CN113924122A - 水凝胶微粒中的可调降解 - Google Patents

Abstract

用于在植入部位局部递送和持续释放治疗性细胞和/或组织(包括同质或异质细胞簇)的非藻酸盐水凝胶微粒。所述微粒包括共价交联的非藻酸盐聚合物化合物的3维基质以及包埋在其中的治疗有效量的细胞和/或组织，其中所述细胞具有至少约50％的生存力，并且其中所述微粒具有大于约30pm的大小。还描述了包含这样的微粒的组合物和使用这样的微粒用于治疗的方法。

Description

水凝胶微粒中的可调降解

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年6月7日提交的题为“水凝胶微粒中的可调降解(TUNABLEDEGRADATION IN HYDROGEL MICROPARTICLES)”的美国临时专利申请序列号62/858,578的优先权权益，通过援引以其整体并入本文。

背景技术

发明领域

本发明涉及用于包封生物制品的基于水凝胶的微粒，以及用于调节水凝胶基质的物理和化学特征，例如，以增加或降低微粒的降解概况的方法。

相关技术的描述

细胞微囊化是一个快速扩展的领域，在治疗疾病，诸如糖尿病、癌症、心脏病和免疫紊乱以及组织工程研究和再生医学方面具有广泛的潜在效用。传统的藻酸盐微球仍然遭受差的生物相容性，并且由于它们较慢的胶凝速率，使用更先进的水凝胶进行微囊化具有挑战性。需要的是可以由多种水凝胶材料制造的无细胞毒性、非乳液基水凝胶微粒。

发明内容

本文描述的是用于在植入部位局部递送和持续释放治疗性细胞和/或组织(包括同质或异质细胞簇)的非藻酸盐水凝胶微粒。所述微粒包括共价交联的非藻酸盐聚合物化合物的3维基质以及包埋在其中的治疗有效量的细胞和/或组织，其中所述细胞具有至少50％的生存力，并且其中所述微粒具有大于约30μm的大小。示例性聚合物化合物选自慢胶凝聚合物前体，所述慢胶凝聚合物前体选自由以下组成的组：支链或非支链的透明质酸(hyaluronic acid)、支链或非支链的官能化的透明质酸、支链或非支链的官能化的聚乙二醇、透明质多糖(hyaluronan)、纤维蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-co-乙醇酸、聚己内酯、聚乙烯醇及其组合。所述基质可以进一步包括与所述非藻酸盐聚合物化合物交联的交联剂，所述交联剂选自由以下组成的组：二硫苏糖醇、支链或非支链的官能化的聚乙二醇、二硫醇、乙二醇双-巯基乙酸酯及其组合。示例性官能化的聚乙二醇包括但不限于聚乙二醇二硫醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二乙烯基砜、聚乙二醇二马来酰亚胺及其组合。所述基质可以是均质的，包括一种类型的共价交联的聚合物主链(有或没有额外的不同聚合物类型的交联剂)。所述基质也可以是异质的，包括两种或更多种聚合物前体的混合物，诸如高(≤500kDA，优选≤100kDA)和低(<100kDA，优选≤50kDa)分子量聚合物前体的组合，和/或两种或更多种交联剂的混合物。

本文还描述了包括多个这样的微粒的组合物。这样的组合物还可包括与负载细胞或组织的微粒一起分散的多个“空的”微粒。所述组合物可以包括不同微粒的混合物，例如可降解和耐久性水凝胶微粒的混合物，和/或不同大小的微粒(例如，多个较大微粒和多个较小微粒)的混合物，和/或各自包含不同类型的细胞和/或组织的微粒(例如，产生胰岛素的细胞在一组微粒中以及支持性干细胞在另一组微粒中)的混合物。也可以组合或共同给药两种不同的组合物，而不是将两种不同类型的颗粒混合成单一组合物。

本文还考虑了用于通过给药所述微粒和/或包含这样的微粒的组合物(单独或如果需要的话与其他类型的治疗性化合物组合)在植入部位局部递送和持续释放治疗性细胞和/或组织的各种方法。通常，将所述微粒或组合物直接注射或植入在治疗部位处或治疗部位附近(邻近治疗部位)。

本文还描述了用于通过改变微粒的各种参数来调节微粒的降解速率的各种方法和技术，包括配制和/或加工参数，诸如聚合物前体质量分数或分子量、交联剂分子量、交联剂与聚合物前体的比率、交联剂水解、交联动力学、交联时间(例如，UV暴露时间)及其组合。

进一步地，本文描述的实施方式考虑通过在关节中植入多个空的微粒而空的微粒用于关节润滑和/或粘弹性补充(viscosupplementation)的用途。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有一张或多张彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将由专利局提供。

图(图(Fig.))1是水凝胶前体化合物的共价交联的实例的图示。

图2是用于形成微粒的方法的图示，包括(A)液滴形成，(B)在藻酸盐浴中孵育，(C)藻酸盐壳的形成和增厚，以及(D)水凝胶核交联紧接着去除藻酸盐壳以产生水凝胶微粒。

图3示出了对于(A)微粒周围的藻酸盐壳；以及(B)藻酸盐壳去除之后的水凝胶微粒的图像。

图4示出了(A)负载有胰岛的基于PEG的球形耐久性微粒、(B)负载有胰岛的基于PEG的椭圆形微粒、(C)负载有干细胞的基于MeHA的扁平边缘的微粒以及(D)负载有干细胞的基于MeHA的椭圆形微粒的图像。

图5示出了来自以下的结果：细胞毒性研究以及(A)钙浓度和暴露时间对犬胰岛的生存力的影响，以及(B)光引发剂浓度和UV光暴露时间对细胞生存力的影响。

图6是由ThHA、MeHA、PEGDA或AHA构成的100个代表性微粒的直径及它们的良好的单分散性概况的图形绘图。

图7示出了荧光标记的右旋糖酐扩散到PEGDA、ThHA和MeHA水凝胶微粒中的图像。

图8A是基于随时间推移的剩余的微粒聚合物质量的不同颗粒的降解图。

图8B是不同颗粒的Q值(溶胀比)随时间推移而变化的图。

图8C是基于随时间推移的颗粒质量损失的不同颗粒的降解图。

图9是小鼠中移植后在初始研究群组期间每组的平均每日血糖水平图。

图10示出了从小鼠IP空间回收的微粒的图像，(A)PEDGA、(B)MeHA、(C)PEDGA，其中生存力如通过深红色二硫腙染色指示，以及(D)PEDGA，生存力如通过与深红色二硫腙和绿色钙黄绿素的共染色指示。

图11示出了健康脂肪细胞的图像，表明在植入有PEGDA微粒后没有纤维化组织。

图12是来自每天早上和下午在狗中获得的测量的平均非空腹血糖的图。

图13示出了以下的图像：(A)HEK293细胞在耐久性PEGDA微粒中聚在一起，(B)34天后的PEGDA微粒中的来自(A)的细胞形态或数目几乎没有变化，(C)在可降解MeHA微粒中分散的HEK293细胞以及(D)34天后MeHA微粒中来自(C)的细胞的增殖。

图14示出了来自微板孔的图像，其中收集的用过的培养基示出(A)非常少的HEK293细胞从PEGDA微粒扩散，以及(B)大量的活细胞从MeHA微粒扩散。

图15是概括了来自关于累积细胞释放的研究的平均数据的图。

图16示出了以下的图像：(A)包封在PEGDA微粒中的MSC、(B)包封在MeHA微粒中的MSC、(C)包封在PEGDA微粒中的胰岛、(D)包封在MeHA微粒中的胰岛以及(E)包封在AHA微粒中的MSC。

