CN114306714A - 一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，包括制备干细胞复合生物材料、制备敷设材料、通过敷设材料吸附干细胞复合生物材料后冷冻保存、对敷设材料进行低温解冻后敷设在皮肤对应位置；本发明通过将干细胞培养提取物、寡肽等有效成分与透明质酸钠溶液进行均匀混合，能够起到良好的保湿效果，使有效成分呈胶状，具有一定的粘度，方便其贴附在皮肤上不出现明显的流延；本发明通过将干细胞复合生物材料与敷设材料结合，使其被敷设材料吸附，从而方便将干细胞复合生物材料贴附在皮肤表面，方便使用和吸收。

Description

一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法

技术领域

本发明属于皮肤修复技术领域，具体的，涉及一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是体的第一层屏障，在皮肤因为各种原因出现伤口时，需要及时地对其进行处理，从而加速其修复，使皮肤能够快速地恢复其组织功能，避免皮肤进一步损伤以及出现感染的情况；

现有技术中有通过使用干细胞提取物作为有效成分制备敷料，将制备成凝胶状的干细胞提取物涂覆在伤口处，从而起到保护与修复效果，但是这种方法一方面敷料干燥较快，难以长时间起到有效的防护与修复效果，且干燥后的敷料也难以处理，容易对伤口造成二次伤害，另一方面敷料暴露在空气中，容易受到污染，影响敷料中有效成分的利用，并存在敷料中微生物繁殖速度较快导致伤口出现感染的风险，为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，解决现有技术中基于干细胞的皮肤修复材料易干燥、易污染的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，包括如下步骤：

第一步，制备干细胞复合生物材料；

干细胞复合生物材料的制备方法为：

S1、通过组织块培养法获得脐带间充质干细胞，经纯化，扩大培养后得到干细胞复合因子溶液，通过离心过滤、浓缩与真空冷冻干燥处理后得到冻干粉；

S2、配制透明质酸钠溶液，向其中加入甘油、糖蛋白、酵母提取物、血清蛋白、寡肽以及步骤S1中制备得到的冻干粉，搅拌混合均匀后真空脱泡或离心脱泡得到干细胞复合生物材料；

第二步，制备敷设材料；

第三步，通过敷设材料吸附干细胞复合生物材料后冷冻保存；

第四步，对敷设材料进行低温解冻后敷设在皮肤对应位置；

低温解冻是指在温度不高于4℃的环境下进行解冻。

作为本发明的进一步方案，干细胞复合生物材料中透明质酸钠的质量比0.3％-0.7％，透明质酸钠起到保湿与增稠的效果，冻干粉的添加量为0.1-10g/L，甘油的添加量为20-65g/L，糖蛋白的添加量为15-30g/L，酵母添加物的添加量为5-20g/L，血清蛋白的添加量为10-40g/L，寡肽的添加量为2-8g/L；

作为本发明的进一步方案，寡肽包括寡肽-1、寡肽-3、寡肽4、寡肽5与寡肽-6中的一种或至少两种的任意比混合；

作为本发明的进一步方案，敷设材料的制备方法为：

SS1、将壳聚糖与乙醇加入乙酸溶液中搅拌溶解，得到壳聚糖溶液；

SS2、向壳聚糖溶液中加入甘油与戊二醛，混合均匀后真空脱泡待用；

SS3、向上一步骤处理得到的壳聚糖溶液中加入改性大豆蛋白纤维，待改性大豆蛋白纤维完全浸入壳聚糖溶液后，搅拌混合均匀，真空脱泡；

改性大豆蛋白纤维在壳聚糖溶液中的添加量为12-50g/L；

SS4、将上一步骤处理得到的壳聚糖溶液在表面光滑的玻璃片或瓷片上流延成膜后自然风干，揭膜后用浓度为0.75mol/L的氢氧化钠溶液浸泡处理40-70s，用去离子水冲洗后在温度15-25℃的无菌环境下自然风干，得到敷设材料。

作为本发明的进一步方案，其中壳聚糖的脱乙酰度为81.5％，乙酸溶液的摩尔浓度为0.17-0.60mol/L，壳聚糖在壳聚糖溶液中的用量为15-18g/L；

其中乙醇在乙酸溶液中的添加量为20-18mL/L。

作为本发明的进一步方案，所述改性大豆蛋白纤维的制备方法为：

配制质量浓度为5％的醋酸与质量浓度为1％的尿素的混合溶液，称取壳聚糖加入其中，搅拌混合至壳聚糖完全溶解后，真空脱泡；

配制质量浓度为0.5％-2％的透明质酸钠去离子水溶液，然后向其中加入氢氧化钠调节pH至9.5-10.5，得到透明质酸钠溶液，然后真空脱泡，除去透明质酸钠溶液中的气泡待用；

将混合溶液与透明质酸钠溶液按照体积比1-3:1均匀混合后，向其中加入丝胶蛋白，搅拌使丝胶蛋白均匀分散，真空脱泡处理，然后向其中加入交联剂，均匀混合后静置反应30-60min后得到处理液；

将大豆蛋白纤维加入处理液中，搅拌或者超声分散后浸泡20-30min后，取出大豆蛋白纤维沥干后加入无水乙醇中浸泡1-3h，固液分离，将取出的大豆蛋白纤维烘干干燥后得到改性大豆蛋白纤维。

作为本发明的进一步方案，所述大豆蛋白纤维的长度为0.5-2.5mm。

作为本发明的进一步方案，丝胶蛋白的制备方法为：

S11、将粉末状丝胶蛋白加入去离子水中浸泡复水后，真空冷冻干燥，重复复水-干燥步骤2-4次，得到具有多孔结构的丝胶蛋白；

S12、将上一步骤制备得到的丝胶蛋白加入硝酸银溶液中浸泡15-25min，然后紫外光照射至硝酸银溶液完全转变为黑色，固液分离后烘干干燥，得到丝胶蛋白。

作为本发明的进一步方案，通过敷设材料吸附干细胞复合生物材料的方法为：

将敷设材料浸入干细胞复合生物材料中，采用超声处理，超声频率为25-40KHz，超声时间为2-10min；

超声结束后继续浸渍5-30min。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过将干细胞培养提取物、寡肽等有效成分与透明质酸钠溶液进行均匀混合，能够起到良好的保湿效果，使有效成分呈胶状，具有一定的粘度，方便其贴附在皮肤上不出现明显的流延；

(2)本发明通过将干细胞复合生物材料与敷设材料结合，使其被敷设材料吸附，从而方便将干细胞复合生物材料贴附在皮肤表面，方便使用和吸收；

(3)本发明通过壳聚糖成膜制备敷设材料，成型的敷设材料具有良好的亲肤性与柔软性，敷设材料表面光滑，另外，敷设材料通过加入改性大豆蛋白纤维能够提升敷设材料的保水性质，使敷设材料能够尽可能多的吸附干细胞复合生物材料，使敷设材料在敷设过程中能够保持湿润状态，不会在短时间内出现干燥变硬的情况，并且改性大豆蛋白纤维的均匀混入能够在保证敷设材料的柔软性的同时有效提升敷设材料的抗拉强度，使敷设材料在加工与使用过程中不易断裂；

(4)本发明通过在大豆蛋白纤维表面复合有具有抗细效果的丝胶蛋白，在提升敷设材料的亲肤保水性质的同时，能够有效提升敷设材料的抗菌效果，从而有效抑制混合后的敷设材料与干细胞复合生物材料中的微生物的繁殖。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，包括如下步骤：

第一步，制备干细胞复合生物材料；

第二步，制备敷设材料；

第三步，对干细胞复合生物材料与敷设材料进行整合后冷冻保存；

其中整合是指通过敷设材料吸附干细胞复合生物材料；

第四步，对敷设材料进行低温解冻后敷设在皮肤对应位置。

其中低温解冻是指在温度不高于4℃的环境下进行解冻，能够有效降低细菌等微生物的快速繁殖对敷设材料造成污染，影响敷设材料的使用效果；

干细胞复合生物材料的制备方法为：

S1、通过组织块培养法获得脐带间充质干细胞，经纯化，扩大培养后得到干细胞复合因子溶液，通过离心过滤、浓缩与真空冷冻干燥处理后得到冻干粉；

S2、配制透明质酸钠溶液，向其中加入甘油、糖蛋白、酵母提取物、血清蛋白、寡肽以及步骤S1中制备得到的冻干粉，搅拌混合均匀后真空脱泡或离心脱泡得到干细胞复合生物材料。

干细胞复合生物材料中透明质酸钠的质量比0.3％-0.7％，透明质酸钠起到保湿与增稠的效果，冻干粉的添加量为0.1-10g/L，甘油的添加量为20-65g/L，糖蛋白的添加量为15-30g/L，酵母添加物的添加量为5-20g/L，血清蛋白的添加量为10-40g/L，寡肽的添加量为2-8g/L；

寡肽包括寡肽-1、寡肽-3、寡肽4、寡肽5与寡肽-6中的一种或至少两种的任意比混合；

敷设材料的制备方法为：

SS1、将壳聚糖与乙醇加入乙酸溶液中搅拌溶解，得到壳聚糖溶液；

其中壳聚糖的脱乙酰度为81.5％，乙酸溶液的摩尔浓度为0.17-0.60mol/L，壳聚糖在壳聚糖溶液中的用量为15-18g/L，

其中乙醇在乙酸溶液中的添加量为20-18mL/L；

SS2、向壳聚糖溶液中加入甘油与戊二醛，混合均匀后真空脱泡待用；

甘油能够提升壳聚糖膜的弹性与柔软性，使成型后的壳聚糖膜更加亲肤，与皮肤贴合效果更好；其中戊二醛的添加量为壳聚糖重量的10％-20％，戊二醛的加入能够显著提升成膜的强度，避免敷设材料在成型后易于撕裂损坏；

SS3、向上一步骤处理得到的壳聚糖溶液中加入改性大豆蛋白纤维，待改性大豆蛋白纤维完全浸入壳聚糖溶液后，搅拌混合均匀，然后真空脱泡；

其中改性大豆蛋白纤维在壳聚糖溶液中的添加量为12-50g/L；

在实际生产过程中，可以首先通过低速搅拌使改性大豆蛋白纤维与壳聚糖溶液混合至一定程度，然后再提升转速对两者进行混合；

SS4、将上一步骤处理得到的壳聚糖溶液在表面光滑的玻璃片或者瓷片上流延成膜后自然风干，揭膜后用浓度为0.75mol/L的氢氧化钠溶液浸泡处理40-70s，用去离子水冲洗后在温度15-25℃的无菌环境下自然风干，得到敷设材料。

通过加入改性大豆蛋白纤维能够提升敷设材料的保水性质，使敷设材料能够尽可能多的吸附干细胞复合生物材料，使敷设材料在敷设过程中能够保持湿润状态，不会在短时间内出现干燥变硬的情况，并且改性大豆蛋白纤维的均匀混入能够在保证敷设材料的柔软性的同时有效提升敷设材料的抗拉强度，使敷设材料在加工与使用过程中不易断裂；

所述改性大豆蛋白纤维的制备方法为：

配制质量浓度为5％的醋酸与质量浓度为1％的尿素的混合溶液，称取壳聚糖加入其中，搅拌混合至壳聚糖完全溶解后，真空脱泡，将混合溶液中的气泡除去，其中壳聚糖的质量浓度为5％-7％；

将透明质酸钠加入去离子水中，搅拌混合至透明质酸钠完全溶解，其中透明质酸钠的质量浓度为0.5％-2％，然后向其中加入氢氧化钠调节pH至9.5-10.5，得到透明质酸钠溶液，然后真空脱泡，除去透明质酸钠溶液中的气泡待用，其中透明质酸钠的分子量为80万-120万；

将混合溶液与透明质酸钠溶液按照体积比1-3:1均匀混合后，向其中加入丝胶蛋白，搅拌混合使丝胶蛋白均匀分散，真空脱泡处理，然后向其中加入京尼平或二乙烯基砜作为交联剂，均匀混合后静置反应30-60min后得到处理液；

将大豆蛋白纤维加入处理液中，搅拌或者超声分散后浸泡20-30min后，取出大豆蛋白纤维沥干后加入无水乙醇中浸泡1-3h，然后固液分离，将取出的大豆蛋白纤维烘干干燥后得到改性大豆蛋白纤维；

所述大豆蛋白纤维为短纤维，其长度为0.5-2.5mm；

大豆蛋白纤维具有良好的亲肤性以及柔软的手感，且大豆蛋白纤维的表面粗糙，有细微的孔隙，具有良好的透气导湿功能；

在该步骤中，交联后的透明质酸钠发生溶胀形成凝胶，然后通过无水乙醇对凝胶进行浸泡处理能够将凝胶中的交联剂除去，避免交联剂大量残留，同时无水乙醇能起到固定液的作用，对壳聚糖溶液起到固定的作用，从而在原料纤维的表面形成一层凝胶层，该凝胶层以透明质酸钠与壳聚糖作为胶凝原料，再以抗菌丝胶蛋白作为填充物，使改性大豆蛋白纤维具有良好的亲肤效果，同时透明质酸钠凝胶具有良好的亲水保湿效果，与干细胞复合生物材料也具有良好的混合效果。

在本发明的一个实施例中，通过对丝胶蛋白进行改性处理，使其具有良好的抗菌效果，从而进一步提升敷设材料的抗菌效果，抑制敷设材料与干细胞复合生物材料中的细菌繁殖；

具体的，具有抗菌效果的丝胶蛋白的制备方法为：

S11、将粉末状丝胶蛋白加入去离子水中浸泡复水后，真空冷冻干燥，然后再次复水，再通过真空冷冻干燥技术进行干燥，重复复水-干燥步骤2-4次，得到具有多孔结构的丝胶蛋白；

该方法能够在丝胶蛋白的内部形成孔道结构，提升了丝胶蛋白的比表面积；

S12、将上一步骤制备得到的具有多孔结构的丝胶蛋白加入硝酸银溶液中浸泡15-25min，然后紫外光照射至硝酸银溶液完全转变为黑色，固液分离后烘干干燥，得到具有抗菌效果的丝胶蛋白；

通过将具有多孔结构的丝胶蛋白加入硝酸银溶液中浸泡，使丝胶蛋白充分吸收有硝酸银溶液，然后再通过紫外光照射，使硝酸银还原生成纳米银，从而使纳米银均匀分布在丝胶蛋白的微孔结构中，从而使丝胶蛋白具有良好的抗菌能力；

对干细胞复合生物材料与敷设材料进行整合的方法为：

将干细胞复合生物材料搅拌分散均匀后进行真空脱泡处理，该步骤主要考虑到干细胞复合生物材料长时间静置后会出现固相物质分布不均匀的情况；

将敷设材料浸入干细胞复合生物材料中，具体的方法为：首先采用超声处理，利用超声加速敷设材料对干细胞复合生物材料的吸附效率，超声频率为25-40KHz，超声时间为2-10min；

超声结束后继续浸渍5-30min，将完成浸渍的敷设材料取出包装；

需要注意的是，干细胞复合生物材料与敷设材料的整合过程是在4℃以下的温度环境中进行的，能够抑制微生物的繁殖，并有利于保持干细胞复合生物材料的活性。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，制备干细胞复合生物材料；

干细胞复合生物材料的制备方法为：

S1、通过组织块培养法获得脐带间充质干细胞，经纯化，扩大培养后得到干细胞复合因子溶液，通过离心过滤、浓缩与真空冷冻干燥处理后得到冻干粉；

S2、配制透明质酸钠溶液，向其中加入甘油、糖蛋白、酵母提取物、血清蛋白、寡肽以及步骤S1中制备得到的冻干粉，搅拌混合均匀后真空脱泡或离心脱泡得到干细胞复合生物材料；

第二步，制备敷设材料；

第三步，通过敷设材料吸附干细胞复合生物材料后冷冻保存；

第四步，对敷设材料进行低温解冻后敷设在皮肤对应位置；

低温解冻是指在温度不高于4℃的环境下进行解冻。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，干细胞复合生物材料中透明质酸钠的质量比0.3％-0.7％，冻干粉的添加量为0.1-10g/L，甘油的添加量为20-65g/L，糖蛋白的添加量为15-30g/L，酵母添加物的添加量为5-20g/L，血清蛋白的添加量为10-40g/L，寡肽的添加量为2-8g/L。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，寡肽包括寡肽-1、寡肽-3、寡肽4、寡肽5与寡肽-6中的一种或至少两种的任意比混合。

4.根据权利要求3所述的一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，敷设材料的制备方法为：

SS1、将壳聚糖与乙醇加入乙酸溶液中搅拌溶解，得到壳聚糖溶液；

SS2、向壳聚糖溶液中加入甘油与戊二醛，混合均匀后真空脱泡待用；

SS3、向上一步骤处理得到的壳聚糖溶液中加入改性大豆蛋白纤维，待改性大豆蛋白纤维完全浸入壳聚糖溶液后，搅拌混合均匀，真空脱泡；

改性大豆蛋白纤维在壳聚糖溶液中的添加量为12-50g/L；

SS4、将上一步骤处理得到的壳聚糖溶液在表面光滑的玻璃片或瓷片上流延成膜后自然风干，揭膜后用浓度为0.75mol/L的氢氧化钠溶液浸泡处理40-70s，用去离子水冲洗后在温度15-25℃的无菌环境下自然风干，得到敷设材料。

5.根据权利要求4所述的一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，其中壳聚糖的脱乙酰度为81.5％，乙酸溶液的摩尔浓度为0.17-0.60mol/L，壳聚糖在壳聚糖溶液中的用量为15-18g/L；

其中乙醇在乙酸溶液中的添加量为20-18mL/L。

6.根据权利要求5所述的一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，所述改性大豆蛋白纤维的制备方法为：

配制质量浓度为5％的醋酸与质量浓度为1％的尿素的混合溶液，称取壳聚糖加入其中，搅拌混合至壳聚糖完全溶解后，真空脱泡；

配制质量浓度为0.5％-2％的透明质酸钠去离子水溶液，然后向其中加入氢氧化钠调节pH至9.5-10.5，得到透明质酸钠溶液，然后真空脱泡，除去透明质酸钠溶液中的气泡待用；

将混合溶液与透明质酸钠溶液按照体积比1-3:1均匀混合后，向其中加入丝胶蛋白，搅拌使丝胶蛋白均匀分散，真空脱泡处理，然后向其中加入交联剂，均匀混合后静置反应30-60min后得到处理液；

将大豆蛋白纤维加入处理液中，搅拌或者超声分散后浸泡20-30min后，取出大豆蛋白纤维沥干后加入无水乙醇中浸泡1-3h，固液分离，将取出的大豆蛋白纤维烘干干燥后得到改性大豆蛋白纤维。

7.根据权利要求6所述的一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，所述大豆蛋白纤维的长度为0.5-2.5mm。

8.根据权利要求1所述的一种干细胞复合生物材料用于皮肤再生修复的方法，其特征在于，通过敷设材料吸附干细胞复合生物材料的方法为：

将敷设材料浸入干细胞复合生物材料中，采用超声处理，超声频率为25-40KHz，超声时间为2-10min；

超声结束后继续浸渍5-30min。