CN115671374A - 一种丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法，以丝素蛋白为原料制成丝素蛋白溶液，将质量分数为2～6％的丝素蛋白溶液与质量分数为2～7％的单宁酸溶液按照体积比3:2混合得到丝素蛋白基黏胶，冷冻干燥48h后将得到的粉末与聚乙二醇以5:0.08(g/g)的比例混合均匀后得到所述丝素蛋白基止血黏胶粉末。本发明将单宁酸引入丝素蛋白中，通过直接混合法制备出具有水响应性湿粘附功能的可降解止血微粒，生物相容性好，止血速度快。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法。
背景技术
血液是人体非常重要的组成部分之一，它负责向组织提供气体和营养物质并且按需提供免疫信号和止血响应。出血是创伤发生后最常见的临床表现之一，由微小伤口引起的出血不足以致命，可以通过自身的凝血机制实现止血；然而，如果人在短时间内失血量达全身血液的30％或更多，就会危及生命。据统计，全球每年约有580万人死于不可控制的大出血，其中30％是创伤性死亡。值得注意的是，在出血发生5-10min内若能立即控制出血可有效降低死亡率，因此，快速止血材料的研发近年来引起了越来越多的关注。目前市面上存在着很多止血材料，如celox、沸石、介孔二氧化硅、壳聚糖、淀粉、明胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白原凝血酶、氧化纤维素等，它们虽然对体表止血具有较高的效率，但由于它们对湿创面的粘附性能较差，容易发生脱落，缺乏激活凝血因子的有效成分以及生物相容性和降解性能，在止血过程中发生放热导致严重的组织损伤等因素的影响，通常不能阻止不规则的深切窄的不可压缩性伤口的出血。因此，研发一种新型的够快速处理不可压缩出血的止血材料是非常必要的。
近年来，随着丝素蛋白水溶液制备方法的出现，以及丝素蛋白优良的性能，丝素蛋白基生物材料正在被广泛的开发和研究。丝素蛋白是一种天然的生物聚合物，由18种氨基酸组成，其分子组成包括H链、L链以及p25链，具有良好的生物相容性、可调节的生物降解性、低免疫原性、独特的力学性能、良好的氧气和水蒸气渗透性和最小的炎症反应，且来源广泛，易于获得。丝素蛋白具有一定的止血活性，在止血领域的应用具有极大潜力。研究发现，丝素止血材料的止血机理可从以下几个方面解释：一、丝素止血材料接触血液后可以快速溶胀成凝胶封堵血管促进止血；二、丝素止血材料的多孔结构引起红细胞的聚集和吸附蛋白，从而使血液黏度增加，减缓血液流速，加速凝血块的形成；三、丝素止血材料可通过丝素蛋白本身的负电性附黏附血小板，激活自身内源性凝血系统实现凝血。此外，丝素蛋白具有可调节的机械性能。机械刚度是组织修复材料的关键性质。为了保证修复材料的治疗效果，所使用的修复材料必须与目标组织的刚度相匹配。丝素蛋白分子链可以物理组装成坚固的β-折叠结构，并且通过控制β-折叠结构的含量，可以对丝素蛋白材料的强度进行调节，如含有少量β-折叠结构的丝素蛋白材料的机械强度偏低，偏柔软，而含有大量β-折叠结构的丝素蛋白材料则会表现出高的机械强度和刚性。由此，我们可以通过不同的制备工艺获得理想的材料。再者，丝素蛋白对于成纤维细胞黏附、发育、生长、分化有着积极作用，和胶原蛋白一样，它可以作为基质促进锚定依赖的哺乳动物细胞的生长，这说明丝素蛋白具有良好的生物相容性，并且有助于伤口愈合。对内脏等不可按压部位的大出血进行快速止血需要在持续血流的情况下实现与湿组织表面的强粘附，然而，丝素蛋白基材料在湿环境和动态生物环境中的机械和粘附性能较弱，不可单独用于不可按压止血。
止血材料的形式影响其功能和应用，现有技术中丝素蛋白材料多与其他物质结合形成凝胶材料，粘附性强，但吸水能力减弱，多数适用于规则形状和低血流的伤口。相比之下，不规则形状和高血流的伤口的出血很难控制，丝素蛋白凝胶材料因为较弱的吸水能力难以满足高血流的需要，止血慢。因此，为特定的应用决定合适的止血材料是很重要的。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明将单宁酸引入丝素蛋白中，通过直接混合法制备出具有水响应性湿粘附功能的可降解止血微粒，提供一种可对不可按压伤口的出血进行有效控制的丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
