CN116925359A - 一种多孔微球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种多孔微球的制备方法，多孔微球是由含有氨基的高分子和含有醛基的高分子经席夫碱反应得到。本发明反应过程温和、交联剂毒性小，多孔微球用于止血时，可以通过毛细作用快速吸血，又因其多孔的性质，吸附的血量大，最终达到快速大量吸血的效果。

Description

一种多孔微球的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种多孔微球的制备方法。
背景技术
研究表明，当人体受到意外的伤害造成失血时，超过人体总血量的30％就可能引起死亡。如果在失血的初期能够有效控制住出血，受伤人员的存活率可以大大提升。不受控制的大出血是造成伤员死亡的主要原因之一，每年造成200多万人死亡。因此，快速、高效止血对挽救伤员生命至关重要。
明胶是胶原部分水解后获得的可溶性蛋白。研究表明，明胶具有较强的液体吸收能力，能够浓缩血清，因此拥有良好的止血性能。普鲁兰多糖是一种线性的微生物胞外多糖，与其他聚合物体系相比，具有优异的力学性能、亲水性、良好的生物相容性等优点。明胶微球传统的化学交联方式如使用小分子交联剂戊二醛、京尼平等，或者采用甲基丙烯酰胺化的明胶在光引发下双键聚合进行交联，但是这些方式会引起材料不易降解、反应不可控等问题。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种多孔微球的制备方法，所述方法制备的多孔微球是由含有氨基的高分子和含有醛基的高分子溶液经席夫碱反应得到。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的多孔微球的制备方法。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种止血材料，包括第一方面任意一项所述方法制备的多孔微球。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种促进伤口愈合的材料，包括第一方面任意一项所述的多孔微球。多孔微球可以促进伤口愈合。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种药物载体，包括第一方面任意一项所述的多孔微球。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种细胞支架，包括第一方面任意一项所述的多孔微球。
在一实施例中，本发明提供了可以快速大量止血的多孔微球的制备方法。
在一实施例中，本发明反应过程温和、交联剂毒性小，多孔微球用于止血时，可以通过毛细作用快速吸血，又因其多孔的性质吸血的量比较大，最终可以达到快速大量吸血的效果。
附图说明
图1为实施例5制备的明胶/氧化普鲁兰多糖微球的扫描电镜图；
图2为实施例8制备的明胶/氧化葡聚糖微球的扫描电镜图；
图3为实施例9制备的明胶/氧化透明质酸微球的扫描电镜图；
图4为实施例10制得的明胶/改性四臂聚乙二醇微球电镜图；
图5为实施例1、2、3制备的明胶/氧化普鲁兰多糖微球的热重分析图；
图6为实施例2制备的明胶/氧化普鲁兰多糖微球的细胞毒性分析图；
图7A为实施例2体内降解的小动物成像荧光成像图；
图7B为实施例2体内降解的小动物的粪便和尿液的荧光强度图；
图7C为实施例2体内降解的小动物的心、肝、脾、肺、肾的荧光强度图；
图7D为实施例2体内降解的小动物的胃、肠的荧光强度图；
图8为实施例1、2、3制备的明胶/氧化普鲁兰多糖微球的溶血实验统计图；
图9为实施例2制备的明胶/氧化普鲁兰多糖微球在SD大鼠断尾实验中的效果图；
图10为实施例2制备的明胶/氧化普鲁兰多糖微球在SD大鼠肝切叶模型中止血效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以用任意适当的方法结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者操作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种多孔微球，所述多孔微球是由含有氨基的高分子和含有醛基的高分子经席夫碱反应得到。
在一实施例中，所述多孔微球的制备方法包括：将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子的溶液充分混合后加入油相中，反应得到微球。利用含有氨基的高分子和含有醛基的高分子两者发生希夫碱反应进行交联固化的同时，液滴通过一些物理变化改变其形貌，通过选取一些发生化学反应比形成物理变化改变形貌缓慢的条件，即交联时间远大于液滴分散时间。因此，在交联的同时进行形貌的改变。
