由无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、苏氨酸、丝氨酸和牛磺酸组成。

更优选的是，所述试剂盒还包含无菌水。更优选的是，所述试剂盒由由无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、苏氨酸、丝氨酸、牛磺酸和无菌水组成。所述无菌水可以为双蒸水或去离子水。

进一步优选的是，所述无血清培养基选自由RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、IMDM培养基和F12培养基组成的组中的一种；更进一步优选为所述无血清培养基选自由RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基和DMEM低糖培养基组成的组中的一种。

在一些优选的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)使用所述冻存液将待冻存的细胞稀释成细胞悬浮液；

(2)然后将所述细胞悬浮液转移到冻存管冻存。

优选的是，所述细胞悬浮液的浓度为1x10⁶个细胞/ml-1x10⁷个细胞/ml。

更优选的是，所述冻存是将装有细胞悬浮液的冻存管直接放置于-70℃以下冰箱冻存。本发明方法可以直接将冻存管放置于-70℃以下冰箱冻存，既不需要采用程序降温仪，更不需要放置在-196℃液氮中，无需繁琐的冻存步骤，节省了大量时间和精力。

可选的是，所述方法在步骤(1)之前还包括培养细胞的步骤，例如将细胞培养至80％至90％例如85％的汇合度。另外可选的是，所述细胞为贴壁细胞，所述方法在步骤(1)之前还包括使用胰酶进行消化的步骤。

本发明对待冻存的细胞没有限制，本发明的冻存液或试剂盒是通用的，适用于各种类型的细胞。所述细胞可以是动物细胞、人体组织或器官来源的细胞、植物细胞、或微生物细胞，优选为动物细胞、人体组织或器官来源的细胞，例如人类细胞或其他动物细胞，例如为成纤维细胞或人胚肾细胞，例如选自由小鼠成纤维3T3细胞、人胚肾293E细胞、人胚肾293F细胞、人胚肾293T细胞、人B淋巴细胞、人T淋巴细胞、人NK细胞、人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)、人原代DC细胞、人慢性髓原白血病细胞K562、人胰腺癌Capan-1细胞、人胰腺癌PANC-1细胞、人乳腺癌细胞MCF-7、人非小细胞肺癌A549、人结肠癌细胞HT-29、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela、人前列腺癌细胞PC3、人皮肤角质细胞HACAT、鼠源黑色素瘤B16、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠骨髓瘤细胞FO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、小鼠杂交瘤细胞OKT3、小鼠杂交瘤细胞OKT8、小鼠杂交瘤细胞2E8、小鼠原代精原干细胞和鼠脑微血管内皮细胞组成的组的细胞。

在一个具体的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清培养基DMEM(高糖)、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸和余量的水，并且所述细胞是成纤维细胞，尤其是小鼠成纤维细胞3T3细胞。

在另一个具体的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清培养基DMEM(高糖)、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸和余量的水，并且所述细胞为人胚肾细胞，尤其是人胚肾细胞293E细胞。

在一个特别优选的实施方式中，所述冻存液包含85％(v/v)的无血清培养基RPMI-1640、0.5％(w/v)的甘露糖、0.5％(w/v)的山梨醇、0.1％(w/v)的苏氨酸、0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.10％(w/v)的牛磺酸和余量的水，并且所述细胞是成纤维细胞，尤其是小鼠成纤维细胞3T3细胞。

实施例

下文将通过举例说明的方式通过如下实施例对本发明进行一步的说明，但是本发明请求保护的范围不限于这些实施例。

在实施例中使用的主要无血清培养基和其他试剂：

(1)DMSO，购自MP Biomedicals公司，DMSO细胞培养级，产品货号：02196055。

(2)RPMI-1640培养基，购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司，含谷氨酰胺但不含硝酸钙，产品货号：CGM112.06。

(3)DMEM(H)培养基，即DMEM高糖培养基，购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司，产品货号：CGM101.06。

(4)DMEM(L)培养基，即DMEM低糖培养基，购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司，产品货号：CGM103.06。