图17是包封在PEGDA和AHA微粒中的大鼠胰岛素瘤细胞系的细胞生存力图。

图18示出了胰岛的图像，该胰岛包封在PEGDA或MeHA中，并且用二硫腙染色以证明是产生胰岛素的功能性胰岛。

图19示出了以下的图像：(A)输注到腹部网膜内和周围的PEDGA微粒，(B)附着在第一只狗的组织上的微粒，以及(C)以及附着在第二只狗的组织上的微粒，证明了颗粒的“粘性”。

图20示出了以下的图像：(A)大鼠膝关节中蓝色染色的PEGDA微粒，透过肌肉可见；(B)解剖的膝关节，示出膝囊区中的蓝色染色的PEGDA微粒；(C)进一步解剖的膝关节，示出蓝色染色的PEGDA微粒保留在最初植入的膝关节的地方。

图21示出了三个微粒组的外植组织的苏木精和伊红染色的图像。

图22是(没有)异物对网膜中的微粒响应的图。

图23是水凝胶前体溶液中使用的核(主链)聚合物物质的质量分数对Q值的影响的图。

图24A是展示其中增加交联剂浓度导致更低的Q值的制剂的图。

图24B是展示其中增加交联剂浓度导致更高的Q值的制剂的图。

图25A是展示其中增加pH导致更高的Q值的制剂的图。

图25B是展示其中增加pH导致更低的Q值的制剂的图。

图26A是展示其中增加交联剂的分子量导致更高的Q值的制剂的图。

图26B是展示其中增加交联剂的分子量没有引起Q值变化的制剂的图。

图27A是改变具有恒定反应位点/克的核聚合物物质的分子量对Q值的影响的图。

图27B是改变具有不同反应位点/克的核聚合物物质的分子量对Q值的影响的图。

图28A是不同微粒制剂的UV交联时间对颗粒的Q值(溶胀比)和直径的影响的图。

图28B是UV交联时间对MeHA微粒Q值的影响的图。

具体实施方式

本发明广泛地涉及用于局部递送和持续释放治疗性细胞和组织的水凝胶微粒。水凝胶微粒保护植入的细胞免于在生理条件下的初始降解和冲洗(生物降解)，并控制细胞(及其治疗性蛋白质和分子)在若干个小时至若干个周或月的时间段内释放到局部或全身区域的动力学。被设计用于降解的水凝胶微粒最终在数天或数周的时间段内以及通常在小于3个月内通过正常生理过程在体内降解。这意指整个水凝胶在此时间范围内已通过正常生理条件降解并被冲走，使得在植入区域中基本上没有留下水凝胶(应当理解，痕量的凝胶或聚合物可能仍保留在该区域中，但通常不再足以充当植入细胞的包封剂)。还应当理解，在一些适应症中，特别是在关节处植入的情况下，微粒还通过在关节部位的运动和冲击而经受机械降解。

水凝胶微粒包括水凝胶基质，在其中包封了治疗有效量的细胞。细胞可以是真核或原核的。原核细胞的实例包括细菌和古菌。真核细胞包括动物细胞、植物细胞和真菌。细胞可以是非增殖性的或增殖性的。在植入之前和/或在植入时间段期间，或者在将增殖性细胞从降解水凝胶中释放出来之后，增殖性细胞将从包封在水凝胶内的初始细胞数目进一步增殖(增加)。非增殖性细胞具有有限的体外扩增能力，并且一般不会从初始细胞数目增加。然而，由于水凝胶微粒中的有利条件，包封的细胞中存在极少的细胞死亡，并且被水凝胶包封的非增殖性细胞的初始细胞数目也不会明显减少。在一种或多种实施方式中，与包括在前体溶液中的起始细胞群的生存力相比，包封在微粒中之后的细胞的初始生存力保持至少50％，优选至少约70％生存力，更优选至少约80％生存力，甚至更优选至少约90％生存力，以及甚至更优选地包封之后至少约95％生存力。换句话说，在包封期间损失小于50％的细胞群，优选小于30％，更优选小于20％，甚至更优选小于90％，以及甚至更优选小于5％的细胞群在包封过程期间损失。这是由于温和的包封过程以及细胞培养基和营养物质能够在储存期间扩散到微粒中。换句话说，在一种或多种实施方式中，微粒具有低扩散势垒。

在一种或多种实施方式中，包括在水凝胶前体溶液中的细胞群将包括约100万至约5亿个细胞/mL水凝胶前体溶液，优选约400万个细胞至约3亿个细胞/mL水凝胶前体溶液，并且在一些实施方式中，约500万至约1.5亿个细胞/mL前体溶液。在一种或多种实施方式中，水凝胶前体溶液将包括按体积计大约15％的待包封的细胞、细胞簇或组织/mL水凝胶前体溶液。

增殖性细胞的实例包括干细胞和活化T细胞，而非增殖性细胞的实例包括胰岛和分化的神经元细胞。在任何一种情况下，细胞(及它们的相关细胞产物)从水凝胶中缓慢释放到植入的局部区域。可与细胞一起分泌的示例性细胞产物包括信号传导分子、治疗性蛋白质、囊泡、抗体、病毒、胞外体等。这些具有蛋白质基础的组分可以呈它们的天然形式，或可以是经过遗传修饰的。同样，细胞产物组分可以是天然的或遗传修饰的。与其他载体或未包封的细胞相比，水凝胶微粒允许细胞在植入的局部区域维持更长的时间段，并向该区域提供细胞和/或它们的信号传导分子、蛋白质等的临时但可持续的释放，以提高植入细胞的治疗效果。应当理解，细胞负载量将取决于所用细胞的大小和每个微粒的大小。在一种或多种实施方式中，微粒的体积的最高达50％由包封的细胞、细胞簇和/或组织构成，优选地，细胞、簇和/或组织负载量范围为约10％至约20％的微粒体的体积。通常，约50至约1x10⁵个细胞可以被包封在每个1-mm的微粒中，优选地约100至约1x10⁵个将被包封在每个1-mm的微粒中。

在一种或多种实施方式中，微粒由较弱的水凝胶形成，这些水凝胶最终在自植入之日起约3个月(90天)或更短内在体内分解，并且在本文中被称为“可降解的”水凝胶(应当理解大多数水凝胶最终最后会降解)。如本文使用的，“可降解的”水凝胶微粒被定义为“持续释放”但“快速降解的”或“短期”水凝胶，其将保持其自维持微粒体在PBS中持续至少24小时以及在体内植入时最高达3个月。这样的可降解的水凝胶微粒也会在体外储存条件(PBS和37℃)下在约6个月内分解和降解。换句话说，水凝胶基质具有的“体外储存稳定性”小于6个月，这意指它在37℃下在PBS中储存时在6个月或更短内开始水解并从其自维持体分裂开。在一种或多种实施方式中，可降解的水凝胶微粒的特征在于具有大于150、优选地大于200的Q值。然而，如下所说明的，对交联化学物进行额外的改性(例如，使用水解不稳定的交联剂)可以产生具有低Q值(强初始基质)的微粒，但是其分解得相当快，并且仍然被表征为可降解的水凝胶微粒。

这些可降解微粒与涉及耐久性水凝胶微粒的替代实施方式形成对比。这样的耐久性水凝胶微粒也是持续释放的，但对于更长期的应用，使得它们在37℃下在PBS中的储存条件下至少6个月不会分解或降解。换句话说，耐久性微粒具有大于6个月的“体外储存稳定性”。在一种或多种实施方式中，耐久性水凝胶颗粒在室温(27℃)下在PBS中在一年或更长是贮存稳定的。优选地，当这样的耐久性水凝胶微粒被植入时，它们在正常生理(亦称通过吞噬作用、降解、吸附等的正常体内异物清除)条件下至少3个月以及更优选至少6个月内不会被分解。