在一实施例中，所述多孔微球的制备方法包括：将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合得到的溶液尽快滴加到油相中，反应结束后，脱水、离心、洗涤去除油相、浸泡、冻干，得到多孔微球。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中。
在一实施例中，含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合，混合时间可以为10～40s，优选为15～30s，更优选为30s。
在一实施例中，含有氨基的高分子与含有醛基的高分子的混合液滴加入油相的时间可以为60～130s，优选为120s。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中后，继续搅拌，使得各组分继续反应。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中后，加热至37～65℃，优选37℃，继续搅拌。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中后，继续搅拌的时间为1～12h。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子快速混合得到的溶液尽快滴加入油相之前，分别将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子混合得到的溶液滴、油相预热至37～65℃。
在一实施例中，继续搅拌至反应结束后，依次对产物进行冷却、脱水、洗涤、离心，对离心后的微球用去离子水进行浸泡，冷冻生长冰晶，然后冻干，得到所述多孔微球。
在一实施例中，使用去离子水对离心后的微球进行浸泡，利于下一步冷冻生长冰晶。
在一实施例中，所述油相可以包含石蜡油、花生油、玉米油、橄榄油中的至少一种。
在一实施例中，所述油相中还包含乳化剂。
在一实施例中，所述乳化剂包括但不限于Span 80、Span 60、Tween 80、蔗糖酯、十二烷基苯磺酸钠等中的至少一种。
在一实施例中，所述反应是在37～70℃下进行。
在一实施例中，所述含有氨基的高分子、含有醛基的高分子可以是天然高分子或合成高分子。
在一实施例中，所述含有氨基的高分子包括但不限于丝素蛋白、明胶、胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、氨基改性的聚乙二醇中的至少一种。现有技术中使用的是带有双键的高分子，需要光固化等辅助条件，而本发明中的高分子可以不带有双键，不需要光固化等辅助条件。
在一实施例中，所述含有醛基的高分子包括但不限于醛基化的天然高分子、醛基化的合成高分子中的至少一种。
在一实施例中，天然高分子经氧化剂氧化，得到醛基化的高分子。
在一实施例中，氧化剂包括但不限于高碘酸钠、高锰酸钾中的至少一种。
在一实施例中，所述天然高分子包括但不限于普鲁兰多糖、葡聚糖、透明质酸中的至少一种。
在一实施例中，所述醛基化的合成高分子包括但不限于醛基改性的直链聚乙二醇、四臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇等中的至少一种。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的多孔微球的制备方法，包括：将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后滴加到油相中，反应结束后，脱水，离心洗涤去除油相，去离子水浸泡，冷冻生长冰晶，冻干，得到多孔微球。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加入油相中。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中后，继续搅拌，使得各组分继续反应。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中后，加热至37～65℃，继续搅拌。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中后，继续搅拌的时间为1～12h。
在一实施例中，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液快速充分混合后尽快滴加到油相中之前，分别将二者的溶液和油相预热至37～65℃。
在一实施例中，继续搅拌至反应结束后，依次对产物进行冷却、脱水、离心、洗涤，对洗涤后的微球用去离子水进行浸泡，冷冻生长冰晶，然后冻干，得到所述多孔微球。