(5)F12培养基，购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司，产品货号：CGM108.06。

(6)IMDM培养基，购自赛澳美细胞技术(北京)有限公司，产品货号：CGM106.06。

(7)L-丝氨酸，购自Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里齐公司)，产品货号S4311，CAS号56-45-1，线性分子式HOCH2CH(NH2)CO2H，分子量105.09。

(8)L-苏氨酸，购自Sigma-Aldrich，产品货号T8441，CAS号72-19-5，线性分子式CH3CH(OH)CH(NH2)CO2H，分子量119.12。

(9)牛磺酸，购自Sigma-Aldrich，产品货号T8691，CAS号107-35-7，线性分子式NH2CH2CH2SO3H，分子量125.15。

(10)D-(+)-甘露糖，购自Sigma-Aldrich，产品货号M2069，CAS号3458-28-4，经验分子式(希尔表示法)C6H12O6，分子量180.16。

(11)D-山梨醇，购自Sigma-Aldrich，产品货号S3889，CAS号50-70-4，经验分子式(希尔表示法)C6H14O6，分子量182.7。

(12)对照A为赛尔瑞成(北京)生命科学技术有限公司生产的CF0101Cellregen无血清细胞冻存液，其中DMSO的含量为10％(v/v)。

实施例1.细胞的冻存(以贴壁细胞为例)

1.将培养在10cm培养皿中的细胞经过胰酶消化离心重悬后，按密度1x10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃，5％CO₂的条件下继续培养约24小时，此时细胞汇合度达80％-90％。

2.使用胰酶进行消化，以800rpm离心5min，弃废液，加入1ml待检测的细胞冻存液重悬，转移至冻存管，做好标记，冻存细胞的浓度一般在1x10⁶/ml-1x10⁷/ml。

3.依据慢冻速溶原则先在4℃静置30分钟，之后转移至-20℃放置3-4小时，最后存放于-70℃超低温冰箱长期保存。

实施例2：细胞的复苏与检测(以贴壁细胞为例)

1.在冻存一定时间后，从超低温冰箱中取出冻存的细胞，依据慢冻速融的原则在37℃水浴条件下在3-5分钟的时间内融化。在融化的过程中进行轻柔震荡。

2.将细胞转移至超净工作台，分别加入到预先加入有3ml完全培养基的离心管中，做好标记，以800rpm离心5分钟，弃上清后加入2ml新鲜的完全培养基重悬。

3.使用细胞计数板对离心管中的细胞进行计数，记为复苏前细胞数量。

4.将离心管内所有细胞转接到六孔板中，在37℃，5％CO₂的条件下培养3-4小时后，光学显微镜下拍照记录。

5.吸弃培养基，PBS润洗两次后消化，800rpm离心5min后重悬，使用细胞计数板对离心管中的细胞进行计数，记为复苏后细胞数量，即冻存后的存活的细胞数量，计算贴壁率，即细胞存活比例(百分比)。

贴壁率＝复苏后细胞数量/复苏前细胞数量

实施例3：细胞冻存液配制及其冻存效果

除特别说明，配制细胞冻存液的所有的组分都是市售的可用于细胞培养的产品。按照下表配制各种细胞冻存液10ml，然后按照实施例1和实施例2的方法进行细胞冻存和复苏，比较小鼠成纤维细胞3T3细胞在-70℃冻存一个月后细胞的效果(每个处理重复数为5，下同)。

表1

编号	基本培养基(ml)	DMSO(ml)	胎牛血清(ml)	H<sub>2</sub>O(ml)	存活％
						S1	8.5	0	0	1.5	0
S2	8.0	1	1	0	89％
						S3	8.5	1	0	0.5	82％
对照A	——	——	——	——	90％

注：(1)基本培养基为无血清培养基RPMI-1640。(2)存活％为细胞存活比例(％)。(3)H₂O的量为补足至10ml所需的水量。

从上表的结果可以看出，如果没有DMSO和胎牛血清，只有作为基本培养基的无血清培养基RPMI-1640，存活％为0；只有10％(v/v)的DMSO和所述基本培养基，存活率仅为82％。