在任何一种情况下，水凝胶微粒也可表征为微球、微珠或水凝胶微粒。它们以单独的自支撑体形式，包括3维水凝胶基质和悬浮、包埋或包封在水凝胶基质中的细胞。本文还描述了用于植入受试者的持续释放组合物。持续释放组合物包括悬浮在药学上可接受的递送载体中的多个3维水凝胶微粒。

用于在形成微粒中使用的合适的水凝胶前体化合物包括形成水凝胶的聚合物、低聚物和/或单体，并且因此能够通过交联形成交联的或网络结构或基质(即“水凝胶”)，其中液体和细胞可以保留、悬浮、包埋和/或包封在所得胶凝的结构或基质体的间隙空间或孔中。用于本发明的水凝胶前体化合物优选为非藻酸盐水凝胶前体化合物。即，水凝胶前体溶液优选基本上不含藻酸盐化合物(即基于藻酸盐、藻酸或其盐或衍生物的化合物)。如本文使用的，术语“基本上不含”意指成分并非有意添加到组合物中，尽管可能会出现附带的杂质，或者在制造过程中可能留下残留/痕量。在这样的实施方式中，水凝胶前体溶液组合物包括小于按重量计约0.05％，优选小于约0.01％，以及更优选按重量计约0％的这样的成分，基于取溶液的总重量为按重量计100％。

水凝胶微粒可以有利地由多种慢胶凝聚合物前体制造，诸如透明质酸(HA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚乙二醇马来酰亚胺(PEGMAL)、多臂PEG、透明质多糖、纤维蛋白、壳聚糖、胶原、肝素、聚乳酸(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚乳酸-co-乙醇酸(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基丙烯酸(MAA)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、聚丙烯酰胺(PAM)细胞外基质及其功能化的种类(例如，丙烯酸酯化的、甲基丙烯酸酯化的、硫醇化的等)或其多臂种类(例如，4臂PEG、8臂PEG)。然而，任何可交联的水凝胶前体化合物都将适用于与本发明一起使用，其中优选的化合物是生物相容性非藻酸盐均聚物或共聚物，并且特别是非藻酸盐嵌段共聚物，以及其他类型的可交联单体和/或低聚物。通常，包括在前体溶液中的聚合物前体的量将小于50％w/w。对于高分子量(≤500kDa，优选≤100kDa)、多取代的聚合物，诸如透明质酸，该量范围将为约1％至约50％w/w，并且对于较低分子量聚合物(<100kDa，优选≤50kDa)，诸如PEGDA或PEGMAL，为约5％至约50％w/w。

可以通过调节前体化合物的分子量以及选择的交联剂、交联条件和交联过程来调整微粒的交联概况。例如，在一些实施方式中，可能需要“更紧”或更快的交联，以通过限制分子在交联期间从液滴/核渗出到周围环境中的能力来获得更光滑的珠粒表面和/或更强的凝胶。这可以通过增加前体物质的分子量(例如～>40kDa)和/或通过减少交联时间(通过调节交联化学物或引发方法)两者来实现。然而，由于交联密度降低，增加双官能前体物质(即PEGDA)的分子量通常导致更多的扩散凝胶。进一步地，水解不稳定的交联剂可用于产生具有低初始Q值的初始强微粒，以促进细胞植入到部位。然而，这样的交联剂在正常生理条件下将迅速降解，从而将其有效负载(payload)迅速释放到植入部位。取决于具体水凝胶前体化合物，可以通过各种机制进行交联。在一种或多种实施方式中，核/壳微粒与水凝胶基质交联剂组合，优选在溶液中。交联剂通过藻酸盐壳浸出到核/壳微粒中，导致水凝胶前体化合物胶凝(交联)，以形成3维水凝胶基质。交联剂将对应于水凝胶前体化合物，但可以改变以控制在所得交联基质内实现的交联速度和水平。通常，根据所选的交联剂和聚合物体系，用于形成微粒的交联剂量范围将为约0.5mM至约30mM，优选约1mM至约20mM，更优选约2mM至约15mM，甚至更优选约2.5mM至约10mM，以及甚至更优选约2.5mM至约5mM。

合适的交联剂包括光或热引发的交联剂、化学交联剂，诸如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基砜、二硫醇等，其将作为藻酸盐浴的一部分包括在内。也可以使用自交联水凝胶前体。在这些实施方式中，光引发剂诸如

2959(2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮)或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基-次膦酸锂(LAP)可以包括在水凝胶前体溶液中作为催化剂。光引发剂也可以包括在藻酸盐浴中。对于化学交联体系，通常在藻酸盐浴中提供交联剂。对于UV引发的交联体系，交联剂可以与主要聚合物(主链)物质一起包括在藻酸盐浴或水凝胶前体溶液中。

表1提供了可以用于与适当的交联剂一起形成水凝胶的来自不同主链化学物的反应基团的实例。反应中的一些是由UV光引发的，而其他则是化学反应。

表1.反应基团和交联化学

额外的示例性前体化合物包括但不限于非藻酸盐多糖、胶原/明胶、壳聚糖、琼脂糖等。这些前体化合物可以是具有多个臂的支化聚合物或单一主链的未支化/线性聚合物链。它们可以通过将蛋白质、药物或酶附连到水凝胶上来进一步功能化，以实现对细胞附连、功能、增殖或生存力的控制。特别优选的水凝胶前体化合物是透明质酸，或透明质酸/PEG混合物。一种或多种前体化合物也可以用在水凝胶制造时添加到前体化合物中的各种化学实体来官能化。这些化学物将与水凝胶基质结合，而不是包封在间隙空隙中，以便简单地扩散出微粒。实例将包括添加可以被功能化的细胞支持剂，使得它们与交联剂或水凝胶主链反应。在快速降解的微粒中，这些剂将与包封在其中的细胞和细胞产物一起局部释放。

同样，优选的水凝胶是慢胶凝水凝胶，其如本文所用意指具有的胶凝速率不足以在凝胶前体液滴与包含交联剂的溶液接触时形成大体光滑的大体球形的构建体的水凝胶。慢胶凝水凝胶通常被认为是当暴露于交联剂时不会立即(或接近立即，例如在5-10秒左右)形成凝胶液滴的那些。生物相容性水凝胶也是特别优选的，取决于水凝胶的指定的最终用途。如本文使用的，“生物相容性”意指它对包封在基质内的活组织或细胞无害，以及更特别地说，它在生物学上或以其他方式不是不希望的，在于它可以向受试者给药而没有过度的毒性、刺激性，或过敏反应或免疫原性反应，并且不会引起任何不希望的生物效应或以有害方式与包含它的组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员将所众所周知的，将选择生物相容性水凝胶以使受试者中的任何不利副作用最小化。可以与水凝胶前体一起包括的额外的任选成分包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、细胞外基质的其他组分等，包括其合成形式。

通常，在提交于2015年6月3日的美国专利号9,642,814中详细描述了用于制备微粒的技术，该专利通过援引并入本文。该方法包括制备水凝胶前体溶液，该溶液包括分散或溶解在溶剂体系中的水凝胶前体化合物、待包封的细胞和二价阳离子(例如钙、钡、锶及其组合)。二价阳离子与水凝胶前体化合物一起分散或溶解在溶剂体系中。二价阳离子应当以约0.025摩尔/升至约0.25摩尔/升的水平包括在溶液中，基于取溶液的总体积为100％。