本发明第一个目的在于提供一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，其特征在于，以丝素蛋白为原料制成丝素蛋白溶液，将质量分数为2～6％的丝素蛋白溶液与质量分数为2～7％的单宁酸溶液按照体积比3:2混合得到丝素蛋白基黏胶，冷冻干燥48h后将得到的粉末与聚乙二醇以5:0.08(g/g)的比例混合均匀后得到所述丝素蛋白基止血黏胶粉末。
进一步的，所述丝素蛋白溶液的质量分数为3％，单宁酸的质量分数为2.5％。
进一步的，所述丝素蛋白与单宁酸的质量比为9:5。
进一步的，所述聚乙二醇的质量分数为1.6％。
进一步的，所述丝素蛋白以蚕茧为原料，依次经过脱胶、溶解、透析后获得。
进一步的，所述丝素蛋白溶液的制备过程为：
1)丝素的脱胶：
将剪碎的蚕茧以1:25的浴比用质量分数为0.5％的NaCO3溶液中脱胶，脱胶时所用温度为100℃，时间为90min；脱胶完成后，使用去离子水洗涤丝素三次，随后置于60℃烘箱烘干后保存备用；
2)丝素的溶解：
将步骤1)得到的丝素用三元溶液以1:10浴比在80℃水浴锅中溶解2h，溶解完成后，用八层纱布过滤得到丝素蛋白溶液；
3)丝素蛋白溶液透析：
将步骤2)得到的丝素蛋白溶液用分子载留量为3500的透析袋透析三天，最后将丝素蛋白溶液的质量分数稀释至需要的浓度得到。
进一步的，所述三元溶液由为卤化物溶液、无水乙醇与水组成。所属卤化物溶液为氯化钙或溴化锂溶液。
本发明第二个目的在于提供一种上述制备方法获得的丝素蛋白基止血黏胶粉末。
进一步的，所述止血黏胶粉末为聚乙二醇亲水改性止血黏胶粉末。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
本发明将丝素蛋白溶液与单宁酸溶液均匀混合并搅拌形成黏胶，冷冻干燥并研磨、亲水改性后形成新型的止血材料——丝素蛋白基止血黏胶粉末，其能在伤口处快速吸收血液形成黏胶后强湿粘附伤口，从而达到快速止血的作用。
丝素蛋白与单宁酸的质量比、黏胶粉末的亲水改性程度对本发明止血速度就有较大的影响，单宁酸中大量的邻位酚羟基，即便是在有水存在的情况下，也可以通过强氢键的形成而附着在基体上，具有很强的粘附性，而且单宁酸与丝素蛋白作用使丝素单标表面水分子层减少，发生聚集和沉淀，增加胶粘性；但是单宁酸与丝素蛋白形成的多孔骨架材料由于具有强湿粘附性，从而导致吸水速度慢，止血时间过长，无法用于高血流的伤口。本发明中通过聚乙二醇对形成的丝素蛋白基黏胶进行亲水改性，丝素蛋白形成冻干粉后与聚乙二醇混合，在使用时聚乙二醇起到导水的作用，大大提高了丝素蛋白基黏胶的亲水性，使自组装后的丝素蛋白遇水成胶，堵住伤口并利用单宁酸与丝素蛋白的凝血作用促进快速凝血。
本发明具有很好的生物相容性，止血速度快，在高亲水性的基础上吸收流出的血液，同时利用强的胶粘性堵住出血口，防止血液从出血口流出。本发明除可用于普通止血外，更重要的是适用于出血量较大，或不可按压伤口的止血，改变不可按压伤口止血困难的现状。制备方法简单，生产成本低，适用于规模化生产。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
图1为本发明一种丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法的制备流程图。
图2为本发明一种丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法中添加聚乙二醇前后没吸水与吸水状态下的结构扫描图。
图3为本发明一种丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法止血机理图。
图4为本发明一种丝素蛋白基止血黏胶粉末及其制备方法止血效果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
需要说明的是，本发明中ST-PEG指本发明制备方法所获得的丝素蛋白基止血黏胶粉末；CeloxTM为市场购买壳聚糖止血敷料；ST指未与聚乙二醇混合的丝素蛋白基黏胶冻干粉末。