实施例4：细胞冻存液配制及其冻存效果

除特别说明，配制细胞冻存液的所有的组分都是市售的可用于细胞培养的产品。按照下表配制各种细胞冻存液10ml，然后按照实施例1和实施例2的方法进行细胞冻存和复苏，比较小鼠成纤维细胞3T3细胞在-70℃冻存一个月的效果。

表2

注：基本培养基为无血清培养基RPMI-1640。

从上表可以看出，加上了甘露糖和山梨醇，存活率略有增加。增加了牛磺酸、丝氨酸和苏氨酸，存活率进一步增加。不过尽管增加了牛磺酸、丝氨酸和苏氨酸，如果甘露糖和山梨醇的量减少，存活率略有下降，如果甘露糖和山梨醇的量过多，则存活率显著降低。

甘露糖是一种单糖，结构和葡萄糖类似，为多种多糖的组成成分，以游离状态存在于某些植物果皮中。甘露糖的亲水性强，水溶性好，广泛分布于体液和组织中，对细胞无毒性。山梨糖醇，也称山梨醇、葡萄糖醇，易溶于水，与水分子亲和力强，能与大量水分子结合，减少自由水的比例，减少冷冻过程中冰晶的形成。鉴于上述结果，推测可能由于甘露糖和山梨糖醇能够起到稳定细胞的作用，能够部分地弥补降低DMSO所带来的可能存在的负面作用。

牛磺酸是一种由含硫氨基酸转化而来的带有氨基的酸。牛磺酸广泛分布于体内各个组织和器官，且主要以游离状态存在于组织间液和细胞内液中，长期以来一直被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物。鉴于以上效果，推测在本发明中可能起到稳定细胞的作用，从而部分地代替了DMSO的某些功能或作用。

丝氨酸是一种非必需氨基酸，可促进脂肪和脂肪酸的新陈代谢，有助于维持免疫系统，还具有稳定pH值的作用，是自然保湿因子(NMF)之一，可以用于用于配制氨基酸输液和营养增补剂。在本发明中的作用未明确，有可能起到稳定pH和营养细胞等作用。

苏氨酸尤其是L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以缓解人体疲劳，促进生长发育，常作为营养添加剂使用。鉴于以上效果，推测可能由于苏氨酸的结构中含有羟基，具有持水作用，能与寡糖链结合，对保护细胞膜和营养细胞等作用。

实施例5：细胞冻存液配制及其冻存效果

表3

注：基本培养基为无血清培养基RPMI-1640。

从上表可以看出，在所述冻存液包含所示基本培养基、DMSO、甘露糖、山梨醇牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸和余量的水的情况下，并且DMSO在4％(v/v)至6％(v/v)时，存活率可以达到90％以上，甚至高达97％。

实施例6：细胞冻存液配制及其冻存效果

表4

注：基本培养基为无血清培养基DMEM(高糖)。

实施例7：细胞冻存液配制及其冻存效果

除特别说明，配制细胞冻存液的所有的组分都是市售的可用于细胞培养的产品。按照下表配制各种细胞冻存液10ml，然后按照实施例1和实施例2的方法进行细胞冻存和复苏，比较人胚肾细胞293E细胞在-70℃冻存一个月的效果。

表5

注：基本培养基为无血清培养基RPMI-1640。

从上表的结果可以看出，在所述冻存液包含所示基本培养基、DMSO、甘露糖、山梨醇牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸和余量的水的情况下，并且在DMSO在4％(v/v)至6％(v/v)时，存活率可以达到85％以上。

实施例8：细胞冻存液配制及其冻存效果

表6

注：基本培养基为无血清培养基DMEM(高糖)。

实施例9：细胞冻存液配制及其冻存效果

除特别说明，配制细胞冻存液的所有的组分都是市售的可用于细胞培养的产品。按照下表配制各种细胞冻存液10ml，然后参照实施例1和实施例2的方法进行细胞冻存和复苏，比较人胚肾悬浮细胞293F细胞在-70℃冻存一个月的效果。