水凝胶前体溶液还可以包括任选的水凝胶交联剂、催化剂、添加剂、培养基、营养物、pH缓冲剂、密度调节剂、粘度调节剂等。然后将水凝胶前体溶液与藻酸盐组合以引发在水凝胶前体溶液周围的藻酸盐的胶凝(通过“由内而外(inside out)”的胶凝过程)以产生核/壳微粒。每个核/壳微粒包括围绕液体核的藻酸盐壳，其包括水凝胶前体溶液。如图2所图示的，这通常涉及(A)将前体溶液逐滴添加到(B)藻酸盐浴中，诸如通过产生/挤出滴入或喷入藻酸盐浴中的前体溶液液滴。溶液中藻酸盐的量可以变化，但是范围可以是约0.1％至约2.0％重量/体积，基于取溶液的总体积为100％。通常，藻酸盐溶液的粘度应当小于水凝胶前体溶液的粘度。藻酸盐溶液的粘度取决于藻酸盐浓度和藻酸盐聚合物的平均分子量(即藻酸盐分子的长度或链中单体单元的数目)，在相似的浓度下，链越长导致粘度越高。在一种或多种实施方式中，藻酸盐溶液的粘度在室温(～20至25℃)下范围将为约1至约20cP，以及优选为约1至约4cP。更特别地，在室温下，水凝胶前体溶液的粘度与藻酸盐溶液的粘度的比率应当大于1。在另一实施方式中，水凝胶前体溶液的粘度与藻酸盐溶液的粘度的比率为约1:1至约1000:1。在一种或多种实施方式中，水凝胶前体的粘度比率为约20:1。在一种或多种实施方式中，水凝胶前体溶液的粘度为约1至约500cP，其中在室温下约40至约100cP是特别优选的。藻酸盐浴的pH范围应当为约6.2至约7.8，以及优选约6.6至约7.4。

如(B)和(C)所图示的，藻酸盐壳由内而外形成，并随着阳离子从前体溶液液滴中浸出而在液滴周围变厚。换句话说，液滴中阳离子的存在导致浴中的藻酸盐聚结到表面并在液滴周围交联。接下来，引发液体核中水凝胶前体化合物的胶凝，诸如通过交联和/或聚合以产生核/壳交联的微粒。每个核/壳交联的微粒包括藻酸盐壳和胶凝核，胶凝核包括交联的3维水凝胶基质和包埋的细胞。交联可以是化学诱导的、热诱导或光引发的，这取决于制备的具体前体溶液。例如，水凝胶交联剂可以包括在藻酸盐浴中并通过藻酸盐壳扩散以交联核中的水凝胶微粒。替代地，核/壳微粒可以经受UV辐射源以引发水凝胶微粒核中的交联。UV暴露时间范围为约1min.至约10min.，优选约2min.至约8min.，甚至更优选约2.5min.至约5min.。UV暴露的波长将取决于所选择的光引发剂和/或聚合物体系，但是通常范围将为约100nm至约400nm，优选约315nm至约400nm，以及更优选约365nm。

与藻酸盐型微粒的离子键不同，本发明的微粒涉及水凝胶前体化合物的共价交联，如图1所图示的。PEGDA实例示出了PEG主链(黑线)末端的二丙烯酸酯化学物，其中反应位点由双红线表示。PEGDA分子相互交联，产生最终的水凝胶制剂。相比之下，具有示出为分散在链(红色双线)上的反应基团的MeHA主链(蓝线)与PEGDA共价交联(图1)。因此，应当理解，通过交联反应化学地改变在最终产品中的前体化合物以产生交联的水凝胶基质。例如，在一种或多种实施方式中，水凝胶基质基本上由(或主要(event)由)包含硫醚和酯交联键的PEG和HA聚合物的交联网络组成(例如，对于硫醇化的HA)。然而，应当理解，基质可以包括留在网络中的痕量未反应的前体化合物、官能团等。表1中提供了可能的水凝胶基质和交联的其他实例。该列表提供了实例，但并非详尽的。可用于表1中所列化学物的主链分子的实例包括壳聚糖、琼脂糖、硫酸软骨素或分子的组合。主链之间形成的键包括与硫醚加酯、硫醚加酯和β碳上的甲基、硫醚砜或硫醚琥珀酰亚胺的化学键。但是可以使用其他化学键。光(自由基)键可以包括酯加醚或酰胺加醚。应当理解，存在可以利用的越来越复杂的组合，使得可能的组合实际上是无限的。

一旦核已经被胶凝，然后去除藻酸盐壳(例如，用螯合剂和/或机械搅动，诸如超声处理)以产生自维持水凝胶微粒或微珠以及包埋在其中的细胞，如(D)所图示的。换句话说，藻酸盐壳不是最终产品的一部分，并且总是在使用微粒之前被去除。所得水凝胶微粒可以使用网筛或其他装置从溶液中收集，并且可以根据需要冲洗或悬浮在培养基或适当的营养物中。同样，所得可降解水凝胶微粒优选基本上不含藻酸盐。

该技术可用于在水凝胶微粒中包埋/包封细胞、细胞簇、组织、其组合和其片段。细胞可以是天然来源的或新鲜分离的原代细胞、培养的或扩增的细胞、建立的细胞系、分化的或未分化的、工程化的或遗传修饰的等。细胞和组织的非限制性实例包括胰岛、胰岛簇、肝实质细胞、干细胞和相关细胞和组织，以及内分泌细胞、干细胞簇、甲状腺簇、肾上腺簇、垂体簇和用于组织工程或基于细胞的治疗的其他3维细胞簇。也可以在微粒中使用细胞类型和/或组织的组合(例如，与干细胞组合的原代细胞类型)。取决于细胞类型，微粒还可以包括在支持细胞维持和生长的细胞培养基的水凝胶基质组分内。示例性培养基组分包括以下中的一种或多种：血清、烟酰胺、抗生素(青霉素、两性霉素B、链霉素、硫酸庆大霉素)、氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺等)、pH缓冲液(碳酸氢钠)、无机盐(钠、钾、镁和钙离子源)、碳源(葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、丙酮酸钠)、蛋白质和肽(白蛋白、转铁蛋白、纤维粘连蛋白、激活素、胰岛素)、脂肪酸和脂质、维生素(A、D、E、K、B、烟酰胺)、矿物质和微量元素(锌、铜、硒)、激素、生长因子等。完全培养基、基础培养基和培养基组分是可商购的，包括但不限于伊格尔极限必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium)(EMEM)、杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)、RPMI-1640、哈姆营养混合物(Ham’s Nutrient Mixtures)、伊斯科夫改良杜尔贝科氏培养基(Iscove’sModified Dulbecco’s Medium)(IMDM)、CMRL-1066等。

所得水凝胶基质的特征是可渗透液体和气体的半刚性网络，但是其表现为不流动并在稳态下保持其完整性。水凝胶可以被认为是一种固体以及也可以被描述为具有接近无穷大的粘度。水凝胶基质是3维自维持体。术语“自维持体”意指水凝胶基质一旦形成，无需外部支撑结构即保持其形状，并且仅由于其自身的内力或重量而不易变形。自维持体不像果冻、腻子(putty)或糊剂那样柔韧、可永久变形或可流动，而是有弹性，使得基质体可在力作用下暂时屈服或变形。换句话说，自维持体在轻微压缩和/或弯曲后将回缩或弹回原形—应当理解，水凝胶基质在足够施加外部压力或力的情况下会裂开、破裂或剪切(并且之后不会恢复)。

