CN117481109B - 一种细胞储存介质及储存方法 - Google Patents
一种细胞储存介质及储存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117481109B CN117481109B CN202311799067.1A CN202311799067A CN117481109B CN 117481109 B CN117481109 B CN 117481109B CN 202311799067 A CN202311799067 A CN 202311799067A CN 117481109 B CN117481109 B CN 117481109B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- trehalose
- vitamin
- proline
- weight
- prepared
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003860 storage Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 103
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 103
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 103
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 97
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims abstract description 70
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims abstract description 70
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims abstract description 70
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims abstract description 70
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 70
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 45
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 32
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 30
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 28
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims abstract description 26
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims abstract description 19
- FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N anthracene-2-sulfonyl chloride Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC(S(=O)(=O)Cl)=CC=C3C=C21 FZAQROFXYZPAKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims abstract description 15
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims abstract description 15
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 claims abstract description 13
- GTDPSWPPOUPBNX-UHFFFAOYSA-N ac1mqpva Chemical compound CC12C(=O)OC(=O)C1(C)C1(C)C2(C)C(=O)OC1=O GTDPSWPPOUPBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 37
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 33
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 27
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 23
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 10
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 9
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 8
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- PFPYHYZFFJJQFD-UHFFFAOYSA-N oxalic anhydride Chemical compound O=C1OC1=O PFPYHYZFFJJQFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000013078 crystal Substances 0.000 abstract description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 abstract description 4
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 abstract description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 abstract description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 abstract description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 42
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 21
