CN112300418B - 一种可粘附高效止血微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可粘附高效止血微球及其制备方法，该方法涉及医疗器械领域，其制备方法为：将接枝多巴胺的天然高分子与含有氨基的高分子物质按一定比例搅拌混合成均匀的液体，通过反相悬浮聚合法和乳化交联技术制得一定粒径的具有三维网状结构的微球。再通过静电作用的方法将止血剂卡洛磺钠吸附在微球的表面，最后干燥得到可粘附负载止血剂的止血微球。止血微球通过调控交联度控制止血微球的三维网状结构，实现吸水倍率和吸水速度增强，表面的多巴胺实现对伤口强粘附堵塞伤口并且止血微球表面止血剂可加快内源性止血过程。因此，止血微球三种止血方式协同作用达到快速止血的效果，并且本发明制备方式简单，对环境无污染生产成本低，应用前景广阔。

Description

一种可粘附高效止血微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，特别涉及一种可粘附高效止血微球及其制备方法。
背景技术
不可控出血是战争、交通事故等死亡的重要原因，也是外科手术中不可避免的问题。据统计，在失血初期及时的止血能够减少30%的死亡。并且其中有80%的死亡是因为伤口位于不可按压止血，例如因此，胸、腹、头、颈等。因此，通过快速有效的方法控制出血是降低因出血而引起死亡的关键。
不同的止血材料，如纱布、绷带、海绵，被广泛应用于手术过程或外出血的治疗。然而，这些止血剂不适用于不规则伤口、腔内出血和敏感组织的应用。止血颗粒的出现为克服这些问题提供了一种新方法。止血颗粒不仅止血速度快，而且操作简便，保质期长。Quickclot，HaemoCer，HemCom，Arista是典型的基于微颗粒的止血粉，由于易于应用和优越的止血活性，在市场上占有一定的份额。然而，Quickclot这类硅铝酸盐类止血产品虽然具有较好的止血性能，但后期应用发现，此类产品容易大量发热，导致组织被灼伤，给患者带来二次伤害，并且在体内不可降解。与硅铝酸盐类产品相比，天然高分子类以及衍生物产品具有的最大优势在于此类产品具有良好的生物相容性和可降解性能，美国Medafor公司生产的Arista微球的表面具有裂隙结构，增强了其对于水的吸附能力。然而其吸水性较慢，粘度性能较差，对于大面积渗血或动脉出血不能达到很好的止血效果。
大多数止血颗粒通常归因于它们快速的液体吸收能力，浓缩凝血因子后，引发凝血级联反应，最终完成加快止血的任务。中国专利文献CN109517225A公开了一种坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法，所述选用天然多聚糖，通过反相悬浮乳液法，以多价金属离子为交联剂形成坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。通过调控组分的分子量、溶液黏度、制备工艺条件等方法调控微球表面的结构，进而调节微球的比表面积。微球的比表面积影响微球的吸液能力，增大比表面积，增加微球的吸液能力，使微球的止血能力增大。但是该专利没有涉及到微球对伤口的附着性，不能够避免微球被血液冲走。并且微球的止血机理只是采用物理止血的方式，对于动脉出血不能起到较好的效果。
止血剂如凝血酶，纤维蛋白原和纤维蛋白等可以直接参与止血过程。中国专利文献CN111282016A公开一种海藻酸钙/凝血酶复合止血微球，该复合止血微球与创面接触后，大量吸收血液溶胀并释放其中的凝血酶和Ca2+，Ca2+促进机体产生凝血因子加快凝血，而凝血酶则直接促使伤口血液凝结，从而达到快速止血目的。然而，凝血酶会带来生物源性污染的可能性。中国专利文献CN109111591A公开了一种载药止血海绵的制备方法，采用喷涂或浸渍的方法将壳聚糖-止血药物复合溶液负载到木质纤维素海绵，通过壳聚糖和止血药物的协同作用，能迅速吸收伤口表面的血液，有效促进创面凝血。但是，止血剂与海绵之间无化学和物理的作用，止血剂从海绵中的释放不可控，这可能会导致生物体其他部位因止血剂引起的凝血。因此，通过非生物源性的止血剂与止血微球通过物理或化学作用是有必要的，止血剂与止血微球复合，利用其协同作用达到快速止血的目的。
综上所述，制备一种吸水性率大、在湿态下粘附性强的快速止血微球是有必要的。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，在原有的吸水性止血微球的基础上增加了止血微球对伤口的粘附性，使止血微球不易被血液冲走；并且通过静电作用引入的止血剂使止血微球可以参与体内止血过程，止血微球协同吸收血液、堵塞伤口和止血药物三种止血方式，大大减少止血时间。
止血剂卡络磺钠能增强毛细血管弹性，降低毛细血管的通透性，增进毛细血管断裂端的回缩作用，稳定毛细血管及周围组织中的酸性粘多糖，显著缩短出血时间，促进凝血酶的活性和纤维蛋白元的溶解，进而使出血部位形成血栓而达到止血。
本发明的技术方案如下：
1.一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：（1）接枝多巴胺的生物高分子物质的制备：生物高分子在缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，用(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的进行活化后加入多巴胺，得到接枝多巴胺的生物高分子；（2）水相的制备：将含有氨基的高分子物质与多巴胺-接枝的生物高分子溶于氮气净化的去离子水，搅拌均匀，得到一定浓度均一的水相溶液；（3）油相的制备：将乳化剂加入至油中，以一定的搅拌速度搅拌乳化0.5-3h混合均匀，得到油相；（4）乳化反应：在一定搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，待所述水相滴加完后，搅拌一段时间，形成均一稳定的乳状微乳液；（5）交联反应：在设定的搅拌速度下搅拌微乳液，将一定浓度的交联剂慢慢滴加到微乳液中，滴加完后搅拌一段时间，静置分层，离心分离出下层的微球，用有机溶剂洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球；（6）静电吸附：将微球分散到有一定浓度卡络磺钠的pH=5-6的盐溶液中，搅拌一段时间后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球；（7）微球的干燥：将微球分散液置于一定温度下干燥得到可粘附高效止血微球。