水凝胶微粒是一种基质型胶囊，在整个珠粒中保持填充材料，而不是像核-壳型胶囊那样具有不同的壳。如上所述的，水凝胶微粒也是自维持体。在一种或多种实施方式中，所得微粒的形状基本为球形。有利地，取决于所选液滴发生器的能力，粒度是高度可定制的。在一种或多种实施方式中，所得水凝胶微球或微粒具有大于30μm的平均(average)(平均(mean))最大截面表面比表面尺寸(即，在球形或椭圆形微球的情况下，其直径)，以及在一些情况下大于300μm。在一种或多种实施方式中，所得水凝胶微球或微粒具有的平均(平均)最大表面比表面尺寸小于约5mm。优选地，所得水凝胶微球或微粒具有的平均(平均)最大表面比表面尺寸小于约2mm，更优选约30μm至约2mm，甚至更优选范围为约50μm至约1.5mm，更优选约150μm至约1.5mm，甚至更优选约300μm至约1.4mm。在一些情况下，可以形成大小范围是约30μm至约750μm或500μm的较小微粒。为了便于参考，该截面尺寸在本文中简称为微粒的“大小”。在任何情况下，本发明的水凝胶微粒不是纳米级的并且不会被认为是纳米颗粒或任何其他种类的纳米晶体形状。

水凝胶微粒特别适用于急性或慢性病症的局部治疗性治疗，其中短期治疗方案可用于缓解这样的病症。实例包括用于骨或软骨修复(例如，在关节中)的细胞、细胞簇和/或组织的局部递送(例如，直接注射)以及移植的治疗性细胞、细胞簇和/或组织免受宿主免疫系统的一般保护。微粒在短时间段内(例如，数天、数周、最长达三个月)保护包封的细胞、细胞簇和/或组织免受免疫系统，释放其治疗益处，直到水凝胶通过正常的生理过程分解并被洗掉。还设想了全身治疗。在一种或多种实施方式中，微粒不用于递送小分子治疗剂并且优选不含这样的药物，除非这样的药物作为细胞支持活性剂包括在微粒中(例如，以确保细胞和植入物成功，诸如免疫抑制剂)，但不作为活性剂或治疗剂本身的程度。

对于治疗方法，将微粒悬浮或分散在合适的递送载体中以向受试者给药。示例性递送载体将包括其中分布有微粒的生物相容性液体悬浮液、粘性溶液、腻子、糊剂或凝胶，并且优选地包括支持待给药的细胞、细胞簇和/或组织的维持和生长的营养物和组分。可以根据细胞或组织类型进一步补充的如上所述的细胞培养基是优选的载体。盐溶液或其他缓冲溶液也可用作递送载体。方法通常包括以下(或由以下组成)：向患者局部给药治疗有效量的所得微粒组合物，诸如向患者的炎症、损伤、关节炎、退化等的位置给药治疗有效量的所得微粒组合物。给药通常包括在炎症、损伤、关节炎、退化等的部位或其附近直接注射微粒组合物。有利地，持续释放微粒组合物将给药的细胞、细胞簇和/或组织限制在局部区域中持续治疗有效时间段，使得缓慢释放的细胞、细胞簇和/或组织和/或它们的细胞组分或产物在局部区域释放以缓解或减轻患者病症的严重程度。如本文使用的，术语“治疗有效的”是指将引起研究员或临床医师正在寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的量和/或时间段，并且特别是引起一些希望的治疗效果的量和/或时间段。例如，在一种或多种实施方式中，治疗有效量和时间段是减轻炎症并引发或促进炎症、损伤、关节炎、退化等的部位愈合的那些。本领域技术人员认识到，即使病症没有完全根除而是部分改善，量或时间段也可以被认为是治疗有效的。

如有必要，可以通过额外注射或输注重复治疗。本领域技术人员将理解，治疗方案可以根据具体炎症、损伤、关节炎、退化、病症或愈合状态以及医学或兽医从业者或研究员的偏好而变化。例如，神经元修复，诸如脊髓损伤或退行性疾病的修复，可以将微囊化的干细胞注射到硬膜外腔或硬膜外病变区域进行潜在治疗。可降解水凝胶微粒旨在立即将干细胞释放到该区域，使干细胞直接与环境相互作用，或者被设计成持续更长(例如，～1-3个月)的可降解微粒可以微囊化干细胞以释放生长促进因子进入该区域，同时缓慢降解掉，释放细胞进行破坏和降解，直到没有留下任何东西。同样，心脏病发作后的心脏修复可以通过从被微囊化并放置于损伤区域的细胞、细胞簇和/或组织中局部释放细胞或生长因子来改善。另一实例包括通过激素疗法治疗无功能的腺体，诸如通过将微囊化的甲状腺细胞、细胞簇和/或组织放置在颈部或附近/相邻部位来恢复甲状腺功能(如果去除或减少甲状腺后存在瘢痕组织)。耐久性水凝胶微粒的额外实例包括局部递送与神经内分泌疾患有关的神经递质、在未愈合骨折附近释放递送的骨促进因子、全身释放分子诸如心房钠尿肽以治疗充血性心力衰竭、释放治疗血友病中的凝血因子或包封产生各种生物活性物质的工程化或转基因细胞。

在一种或多种实施方式中，“空的”水凝胶微粒也可以作为关节润滑治疗的一部分来给药。换句话说，水凝胶本身的存在为患者提供了治疗性缓解，而不需要颗粒本身中的细胞或任何其他活性剂。

与藻酸盐或其他类型的微粒相比，本发明的组合物和微粒在植入时的特别优势是它们改善的“粘性”。即，微粒在植入部位具有粘附或附着到体内组织的趋势，并在以下实施例的照片中示出。这通过在植入部位维持细胞、细胞簇和/或组织及其细胞产物的局部释放而进一步增强了治疗的有效性。此外，微粒证明在植入部位没有诱导任何炎症反应和/或任何异物反应，包括淋巴细胞或胶原环形成。

在审阅本文的公开内容和下面的工作实施例后，本发明的各种实施方式的额外的优点对于本领域技术人员来说将是显而易见的。应当理解，除非本文另有说明，否则本文描述的各种实施方式不一定是相互排斥的。例如，在一种实施方式中描述或描绘的特征也可以包括在其他实施方式中，但不一定包括在内。因此，本发明涵盖本文描述的特定实施方式的多种组合和/或结合。

如本文使用的，短语“和/或”在两个或更多个项目的列表中使用时意指可单独采用所列项目中的任何一个或可采用所列条目中的两个或更多个的任何组合。例如，如果组合物被描述为包含或不包含组分A、B和/或C，则该组合物可以包含或不包含：仅A；仅B；仅C；A和B组合；A和C组合；B和C组合；或A、B和C组合。

本说明书还使用数值范围来量化与本发明的各种实施方式相关的某些参数。应当理解，当提供数值范围时，这样的范围将被解释为：为仅列举范围的下限值的声称限制以及仅列举范围的上限值的声称限制提供字面支持。例如，约10至约100的公开数值范围为列举“大于约10”(没有上限)的声称和列举“小于约100”(没有下限)的声称提供字面支持。

实施例

以下实施例阐述了根据本发明的方法。然而，应当理解，这些实施例是通过说明的方式提供的，并且不应当将其中的任何内容视为对本发明的整体范围的限制。

我们表面，实施例中使用的一种或多种HA制剂在小于3个月的时间段内降解。相比之下，PEGDA的制剂更耐久性。我们通过对比可降解微粒对比耐久性微粒来比较以这种方式制造的产品的特性。这些比较包括物理和化学差异、体外和体内稳定性、最终产品微粒内的细胞形态、功能和迁移，以及最终产品微粒在体内附连于组织从而将它们的应用定位在体内的能力。