在一实施例中，使用去离子水对洗涤后的微球进行浸泡。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种止血材料，包括第一方面任意一项所述的方法制备的多孔微球。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种促进创面愈合的材料，包括第一方面任意一项所述制备的多孔微球。根据制备多孔微球的原材料性质，可以使制备出来的材料具有促进伤口愈合效果的性质。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种药物载体，包括第一方面任意一项所述的多孔微球。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种细胞支架，包括第一方面任意一项所述的多孔微球。
在一实施例中，提供一种大分子交联剂交联的多孔微球，用于快速大量止血。
在一实施例中，多孔微球的制备方法包括以下步骤：
(1)制备带有醛基的高分子
可以选取一些天然多糖，例如普鲁兰多糖、葡聚糖、透明质酸等，用高碘酸钠、高锰酸钾等氧化剂进行氧化，得到每条分子链上带有多醛基的天然高分子；或者合成每个分子带有两个以上醛基的合成高分子，例如，醛基改性的直链聚乙二醇、四臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇等。
(2)预热、制备油相
液体石蜡加热到37℃，加入适量乳化剂配置成油相，机械搅拌混合均匀。
(3)预热溶解分散相
加热至37℃，配制合适浓度带有氨基的高分子溶液和带有醛基的高分子溶液，带有氨基的高分子可选取丝素蛋白、明胶、胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、氨基改性的聚乙二醇等。
(4)制备多孔微球
将步骤(3)中预溶解的溶液快速充分混合，取25mL，再快速滴加到步骤(2)制备的油相中，滴加完成后，持续搅拌、加热4h。4h后，将固化好的微球用丙酮、异丙醇等有机溶剂洗涤去油相，洗净油相后，将微球浸泡在去离子水中，浸泡90min后，放入冰箱中过夜冷冻，然后冻干。冻干后即可得到多孔微球。本发明在滴加过程中发生交联，滴加结束后交联未完全结束，而是继续缓慢进行，搅拌的过程会进一步影响材料形成液滴，进一步交联固化成为微球。现有技术中使用微流控等方法主要是形成液滴，未固化。
在一实施例中，本发明制备的多孔微球可降解。
在一实施例中，步骤(1)中，氧化多糖的氧化程度可以根据加入的氧化剂含量进行调节。
在一实施例中，步骤(1)中，使用的氧化多糖包括但不限于普鲁兰多糖、葡聚糖和透明质酸等。
在一实施例中，步骤(2)中，预热、配制的油相包括但不限于石蜡油、花生油、玉米油、橄榄油等，乳化剂种类包括但不限于Span 80、Span 60、Tween 80、蔗糖酯、十二烷基苯磺酸钠等。
在一实施例中，步骤(4)中，机械搅拌速度包括但不限于500-1500rpm，得到的微球的粒径会因为搅拌速度以及其溶液粘度不同而不同，包括但不限于20-500μm。
在一实施例中，提供了多孔微球在止血封闭、伤口愈合、药物载体、细胞支架等方面的应用。
在一实施例中，利用本发明的方法制备多孔微球，可以综合两种或两种以上原料的特性，且因为发生化学交联比单纯的物理混合网络更致密，结构更加稳定，原料中存在明胶还可以使得微球降解性、生物相容性良好，有望通过调整微球的原料比例从而达到材料与生物应用部位的高度匹配。此外，制备强度较高的复合微球还可以通过调节冰晶生长温度从而得到不同孔径大小的多孔微球，进而提供给不同细胞作为细胞支架。
在一实施例中，本发明提供了一种可控降解、高强度复合材料的多孔微球及其制备方法。
在一实施例中，本发明的第一个目的在于提供一种可以用两种及以上高分子材料进行制备微球的方法。
在一实施例中，本发明的第二个目的在于提供一种用高分子例如氧化普鲁兰多糖、氧化葡聚糖、氧化透明质酸交联的明胶微球的制备方法。
在一实施例中，本发明的第三个目的在于制备一种强度适应于制备多种孔径大小的微球的方法。
在一实施例中，本发明的第四个目的在于制备一种可生物降解的多孔明胶/氧化普鲁兰多糖复合微球，用于伤口止血。
在一实施例中，本发明提供的多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球的制备方法包括以下步骤：