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 16
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 11
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000003507 refrigerant Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013043 cell viability test Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940095674 pellet product Drugs 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明提出了一种细胞储存介质及储存方法,属于细胞储存技术领域。将海藻糖与二酸酐反应后制得羧基化海藻糖,分液与脯氨酸和维生素C反应,产物加入大豆卵磷脂、胆固醇中,制备脯氨酸‑海藻糖/维生素C‑海藻糖混合脂质体,与甜菜碱、β‑烟酰胺单核苷酸、亚精胺、海藻糖、甘油、HEPES缓冲溶液混合均匀,制得细胞储存介质。本发明制得的细胞储存介质对脂肪间充质干细胞具有很好的低温保护作用,能够明显改善单独添加海藻糖的效果,有一定的渗透性,减少胞内冰晶形成从而减少细胞损伤,同时安全无毒,能够促进干细胞分化,提高干细胞存活率和干性,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及细胞储存技术领域,具体涉及一种细胞储存介质及储存方法。
背景技术
细胞是生命的基本单位,人体即是由200多种细胞组成的,例如心肌细胞,血细胞和干细胞。干细胞是拥有自我更新和分化能力的细。从脂肪组织中获取间充质干细胞是成体干细胞来源的最佳途径,它在体外增殖快、衰亡率低、分化能力强,同时具有储备量大、取材容易、经体外扩增后具有较低的免疫原性和良好的免疫调节功能等优点,非常具有临床应用潜力,可以治疗多种疑难病症并已取得了突破性进展。因此,脂肪间充质干细胞的储存有重要意义。
目前,多采用二甲亚砜(10%)和胎牛血清蛋白(FBS) (90%)的冻存液冷冻保存干细胞,但是,这些冷冻剂中高浓度冷冻剂的细胞毒性作用,如二甲亚砜不利于细胞的恢复。也有人研究通过1,2-丙二醇、甘油替换二甲亚砜作为冷冻液,但是冷冻效果尚且不如二甲亚砜。
CN107306936B公开了一种常温条件下保存运输干细胞的方法及其所使用的基质。保存运输干细胞的方法包括:干细胞团块形成步骤;干细胞团块培养步骤;干细胞团块制品封装运输步骤;干细胞团块基质去除步骤。可见,该方法需要形成干细胞团块和去除干细胞团块基质的过程,过程比较复杂。
发明内容
本发明的目的在于提出一种细胞储存介质及储存方法,具有很好的低温保护作用,能够明显改善单独添加海藻糖的效果,有一定的渗透性,减少胞内冰晶形成从而减少细胞损伤,同时安全无毒,能够促进干细胞分化,提高干细胞存活率和干性,具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明提供一种细胞储存介质的制备方法,将海藻糖与二酸酐反应后制得羧基化海藻糖,分液与脯氨酸和维生素C反应,产物加入大豆卵磷脂、胆固醇中,制备脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体,与甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸、亚精胺、海藻糖、甘油、HEPES缓冲溶液混合均匀,制得细胞储存介质。
作为本发明的进一步改进,包括以下步骤:
S1.羧基化海藻糖的制备:将海藻糖与二酸酐在碱的存在下反应,制得羧基化海藻糖;
S2.脯氨酸-海藻糖的制备:将脯氨酸和步骤S1制得的羧基化海藻糖在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的存在下反应,制得脯氨酸-海藻糖;
S3.氯化海藻糖的制备:将海藻糖与二氯亚砜反应,制得氯化海藻糖;
S4.维生素C-海藻糖的制备:将步骤S3制得的氯化海藻糖与维生素C在碱的存在下反应,制得维生素C-海藻糖;
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的制备:将步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、步骤S4制得的维生素C-海藻糖与大豆卵磷脂、胆固醇溶于溶剂中,混合均匀,减压旋蒸挥发溶剂,然后加入HEPES缓冲溶液,加热水合,超声,微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体;
S6.活性剂的制备:将甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸、亚精胺混合均匀,制得活性剂;
S7.细胞储存介质的制备:将步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、步骤S6制得的活性剂、海藻糖、甘油、HEPES缓冲溶液混合均匀,制得细胞储存介质。
作为本发明的进一步改进,步骤S1中所述海藻糖、二酸酐、碱的摩尔比为2-3:1:3-5,所述反应的温度为70-80℃,时间为7-12h,所述碱选自三乙胺、二乙胺、NaOH、KOH中的至少一种,所述二酸酐选自乙二酸酐、马来酸酐、琥珀酸酐中的至少一种;步骤S2中所述脯氨酸、羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1-1.2:1:1.8-2.2:1.8-2.2,所述反应的温度为35-45℃,时间为17-20h。
作为本发明的进一步改进,步骤S3中所述海藻糖与二氯亚砜的摩尔比为1.2-1.5:1,所述反应温度为室温,时间为0.5-1h;步骤S4中所述氯化海藻糖、维生素C、碱的摩尔比为1:1.1-1.2:3-5,所述反应温度为50-60℃,时间为2-4h,所述碱选自三乙胺、二乙胺、NaOH、KOH中的至少一种。
作为本发明的进一步改进,步骤S5中所述脯氨酸-海藻糖、维生素C-海藻糖、大豆卵磷脂、胆固醇的质量比为5-7:3-5:12-15:3-5,所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为3-5:1的混合溶剂,所述HEPES缓冲溶液的浓度为8-12mmol/L,所述加热水合的温度为50-55℃,时间为0.5-1h,所述超声的功率为800-1000W,时间为10-20min,所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
作为本发明的进一步改进,步骤S6中所述甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸、亚精胺的质量比为3-5:0.5-1:0.1-0.3。