实施例1

耐久性对比可降解水凝胶微粒最终产品的物理和化学差异

介绍

细胞包封的概念由Lim和Sun于1980年首次普及，他们表明嵌入藻酸盐水凝胶微粒中的胰岛可以逆转大鼠的糖尿病，而无需免疫抑制，尽管只有几周。此最初的成功之后是旨在更好地理解和改善过程的研究。随时间推移，该领域已经取得了很大进展，然而众所周知，藻酸盐微球继续遭受长期生物不相容性的问题。尽管其局限性，但藻酸盐因其独特的、近乎瞬时的交联动力学使得能够直接制造方便的可注射微粒而持续作为细胞包封的明显材料选择。

相反，由于较慢的交联速率，其他水凝胶通常只能制备成大块宏观结构。已经开发了使用替代水凝胶(诸如聚乙二醇、琼脂糖、壳聚糖或透明质酸)生产微球的一些方案。然而，这些方法基于油乳液技术，由于它们依赖于非水性溶剂和差的过程控制，通常不适合细胞包封和移植。

随着细胞包封应用的数目和复杂性不断增长，能够使用先进的生物材料制造方便、可注射、生物相容性微粒将果断地有用。在此，测试了提交于2015年6月3日并通过援引并入本文的美国专利号9,642,814中描述的用于生产水凝胶微粒的新方法，称为核-壳球化(CSS)。这种方法被战略性地设计用于使用与藻酸盐相比胶凝速度慢得多的水凝胶，使得能够产生具有各种化学、物理和生物活性特性的水凝胶微粒。此外，该方法不使用油乳液技术，而是为标准GMP就绪设备和材料开发的，以更好地促进可及性、规模和法规遵从性。我们说明了使用两种流行的水凝胶透明质酸(HA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)通过CSS来微粒生产。

方法

CSS交联程序的细胞毒性

通过将犬胰岛暴露于包含100mM或200mM氯化钙、10mM HEPES缓冲液和20％PEGDA、MW 3,400Da(Laysan Bio,Inc.)的溶液中5、10或15分钟来测试钙(CSS方法中的一种组分)的细胞毒性。将组还暴露于不含PEGDA的100mM氯化钙，以评估单独的钙的作用。胰岛以大约5,000IEQ/mL悬浮在测试溶液中，以模拟与包封过程相关的高细胞负载密度。钙暴露之后，将胰岛用补充的CMRL 1066胰岛培养基洗涤两次，以及然后在37℃和5％CO₂下孵育3小时，然后进行评估。

使用碘化丙啶染色和荧光显微法鉴定死细胞。用Cytation 5成像多模式读取器(Cytation 5Imaging Multi-Mode Reader)(Biotek Instruments,Inc,531/647nm ex/em)捕获荧光显微照片。通过使用Adobe Photoshop计算红色(死的)像素与总胰岛像素的比率来量化细胞死亡。每组分析了二十五个单独的胰岛，并通过二硫腙染色将其与非胰岛组织区分开来。结果报告为平均活细胞分数，并归一化为匹配的未处理对照(即来自培养基中同一批次的胰岛)的胰岛生存力。

对于PEGDA和甲基丙烯酸酯化的透明质酸(MeHA)微粒，使用了光交联。因此，首先进行了检查紫外光(UV)和光引发剂的毒性的研究。将犬胰岛悬浮在包含0、0.025或0.05％(w/v)的光引发剂

2959的杜尔贝科氏(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。将大约50个IEQ负载到24孔板的孔中，并用长波紫外(UV)光辐照3、5或10分钟。根据制造商数据(Uvitron International)，使用PortaRay400 UV灯以低功率模式在6”距离处辐照板，对应于大约40mW/cm²。暴露之后，将胰岛用补充的CMRL 1066胰岛培养基洗涤两次，以及在37℃和5％CO₂下孵育3小时，然后进行评估。细胞死亡通过碘化丙啶染色进行评估，并如前一节所述的进行量化。

制造MeHA水凝胶微粒

一旦确定交联剂的非毒性水平，就开始微粒生产。图2提供了用于水凝胶微粒制造的CSS方法的一般示意图。通过以下首先合成MeHA：在三乙胺和叔丁基溴化铵(Sigma)存在下在50:50水:DMSO混合物中，使HA(MW 1MDa，Lifecore Biomedical)与50倍摩尔过量的缩甲基丙烯酸缩水甘油酯(Sigma)反应5天。然后将MeHA用去离子(DI)水渗析2天，以及然后冻干。使用¹H NMR(Avance AV-III 500，Bruker)通过计算甲基丙烯酸酯质子与甲基质子的相对峰面积的比率确定甲基丙烯酸酯化度为54-72％。

在包含100mM氯化钙、15mM HEPES以及0.05％(w/v)的带有OptiPrep的

2959的定制缓冲液(CosmoBioUSA,Inc.)中制备2.5％:1％(w/w)的甲基丙烯酸酯化的HA:PEGDA聚合物共混物(MW 3.4kDa，Laysan Bio,Inc)。在该实施方式中，将低浓度的PEGDA作为交联剂添加到MeHA溶液中以增加水凝胶的交联密度。使溶液通过0.22微米过滤器。在室温下用Cannon-Manning半微量校准的玻璃毛细管粘度计测量前体溶液的粘度。

将前体通过自动液滴发生器挤出到包含300mM甘露醇、0.1％Tween 20的0.15％(w/v)藻酸钠(Protanal LF 10/60,FMC Corp.)的搅拌浴中，并使用定制的15mM HEPES缓冲液调节至pH 7.6。对于MeHA前体，还将0.05％(w/v)

2959引发剂添加到藻酸盐浴中以维持

在液滴与浴之间的平衡，并最小化

从液滴一旦滴入浴后的浸出(这将减少交联)。使用在1.5mm同心空气喷嘴内配备有喷气喷嘴系统和400微米直径的内部流体喷嘴的Buchi 395-Pro包封器(Buchi Corporation,纽卡斯尔(Newcastle)，特拉华州(DE))用于液滴生成。使用压缩氮气挤出液滴。MeHA液滴形成核-壳构建体，具有包封水凝胶前体溶液/液滴核的各自的藻酸盐壳。然后用长波UV光辐照水凝胶前体溶液/液滴核以引发MeHA和PEGDA的自由基光交联。浴中心的辐照度为大约40mW/cm²(PortaRay 400,Uvitron International)。在前体溶液的挤出期间以及在挤出后1分钟连续应用辐照，以确保核-壳构建体中的水凝胶核完全交联。接下来将核-壳构建体在DPBS中的25mM柠檬酸盐缓冲液中在温和搅拌下冲洗5分钟以溶解藻酸盐壳。使用钢网筛收集所得微粒并将其悬浮在DPBS中。在50mM柠檬酸盐中进行第二次冲洗持续5分钟以确保完全溶解并去除藻酸盐壳。