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入2.1-8.4mmol的高碘酸钠避光搅拌反应2-8h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析，透析60h将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后加入溶液1-5％的乳化剂，机械搅拌300-1500rpm混合均匀，37-65℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成10-20％w/v的水溶液，氧化后的普鲁兰多糖配制成2-10％w/v浓度的水溶液，溶液在37-65℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌快速均匀混合，30-90s即可，取25mL混合液，滴加到预热的油相中，根据其粘度变化的时间，30-180s内滴加完成，37-65℃持续加热，继续机械搅拌300-1500rpm，持续1-12h。反应完成后，冰浴冷却10-30min，冷却后，体系中加入200mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮、异丙醇等有机溶剂将微球洗涤，然后再用1000rpm离心，反复3次及以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，去离子水浸泡90min后，可以放入-20℃或-80℃的冰箱，过夜等待冰晶生长，或者直接用液氮促进冰晶快速生长，得到具有一定大小冰晶的微球，冻干后即可得到具有不同孔径大小的多孔微球。
在一实施例中，步骤(1)中，所述的溶液所用的高碘酸钠用量不超过8.4mmol，过高的氧化剂用量容易造成过度氧化。高碘酸钠氧化时间实验得到最佳的时间范围是4-6h。
在一实施例中，步骤(2)中，乳化剂可以优选5％浓度的Span 80，机械搅拌速度维持在500-800rpm即可。
在一实施例中，步骤(3)中，在优化实验方案中预热温度控制在37℃最佳。机械搅拌速度维持在500-800rpm即可。明胶溶液浓度可以选择20％w/v，氧化普鲁兰多糖浓度选择为2-6％w/v最佳。
在一实施例中，步骤(4)中，可以选用500-800rpm磁力搅拌快速均匀混合，持续大约30s，滴加到油相的时间可以控制在60s以内。反应结束后，优选使用200mL丙酮进行脱水，洗涤剂优选丙酮和异丙醇这两种有机溶剂。冰晶生长的温度根据所需要孔径的大小调节，温度越低，冰晶越大，得到多孔微球的孔径就越大。
在一实施例中，本发明提供一种复合两种及以上大分子交联而制备多孔微球的方法，根据上述任一所述方法制备得到。
在一实施例中，本发明提供一种多孔明胶/普鲁兰多糖微球，用于出血性创伤的封闭。SD大鼠的尾巴在1/2截断，用150mg的多孔微球，即可观察到断尾处被多孔微球吸附液体。.
在一实施例中，本发明提供一种可以不用移除，可以避免造成二次伤害的止血封闭材料。明胶/氧化普鲁兰多糖微球在体内可以自然降解，是一种具有潜力的止血材料。
实施例1
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入8.4mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜，冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后在油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化普鲁兰多糖配制成2％w/v浓度的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s(通过实验尝试，此氧化条件的普鲁兰多糖和明胶最佳混合时间为30s)，混合后滴加到预热的油相中取25mL混合液，在120s内完成滴加，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入-20℃的冰箱中，过夜等待冰晶生长，冻干后即可得到多孔微球GPMs-Ⅰ。
实施例2
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入8.4mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后在油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化普鲁兰多糖配制成4％w/v的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s，混合后滴加到预热的油相中，取25mL混合液，120s滴加完成，持续加热37℃、机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入-20℃的冰箱中，过夜等待冰晶生长，冻干后即可得到多孔微球GPMs-Ⅱ。
实施例3
