CN113490414A - 干细胞的保存 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞保存领域，特别地涉及包含分子量为约35000Da的聚乙二醇(PEG)的水溶液作为用于保存干细胞的细胞外试剂的用途。

Description

干细胞的保存
发明领域
本主题发明涉及干细胞保存领域，特别地涉及包含分子量为约35000Da的聚乙二醇(PEG)的水溶液作为用于保存干细胞的细胞外试剂的用途。
现有技术
由于干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，因此它们在科学研究和临床治疗中得到广泛应用。干细胞具有很多功能和应用——例如，它们可以用于与组织和器官体外生长有关的研究、疾病模型的开发、筛选、以及治疗方法中。例如，间充质干细胞可以用于治疗糖尿病、肝硬化、皮肤损伤以及心肌梗死。此外，它们可以增强造血功能，调节免疫反应。
通过临床前和临床试验使得基于干细胞的疗法不断进步。用于保存和递送细胞的改良载体溶液将允许拓展基于干细胞的先进疗法在世界范围内的应用可能性。此外，细胞稳定性的提高(理解为维持活力(viability)和功能性)，将为干细胞的应用范围提供灵活性和扩展性。随时间并由于受多种外部因素(例如载体溶液的组成或运输过程中的温度条件)的影响，细胞的质量发生变化。然而，干细胞在所有指定应用中的应用要求开发有效的其保存方法，不仅要确保维持高细胞活力，还要确保免受细菌和病原体的污染，以及确保培养细胞的合理成本。
在冷储存(即低温条件下)下保存器官、组织和细胞意指使用0℃到5℃范围内的温度，例如约4℃的温度。所谓的低温溶液用于此目的。在4℃的温度下，浸入这种溶液中的细胞保持在称为持续低温的状态。用于该目的的许多溶液在现有技术中是已知的，例如
Figure BDA0003232013230000011
(也被称为威斯康星大学(University of Wisconsin)溶液或UW溶液)，或EURO-COLLINS。
然而，在这样的条件下，只有短期储存是可能的。如果是长期储存，必须在保存的材料的冷冻温度和液氮温度(-196℃)之间的温度范围内冷冻它们。这个过程也被称为冷冻保存。
现有技术中存在许多与器官、组织和细胞的保存方法的优化有关的技术方案，这些技术方案都涉及冷储存(coldstorage)和冷冻保存(cryopreservation)。
为了保证有效的移植，干细胞必须以维持它们的活力的方式保存。例如，在冷冻保存的情况下，为了消除由冷冻引起的主要由于细胞内冰的形成和化学渗透应力的细胞死亡付出了很大的努力。冷冻保护剂，例如二甲亚砜(DMSO)，用于此目的。
文献US 6,045,990描述了用于低温储存人或动物器官、组织和细胞的无细胞溶液。所述溶液包含选自包括钾离子、钠离子、镁离子和钙离子的组的至少一种电解质；大分子溶胀剂；生物缓冲液；营养有效量的至少一种单糖；甘露醇，不可渗透细胞膜的不可渗透阴离子；对ATP再生有效的底物；以及谷胱甘肽。
由N.Matsumoto等人发表，‘Successful liquid storage of peripheral bloodstem cells at subzero non-freezing temperature[在零度以下非冷冻的温度下成功液态储存外周血干细胞]’Bone Marrow Transpl.[骨髓移植],(2002),30,777-784，描述了在零度以下但不冷冻的温度下干细胞保存期间的几种溶液的实验。测试了(i)血浆、ACD-A溶液和肝素的混合物；(ii)Belzer UW溶液-含有肝素、乳糖酸钾、KH2PO4、棉子糖、腺苷、谷胱甘肽、别嘌呤醇、羟乙基淀粉和NaOH的细胞内配制品，以及上述两种配制品与白蛋白的混合。
申请CN 105145547描述了用于干细胞冷冻保存的流体，所述流体包含DMSO、脐带间充质干细胞条件培养基和胎牛血清。
CN 104770363公开了用于干细胞冷冻保存的无血浆溶液，所述无血浆溶液包含DMSO和右旋糖酐-40。
文献CN 105961374公开了尤其是用于干细胞冷冻保存的细胞冷冻保存流体，所述细胞冷冻保存流体包含：PBS或生理盐水；作为主要成分的基础培养基，以及一种或多种选自以下的组分：聚乙二醇、丙二醇、依克多因(Ectoin)、白蛋白、海藻糖、脯氨酸和泊洛沙姆188。提及的用于细胞冷冻保存的流体不含有血清和DMSO。根据专利说明书的内容，为了降低冷冻温度并且增加细胞脱水而添加聚乙二醇。该文献既没有公开所使用的聚乙二醇的分子量，也没有限定所述流体是细胞内类型还是细胞外类型。