作为本发明的进一步改进,步骤S7中所述脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、活性剂、海藻糖、甘油、HEPES缓冲溶液的质量比为5-7:2-4:7-10:3-5:100-120,所述HEPES缓冲溶液的浓度为8-12mmol/L。
作为本发明的进一步改进,具体包括以下步骤:
S1.羧基化海藻糖的制备:将2-3摩尔当量海藻糖、1摩尔当量二酸酐溶于乙腈中,加入3-5摩尔当量的碱,在70-80℃条件下搅拌反应7-12h,制得羧基化海藻糖;
S2.脯氨酸-海藻糖的制备:将1摩尔当量步骤S1制得的羧基化海藻糖、1.8-2.2摩尔当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.8-2.2摩尔当量N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中,冰水浴搅拌活化20-30min,加入1-1.2摩尔当量的脯氨酸,在35-45℃条件下搅拌反应17-20h,制得脯氨酸-海藻糖;
S3.氯化海藻糖的制备:将1.2-1.5摩尔当量海藻糖溶于二氯甲烷中,在冰水浴条件下加入1摩尔当量二氯亚砜,室温搅拌反应0.5-1h,制得氯化海藻糖;
S4.维生素C-海藻糖的制备:将1摩尔当量步骤S3制得的氯化海藻糖、1.1-1.2摩尔当量维生素C和3-5摩尔当量碱加入乙腈中,50-60℃反应2-4h,制得维生素C-海藻糖;
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的制备:将5-7重量份步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、3-5重量份步骤S4制得的维生素C-海藻糖、12-15重量份大豆卵磷脂、3-5重量份胆固醇溶于200重量份溶剂中,所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为3-5:1的混合溶剂,混合均匀,减压至压强为90-100kPa,在50-60℃水浴中旋蒸挥干溶剂,然后加入浓度为8-12mmol/LHEPES缓冲溶液,加热至55-60℃,水合0.5-1h,800-1000W超声10-20min,用0.22μm微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体;
S6.活性剂的制备:将3-5重量份甜菜碱、0.5-1重量份β-烟酰胺单核苷酸、0.1-0.3重量份亚精胺混合均匀,制得活性剂;
S7.细胞储存介质的制备:将5-7重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、2-4重量份步骤S6制得的活性剂、7-10重量份海藻糖、3-5重量份甘油、100-120重量份浓度为8-12mmol/LHEPES缓冲溶液混合均匀,制得细胞储存介质。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的细胞储存介质。
本发明进一步保护一种脂肪间充质干细胞的储存方法,将脂肪间充质干细胞均匀分散在上述细胞储存介质中,细胞密度为106-107个/mL,然后将混合液在3-5℃平衡50-70min,以0.8-1.2℃/min的速度降至-78至-85℃保存。
本发明具有如下有益效果:
海藻糖是一种无毒且生物相容性好的非膜渗透性的天然二糖,具有良好的抗低温、失水的能力,可以保证生物组织在低温失水状态下的存活,但只有当海藻糖同时存在于细胞膜两侧时,才能充分发挥保护作用。
本发明制备了一种脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体,能够促进海藻糖组分与细胞膜融合从而进入细胞膜内,保证在细胞膜两侧均含有一定浓度的海藻糖,起到了很好的保护作用;而脯氨酸对海藻糖的改性,能够起到减少细胞渗透压损伤的作用,还可以抑制冰的结晶,从而有效减少细胞冷冻保存过程中的渗透损伤和冰晶的机械损伤的效果。维生素C对海藻糖的改性,能够提高干细胞的干性、多能性、自我更新和分化能力,促进诱导多能干细胞的产生。同时,脂质体中磷脂及胆固醇的存在,对冻存后细胞膜的损伤也能够进行修复的作用。
因此,通过制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体和海藻糖的协同作用,在较低的浓度下就能对脂肪间充质干细胞起到很好的低温保护作用,整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化,从而避免“胞内冰损伤”、“溶质性损伤”和“细胞骨架系统损伤”等。
本发明活性剂包括甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸、亚精胺,其中,β-烟酰胺单核苷酸是辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体,能够适当延长脂肪间充质干细胞的寿命,具有抗衰老的作用。自噬是一个降解细胞中不需要的蛋白质的过程,是多能干细胞的产生所必需的,亚精胺是一种抗衰老自噬诱导剂,可以通过诱导自噬,降解细胞中不需要的蛋白质,促进多能干细胞的产生。甜菜碱能够维持胚胎干细胞自我更新,多向分化的能力。本发明活性剂多种小分子的协同作用,起到维持细胞干性或促进细胞重编程的能力,同时,具有安全性高、成本低和效率高的优势。
甘油可以与水分子紧密结合,降低体系的冰点,增加粘滞性,减小低温和深低温情况下形成的冰晶大小,从而起到了减少对细胞膜的机械损伤的效果。
本发明制得的细胞储存介质对脂肪间充质干细胞具有很好的低温保护作用,能够明显改善单独添加海藻糖的效果,有一定的渗透性,减少胞内冰晶形成从而减少细胞损伤,同时安全无毒,能够促进干细胞分化,提高干细胞存活率和干性,具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
猪脂肪间充质干细胞,购于上海联祖生物科技有限公司。
实施例1:本实施例提供一种细胞储存介质的制备方法,具体包括以下步骤:
具体包括以下步骤:
S1.羧基化海藻糖的制备:将0.2mol海藻糖、0.1mol乙二酸酐溶于200mL乙腈中,加入0.3mol NaOH,在70℃条件下搅拌反应7h,减压除去溶剂,乙醇和乙醚按照体积比1:3重结晶,制得羧基化海藻糖;
S2.脯氨酸-海藻糖的制备:将0.1mol步骤S1制得的羧基化海藻糖、0.18mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.18mol N-羟基琥珀酰亚胺溶于200mL水中,冰水浴搅拌活化20min,加入0.1mol脯氨酸,在35℃条件下搅拌反应17h,反应结束后,产物过滤,洗涤,干燥,制得脯氨酸-海藻糖;
S3.氯化海藻糖的制备:将0.12mol海藻糖溶于200mL二氯甲烷中,在冰水浴条件下加入0.1mol二氯亚砜,室温搅拌反应0.5h,减压除去溶剂,产物洗涤,干燥,制得氯化海藻糖;
S4.维生素C-海藻糖的制备:将0.1mol步骤S3制得的氯化海藻糖、0.11mol维生素C和0.3mol NaOH加入200mL乙腈中,50℃反应2h,减压除去溶剂,产物用乙醚重结晶,制得维生素C-海藻糖;