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入8.4mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后在油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化普鲁兰多糖配制成6％w/v浓度的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s，混合后滴加到预热的油相中，取25mL混合液，120s内完成滴加，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入-20℃的冰箱中，过夜等待冰晶生长冻干后即可得到多孔微球GPMs-Ⅲ。
实施例4
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入8.4mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后在油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧普鲁兰多糖配制成4％w/v浓度的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s，混合后滴加到预热的油相中，取25mL混合液，120s滴加完成，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入-80℃的冰箱中，过夜等待冰晶生长，冻干后即可得多孔微球GPMs-IV。
实施例5
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入8.4mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜,冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后在油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化普鲁兰多糖配制成4％w/v浓度的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s，混合后滴加到预热的油相中，取25mL混合液，120s滴加完成，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入液氮中，5min后，待冰晶生长完全，在进行冻干，最后即可得到多孔微球GPMs-V。
实施例6
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入4.2mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析60h，将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后加入油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化普鲁兰多糖配制成4％w/v浓度的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s，混合后滴加到预热的油相中，取25mL混合液，120s滴加完成，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入-20℃的冰箱中，过夜等待冰晶生长，再进行冻干，冻干后即可得到多孔微球GPMs-VI。
实施例7
(1)氧化普鲁兰多糖
将2g普鲁兰多糖溶于100mL的pH＝4的硫酸溶液中，然后加入2.1mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用1000截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的普鲁兰多糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后在油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化普鲁兰多糖配制成4％w/v浓度的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s，混合后滴加到预热的油相中，取25mL混合液，120s滴加完成，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入-20℃的冰箱中，过夜等待冰晶生长，再进行冻干，冻干后即可得多孔微球GPMs-VII。
实施例8
(1)氧化葡聚糖
将10g葡聚糖溶于100mL的去离子水中，然后加入2.1mmol的高碘酸钠避光搅拌反应4h，反应结束后用3500截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的葡聚糖。
(2)配制反应的油相