申请CN 107912419描述了用于冷冻保存人外周血单核细胞(包括干细胞)的液体，所述液体包含：二甲亚砜、聚乙二醇、人血清白蛋白、勃脉力-A(Plasmalyte-A)、海藻糖、羟乙基淀粉、β-葡聚糖、葡萄糖和维生素C。所述文献没有公开聚乙二醇的分子量。使用聚乙二醇是尤其由于聚乙二醇具有在水中良好的溶解性和低的熔融温度，从而在冷却过程中细胞外溶液不会形成冰晶。
CN 102578077公开了包含细胞内渗透保护剂(DMSO)和细胞外保护剂的无血清冷冻保护剂，所述细胞外保护剂包含NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、分子量在400Da至2000Da范围内的PEG、D-海藻糖和IV型胶原。所公开的试剂可以用于干细胞储存。
作为本主题发明的优选实施方式，本文实施例1中所述的溶液被认为是用于器官灌注和冷储存以供移植的配制品。本发明的申请人以商品名StoreProtect Plus将这种配制品引入市场。
尽管这一领域已经取得了很大的进展，但仍然存在许多相关的问题，尤其是与冷冻保存有关的问题，即以冷冻状态储存细胞。已知的溶液和培养基的主要缺点是，细胞活力随时间(在低温条件下和冷冻保存期间)降低，也在实验室和接受者所在地之间的运输期间降低。
鉴于上述现有技术，还存在未满足的需要，即提供一种能够有效地用于保存干细胞的试剂，所述试剂也可以用于典型的冷冻保存条件中。
出乎意料地，包含分子量约为35000Da的聚乙二醇(PEG)的水溶液能够成功地用作保存干细胞的细胞外试剂，并且在添加二甲亚砜(DMSO)后，也能够用作冷冻保存干细胞的试剂。
发明主题
本发明的主题是如权利要求1所限定的用途。本发明的优选实施方式在从属权利要求2-11中限定。
发明优点
根据本发明人所进行的测试，本主题发明的用途允许有效保存所收集的干细胞。根据本发明保存的干细胞的活力超过了典型的、可商购的储存配制品获得的结果。
另外地，提及的实验证明，在添加二甲亚砜(DMSO)之后，根据本发明的用途还允许有效冷冻保存干细胞。同样在这种情况下，所获得的结果至少与典型的、可商购的配制品的结果相当，并且甚至超过了它们。
因此，根据本发明的用途允许在细胞运输期间使用更广的温度范围，使得细胞更耐受延长的运输时间和变化的温度条件。因此，根据本发明保存的细胞的质量也得到提高。
附图说明
图1示出了在各种测试的配制品中储存12、24、36、48、72、96和120小时之后ADSC细胞活力测量的结果。
图2示出了在HTS配制品和根据本发明使用的溶液中储存12、24、36、48、72、96和120小时后有活力的ADSC细胞的数量。
图3示出了冷冻储存前后ADSC细胞活力测量的结果。
图4示出了解冻后以及在HTS配制品和根据本发明使用的溶液中储存12、24、36、48和72后ADSC细胞活力测量的结果。
具体实施方式
本主题发明是基于其发明人的观察而开发的，所述观察是包含具有限定的分子量的聚乙二醇(PEG)的水溶液允许有效保存干细胞，同时保持它们的活力。
在根据本主题发明的用途中，使用分子量约为35000Da(35kDA)的PEG(也称为PEG35)。根据本发明使用的PEG可以通过任何已知方法获得，其中优选地，所述PEG可以由具有较低分子量的PEG分子合成。在本发明的其他优选实施方式中，可以通过现有技术中已知的任何已知技术来纯化PEG。在本发明的特别优选实施方式中，可以使用可商购的PEG。
根据本发明，PEG优选地以约0.01mmol/l至约5mmol/l的浓度使用，例如以0.02mmol/l、0.03mmol/l、0.04mmol/l、0.05mmol/l、0.06mmol/l、0.07mmol/l、0.08mmol/l、0.09mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l、0.7mmol/l、0.8mmol/l、0.9mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、2.5mmol/l、3.0mmol/l、3.5mmol/l、4.0mmol/l、4.5mmol/l和5mmol/l的浓度使用。在本发明的特别优选实施方式中，PEG浓度低于1mmol/l并且最优选地为约0.03mmol/l。
根据本主题发明，所使用的水溶液被用作细胞外试剂，即其中钠离子(Na+)大于钾离子(K+)浓度的试剂。这种类型的试剂通过减少细胞内冰的形成来防止细胞在储存过程中死亡。
在本发明的优选实施方式中，所述溶液含有至少约30mmol/l浓度的Na+离子以及至少约10mmol/l浓度的K+离子。在本发明的最优选实施方式中，所述溶液含有约125mmol/l浓度的Na+离子以及约25mmol/l浓度的K+离子。