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的制备:将5重量份步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、3重量份步骤S4制得的维生素C-海藻糖、12重量份大豆卵磷脂、3重量份胆固醇溶于200重量份溶剂中,搅拌混合15min,减压至压强为90kPa,在50℃水浴中旋蒸挥干溶剂,然后加入浓度为8mmol/L HEPES缓冲溶液,加热至55℃,水合0.5h,800W超声10min,用0.22μm微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体;
所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为3:1的混合溶剂;
S6.活性剂的制备:将3重量份甜菜碱、0.5重量份β-烟酰胺单核苷酸、0.1重量份亚精胺搅拌混合20min,制得活性剂;
S7.细胞储存介质的制备:将5重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、2重量份步骤S6制得的活性剂、7重量份海藻糖、3重量份甘油、100重量份浓度为8mmol/L HEPES缓冲溶液搅拌混合20min,制得细胞储存介质。
实施例2:本实施例提供一种细胞储存介质的制备方法,具体包括以下步骤:
具体包括以下步骤:
S1.羧基化海藻糖的制备:将0.3mol海藻糖、0.1mol乙二酸酐溶于200mL乙腈中,加入0.5mol KOH,在80℃条件下搅拌反应12h,减压除去溶剂,乙醇和乙醚按照体积比1:3重结晶,制得羧基化海藻糖;
S2.脯氨酸-海藻糖的制备:将0.1mol步骤S1制得的羧基化海藻糖、0.22mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.22mol N-羟基琥珀酰亚胺溶于200mL水中,冰水浴搅拌活化30min,加入0.12mol脯氨酸,在45℃条件下搅拌反应20h,反应结束后,产物过滤,洗涤,干燥,制得脯氨酸-海藻糖;
S3.氯化海藻糖的制备:将0.15mol海藻糖溶于200mL二氯甲烷中,在冰水浴条件下加入0.1mol二氯亚砜,室温搅拌反应1h,减压除去溶剂,产物洗涤,干燥,制得氯化海藻糖;
S4.维生素C-海藻糖的制备:将0.1mol步骤S3制得的氯化海藻糖、0.12mol维生素C和0.5mol KOH加入200mL乙腈中,60℃反应4h,减压除去溶剂,产物用乙醚重结晶,制得维生素C-海藻糖;
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的制备:将7重量份步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、5重量份步骤S4制得的维生素C-海藻糖、15重量份大豆卵磷脂、5重量份胆固醇溶于200重量份溶剂中,搅拌混合15min,减压至压强为100kPa,在60℃水浴中旋蒸挥干溶剂,然后加入浓度为12mmol/L HEPES缓冲溶液,加热至60℃,水合1h,1000W超声20min,用0.22μm微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体;
所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为5:1的混合溶剂;
S6.活性剂的制备:将5重量份甜菜碱、1重量份β-烟酰胺单核苷酸、0.3重量份亚精胺搅拌混合20min,制得活性剂;
S7.细胞储存介质的制备:将7重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、4重量份步骤S6制得的活性剂、10重量份海藻糖、5重量份甘油、120重量份浓度为12mmol/L HEPES缓冲溶液搅拌混合20min,制得细胞储存介质。
实施例3:本实施例提供一种细胞储存介质的制备方法,具体包括以下步骤:
具体包括以下步骤:
S1.羧基化海藻糖的制备:将0.25mol海藻糖、0.1mol乙二酸酐溶于200mL乙腈中,加入0.4mol三乙胺,在75℃条件下搅拌反应10h,减压除去溶剂,乙醇和乙醚按照体积比1:3重结晶,制得羧基化海藻糖;
S2.脯氨酸-海藻糖的制备:将0.1mol步骤S1制得的羧基化海藻糖、0.2mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.2mol N-羟基琥珀酰亚胺溶于200mL水中,冰水浴搅拌活化25min,加入0.11mol脯氨酸,在40℃条件下搅拌反应18h,反应结束后,产物过滤,洗涤,干燥,制得脯氨酸-海藻糖;
S3.氯化海藻糖的制备:将0.135mol海藻糖溶于200mL二氯甲烷中,在冰水浴条件下加入0.1mol二氯亚砜,室温搅拌反应1h,减压除去溶剂,产物洗涤,干燥,制得氯化海藻糖;
S4.维生素C-海藻糖的制备:将0.1mol步骤S3制得的氯化海藻糖、0.115mol维生素C和0.4mol三乙胺加入200mL乙腈中,55℃反应3h,减压除去溶剂,产物用乙醚重结晶,制得维生素C-海藻糖;
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的制备:将6重量份步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、4重量份步骤S4制得的维生素C-海藻糖、13.5重量份大豆卵磷脂、4重量份胆固醇溶于200重量份溶剂中,搅拌混合15min,减压至压强为95kPa,在55℃水浴中旋蒸挥干溶剂,然后加入浓度为10mmol/L HEPES缓冲溶液,加热至57℃,水合1h,900W超声15min,用0.22μm微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体;
所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为4:1的混合溶剂;
S6.活性剂的制备:将4重量份甜菜碱、0.7重量份β-烟酰胺单核苷酸、0.2重量份亚精胺搅拌混合20min,制得活性剂;
S7.细胞储存介质的制备:将6重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、3重量份步骤S6制得的活性剂、8.5重量份海藻糖、4重量份甘油、110重量份浓度为10mmol/L HEPES缓冲溶液搅拌混合20min,制得细胞储存介质。
实施例4:与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的添加量为1重量份。
实施例5:与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的添加量为12重量份。
对比例1
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中未添加脯氨酸-海藻糖。
具体如下:
S5.维生素C-海藻糖脂质体的制备:将10重量份步骤S4制得的维生素C-海藻糖、13.5重量份大豆卵磷脂、4重量份胆固醇溶于200重量份溶剂中,搅拌混合15min,减压至压强为95kPa,在55℃水浴中旋蒸挥干溶剂,然后加入浓度为10mmol/L HEPES缓冲溶液,加热至57℃,水合1h,900W超声15min,用0.22μm微孔滤膜过滤,制得维生素C-海藻糖脂质体;
所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为4:1的混合溶剂。
对比例2
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中未添加维生素C-海藻糖。
具体如下:
S5.脯氨酸-海藻糖脂质体的制备:将10重量份步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、13.5重量份大豆卵磷脂、4重量份胆固醇溶于200重量份溶剂中,搅拌混合15min,减压至压强为95kPa,在55℃水浴中旋蒸挥干溶剂,然后加入浓度为10mmol/L HEPES缓冲溶液,加热至57℃,水合1h,900W超声15min,用0.22μm微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖脂质体;
所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为4:1的混合溶剂。
对比例3
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S5中为脯氨酸-海藻糖和维生素C-海藻糖的混合,未进行脂质体包埋制备。
具体如下:
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合物的制备:将6重量份步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、4重量份步骤S4制得的维生素C-海藻糖混合均匀,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合物;
所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为4:1的混合溶剂。
对比例4
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未添加甜菜碱。
具体如下:
S6.活性剂的制备:将0.7重量份β-烟酰胺单核苷酸、0.2重量份亚精胺搅拌混合20min,制得活性剂。
对比例5
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未添加β-烟酰胺单核苷酸。
具体如下:
S6.活性剂的制备:将4重量份甜菜碱、0.2重量份亚精胺搅拌混合20min,制得活性剂。
对比例6
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S6中未添加亚精胺。
具体如下:
S6.活性剂的制备:将4重量份甜菜碱、0.7重量份β-烟酰胺单核苷酸搅拌混合20min,制得活性剂。
对比例7
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中未添加活性剂。
具体如下:
S7.细胞储存介质的制备:将6重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、8.5重量份海藻糖、4重量份甘油、110重量份浓度为10mmol/L HEPES缓冲溶液搅拌混合20min,制得细胞储存介质。
对比例8
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中未添加脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体。
具体如下:
S7.细胞储存介质的制备:将3重量份步骤S6制得的活性剂、8.5重量份海藻糖、4重量份甘油、110重量份浓度为10mmol/L HEPES缓冲溶液搅拌混合20min,制得细胞储存介质。
对比例9
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中未添加海藻糖。
具体如下:
S7.细胞储存介质的制备:将6重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、3重量份步骤S6制得的活性剂、4重量份甘油、110重量份浓度为10mmol/LHEPES缓冲溶液搅拌混合20min,制得细胞储存介质。
对比例10
与实施例3相比,不同之处在于,步骤S7中未添加甘油。
具体如下:
S7.细胞储存介质的制备:将6重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、3重量份步骤S6制得的活性剂、8.5重量份海藻糖、110重量份浓度为10mmol/L HEPES缓冲溶液搅拌混合20min,制得细胞储存介质。
实施例6:一种脂肪间充质干细胞的储存方法,将猪脂肪间充质干细胞均匀分散在实施例1制得的细胞储存介质中,细胞密度为2×106个/mL,然后将混合液在3℃平衡50min,以0.8℃/min的速度降至-78℃保存。
实施例7:一种脂肪间充质干细胞的储存方法,将猪脂肪间充质干细胞均匀分散在实施例2制得的细胞储存介质中,细胞密度为107个/mL,然后将混合液在5℃平衡70min,以1.2℃/min的速度降至-85℃保存。
实施例8:一种脂肪间充质干细胞的储存方法,将猪脂肪间充质干细胞均匀分散在实施例3制得的细胞储存介质中,细胞密度为5×106个/mL,然后将混合液在4℃平衡60min,以1℃/min的速度降至-80℃保存。
实施例9-10和对比例11-20与实施例8相比,不同之处在于,细胞储存介质分别由实施例4-5或对比例1-10制得的的细胞储存介质替代。
测试例1 细胞毒性测试
用含有10%(v/v)胎牛血清、1%(v/v)双抗的DMEM复合培养基,在5%的CO2、37℃培养箱中培养L929细胞。当细胞生长密度达到70%左右时,用胰蛋白酶消化L929细胞,将消化后的细胞种在96孔板(1×105/孔)中,各添加200μL的DMEM培养基,继续培养24h后,用移液枪去除96孔板中的培养基,实验组加入分别200μL实施例1-5和对比例1-10制得的细胞储存介质,继续培养24h,对照组为10mmol/L HEPES缓冲溶液。培养结束后,去除介质,在避光处向每孔中加入含有5mg/ml L-13-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的10mmol/LHEPES缓冲溶液20μL,继续避光培养4h。之后去除缓冲液,每孔加入150μL DMSO,在37℃摇床中孵化30min后,使用酶标仪测定其在490nm处的吸光度。
细胞存活率(%)=OD(样品组)/OD(对照组)×100%
结果见表1。
表1
由上表可知,加入本发明实施例1-3制得的细胞储存介质后,L929细胞存活率高于90%,对细胞几乎没有细胞毒性,具有较好的生物相容性。
测试例2