进一步的，本发明所述的仿生增强粘附多孔静电负载止血剂的止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述生物高分子为海藻酸钠，明胶，透明质酸，羧甲基纤维素中的一种或多种；所述的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、碳酸缓冲溶液或2-(N-吗啉基)乙磺酸（MES）缓冲液中的一种。
进一步的，本发明所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述含有氨基的物质包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖、氨基化羧甲基壳聚糖，氨基化明胶中的一种或者多种；所述水相溶液的浓度为2-5%（w/w）；所述接枝多巴胺生物高分子物质与含氨基高分子物质的质量之比为2:3。
进一步的，本发明所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述油相中的油为液体石蜡、石油醚、植物油中的一种或多种，所述乳化剂为Span-60、Span-80和Tween-60中的一种或多种；所述乳化剂的浓度为0.3-3％之间。
进一步的，本发明所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述设定搅拌转速为200-300 rpm。
进一步的，本发明所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述设定搅拌转速为600-800 rpm，所述滴加完后的搅拌设定时间为1.5-3h；水相与油相的体积比为1:1-3。
进一步的，本发明所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中所述交联剂是氯化钙，京尼平、戊二醛和三聚磷酸钠中的一种或多种；所述交联剂的浓度为0.5%-20%（w/w）；所述交联剂溶液与均匀乳液的体积比是2-7：10；所述的滴加完后搅拌时间为3-5 h；所述的有机溶剂乙酸乙酯、正己烷、甲醇和无水乙醇中的一种或多种。
进一步的，本发明所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中所述止血剂卡络磺钠的浓度为0.1%-1%；所述的盐溶液为0.1-0.15 M氯化钠水溶液；所述的反应时间为30-120 min。
进一步的，本发明所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中所述干燥方式包括冷冻干燥、真空干燥或常压干燥；所述的干燥温度在30-40℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明制备的可粘附高效止血微球表面粗糙，整个微球具多孔网状结构，因此具有极大的比表面积和比孔容，吸水倍率高，可以快速吸收血液中的水分，促进血液中凝血因子的浓缩，实现快速止血的目的。
2.本发明制备的可粘附高效止血微球表面具有邻苯二酚基团，通过对多巴胺与生物高分子接枝率的调节，以及含有氨基高分子物质与多巴胺-生物高分子比例的调节，可以调节止血微球对伤口的粘附性能，并且邻苯二酚对伤口的粘附不受血液的影响。
3.本发明制备的可粘附高效止血微球表面静电吸附有卡络磺钠，可以促进凝血酶的活性和纤维蛋白元的溶解，直接加快内源性止血过程，进而使出血部位形成血栓而达到止血。
4.本发明可粘附高效止血微球选用的原料为天然来源，安全性好且价格低廉，所得交联多孔止血微球安全有效、生物相容性好；作为血液因子浓缩类止血材料为各种创伤和手术组织创面的出血区提供了一种止血快速、使用方便的止血方法。
附图说明
图1为本发明所述可粘附高效止血微球的制备示意图。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作详细阐述，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述说明限定本发明的保护范围。
实施例1
一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）接枝多巴胺的海藻酸钠的制备：海藻酸钠溶在PBS缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，加入多巴胺，得到接枝多巴胺的海藻酸钠。
（2）水相的制备：将羧甲基壳聚糖与多巴胺-接枝的海藻酸钠溶于氮气净化的去离子水，搅拌均匀，得到浓度为2%均匀的水相溶液其中羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的海藻酸钠的质量比例为2:3。
（3）油相的制备：将Span-60加入至液体石蜡中，以300 rpm的搅拌速度搅拌乳化1h混合均匀，得到油相，Span-60占液体石蜡的0.4%；
（4）乳化反应：在700 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:2.5，待所述水相滴加完后，搅拌2 h后，形成均匀稳定的乳状微乳液。