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
实施例1：
参见附图1，一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，包括如下步骤：
1)丝素的脱胶：
将剪碎的蚕茧以1:25的浴比用质量分数为0.5％的NaCO3溶液中脱胶，脱胶时所用温度为100℃，时间为90min；脱胶完成后，使用去离子水洗涤丝素三次，随后置于60℃烘箱烘干24h以除去丝素表面的水分后保存备用。
2)丝素的溶解：
将步骤1)得到的丝素用三元溶液以1:10浴比在80℃水浴锅中溶解2h，溶解完成后，用八层纱布过滤得到丝素蛋白溶液。
3)丝素蛋白溶液透析：
将步骤2)得到的丝素蛋白溶液用分子载留量为3500的透析袋透析三天，最后将丝素蛋白溶液的质量分数稀释至5％，得到丝素蛋白溶液。
4)丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备：
首先制备质量分数为6.25％的单宁酸溶液，将步骤3)制备的丝素蛋白溶液与单宁酸溶液按3:2的体积比混合并搅拌得到丝素蛋白基黏胶，将黏胶冷冻干燥48h并研磨成粉末得到丝素蛋白基止血黏胶粉末。
5)丝素蛋白基止血黏胶粉末的亲水改性：
将步骤4)得到的丝素蛋白基止血黏胶粉末与聚乙二醇以5:0.08(g/g)的比例均匀混合，得到亲水改性丝素蛋白基止血黏胶粉末。
实施例2：
一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，包括如下步骤：
1)丝素的脱胶：
将剪碎的蚕茧以1:25的浴比用质量分数为0.5％的NaCO3溶液中脱胶，脱胶时所用温度为100℃，时间为90min；脱胶完成后，使用去离子水洗涤丝素三次，随后置于60℃烘箱烘干24h以除去丝素表面的水分后保存备用。
2)丝素的溶解：
将步骤1)得到的丝素用三元溶液以1:10浴比在80℃水浴锅中溶解2h，溶解完成后，用八层纱布过滤得到丝素蛋白溶液。
3)丝素蛋白溶液透析：
将步骤2)得到的丝素蛋白溶液用分子载留量为3500的透析袋透析三天，最后将丝素蛋白溶液的质量分数稀释至3％，得到丝素蛋白溶液。
4)丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备：
首先制备质量分数为2.5％的单宁酸溶液，将步骤3)制备的丝素蛋白溶液与单宁酸溶液按3:2的体积比混合并搅拌得到丝素蛋白基黏胶，将黏胶冷冻干燥48h并研磨成粉末得到丝素蛋白基止血黏胶粉末。
5)丝素蛋白基止血黏胶粉末的亲水改性：
将步骤4)得到的丝素蛋白基止血黏胶粉末与聚乙二醇以5:0.08(g/g)的比例均匀混合，得到亲水改性丝素蛋白基止血黏胶粉末。当丝素与单宁酸的投入比过高时，则凝胶中丝素的含量增加，此时凝胶的粘性减弱，不利于附着并对伤口进行封堵；丝素与单宁酸的投入比过低时，则凝胶中单宁酸的含量增加，此时凝胶的力学性能下降，同样不利于湿粘附封堵出血组织。且丝素与单宁酸形成黏胶后，对血液的吸收能力大大下降，丝素含量越高吸收能力越低，难以促进血液凝固，止血速度慢。在一优选实施例中，丝素蛋白溶液的质量分数为3％，单宁酸的质量分数为2.5％，丝素蛋白与单宁酸的质量比为9:5。
为了在封堵出血口的同时提高止血粉对血液的吸收能力，加快凝血速度，实现快速止血，本发明中对丝素与单宁酸冻干粉末与聚乙二醇混合，不需要在使用前形成凝胶，以粉末形式使用，在伤口表面吸收血液后快速形成凝胶覆盖在伤口表面，并通过聚乙二醇起到导水的作用，增大对血液的吸收量，实现快速凝血。聚乙二醇的添加量对止血效果具有较大影响，聚乙二醇的质量分数较低时，对黏胶粉末亲水改性作用较小，黏胶粉末仍比较疏水，导致黏胶粉末吸水成凝胶的速度减慢；若聚乙二醇的质量分数过高，则会导致黏胶粉末分散在聚乙二醇中，进而影响黏胶粉末聚集并吸水形成凝胶，以及在止血中的效率。
参见附图2，通过对本发明是否添加聚乙二醇结构进行研究，可以发现，本发明冻干粉末与聚乙二醇混合后形成的粉末气孔率高，在伤口表面易于快速吸水形成凝胶，且形成凝胶后粘结性好，利于对伤口的封堵。而不添加聚乙二醇的黏胶，气孔率低，多为闭气孔，不利于吸水，形成凝胶后力学性能差。