制造ThHA水凝胶微粒

通过以下制备ThHA前体：将1.2％(w/w)的硫醇化的HA(HyStem，Biotime Inc)溶解在包含100mM氯化钙和OptiPrep的定制缓冲液(CosmoBioUSA,Inc)中以调节溶液密度。使用定制的15mM HEPES缓冲液将前体溶液的pH调整为大约7.0，以减少ThHA大分子单体的二硫桥接。如上所述测量溶液粘度。如上所述生产核-壳构建体。然而，交联是通过化学交联实现的(对比使用MeHA微粒的自由基光交联)。PEGDA分子的末端丙烯酸酯基团通过迈克尔型加成与ThHA上的硫醇基团键合。简言之，前体溶液在与藻酸盐浴接触后产生具有ThHA前体核和藻酸盐壳的核-壳构建体。藻酸盐浴还包含0.4％PEGDA充当交联剂(MW 3.4kDa,LaysanBio,Inc)，并轻轻搅拌5分钟。浴和水凝胶前体两者都可以包含交联剂(例如，PEGDA)，但在这个方案中，它优选地只包括在浴中。通过较小的3.4kDa PEGDA分子通过藻酸盐壳扩散到核中来进行交联。然后用DPBS将浴液稀释一半，这将溶液pH降低到7.4。继续搅拌额外的30分钟以交联核内的HA前体。收集核-壳构建体，并如上所述去除藻酸盐壳以产生微粒。

制造PEGDA水凝胶微粒

通过以下制备PEGDA水凝胶前体溶液：将PEGDA3.4kDA和20kDa(Laysan Bio,Inc.)分别以18％和12％(w/w)溶解在包含100mM氯化钙、10mM HEPES和0.025％(w/v)

2959的缓冲液中。使用0.22微米注射器过滤溶液并如上所述测量粘度。关于MeHA微粒，将前体挤出到搅拌的藻酸盐浴中，但具有0.025％(w/v)

2959。用于MeHA和PEGDA微粒制造的所有溶液都是在通过超声处理脱气的水中制备的，以消除过量的氧气(一种已知的光交联抑制剂)。如上所述对核-壳构建体进行辐照以实现核的交联。如上所述进一步处理构建体以溶解藻酸盐壳并产生水凝胶微粒。

制造AHA水凝胶微粒

首先，在三乙胺和N-二甲基甲酰胺(Sigma)的存在下，通过使HA(MW 1MDa或200kDa，Lifecore Biomedical)与丙烯酰氯和缩水甘油(TCI)反应5天来合成AHA。然后将AHA用去离子(DI)水渗析5天，以及然后冻干。使用¹H NMR(Avance AV-III 500，Bruker)通过计算酰化质子与甲基质子的相对峰面积的比率确定丙烯酰化度为53-72％。然后通过以下制备AHA前体溶液：将4％的丙烯酸酯化的HA溶解在包含100mM氯化钙、15mM HEPES缓冲液和0.05％(w/v)

2959的定制缓冲液中。使用0.22微米注射器过滤前体溶液并如上所述测量粘度。关于MeHA颗粒，将前体挤出到搅拌的藻酸盐浴中。如上所述对核-壳构建体进行辐照以实现核的交联。如上所述，使用柠檬酸盐缓冲液去除藻酸盐壳以收集AHA水凝胶微粒。

水凝胶微粒的物理特性和大小分布

使用Biotek Cytation 5多模式成像读取器捕获100个单独微粒的图像。微粒在PBS的多孔板中成像，并以Adobe Photoshop分析图像以确定每种微粒类型的平均微粒直径和大小分布(N＝100个微粒)。通过确定每种微粒类型的溶胀比“Q”(即溶胀的水合质量与干质量的比率)进一步表征水凝胶微粒。在测量之前将微粒浸入过量DI水中24小时以去除溶解的盐并确保达到平衡溶胀。去除微粒的过量表面水分，以及然后在预先称重的表面皿上称重。随后，将微粒在60℃下干燥过夜并重新称重以获得干质量(N＝3)。

微粒的扩散特征

按照先前公布的程序，将水凝胶微粒在0.1mg/mL的FITC标记的右旋糖酐的DPBS溶液中孵育过夜，分子量为10、40、70和500kDa(Invitrogen Molecular Probes)。将微粒用DPBS冲洗并通过激光扫描共聚焦显微镜(Olympus Fluoview 300)成像以监测探针的流出。在从FITC-右旋糖酐孵育溶液中去除微粒后3至30分钟之间的设定时间点捕获显微照片。

孔径计算

使用在FEI Quanta 600F ESEM仪器上进行的环境扫描电子显微术(ESEM)检查空的PEGDA和MeHA微粒。将样品浸入冷却台上的水中，在SEM室中温度设定为6C。然后将室抽真空至1000Pa并将相对湿度维持在100％。图像以10,000倍的放大率捕获。还收集了标准SEM图像。对于这些图像，样品在临界点干燥或冻干并涂覆有10nm铂，并在相同的ESEM仪器上以高真空模式在5kV下成像。SEM图像以1000倍的放大率下捕获。

结果

核-壳球化程序

水凝胶微粒是通过图2中总结的CSS方法制造的。该方法从缓慢硬化水凝胶前体溶液(官能化的PEG或HA)开始，当它撞击藻酸盐浴时，它作为液滴被包埋在藻酸盐壳中，为官能化的PEG或HA提供时间来硬化。围绕核微粒形成的藻酸盐壳的特征在于同心环连接形态(图3A)。随后，去除藻酸盐壳，只留下内核水凝胶(图3B)。图3B示出了微粒的以球形为主的形状。然而，对于最终产品，其他形状是可接受的。图4提供了可接受的最终产品特征的额外的实例。图4A提供了更耐久性(又名持久)的基于PEGDA的微粒的实例，该微粒具有较慢的降解概况，负载有犬胰岛细胞，具有完全球形形状。图4B示出了负载有胰岛但具有长型形状；3D椭圆体形状的类似的耐久性的基于PEGDA的微粒。图4C图示了降解较快(又名短期)的基于MeHA的微粒，该微粒具有较快的降解概况，负载有干细胞，在左侧具有扁平边缘。图4D示出了相同类型的微粒，但具有3D椭圆体形状。所有这些微粒，以及其他相关形状，诸如泪珠形或蛋形的都是CSS微粒最终产品的功能实例。

细胞毒性研究

在微粒制造期间，虽然藻酸盐壳仍然存在，但核的胶凝需要交联，使得在壳去除后它会维持3维、自维持结构。为了优化CSS的方法，评估了微粒制造过程的交联组分对新鲜分散的细胞(犬胰岛)的细胞毒性影响。图5A描绘了钙浓度和暴露时间对犬胰岛生存力的影响。测试的三个条件是100和200mM钙与PEGDA或仅100mM钙。在5分钟的最短的测量暴露时间下，没有观察到任何组的细胞毒性有显著差异。与匹配的未处理对照(来自培养基中同一批次的胰岛)相比，所有组的生存力都超过97.5％。然而，与5分钟的测量相比，在随后的每个时间点，看到200mM钙组的生存力显著下降。在10分钟和15分钟两者时，200mM钙组的生存力显著低于两个100mM组。在10分钟内，在任一100mM组中均未观察到差异。然而，在15分钟时，与5分钟和10分钟时间点相比以及与在15分钟时没有PEGDA的100mM组相比，示出包含PEGDA的100mM组的生存力显著降低。有趣的是，在没有PEGDA的100mM组内的任何时间点都没有观察到生存力的显著变化，与对照相比，15分钟时生存力为97.6％。

光引发剂浓度和UV光暴露时间对细胞生存力的影响如图5B所示。将犬胰岛在浓度为0、0.025和0.05％(w/v)的

2959下用～40mW/cm²长波UV暴露辐照3、5和10分钟，并评估细胞毒性。有趣的是，不包含光引发剂(

2959)的组示出最高程度的细胞毒性。与3分钟暴露时间相比，0％组的生存力在5分钟和10分钟时显著降低。此外，与两个包含

的组相比，0％组在5分钟和10分钟时生存力显著更低。0.025％与0.05％组之间的唯一的显著差异是在10分钟时，活细胞分数分别为94.5％和87.2％。

水凝胶微粒的物理特性和大小分布

为了充分测试新的CSS平台，微粒由两种不同的起始材料：HA和PEGDA产生。HA生产进一步分为硫醇化的HA(ThHA)和甲基丙烯酸酯化的HA(MeHA)，以使用CSS平台分别评估化学交联和光交联的水凝胶两者。表2提供了交联之前和之后的水凝胶制剂的物理特性，以及平均微粒直径和直径范围。