优选地，以氢氧化钠(NaOH)的形式引入钠离子，而以磷酸二氢钾(KH2PO4)的形式引入钾离子。
在本发明的特别优选实施方式中，除了上述组分(即PEG、钠离子和钾离子)外，所述溶液可以含有在细胞储存配制品领域中使用的其他组分，即包含不可渗透阴离子的试剂、来自糖类(the group of sugars)的化合物、膜稳定剂/缓冲溶液和能量源。
在本发明的特别优选实施方式中，提及的溶液包含：
Figure BDA0003232013230000051
其中
所述溶液的pH在约6,5至约8的范围内，以及
所述溶液的渗透压在约290mOsm/kg至约320mOsm/kg的范围内。
不可渗透细胞膜的阴离子(其作用是防止低温引起的细胞肿胀)是乳糖酸或其盐。
棉子糖的功能是另外的渗透支持。在本发明的优选实施方式中，使用棉子糖五水合物(棉子糖·5H2O)。
膜稳定剂是硫酸镁，优选地硫酸镁七水合物(MgSO4·7H2O)，其起作用以稳定细胞膜的电化学平衡，这决定Na+离子、K+离子、磷离子和Ca2+离子的适当转运。
KH2PO4是缓冲系统，其作用是维持溶液的pH，从而提供酸/碱平衡。另外地，它还向溶液提供钾离子。
谷胱甘肽和别嘌呤醇是对抗自由基形成和作用的试剂。
腺苷是ATP前体的来源，作为能量源。
用于制备根据本发明使用的溶液的水是药学上可接受的注射用水。
在本发明的最优选实施方式中，提及的溶液包含：
Figure BDA0003232013230000052
Figure BDA0003232013230000061
以及
其量足以获得pH约7.4的NaOH、以及
注射用水，
其中所述溶液具有300mOsm/kg的渗透压并且包含约125mmol/l的Na+离子。
当根据本主题发明的用途旨在用于冷冻保存时，需要添加冷冻保护剂。冷冻保护剂可以是冷冻保存配制品中使用的这种类型的任何组分，其中优选地是二甲亚砜(DMSO)。优选地，基于溶液的总体积，二甲亚砜(DMSO)以约5体积％至约20体积％的浓度使用，最优选地以约10体积％的浓度使用。
根据本发明使用的溶液不含有单独添加的钙离子或作为包括在所提及的溶液的组成中的化合物的组分而添加的钙离子。用于制备根据本发明使用的溶液的注射用水也不含有所述离子。
根据本发明，上文和下文中使用的术语“约”应理解为与给定值的+/-5％的偏差，反映了在制造本发明组合物的过程中，例如在测量溶液的组分期间可能出现的不精确。
实施例
实施例1
用于干细胞保存的溶液
在与干细胞保存有关的实验中，使用了具有以下组成的配制品StoreProtectPlus(制造商：Carnamedica)：
Figure BDA0003232013230000062
Figure BDA0003232013230000071
以及
其量足以获得pH约7.4的NaOH、
注射用水，
实施例1的溶液表现出约300mOsm/kg的渗透压，并且包含浓度约为120mmol/l的钠离子(Na+)以及浓度约为25mmol/l的钾离子(K+)。
实施例2
用于干细胞冷冻保存的溶液
在与干细胞冷冻保存相关的实验中，使用来自实施例1的配制品，所述配制品另外地包含相对于溶液的总体积的10体积％的二甲亚砜(DMSO)。
实施例3
干细胞的短期保存
从9个供体中分离的间充质脂肪源性干细胞(ADSC)被分成测试组，并储存长达120h。使用以下实验组：(a)NaCl溶液(0.9％)，(b)含葡萄糖的NaCl溶液(0.9％)，(c)林格氏溶液(Ringer’s solution)(费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi))，(d)勃脉力(Plasmalyte)配制品(巴克斯特公司(Baxter))(每1000ml溶液包含：5.26g的氯化钠、0.37g的氯化钾、0.3g的氯化镁(6H2O)、3.68g的乙酸钠(3H2O)、5.02g的葡萄糖酸钠，并且包含：140mmol/l的钠离子、5mmol/l的钾离子、1.5mmol/l的镁离子、98mmol/l的氯离子、27mmol/l的乙酸根离子(CH3COO-)、23mmol/l的葡萄糖酸根离子(C6H11O7 -)，其中溶液的理论渗透压为294mOsm/l，pH为约7.4(从6.5-8.0))，(e)HypoThermosol FRS配制品(HTS，生物生命溶液公司(BioLife Solutions))(包含/：Trolox、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、H2PO4 -、HEPES、乳糖酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱甘肽)以及(e)如实施例1中限定的溶液。短期保存(最长120小时)在4℃的温度下进行，其中在(d)组和(e)组的情况下还在室温下进行。在实验过程中，在选定的时间点观察细胞活力和有活力细胞的数目。