将猪脂肪间充质干细胞程序升温解冻后用α-MEM完全培养液重悬细胞,在37℃和5%二氧化碳加湿培养箱中培养进行体外培养,待细胞密度为60-70%时,用PBS溶液冲洗细胞,接种到无血清培养基中,接种后细胞密度为2×107个/mL,培养36h后,收集细胞,获得猪脂肪间充质干细胞。
将获得的猪脂肪间充质干细胞分别按照实施例6-10和对比例11-20中得到进行储存30天,然后将样品以2℃/min的速率升温至-20℃,放入0℃冰水混合物中解冻30min,在37℃恒温培养箱解冻1h,然后将样品浸入50mmol/L柠檬酸钠溶液中,轻轻摇动5min,离心收集细胞并用新鲜培养基重悬。
细胞存活率测试:
使用台盼蓝染色法评估细胞存活率。将细胞悬液用等体积的0.4%台盼蓝染色剂在室温下孵育2min。使用细胞计数器测试活细胞数量,并通过计算获得细胞存活率。
细胞存活率(%)=活细胞数/总细胞数×100%。
结果见表2。
表2
由上表可知,本发明实施例1-3制得的细胞储存介质能明显提高冻存细胞的存活率。
细胞克隆率测试:
将细胞接种至10cm细胞培养皿中,每皿接种200个细胞,每皿加入10mL培养基,缓慢晃动培养皿,使细胞均匀分布,将培养皿置于37℃和5%二氧化碳加湿培养箱中培养3周,取出,去培养基,杜氏磷酸盐缓冲液清洗3次,加入5mL甲醇固定15min,去固定液,加入1mLGiemsa染色1,混匀,1min后加入2mL Giemsa染色2,混匀后室温染色10min,流水洗去染色液,晾干,计数大于10个细胞的克隆数,计算克隆形成率。以未进行冻存的干细胞作为对照组。
克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%
结果见表3。
表3
由上表可知,采用本发明实施例1-3制得的细胞储存介质进行冻存,对干细胞的克隆形成率影响不大,不会明显减少克隆团的数量。
实施例4、5与实施例3相比,步骤S7中脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的添加量为1重量份或12重量份。冻存细胞存活率下降,克隆形成率下降。合适的浓度对于提高冻存细胞存活率和保持克隆性能具有明显的影响。
对比例1、2与实施例3相比,步骤S5中未添加脯氨酸-海藻糖或维生素C-海藻糖。对比例3与实施例3相比,步骤S5中为脯氨酸-海藻糖和维生素C-海藻糖的混合,未进行脂质体包埋制备。对比例8与实施例3相比,步骤S7中未添加脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体。冻存细胞存活率下降,克隆形成率下降。本发明制备了一种脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体,能够促进海藻糖组分与细胞膜融合从而进入细胞膜内,保证在细胞膜两侧均含有一定浓度的海藻糖,起到了很好的保护作用;而脯氨酸对海藻糖的改性,能够起到减少细胞渗透压损伤的作用,还可以抑制冰的结晶,从而有效减少细胞冷冻保存过程中的渗透损伤和冰晶的机械损伤的效果。维生素C对海藻糖的改性,能够提高干细胞的干性、多能性、自我更新和分化能力,促进诱导多能干细胞的产生。同时,脂质体中磷脂及胆固醇的存在,对冻存后细胞膜的损伤也能够进行修复的作用。
对比例4、5、6与实施例3相比,步骤S6中未添加甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸或亚精胺。对比例7与实施例3相比,步骤S7中未添加活性剂。细胞毒性提高,冻存细胞存活率下降,克隆形成率下降。本发明活性剂包括甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸、亚精胺,其中,β-烟酰胺单核苷酸是辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体,能够适当延长脂肪间充质干细胞的寿命,具有抗衰老的作用。自噬是一个降解细胞中不需要的蛋白质的过程,是多能干细胞的产生所必需的,亚精胺是一种抗衰老自噬诱导剂,可以通过诱导自噬,降解细胞中不需要的蛋白质,促进多能干细胞的产生。甜菜碱能够维持胚胎干细胞自我更新,多向分化的能力。本发明活性剂多种小分子的协同作用,起到维持细胞干性或促进细胞重编程的能力,同时,具有安全性高、成本低和效率高的优势,三者具有协同增效的作用。
对比例9与实施例3相比,步骤S7中未添加海藻糖。冻存细胞存活率下降,克隆形成率下降。通过制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体和海藻糖的协同作用,在较低的浓度下就能对脂肪间充质干细胞起到很好的低温保护作用,整个保存系统可以在相对较慢的冷却速率下形成玻璃化,从而避免“胞内冰损伤”、“溶质性损伤”和“细胞骨架系统损伤”等。
对比例10与实施例3相比,步骤S7中未添加甘油。冻存细胞存活率下降。甘油可以与水分子紧密结合,降低体系的冰点,增加粘滞性,减小低温和深低温情况下形成的冰晶大小,从而起到了减少对细胞膜的机械损伤的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种细胞储存介质的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.羧基化海藻糖的制备:将海藻糖与二酸酐在碱的存在下反应,制得羧基化海藻糖;
S2.脯氨酸-海藻糖的制备:将脯氨酸和步骤S1制得的羧基化海藻糖在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的存在下反应,制得脯氨酸-海藻糖;
S3.氯化海藻糖的制备:将海藻糖与二氯亚砜反应,制得氯化海藻糖;
S4.维生素C-海藻糖的制备:将步骤S3制得的氯化海藻糖与维生素C在碱的存在下反应,制得维生素C-海藻糖;
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的制备:将步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、步骤S4制得的维生素C-海藻糖与大豆卵磷脂、胆固醇溶于溶剂中,混合均匀,减压旋蒸挥发溶剂,然后加入HEPES缓冲溶液,加热水合,超声,微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体;
S6.活性剂的制备:将甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸、亚精胺混合均匀,制得活性剂;