（5）交联反应：以250 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将20 wt%的CaCl2慢慢滴加到微乳液中，交联溶液与溶液的体积比为3:10，滴加完后搅拌4 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（6）静电吸附：将微球分散到浓度为0.2%卡络磺钠的pH=5的0.12 M NaCl溶液中，搅拌40 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（7）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
实施例2
一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）接枝多巴胺的透明质酸的制备：透明质酸溶在PBS缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，加入多巴胺，得到接枝多巴胺的透明质酸。
（2）水相的制备：将氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺-接枝的透明质酸溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为5%均匀的水相溶液其中氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的透明质酸的质量比例为2:3。
（3）油相的制备：将Span-80加入至液体石蜡中，以200 rpm的搅拌速度搅拌乳化0.5 h混合均匀，得到油相，Span-80占液体石蜡的3%；
（4）乳化反应：在800 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:1，待所述水相滴加完后，搅拌2 h后，形成均一稳定的乳状微乳液。
（5）交联反应：以200 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将0.5 wt%的戊二醛慢慢滴加到微乳液中，交联溶液与溶液的体积比为3:10，滴加完后搅拌3 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（6）静电吸附：将微球分散到浓度为0.1%卡络磺钠的pH=5的0.15 M NaCl溶液中，搅拌120 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（7）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
实施例3
一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）接枝多巴胺的明胶的制备：明胶溶在PBS缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，加入多巴胺，得到接枝多巴胺的明胶。
（2）水相的制备：将氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺-接枝的明胶溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为2.5%均匀的水相溶液其中氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的明胶的质量比例为2:3。
（3）油相的制备：将Span-60加入至石油醚中，以250 rpm的搅拌速度搅拌乳化3 h混合均匀，得到油相，Span-60是石油醚的0.3%；
（4）乳化反应：在600 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:3，待所述水相滴加完后，搅拌1.5 h后，形成均匀稳定的乳状微乳液。
（5）交联反应：以300 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将浓度0.6 wt%的京尼平慢慢滴加到微乳液中，交联溶液与溶液的体积比为7:10，滴加完后搅拌5 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（6）静电吸附：将微球分散到浓度为1%卡络磺钠的pH=5的0.1 M NaCl溶液中，搅拌30 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（7）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
实施例4
一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）接枝多巴胺的海藻酸钠的制备：海藻酸钠溶在PBS缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，加入多巴胺，得到接枝多巴胺的海藻酸钠。
（2）水相的制备：将氨基化明胶与多巴胺接枝的海藻酸钠溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为4.5%均匀的水相溶液其中氨基化明胶与多巴胺接枝的海藻酸钠的质量比例为2:3。
（3）油相的制备：将Span-80加入至液体石蜡中，以300 rpm的搅拌速度搅拌乳化3h混合均匀，得到油相，Span-80是石液体蜡的0.4%；
（4）乳化反应：在700 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:3，待所述水相滴加完后，搅拌2.5 h后，形成均一稳定的乳状微乳液。