表7

注：基本培养基为无血清培养基RPMI-1640。

从上表的结果可以看出，在所述冻存液包含所示基本培养基、DMSO、甘露糖、山梨醇牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸和余量的水的情况下，并且在DMSO在4％(v/v)至6％(v/v)时，存活率可以达到90％以上。

实施例10：细胞冻存液配制及其冻存效果

表8

注：基本培养基为无血清培养基DMEM(高糖)。

从上表的结果可以看出，在所述冻存液包含所示基本培养基、DMSO、甘露糖、山梨醇牛磺酸、丝氨酸、苏氨酸和余量的水的情况下，并且在DMSO在4％(v/v)至6％(v/v)时，存活率可以达到87％以上。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液包含如下组分或者由如下组分组成：无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、氨基酸和水。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液还包含牛磺酸。

3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于，所述氨基酸为苏氨酸和/或丝氨酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的冻存液，其特征在于，所述无血清培养基选自由RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、IMDM培养基和F12培养基组成的组中的一种。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的冻存液，其特征在于，所述冻存液包含4％(v/v)至6％(v/v)的二甲基亚砜，优选为5％(v/v)的二甲基亚砜。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的冻存液，其特征在于：

所述冻存液包含80％(v/v)至90％(v/v)优选85％(v/v)的无血清细胞培养基；

所述冻存液包含0.2％(w/v)至1.0％(w/v)优选0.5％(w/v)的甘露糖；

所述冻存液包含0.2％(w/v)至1.0％(w/v)优选0.5％(w/v)的山梨醇；

所述冻存液包含0.05％(w/v)至0.3％(w/v)优选0.1％(w/v)的苏氨酸；

所述冻存液包含0.05％(w/v)至0.3％(w/v)优选0.2％(w/v)的丝氨酸；和/或

所述冻存液包含0.05％(w/v)至0.15％(w/v)优选0.10％(w/v)的牛磺酸；

另外更优选的是，所述冻存液包含80％(v/v)至90％(v/v)优选85％(v/v)的无血清细胞培养基、0.2％(w/v)至1.0％(w/v)优选0.5％(w/v)的甘露糖、0.2％(w/v)至1.0％(w/v)优选0.5％(w/v)的山梨醇、0.05％(w/v)至0.3％(w/v)优选0.1％(w/v)的苏氨酸、0.05％(w/v)至0.3％(w/v)优选0.2％(w/v)的丝氨酸、和0.05％(w/v)至0.15％(w/v)优选0.10％(w/v)的牛磺酸。

7.一种细胞冻存液试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含无血清细胞培养基、二甲基亚砜、甘露糖、山梨醇、苏氨酸和丝氨酸；

优选的是，所述试剂盒还包含牛磺酸；

更优选的是，所述试剂盒还包含无菌水；

进一步优选的是，所述无血清培养基选自由RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、IMDM培养基和F12培养基组成的组中的一种。

8.一种无血清细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述方法采用权利要求7所述的试剂盒制备权利要求1至6中任一项所述的冻存液。

9.一种细胞冻存方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1至6中任一项所述的冻存液或者由权利要求7所述的试剂盒配制的冻存液进行冻存。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)使用所述冻存液将待冻存的细胞稀释成细胞悬浮液；

(2)然后将所述细胞悬浮液转移到冻存管冻存；

优选的是，所述细胞悬浮液的浓度为1x 10⁶个细胞/ml-1x 10⁷个细胞/ml；

更优选的是，所述冻存是将装有细胞悬浮液的冻存管直接放置于-70℃以下冰箱冻存；

可选的是，所述方法在步骤(1)之前还包括培养细胞的步骤，例如将细胞培养至80％至90％，例如85％的汇合度；

另外可选的是，所述细胞为贴壁细胞，所述方法在步骤(1)之前还包括使用胰酶进行消化的步骤。