将500mL的石蜡油倒入1000mL的反应瓶中，然后在油相中加入16g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化葡聚糖配制成4％w/v的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化葡聚糖微球
将预热好的分散相用磁力搅拌等比例快速均匀混合30s，混合后滴加到预热的油相中，取25mL混合液，120s滴加完成，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、3h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入200mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入液氮中，待冰晶生长完全后，再冻干，最后即可得到多孔微球GPMs-VIII。
实施例9
(1)氧化透明质酸
将10g透明质酸溶于100mL的去离子水中，然后加入13g的高碘酸钠避光搅拌，反应4h，反应结束后用3500截留分子量的透析袋进行透析，透析60h后将溶液冷冻过夜，最后将其进行冻干，冻干后得到氧化的透明质酸。
(2)配制反应的油相
将100mL的石蜡油倒入250mL的反应瓶中，然后在油相中加入3g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热溶解配制成20％w/v的水溶液，氧化透明质酸配制成4％w/v的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/氧化透明质酸微球
将预热好的分散相用磁力搅拌快速均匀混合15s，混合后滴加到预热的油相中，取出其中5mL混合液，30s滴加完成，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、持续16h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入50mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入液氮中，待冰晶生长完全，冻干，最终即可得到多孔微球GPMs-IX。
实施例10
(1)氨基改性化聚乙二醇
可以选取4臂的聚乙二醇进行氨基化改性，或者直接购改性的氨基化聚乙二醇，本实施例选取了10k分子量的氨基化4臂聚乙二醇。
(2)配制反应的油相
将100mL的石蜡油倒入250mL的反应瓶中，然后在油相中加入3g的Span 80，机械搅拌530rpm混合均匀，37℃预热。
(3)预溶解分散相
将明胶加热至37℃配制成20％w/v的水溶液，氨基化的聚乙二醇配制成4％w/v的水溶液，二者分别在37℃预热。
(4)制备多孔明胶/聚乙二醇微球
将预热好的分散相用磁力搅拌快速均匀混合15s，混合后尽快滴加到预热的油相中，取5mL混合液，30s滴加完成，持续加热37℃、继续机械搅拌530rpm、持续16h。反应完成后，用冰浴冷却15min，冷却后，体系中加入50mL丙酮进行脱水，脱水30min后，用丙酮洗涤微球，1000rpm离心，此过程反复3次以上，待微球表面的油洗净后，用去离子水浸泡微球，浸泡90min后，放入液氮中，待冰晶生长完全，冻干后即可得多孔微球GPMs-X。
(一)微球结构表征
(1)扫描电镜形貌表征
为了检测多孔微球的形貌，对实施例5所制备的多孔明胶/氧化普鲁兰多糖微球进行形貌分析，得到的扫描电镜照片如图1所示，微球具有比较大的孔径，冻干后得到的微球其孔径约为10μm。从图1可见，微球具有孔径结构，且结构稳定，没有塌陷等情况发生。
为了检测多孔微球的形貌，对实施例8所制备的多孔明胶/氧化葡聚糖微球进行形貌分析，得到的扫描电镜照片如图2所示。可见，微球拥有多孔结构且结构稳定，没有塌陷。
为了检测多孔微球的形貌，对实施例9所制备的多孔明胶/氧化透明质酸微球进行形貌分析，得到的扫描电镜照片如图3所示。可见，微球具有多孔结构，结构没有塌陷。相较于前两种微球(图1、2)，图3所示的微球的粒径较大，可能是由于透明质酸粘度大，受到同样的剪切力分散性更差，其孔径结构没有前两种稳定，可能是由于透明质酸本身强度没有普鲁兰多糖和葡聚糖高。
三种微球中，使用的明胶和氧化多糖的比例相同，油相、乳化剂种类和含量、反应转速一样，但是得到的微球的粒径不同，相同的致孔条件即均为液氮致孔，得到的微球孔径大小也不同，说明其不同组合的原料因其黏度等特性的不同，会得到不同粒径大小、孔径大小的微球。
图4为实施例10制得的多孔微球电镜图，由图可见，明胶和改性聚乙二醇也可以运用此方法制备微球
(2)热重分析
对实施例1、2、3中得到的微球GPMs-Ⅰ、GPMs-Ⅱ、GPMs-Ⅲ进行热重分析，从100℃开始，用5℃/min的条件进行升温，升温至800℃。得到的热重曲线如图5所示，微球的失重率小于其原料明胶和氧化普鲁兰多糖。