S7.细胞储存介质的制备:将步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、步骤S6制得的活性剂、海藻糖、甘油、HEPES缓冲溶液混合均匀,制得细胞储存介质。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S1中所述海藻糖、二酸酐、碱的摩尔比为2-3:1:3-5,所述反应的温度为70-80℃,时间为7-12h,所述碱选自三乙胺、二乙胺、NaOH、KOH中的至少一种,所述二酸酐选自乙二酸酐、马来酸酐、琥珀酸酐中的至少一种;步骤S2中所述脯氨酸、羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1-1.2:1:1.8-2.2:1.8-2.2,所述反应的温度为35-45℃,时间为17-20h。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S3中所述海藻糖与二氯亚砜的摩尔比为1.2-1.5:1,所述反应温度为室温,时间为0.5-1h;步骤S4中所述氯化海藻糖、维生素C、碱的摩尔比为1:1.1-1.2:3-5,所述反应温度为50-60℃,时间为2-4h,所述碱选自三乙胺、二乙胺、NaOH、KOH中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S5中所述脯氨酸-海藻糖、维生素C-海藻糖、大豆卵磷脂、胆固醇的质量比为5-7:3-5:12-15:3-5,所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为3-5:1的混合溶剂,所述HEPES缓冲溶液的浓度为8-12mmol/L,所述加热水合的温度为50-55℃,时间为0.5-1h,所述超声的功率为800-1000W,时间为10-20min,所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S6中所述甜菜碱、β-烟酰胺单核苷酸、亚精胺的质量比为3-5:0.5-1:0.1-0.3。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤S7中所述脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、活性剂、海藻糖、甘油、HEPES缓冲溶液的质量比为5-7:2-4:7-10:3-5:100-120,所述HEPES缓冲溶液的浓度为8-12mmol/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
S1.羧基化海藻糖的制备:将2-3摩尔当量海藻糖、1摩尔当量二酸酐溶于乙腈中,加入3-5摩尔当量的碱,在70-80℃条件下搅拌反应7-12h,制得羧基化海藻糖;
S2.脯氨酸-海藻糖的制备:将1摩尔当量步骤S1制得的羧基化海藻糖、1.8-2.2摩尔当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1.8-2.2摩尔当量N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中,冰水浴搅拌活化20-30min,加入1-1.2摩尔当量的脯氨酸,在35-45℃条件下搅拌反应17-20h,制得脯氨酸-海藻糖;
S3.氯化海藻糖的制备:将1.2-1.5摩尔当量海藻糖溶于二氯甲烷中,在冰水浴条件下加入1摩尔当量二氯亚砜,室温搅拌反应0.5-1h,制得氯化海藻糖;
S4.维生素C-海藻糖的制备:将1摩尔当量步骤S3制得的氯化海藻糖、1.1-1.2摩尔当量维生素C和3-5摩尔当量碱加入乙腈中,50-60℃反应2-4h,制得维生素C-海藻糖;
S5.脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体的制备:将5-7重量份步骤S2制得的脯氨酸-海藻糖、3-5重量份步骤S4制得的维生素C-海藻糖、12-15重量份大豆卵磷脂、3-5重量份胆固醇溶于200重量份溶剂中,所述溶剂为二氯甲烷和乙醇的按照体积比为3-5:1的混合溶剂,混合均匀,减压至压强为90-100kPa,在50-60℃水浴中旋蒸挥干溶剂,然后加入浓度为8-12mmol/LHEPES缓冲溶液,加热至55-60℃,水合0.5-1h,800-1000W超声10-20min,用0.22μm微孔滤膜过滤,制得脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体;
S6.活性剂的制备:将3-5重量份甜菜碱、0.5-1重量份β-烟酰胺单核苷酸、0.1-0.3重量份亚精胺混合均匀,制得活性剂;
S7.细胞储存介质的制备:将5-7重量份步骤S5制得的脯氨酸-海藻糖/维生素C-海藻糖混合脂质体、2-4重量份步骤S6制得的活性剂、7-10重量份海藻糖、3-5重量份甘油、100-120重量份浓度为8-12mmol/LHEPES缓冲溶液混合均匀,制得细胞储存介质。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的细胞储存介质。
9.一种脂肪间充质干细胞的储存方法,其特征在于,将脂肪间充质干细胞均匀分散在权利要求8所述的细胞储存介质中,细胞密度为106-107个/mL,然后将混合液在3-5℃平衡50-70min,以0.8-1.2℃/min的速度降至-78至-85℃保存。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311799067.1A CN117481109B (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种细胞储存介质及储存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311799067.1A CN117481109B (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种细胞储存介质及储存方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117481109A CN117481109A (zh) | 2024-02-02 |
CN117481109B true CN117481109B (zh) | 2024-03-12 |
Family
ID=89678577
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311799067.1A Active CN117481109B (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种细胞储存介质及储存方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117481109B (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110343245A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-10-18 | 天津大学 | 一种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽及制备方法 |
CN110934132A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-03-31 | 苏州君欣生物科技有限公司 | 一种无血清无dmso细胞冻存液及其制备方法 |