（5）交联反应：以300 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将18wt%的CaCl2慢慢滴加到微乳液中，交联溶液与溶液的体积比为3:10，滴加完后搅拌3.5 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（6）静电吸附：将微球分散到浓度为0.1%卡络磺钠的pH=5的0.1 M NaCl溶液中，搅拌30 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（7）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
实施例5
一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）接枝多巴胺的羧甲基纤维素的制备：明胶溶在PBS缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，加入多巴胺，得到接枝多巴胺的羧甲基纤维素。
（2）水相的制备：将羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的羧甲基纤维素溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为4%均匀的水相溶液其中羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的羧甲基纤维素的质量比例为2:3。
（3）油相的制备：将Tween-60加入至植物油中，以300 rpm的搅拌速度搅拌乳化3 h混合均匀，得到油相，Tween-60占植物油的0.4%；
（4）乳化反应：在800 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:3，待所述水相滴加完后，搅拌2h后，形成均一稳定的乳状微乳液。
（5）交联反应：以200 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将2 wt%的戊二醛慢慢滴加到微乳液中，滴加完后搅拌5 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（6）静电吸附：将微球分散到浓度为0.1%卡络磺钠的pH=5的0.1 M NaCl溶液中，搅拌100 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（7）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
实施例6
一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）接枝多巴胺的明胶的制备：明胶溶在PBS缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，加入多巴胺，得到接枝多巴胺的明胶。
（2）水相的制备：将羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的明胶溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为3.5%均匀的水相溶液其中羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的明胶的质量比例为2:3。
（3）油相的制备：将Tween-60加入至植物油中，以300 rpm的搅拌速度搅拌乳化1 h混合均匀，得到油相，Tween-60占植物油的0.4%；
（4）乳化反应：在600 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:3，待所述水相滴加完后，搅拌2h后，形成均一稳定的乳状微乳液。
（5）交联反应：以300 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将2 wt%的戊二醛慢慢滴加到微乳液中，滴加完后搅拌4 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（6）静电吸附：将微球分散到浓度为0.1%卡络磺钠的pH=5的0.1 M NaCl溶液中，搅拌30 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（7）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
实施例7
一种可粘附高效止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）接枝多巴胺的海藻酸钠的制备：海藻酸钠溶在PBS缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，通过(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化，加入多巴胺，得到接枝多巴胺的海藻酸钠。
（2）水相的制备：将氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺-接枝的海藻酸钠溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为2.5%均匀的水相溶液其中氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的海藻酸钠的质量比例为2:3。
（3）油相的制备：将Span-80加入至液体石蜡中，以250 rpm的搅拌速度搅拌乳化1h混合均匀，得到油相，Span-80占液体石蜡的.04%；