(3)孔隙率测试
采用液体置换法(乙醇，室温下)测多孔微球GPMs(I、II、III)的孔隙率。首先，将一个空的比重计(M)装满乙醇(总重量M1)。其次，将多孔微球(GPMs)完全浸泡在充满乙醇的比重计中。用比重计真空化3min，用乙醇填充微球的孔，然后用乙醇重新填充比重计(总重量M2)。最后，排出比重计中剩余的乙醇，剩余重量(比重计、微球和微球孔中的乙醇)为M3。多孔微球的孔隙率(P)计算如下式：
Vs＝(M1-M2+M3-M)/ρethanol
P(％)＝Vp/Vs＝(M3-M-Ms)/(M1-M2+M3-M)
实验结果表明，多孔微球GPMs-I、GPMs-II、GPMs-III均超过90％，也可以证明微球具有多孔的结构。
(二)微球生物安全性测试
(1)细胞毒性实验
将实施例2中得到的微球GPMs-Ⅱ用CCK-8毒性定量法研究微球的细胞活力。小鼠成纤维细胞接种在96孔板中，3000个每孔的细胞密度，在37℃、5％ CO2的培养箱中进行孵育，孵育24h。以5g/mL、10g/mL和20g/mL三个浓度将GPMs-Ⅱ在完培养基中浸泡24h，选择云南白药(YB)以10g/mL的浓度的作为商业对照组。用完全培养基中培养的细胞作为空白对照(Control)。在24h、48h、72h除去样品溶液，加入10μL的CCK-8试剂到培养基中，持续培养1.5h。最后用酶标仪在450nm吸光度处检测样品溶液的吸光度，如图6所示。在高、中、低三种浓度的材料浸提液中，cck-8实验的结果均表现出细胞没有毒性，对比云南白药高的细胞毒性，GPMs显示出了其低细胞毒性方面的优势。
(2)体内降解实验
用Cy 5.5标记明胶制备材料GPMs-II，取1mg在C57小鼠皮下进行埋植，固定时间对小鼠进行荧光成像，观察其荧光强度的变化，结果如图7A，可看出，随着埋植时间的增加，荧光信号明显减弱，埋植1天后，荧光信号明显减弱，4天后减弱更加明显，15天后，荧光信号消失。对上述小鼠的粪便和尿液进行收集，观察其粪便和尿液的荧光强度，可以看出其代谢途径和排泄物荧光信号的强度变化，结果如图7B，可以看出在小鼠的尿液中没有荧光信号，说明GPMs-Ⅱ的代谢不通过肾脏，而粪便存在一定的荧光信号，说明GPMs-Ⅱ的代谢通过胃肠。一定时间解剖一只小鼠，对其心、肝、脾、肺、肾、胃、肠进行荧光信号的观察，结果如图7C和图7D，可以看到在第5天的时候，小鼠的肝脏和肾脏有一些荧光，胃肠在3-15天时均有一定的荧光信号，且随着天数的增加，荧光信号减弱，因此，可以看出GPMs-Ⅱ在小鼠体内代谢主要是通过胃肠道。
(3)血液相容性实验
将实施例1、2、3中得到的微球GPMs-Ⅰ、GPMs-Ⅱ、GPMs-Ⅲ用PBS配制10g/mL的浓度的悬浊液浸泡24h。新鲜的抗凝大鼠全血以3000rpm离心10min后得到红细胞，再用PBS洗涤并再离心，重复3次，用PBS将红细胞稀释为4vol.％的悬浮液。PBS和提取液稀释成(1：1v/v)的混合物分别在37℃下孵育3h。接下来，将混合物以3000rpm的转速离心10min，用酶标仪测试上清液在540nm处的吸光度。0.1％的曲拉通溶液为阳性对照，PBS为阴性对照。得到的数据如图8所示，样品溶血率低于5％，说明材料安全。
(四)多孔微球止血性能测试
(1)大鼠断尾模型止血实验
SD大鼠断尾止血实验：SD大鼠(雄性，300-350g)。大鼠用异氟烷进行气体麻醉。麻醉后，将大鼠放置在手术台上，尾巴进行消毒，尾巴下面垫上的滤纸，拍照记录0s的图片，尾巴在1/2处截断，同时记录时间，使其自由出血5s，5s后迅速擦掉断尾处的血，再在断尾处撒上160mg止血粉(GPMs-Ⅱ)，每隔10s观察出血是否停止，同时在不同时间拍下照片(30s、1min、3min)，如图9所示。SD大鼠断尾模型的止血效果显著，其中GPMs-Ⅱ在60s内就完全止住了断尾的流血，3min后没有明显的变化。
(2)大鼠肝切叶模型止血实验
SD大鼠肝切叶止血实验：SD大鼠(雄性，300-350g)。大鼠用异氟烷进行气体麻醉。麻醉后，将大鼠放置在手术台上，大鼠腹部进行剃毛处理，剪开腹腔，找到肝脏，肝脏用棉适当进行擦拭，擦掉多余体液后，肝脏下垫上滤纸，拍照，记录为0s时的状态，剪下大约为2cm的肝切叶，同时记录时间，自由出血5s后，撒上300mg止血粉(GPMs-Ⅱ)，每隔10s观察一次出血情况，期间10s、30s、1min、2min时进行拍照，直到出血停止。空白组采取自由出血的方式进行实验。结果如图10所示。可见，SD大鼠肝切叶模型止血效果中，可以看出GPMs-Ⅱ对大鼠肝脏止血，在1min时已经成功止血，到2min时没有仍明显变化，而空白组不做任何处理，到2min时仍未能明显止住血。
在一实施例中，本发明制备的微球孔隙率高，采用溶液置换法测试其孔隙率，最高可以超过90％。