CN114982744A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-09-02 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种脐带干细胞储存液及其制备方法 |
CN116569914A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-08-11 | 安徽工业大学 | 一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液及其应用 |
CN117279505A (zh) * | 2021-05-04 | 2023-12-22 | 组织测试技术有限公司 | 冷冻保存方案中不含其它冷冻保护剂的使用海藻糖的保存方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11485953B2 (en) * | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Transwell Biotech Co., Ltd. | Compositions and methods for maintaining cell viability |
EP3685665B1 (en) * | 2019-01-23 | 2023-06-07 | Carnamedica sp. z o.o. | Use of a solution comprising peg for the preservation of stem cells |
-
2023
- 2023-12-26 CN CN202311799067.1A patent/CN117481109B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110343245A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-10-18 | 天津大学 | 一种ε-聚赖氨酸-接枝-疏水氨基酸-接枝-海藻糖的糖肽及制备方法 |
CN110934132A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-03-31 | 苏州君欣生物科技有限公司 | 一种无血清无dmso细胞冻存液及其制备方法 |
CN117279505A (zh) * | 2021-05-04 | 2023-12-22 | 组织测试技术有限公司 | 冷冻保存方案中不含其它冷冻保护剂的使用海藻糖的保存方法 |
CN114982744A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-09-02 | 广州沙艾生物科技有限公司 | 一种脐带干细胞储存液及其制备方法 |
CN116569914A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-08-11 | 安徽工业大学 | 一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity;Zhang M, Oldenhof H, Sydykov B, et al.;Scientific reports;20171231;第7卷(第1期);6198 * |
糖类保护剂在组织低温保存中的研究进展;任丹丹等;医学研究杂志;20230630;第52卷(第7期);180-183 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117481109A (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107027743B (zh) | 细胞冻存液及细胞冻存方法 | |
CN103667187B (zh) | 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法 | |
US20220325247A1 (en) | METHOD FOR PROMOTING GROWTH OF PARIETAL DECIDUAL BASALIS-MESENCHYMAL STEM CELLS (PDB-MSCs) | |
CN105820998A (zh) | 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法 | |
CN106359368A (zh) | 细胞冻存液及冻存方法 | |
Bianco et al. | Characterization of a novel decellularized bone marrow scaffold as an inductive environment for hematopoietic stem cells | |
CN111248193B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞冻存液及其冻存方法 | |
CN105647860A (zh) | 临床治疗级人胎盘底蜕膜来源的间充质干细胞(PDB-MSCs)无血清体外提取制备方法 | |
CN112514892A (zh) | 一种外泌体冻存保护液及其制备方法 | |
CN109619088A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的保存液 | |
CN111973547A (zh) | 干细胞活性因子及其冻干粉剂 | |
CN117481109B (zh) | 一种细胞储存介质及储存方法 | |
CN110577929A (zh) | 一种脐带间充质干细胞的分离培养方法 | |
CN106417253A (zh) | 一种骨骼肌干细胞的冻存液和冻存方法 | |
CN107287254B (zh) | γ-聚谷氨酸的发酵工艺 | |
CN113201489A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法 | |
CN105394028A (zh) | 一种低冷冻损伤的脐带血干细胞冻存方法 | |
CN113133447A (zh) | 一种脐带间充质干细胞冻存液及冻存方法 | |
CN107372469A (zh) | 一种内皮祖细胞的冻存液及冻存方法 | |
CN113412833B (zh) | 一种用于间充质干细胞超低温损伤的冻存保护剂 | |
CN101760445A (zh) | 自体骨髓间充质干细胞的扩增方法 | |
CN111838132A (zh) | 一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液 | |
CN117378598B (zh) | 一种卵母细胞冻存液及其制备方法 | |
CN112425603A (zh) | 一种脂肪干细胞运输保存液 | |
CN114540291B (zh) | 一种脐带间充质干细胞复苏保护液及复苏方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |