CN111973547A - 干细胞活性因子及其冻干粉剂 - Google Patents

干细胞活性因子及其冻干粉剂 Download PDF

Info

Publication number
CN111973547A
CN111973547A CN202010936703.0A CN202010936703A CN111973547A CN 111973547 A CN111973547 A CN 111973547A CN 202010936703 A CN202010936703 A CN 202010936703A CN 111973547 A CN111973547 A CN 111973547A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
umbilical cord
parts
stem cell
active factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010936703.0A
Other languages
English (en)
Inventor
陈清法
毛文哲
杨璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Xiankangda Cell Bank Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Xiankangda Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010936703.0A priority Critical patent/CN111973547A/zh
Publication of CN111973547A publication Critical patent/CN111973547A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/0216—Solid or semisolid forms
    • A61K8/022—Powders; Compacted Powders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/34—Alcohols
    • A61K8/345—Alcohols containing more than one hydroxy group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73—Polysaccharides
    • A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/805—Corresponding aspects not provided for by any of codes A61K2800/81 - A61K2800/95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/84—Products or compounds obtained by lyophilisation, freeze-drying

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了干细胞活性因子及其冻干粉剂，首先提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养。通过采用本发明方法制备的干细胞活性因子及其冻干粉剂，不仅其制备方法简便，而且细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性，并结合保湿锁水的透明质酸和甘油使得冻干粉溶解，直接作用于皮肤，已达到激活细胞功能，方便对肌肤进行修复，其修复效果好，使用方便，可快速对受损肌肤进行修复，达到抵抗肌肤衰老，修复肌肤屏障的目的，达到美容养颜，逆转时光，挽留青春的作用。

Description

干细胞活性因子及其冻干粉剂
技术领域
本发明涉及干细胞活性因子技术领域，具体为干细胞活性因子及其冻干粉剂。
背景技术
在人体内，干细胞是一类保持未分化状态、具有高度自我更新和多项分化潜能的细胞，是机体所有功能细胞的祖宗细胞，在人体的发育及发育成熟后组织器官的维护中起重要作用，干细胞除了能分化为组织细胞修复组织损伤外，还有一个更重要的再生医学功能就是旁分泌细胞因子进行组织修复，如分泌神经细胞营养因子、促血管新生因子、造血支持因子、免疫调节因子、抗凋亡因子和趋化因子等，但是现有的干细胞活性因子提取方法只去除了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，实际应用价值较低。
发明内容
本发明的目的在于提供干细胞活性因子及其冻干粉剂，具备应用价值高的优点，解决了现有的干细胞活性因子提取方法只去除了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，实际应用价值较低的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：干细胞活性因子及其冻干粉剂，包括如下步骤：
（一）干细胞活性因子的提取：
A、提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；
B、当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；
C、当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；
D、细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；
E、将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。
（二）冻干粉剂的制备：
A、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；
B、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；
C、将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min；
D、将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂；
E、将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
优选的，所述步骤一中流式检测标志物结果中显示细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。
优选的，所述步骤一中超声破碎仪破碎细胞时，其程序为：4～6°C，500w，超声2～3秒，间隔8秒，86个循环。
优选的，所述步骤一中脐带选取后，需要对其进行清洗，清洗后的脐带组织剪成4～5cm的小段，清洗一次，然后在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮，然后将华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎，然后将组织碎块转移至125～150ml储液瓶中，加入1～2倍体积的组织消化液，于37～40°C振荡培养箱中消化1.5～3小时，直至无成形组织块，进行细胞培养。
优选的，所述步骤一中的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
通过采用本发明方法制备的干细胞活性因子及其冻干粉剂，不仅其制备方法简便，而且细胞来源具有均质性，符合干细胞的生物学特性，从而保证了干细胞源性活性因子的分泌量，及性能稳定性，并结合保湿锁水的透明质酸和甘油使得冻干粉溶解，直接作用于皮肤，已达到激活细胞功能，方便对肌肤进行修复，其修复效果好，使用方便，可快速对受损肌肤进行修复，达到抵抗肌肤衰老，修复肌肤屏障的目的，达到美容养颜，逆转时光，挽留青春的作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：
干细胞活性因子及其冻干粉剂，包括如下步骤：
（一）干细胞活性因子的提取：
A、提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；
B、当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；
C、当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；
D、细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；
E、将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。
（二）冻干粉剂的制备：
A、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；
B、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；
C、将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min；
D、将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂；
E、将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
实施例一：
首先提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养，然后当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备，然后当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格，然后细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠，最后将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
首选将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用，然后选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液，然后将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min，然后将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂，最后将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
实施例二：
在实施例一中，再加上下述工序：
所述步骤一中流式检测标志物结果中显示细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。
首先提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养，然后当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备，然后当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格，然后细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠，最后将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
首选将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用，然后选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液，然后将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min，然后将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂，最后将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
实施例三：
在实施例二中，再加上下述工序：
所述步骤一中超声破碎仪破碎细胞时，其程序为：4～6°C，500w，超声2～3秒，间隔8秒，86个循环。
首先提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养，然后当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备，然后当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格，然后细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠，最后将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
首选将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用，然后选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液，然后将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min，然后将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂，最后将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
实施例四：
在实施例三中，再加上下述工序：
所述步骤一中脐带选取后，需要对其进行清洗，清洗后的脐带组织剪成4～5cm的小段，清洗一次，然后在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮，然后将华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎，然后将组织碎块转移至125～150ml储液瓶中，加入1～2倍体积的组织消化液，于37～40°C振荡培养箱中消化1.5～3小时，直至无成形组织块，进行细胞培养。
首先提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养，然后当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备，然后当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格，然后细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠，最后将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
首选将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用，然后选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液，然后将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min，然后将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂，最后将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
实施例五：
在实施例四中，再加上下述工序：
所述步骤一中的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红。
首先提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养，然后当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备，然后当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格，然后细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠，最后将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
首选将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用，然后选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液，然后将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min，然后将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂，最后将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：包括如下步骤：
干细胞活性因子的提取：
提取产房中剥离新生胎儿后的脐带组织放入脐带运输液，且经4～6°C环境下24～36h内冷藏后提取脐带间充质干细胞进行培养；
当细胞融合度达65～85%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1～3次，添加2～6ml消化液，室温放置1～3min，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，然后转移至离心管混匀，取样计数，按照6000～8000个细胞/cm²进行传代，2～3天细胞密度达70～80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3～P5代细胞制备；
当细胞活率达80～90%以上时，流式检测标志物合格；
细胞培养至最旺盛时，收集第一次上清至离心管，0.22～0.30μm滤膜过滤上清除菌，用生理盐水清洗2～4次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10～15ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12～24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400～1600r/min，离心4～6min，收集第二次上清，经0.22～0.30μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1～0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；
将上述步骤提取的第一次上清和第二次上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；
（二）冻干粉剂的制备：
A、将上述步骤中制备获得的干细胞活性因子浓缩液，投入反应釜中备用；
B、选取海藻糖2～6份、金桔糖1～4份、甘氨酸2～7份、精氨酸2～6份、氨基乙酸1～4份、甘露醇6～11份、叔丁醇4～12份、蜂蜜12～22份，按比例混合，用振荡器混匀，制成悬液；
C、将上述步骤制备的悬液盛入冷冻盘中，随后放入3～5°C的冰箱中平衡45～60min后，再控温在-30～-25°C冷冻60～80min，然后控温在-80～-60°C冷冻60～90min；
D、将上述步骤中冷冻后的悬液，按4～12份放入反应釜中与干细胞活性因子浓缩液进行混合，然后将混合后的混合液置入真空容器中，借助真空系统将该真空容器内的压力降到三相点以下，同时通过加热模块使真空容器内的温度达到30°C～150°C，使混合液内的水分逐渐蒸发，直至干燥至水分含量为0％～5％，获得片剂；
E、将上述步骤获得的片剂粉碎成50目～200目的粉末，然后压塞密封，即得冻干粉剂。
2.根据权利要求1所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中流式检测标志物结果中显示细胞具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。
3.根据权利要求1所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中超声破碎仪破碎细胞时，其程序为：4～6°C，500w，超声2～3秒，间隔8秒，86个循环。
4.根据权利要求1所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中脐带选取后，需要对其进行清洗，清洗后的脐带组织剪成4～5cm的小段，清洗一次，然后在清洗液中剥离脐带组织中的血管和表皮，然后将华通氏胶撕成小块，清洗后于50ml离心管中剪碎，然后将组织碎块转移至125～150ml储液瓶中，加入1～2倍体积的组织消化液，于37～40°C振荡培养箱中消化1.5～3小时，直至无成形组织块，进行细胞培养。
5.根据权利要求4所述的干细胞活性因子及其冻干粉剂，其特征在于：所述步骤一中的清洗液选用0.9％的生理盐水，所述培养基含有酚红。
CN202010936703.0A 2020-09-08 2020-09-08 干细胞活性因子及其冻干粉剂 Withdrawn CN111973547A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010936703.0A CN111973547A (zh) 2020-09-08 2020-09-08 干细胞活性因子及其冻干粉剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010936703.0A CN111973547A (zh) 2020-09-08 2020-09-08 干细胞活性因子及其冻干粉剂

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111973547A true CN111973547A (zh) 2020-11-24

Family

ID=73449264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010936703.0A Withdrawn CN111973547A (zh) 2020-09-08 2020-09-08 干细胞活性因子及其冻干粉剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111973547A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113583950A (zh) * 2021-08-06 2021-11-02 合肥滴碧云生物科技有限公司 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用
CN114306714A (zh) * 2021-12-31 2022-04-12 安徽科门生物科技有限公司 一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法
CN115125193A (zh) * 2021-07-09 2022-09-30 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 一种动物脐带外泌体及其提取方法和应用
CN117643566A (zh) * 2023-12-11 2024-03-05 瑞因细胞工程科技(广州)有限公司 用于皮肤抗衰的干细胞活性因子精华及其制备方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115125193A (zh) * 2021-07-09 2022-09-30 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 一种动物脐带外泌体及其提取方法和应用
CN115125193B (zh) * 2021-07-09 2024-04-26 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 一种动物脐带提取物及其提取方法和应用
CN113583950A (zh) * 2021-08-06 2021-11-02 合肥滴碧云生物科技有限公司 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用
CN114306714A (zh) * 2021-12-31 2022-04-12 安徽科门生物科技有限公司 一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法
CN114306714B (zh) * 2021-12-31 2022-08-02 安徽科门生物科技有限公司 一种制备用于皮肤再生修复的干细胞复合生物材料的方法
CN117643566A (zh) * 2023-12-11 2024-03-05 瑞因细胞工程科技(广州)有限公司 用于皮肤抗衰的干细胞活性因子精华及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111973547A (zh) 干细胞活性因子及其冻干粉剂
CN106821938B (zh) 一种人间充质干细胞冻干粉的制备方法
CN106982821A (zh) 脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途
CN108823156A (zh) 用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法
CN110693909A (zh) 一种具有生发功效的脐带间充质干细胞因子的制备
CN109593124B (zh) 脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法
CN109627315B (zh) 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法
CN104857022A (zh) 一种间充质干细胞注射液、制备方法及其应用
CN107261213A (zh) 一种活性水凝胶及其制备方法和在手术创伤修复中的应用
CN103667187A (zh) 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法
CN108159078A (zh) 一种细胞生长因子冻干粉、制备方法及应用
CN110448572A (zh) 一种脐带间充质干细胞活性物与脐带血干细胞活性物的复合物的制备方法
CN111088226A (zh) 一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法
CN111388504B (zh) 牙上皮细胞外泌体制备、外泌体植入物的制备及其应用
CN110684722A (zh) 来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法
CN111544454A (zh) 一种促进子宫内膜修复的干细胞复合蛋白制剂的制备方法
CN113430163A (zh) 一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法
CN114984050A (zh) 一种间充质干细胞外泌体冻干粉制备及使用方法
CN105695401B (zh) 一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法
CN112426402A (zh) 一种基于成纤维外泌体的敷贴及制备方法
CN112656815B (zh) 治疗宫腔粘连的方法和使用的干细胞制剂
CN114736856A (zh) 一种犬胎盘间充质干细胞的制备方法及其应用
CN107898812A (zh) 一种基于脐带干细胞及活性成分的软骨损伤混合修复液
CN113583950A (zh) 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用
CN112168805A (zh) 一种胎盘冻干粉胶囊制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20221014

Address after: 523808 Room 301, building 6, No. 9, Xincheng Road, Songshanhu Park, Dongguan City, Guangdong Province

Applicant after: Guangdong xiankangda Cell Bank Co.,Ltd.

Address before: 518000 608, R & D complex building, baoyunda logistics center, Fuhua community, Xixiang street, Bao'an District, Shenzhen, Guangdong Province

Applicant before: SHENZHEN XIANKANGDA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20201124

WW01 Invention patent application withdrawn after publication