建立肝脏和耳动脉出血模型，用于评估本发明止血黏胶粉末的止血能力，参见附图4。选用兔肝脏与耳动脉出血模型进行止血试验，参见附图4A及4C，对于肝出血模型，CeloxTM的止血时间为59.3±0.7s，而本发明止血黏胶粉末在15s就有比较明显的止血效果，在治疗21.7±4.4s后成功止血，CeloxTM的止血时间远远多于ST-PEG。不仅如此，ST-PEG在出血量上也占了极大的优势，参见附图4B，CeloxTM的出血量为182.9±14.3mg，而ST-PEG治疗的出血量仅为137.8±24.2mg。对于耳动脉出血模型，参见图4A及图4E，ST-PEG在19s就有比较明显的止血此熬过，在治疗20.6±2.9s后成功止血，而CeloxTM的止血时间仅为108.3±1.7s。CeloxTM的出血量也远远高于ST-PEG，参见附图4D，CeloxTM的出血量为345.9±99.8mg，而ST-PEG的止血量仅有158.5±33.6mg。通过建立肝脏和耳动脉出血模型，说明了本发明ST-PEG具有优异的湿粘附封堵并止血出血组织伤口的能力，尤其对于高血流的伤口具有明显的止血效果。
参见附图3，本发明丝素蛋白基止血黏胶粉末的止血原理有以下几方面：首先，冻干粉末与聚乙二醇混合得到的止血粉在伤口表面吸收血液后快速形成凝胶覆盖在伤口表面，有效的对出血部位进行密封，在一定程度上降低出血速度，聚乙二醇起到导水作用，提高了止血粉的吸水性，为后面凝血作用提供基础。第二，吸收血液后形成的凝胶在丝素蛋白的作用下富集凝血因子，加速凝血，丝素蛋白自组装后，单宁酸增强了丝素蛋白的止血性能。第三，自组装后的丝素蛋白静电吸附红细胞、血小板，实现快速凝血。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (8)
1.一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，其特征在于：以丝素蛋白为原料制成丝素蛋白溶液，将质量分数为2～6％的丝素蛋白溶液与质量分数为2～7％的单宁酸溶液按照体积比3:2混合得到丝素蛋白基黏胶，冷冻干燥48h后将得到的粉末与聚乙二醇以5:0.08(g/g)的比例混合均匀后得到所述丝素蛋白基止血黏胶粉末。
2.如权利要求1所述一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液的质量分数为3％，单宁酸的质量分数为2.5％。
3.如权利要求1所述一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白与单宁酸的质量比为9:5。
4.如权利要求1所述一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇的质量分数为1.6％。
5.如权利要求1所述一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白以蚕茧为原料，依次经过脱胶、溶解、透析后获得。
6.如权利要求1所述一种丝素蛋白基止血黏胶粉末的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的制备过程为：
1)丝素的脱胶：
将剪碎的蚕茧以1:25的浴比用质量分数为0.5％的NaCO3溶液中脱胶，脱胶时所用温度为100℃，时间为90min；脱胶完成后，使用去离子水洗涤丝素三次，随后置于60℃烘箱烘干后保存备用；
2)丝素的溶解：
将步骤1)得到的丝素用三元溶液以1:10浴比在80℃水浴锅中溶解2h，溶解完成后，用八层纱布过滤得到丝素蛋白溶液；
3)丝素蛋白溶液透析：
将步骤2)得到的丝素蛋白溶液用分子载留量为3500的透析袋透析三天，最后将丝素蛋白溶液的质量分数稀释至需要的浓度得到。
7.一种根据权利要求1-6中任一项所述制备方法获得的丝素蛋白基止血黏胶粉末。
8.如权利要求7所述一种丝素蛋白基止血黏胶粉末，其特征在于：所述止血黏胶粉末为聚乙二醇亲水改性止血黏胶粉末。
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