（4）乳化反应：在700 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:2.5，待所述水相滴加完后，搅拌2 h后，形成均一稳定的乳状微乳液。
（5）交联反应：以250 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将18 wt%的氯化钙慢慢滴加到微乳液中，滴加完后搅拌4 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（6）静电吸附：将微球分散到浓度为0.2%卡络磺钠的pH=5的0.12 M NaCl溶液中，搅拌40 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（7）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
对比例1
一种止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）水相的制备：将氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺-接枝的海藻酸钠溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为2.5%均匀的水相溶液其中氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的海藻酸钠的质量比例为2:3。
（2）油相的制备：将Span-80加入至液体石蜡中，以250 rpm的搅拌速度搅拌乳化1h混合均匀，得到油相，Span-80占液体石蜡的.04%；
（3）乳化反应：在700 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:2.5，待所述水相滴加完后，搅拌2 h后，形成均一稳定的乳状微乳液。
（4）交联反应：以250 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将18 wt%的氯化钙慢慢滴加到微乳液中，滴加完后搅拌4 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（5）静电吸附：将微球分散到浓度为0.2%卡络磺钠的pH=5的0.12 M NaCl溶液中，搅拌40 min后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球。
（6）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
对比例2
一种止血微球及其制备方法，主要包括以下步骤：
（1）水相的制备：将氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺-接枝的海藻酸钠溶于去离子水，搅拌均匀，得到浓度为2.5%均匀的水相溶液其中氨基化羧甲基壳聚糖与多巴胺接枝的海藻酸钠的质量比例为2:3。
（2）油相的制备：将Span-80加入至液体石蜡中，以250 rpm的搅拌速度搅拌乳化1h混合均匀，得到油相，Span-80占液体石蜡的.04%；
（3）乳化反应：在700 rpm搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，其中，水相溶液与油相溶液的体积比是1:2.5，待所述水相滴加完后，搅拌2 h后，形成均一稳定的乳状微乳液。
（4）交联反应：以250 rpm搅拌速度下搅拌微乳液，将18 wt%的氯化钙慢慢滴加到微乳液中，滴加完后搅拌4 h，静置分层，离心分离出下层的微球，用正己烷洗涤，用乙醇洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球。
（5）微球的干燥：将微球分散液用冷冻干燥的方法干燥。
为了对本发明的止血微球的粘附性能测试，猪皮与人组织具有相似的物理性质，我们将用猪皮对进行止血微球的粘附强度测试。
首先，将新鲜的猪皮切成长35mm、宽10mm的长条。然后将100 mg止血微球均匀的放于猪皮组织上，并将另一个猪皮组织覆盖在第一层，以达到1×1 cm2的粘结面积。在施加50g×cm 2的载荷1 min后，使用万能试验机以1.0 mm× min-1的十字头速度测量粘接强度。
表1：实施例与对比例产品粘结强度
Figure 373072DEST_PATH_IMAGE001
通过实施例与对比例对猪皮组织的粘结强度比较，实施例的粘结强度均在50Kpa以上，然而对比例的粘结强度在20KPa左右，这表明未引入多巴胺的止血微球的粘结强度是远远小于引入多巴胺结构的止血微球的粘结强度，说明结果表明多巴胺的引入增加止血微球的对组织的粘结强度。
为了对本发明的止血微球的止血性能测试，进行了体外全血凝血指数测试和动物止血实验。
对实施例1-5和对比例1-2进行体外全血凝血指数测试具体的实验步骤：10 mg样品放置在玻璃盘中，在37℃下孵育5 min，200 μL有抗凝剂的全血缓慢滴加到样品表面，加入20 μL 0.2M CaCl2后在37℃下孵育5 min。滴加15 ml去离子水到玻璃盘中，30 rpm振荡10 min，洗涤不结块的红细胞。分离上清液，最后，用酶标仪测定上清液中含血红蛋白洗涤液的吸光度（540 nm）。样品在540 nm处的吸光度记作A值，全血在去离子水中的吸光度作为参考B值。
血液凝固指数计算：BCI=A/B
Figure 879009DEST_PATH_IMAGE002
100%。所得实验结果如表1所示。
表2：实施例与对比例产品血液凝固指数
Figure 751412DEST_PATH_IMAGE003