在一实施例中，本发明涉及一种用大分子作为交联剂的微球制备方法，该方法可以用于制备快速大量止血的多孔微球。首先制备大分子交联剂，天然化合物可以选取天然多糖，将天然多糖氧化，得到分子链上带有多个醛基多糖；或者合成分子链上带有两个以上醛基的高分子化合物。然后将带有醛基的化合物溶于溶剂中，将带有氨基的化合物也溶于同一种溶剂后，快速充分混合，然后将混合液滴加到含有乳化剂的油相中，通过油包水的方式形成一个个小液滴，带有氨基的化合物和带有醛基的化合物进行交联固化，因为其分散的时间远小于其交联固化的时间，因此，可以达到液滴在油相中充分分散后才完成交联固化的目的；一段时间固化完成后，用有机溶剂洗去油和乳化剂，再用去离子水对微球充分浸泡，浸泡充分后放入冰箱或者液氮中，形成不一样大小的冰晶；最后冻干，得到具有多孔结构的微球。本发明反应过程温和，交联剂毒性小，且可以通过调节带有醛基的化合物的含量或者氧化度等多个方面调节交联密度。交联剂不仅仅能够起到交联的作用，还能提供给微球这种交联剂本身的一些性质；可以通过调整冰晶形成的温度，得到不同大小的冰晶，进而冻干后得到不同孔径大小的多孔微球。多孔微球用于止血时，可以通过毛细作用快速吸血，又因其高孔隙率，从而具有高吸血量。本发明适合在栓塞、载药(尤其是可控释放载药)、致孔剂、细胞支架等多领域制备微球。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种多孔微球的制备方法，其特征在于，所述多孔微球是由含有氨基的高分子和含有醛基的高分子经席夫碱反应得到。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液混合得到的溶液加入油相中，反应得到微球。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多孔微球的制备方法包括：将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液混合得到的溶液加入油相中，反应结束后，去除油相，冻干，得到多孔微球；
或，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液混合得到的溶液加入油相中；
或，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液混合得到的溶液加入油相中后，继续搅拌，使得各组分继续反应；
或，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液混合得到的溶液加入油相中后，加热至37～65℃，继续搅拌；
或，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液混合得到的溶液加入油相中后，继续搅拌的时间为1～12h；
或，将含有氨基的高分子与含有醛基的高分子溶液混合得到的溶液滴加入油相之前，分别将两种溶液和油相预热至37～65℃；
或，继续搅拌至反应结束后，依次对产物进行冷却、脱水、洗涤、离心，对洗涤后的微球进行浸泡，然后冷冻生长冰晶，最后冻干，得到所述多孔微球；
或，用水对洗涤后的微球进行浸泡。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述油相包含石蜡油、花生油、玉米油、橄榄油中的至少一种；
或，所述油相中还包含乳化剂；
或，所述乳化剂包括Span 80、Span 60、Tween 80、蔗糖酯、十二烷基苯磺酸钠中的至少一种；
或，所述反应是在37～70℃下进行。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含有氨基的高分子包括丝素蛋白、明胶、胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、氨基改性的聚乙二醇中的至少一种；
或，所述含有醛基的高分子包括醛基化的天然高分子、醛基化的合成高分子中的至少一种；
或，所述天然高分子包括普鲁兰多糖、葡聚糖、透明质酸中的至少一种；
或，所述醛基化的合成高分子包括醛基改性的直链聚乙二醇、四臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇等中的至少一种。
6.一种如权利要求1～5任意一项所述的制备方法制得的多孔微球。
7.一种止血材料，其特征在于，包括如权利要求6所述的多孔微球。
8.一种促进创面愈合的材料，其特征在于，包括如权利要求6所述的多孔微球。
9.一种药物载体，其特征在于，包括如权利要求6所述的多孔微球。
10.一种细胞支架，其特征在于，包括如权利要求6所述的多孔微球。
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