出于计数的目的，用碘化丙啶标记细胞，并用自动细胞计数器(NanoEntec)计数。
图1示出了实验组(a)、(b)、(d)和(e)获得的活力测量结果，而图2示出了：对于测试组(d)和(e)，作为保存时间函数的有活力细胞的数目。
图1所示的结果证实，在实施例1的溶液的情况下获得了最高的干细胞活力(120小时后高于90％)。在实施例1的溶液的情况下，从实验开始120小时后，有活力细胞的数目也是最高的(图2)。
实施例4
干细胞的冷冻保存
在第二个实验中，测试了实施例2中限定的配制品在干细胞冷冻保存中的可用性。在这个实验中，使用了与实施例1中相同类型的干细胞。将经认证的配制品Stem-CellBanker(Zenoaq)用作参考配制品。实验在-196℃的温度下进行了7天。
在解冻细胞后，进行活力测量(以与实施例1中相同的方式)，并将细胞转移到储存溶液(HypoThermosol FRS(HTS，生物生命溶液公司)(参考配制品)和实施例1的溶液)中，以评估储存条件的变化是否对细胞活力产生负面影响。
在所述保存期间，在选定的时间点(12小时、24小时、48小时、72小时)观察细胞活力。
图3示出了冷冻储存后干细胞活力测量的结果。所述测量结果证实实施例2的配制品提供了冷冻状态下干细胞的有效保存。
图4示出了对于HypoThermosol FRS配制品和实施例1的溶液，解冻后在选定的时间点的干细胞活力测量的结果。图4所示的结果清楚地示出了：实施例1的溶液表现出比所使用的参考配制品更好的特性。

Claims (11)

1.包含分子量为约35000Da的聚乙二醇(PEG)的水溶液作为用于保存干细胞的细胞外试剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述PEG以约0.01mmol/l至约5mmol/l的浓度存在于所述溶液中。
3.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述PEG以低于约1mmol/l的浓度存在于所述溶液中。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述PEG以约0.03mmol/l的浓度存在于所述溶液中。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述溶液包含至少约30mmol/l浓度的Na+离子以及至少约10mmol/l浓度的K+离子。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述溶液包含约125mmol/l浓度的Na+离子以及约25mmol/l浓度的K+离子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述溶液包含：
Figure FDA0003232013220000011
以及另外地
所述溶液的pH在约6,5至约8的范围内，以及
所述溶液的渗透压在约290mOsm/kg至约320mOsm/kg的范围内。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述溶液包含
Figure FDA0003232013220000012
Figure FDA0003232013220000021
以及
其量足以获得pH约7.4的NaOH、以及
注射用水，
其中所述溶液具有300mOsm/kg的渗透压并且包含约125mmol/l的Na+离子。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述用于保存干细胞的细胞外试剂被用于干细胞的冷冻保存。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述溶液进一步包含二甲亚砜(DMSO)，所述二甲亚砜(DMSO)的浓度为相对于所述溶液的总体积约5体积％至约20体积％。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述溶液包含DMSO，所述DMSO的浓度为相对于所述溶液的总体积约10体积％。
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