通过对对比例1与实施例的全血凝固指数进行比较，实施例的血液凝固指数为5%左右远远小于对比例1的全凝血指数15±0.3%，说明多巴胺的引入可以降低凝血时间。这可能是由于多巴胺引入止血微球后对伤口的粘附增强，使止血微球快速堵塞伤口而达到降低止血时间的效果。对比例2与对比例1的全凝血指数结果显示对比例1全凝血指数为15±0.3%具有较好的止血效果，这表明止血剂的加入能减少凝血时间。实施例的全凝血指数远远低于对比例的全凝血指数，这表明多巴胺的引入和止血剂的引入大大降低止血时间，其止血效果好于单独引入多巴胺或者单独引入止血剂。
对实施例7和对比例1-2进行SD大鼠股动脉损伤出血模型测试具体的实验步骤：根据SD大鼠体重，用水合氯醛进行麻醉，解剖使股动脉漏出，利用手术刀剪切动脉至大出血，3s后将0.3 g样品撒在伤口处，观察并记录出血情况和止血时间。术后，缝合伤口，记录7天，14天后的大鼠恢复情况和存活率。每个样品做六只SD大鼠，形成六个平行样。
表3：实施例与对比例产品在SD大鼠股动脉出血模型中的止血时间
Figure 825548DEST_PATH_IMAGE004
表4：实施例与对比例产品在SD大鼠股动脉出血模型中的存活数
Figure 586830DEST_PATH_IMAGE005
SD大鼠股动脉出血模型中实施例7的止血时间只有15±0.1s，而在对比例1和对比例2中的止血时间增加到30±0.2s和止血时间和43±0.3s，说明多巴胺的引入和止血剂的引入大大降低止血时间。这可能是因为多巴胺的引入增强止血微球对伤口的粘度性能，从而增加对伤口的堵塞而减少止血时间，并且止血剂直接参与止血过程，促进内源性止血过程，两者共同作用增强止血微球的止血作用。并且多巴胺的引入和止血剂的添加不会影响SD大鼠存活。
以上的实施例为本发明部分相对较好的实施例，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明的范围的情况下，本发明还会有更多的变化。

Claims (9)

1.一种可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）接枝多巴胺天然高分子物质的制备：天然高分子在缓冲溶液中，在氮气的保护作用下，用(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化后加入多巴胺，得到接枝多巴胺的天然高分子，其中天然高分子为海藻酸钠、明胶、透明质酸，羧甲基纤维素中的一种或多种；（2）水相的制备：将含有氨基的高分子物质与多巴胺接枝的天然高分子溶于氮气净化的去离子水，搅拌均匀，得到一定浓度均一的水相溶液，其中含有氨基的高分子物质为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、氨基化羧甲基壳聚糖，氨基化明胶中的一种或者多种；（3）油相的制备：将乳化剂加入至油中，以一定的搅拌速度搅拌乳化0.5-3h混合均匀，得到油相；（4）乳化反应：在一定搅拌转速下，在30℃下将水相溶液逐滴滴加到油相中，待所述水相滴加完后，搅拌一段时间，形成均匀稳定的乳状微乳液；（5）交联反应：在设定的搅拌速度下搅拌微乳液，将一定浓度的交联剂慢慢滴加到微乳液中，滴加完后搅拌一段时间，静置分层，离心分离出下层的微球，用有机溶剂洗涤，用去离子水洗涤，形成稳定交联的微球，其中交联剂为氯化钙、京尼平、戊二醛和三聚磷酸钠中的一种或多种；（6）静电吸附：将微球分散到有一定浓度卡络磺钠的pH=5-6的盐溶液中，搅拌一段时间后，将微球用去离子水离心洗涤后得到具有药物的止血微球；（7）微球的干燥：将微球分散液置于一定温度下干燥得到可粘附高效止血微球。
2.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球及其制备方法，其特征在于，所述步骤（1）所述的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、碳酸缓冲溶液或2-(N-吗啉基)乙磺酸（MES）缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球的制备方法，其特征在于，所述水相溶液的质量浓度为2-5%；所述接枝多巴胺生物高分子物质与含氨基高分子物质的质量之比为2:3。
4.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述油相中的油为液体石蜡、石油醚、植物油中的一种或多种，所述乳化剂为Span-60、Span-80和Tween-60中的一种或多种；所述乳化剂的浓度为0.3-3％之间。
5.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中设定搅拌转速为200-300 rpm。
6.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中设定搅拌转速为600-800 rpm，所述滴加完后的搅拌设定时间为1.5-3 h；水相与油相的体积比为1:1-3。
7.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中所述交联剂的质量浓度为0.5%-20%；所述交联剂溶液与均匀乳液的体积比是2-7:10；所述的滴加完后搅拌时间为3-5h；所述的有机溶剂为乙酸乙酯、正己烷、甲醇和无水乙醇中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中所述止血剂卡络磺钠的浓度为0.1%-1%；所述的盐溶液为0.1-0.15M氯化钠水溶液；所述反应时间为30min-120min。
9.根据权利要求1所述的可粘附高效止血微球的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中所述干燥方式包括冷冻干燥、真空干燥或常压干燥；所述的干燥温度在30-40℃。
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