表2.微粒制造特征和物理特性

1.溶胀比“Q”是凝胶的水合平衡质量与干质量的比率。

2.HA和PEGDA珠粒直径显著不同(p<0.001)。

对于PEGDA，凝胶前体的前体质量分数为30％，而ThHA和MeHA分别由1.2％和2.5％的溶液制造。高PEGDA前体浓度是实现适合用于形成形状良好的微粒的溶液粘度所必需的。凝胶制剂和相应的前体粘度如表2所示。ThHA是唯一的化学交联的水凝胶，并且与光交联的凝胶(MeHA和PEGDA)相比，它需要显著更多的时间来交联(35分钟)。MeHA微粒的平均直径最大，其次是PEGDA，以及然后是ThHA微粒，它小于其他两组。PEGDA微粒表现出最低的平衡溶胀比“Q”，表明整体水凝胶更紧凑。这在图6中进一步图示，该图绘制了由ThHA、MeHA、PEGDA或AHA构成的100个代表性微粒的直径，并图示了微粒的良好单分散性，尤其是对于HA材料。尽管在交联之前使用相同的液滴生成设备和参数制造，但ThHA微粒的大小比PEGDA或MeHA小得多，并且与PEGDA相比具有更窄的直径范围。平均MeHA和AHA微粒直径是四组中最高的。有趣的是，但与空的PEGDA微粒相比，包含胰岛的PEGDA颗粒展现出稍大的平均直径但改善的单分散性(具有胰岛的PEGDA为938μm[CV:8.4％]，以及空的PEGDA微粒为904μm[CV:15.7％])。

微粒的扩散特征

图7图示了荧光标记的右旋糖酐扩散到PEGDA、ThHA和MeHA水凝胶微粒中。将微粒在不同分子量的荧光右旋糖酐中孵育过夜，冲洗并立即通过共聚焦显微镜检查以评估右旋糖酐渗透的程度以及作为扩散特性的量度的流出速率。10kDa探针能够渗透所有微粒。然而，PEGDA微粒中的荧光较弱，特别是在构建体的中心附近，表明与HA微粒(两者都显示出强荧光)相比的较低的探针渗透率。此外，10kDa探针的荧光在HA组中迅速减弱，并且在冲洗后30分钟不存在或几乎不存在。相比之下，PEGDA组在30分钟时仍可观察到局部荧光，再次表明与两种HA凝胶相比，对于10kDa探针具有更高的扩散势垒。

在PEGDA微粒的周边检测到来自40kDa探针的低水平荧光，但在中心几乎没有观察到信号，表明对探针的扩散势垒(图7)。较大的右旋糖酐(70和500kDa)在PEGDA微粒中几乎没有示出荧光信号，这表明在过夜孵育时间段期间这些探针渗透到凝胶基质中是可忽略不计的。

ThHA和MeHA微粒两者都显示出来自所有评估的探针的强荧光，表明甚至对大分子的扩散势垒也极小。此外，与ThHA相比，对于所有探针在冲洗后立即，MeHA中的相对荧光信号似乎明显更高，表明更高的探针浓度，以及因此甚至更低的扩散势垒。这可以通过70kDa探针得到最好的例证，它具有到ThHA微粒中的适度的输注，但在MeHA微粒中似乎是饱和的。所有额外的研究分别集中在具有最大和最小扩散势垒的水凝胶制剂，为PEGDA和MeHA。

讨论

我们已经开发并评估了一种用于制造用于细胞包封和递送的水凝胶微粒的新方法。由于胶凝速率快，目前用于细胞微囊化的方法主要基于藻酸盐球。用于微囊化的其他水凝胶涉及苛刻的油乳液技术。相反，CSS方法可以用于多种水凝胶材料，并且与标准的、可商购的和GMP就绪设备兼容，并且对胰岛的细胞毒性最小。

低细胞毒性是细胞包封策略的关键特征。因此，我们评估了CSS方法的一些关键许可组分，特别是钙含量和UV暴露对胰岛的细胞毒性的影响。不出人意料地，200mM钙是迅速细胞毒性的。然而，我们发现即使在高度浓缩和粘性PEGDA溶液中，胰岛也耐受100mM钙至少10分钟。暴露于40mW/cm²长波(～365nm)UV光最长达10分钟对犬胰岛的细胞毒性最小。出乎意料地，没有光引发剂的组在UV暴露之后表现出最多的细胞死亡，这与其他类似研究形成对比。然而，这些其他研究使用了低得多的UV强度，在4-10mW/cm²之间，并且本文使用的光引发剂浓度比较低。因此，在我们的实验中，光引发剂可以通过优先吸收UV光子提供保护作用。尽管如此，在包含

2959的组中仍观察到细胞毒性的浓度依赖性增加，这与先前公布的著作一致。

尽管使用相同的400微米喷嘴系统制造，但微粒的大小显著不同，其中MeHA珠粒的直径几乎是ThHA珠粒直径的两倍，对应于每个微粒的总体积大约8倍的差异。组之间的大小差异最可能是制造后体积溶胀动力学差异的结果。水凝胶溶胀受许多变量控制，但与聚合物的初始(即预交联)浓度和制造后凝胶内的交联密度强相关。更特别地，吸附到凝胶聚合物基质上的溶剂分子(例如水)施加向外的压力，导致凝胶膨胀(溶胀)，而凝胶基质中的交联抵抗向外膨胀。例如，具有高初始聚合物浓度和低交联密度的水凝胶将预期在制造后体积上显著膨胀。相反，具有高的交联与聚合物浓度的比率的凝胶在制造后趋向抵抗膨胀。在我们的研究中，ThHA微粒的最终大小较小可能是低初始聚合物分数(1.2％)加上相对高的交联密度的结果。重要的是要注意，制造后的体积溶胀不应与溶胀比“Q”(水合质量/干质量)混为一谈。特别地，Q描述了体积溶胀已经达到平衡后的最终凝胶结构，其中较低的Q值通常表明凝胶更强且更紧凑。因此，凝胶可经历显著的体积溶胀，但仍然具有相对低的Q值，这似乎是本研究中PEGDA微粒的情况。相比之下，与PEGDA微粒相比，ThHA微粒经历相对较小的体积溶胀(如果有的话)，但具有更高的Q值。此外，MeHA微粒尽管具有低的初始聚合物浓度(3.5％)，但是显著溶胀并具有高Q值，表明非常低的相对交联密度。

微粒组之间的扩散特性显著不同。ThHA和MeHA微粒对大小最大为500kDa的右旋糖酐探针的渗透性更强，其中MeHA微粒似乎在所有三组中具有最高的扩散率。相反，PEGDA颗粒似乎强烈限制了MW 40kDa以及更大的右旋糖酐的扩散。尽管各种因素可以影响凝胶的扩散率，但溶胀比“Q”(凝胶的平衡水合质量与干质量的比率)与水凝胶的渗透率强相关。PEGDA、ThHA和MeHA微粒具有的Q值分别为17.3、27.7和105.7。因此，在微粒中观察到的右旋糖酐探针的扩散行为与其相应的Q值和测量的表面孔径一致。

实施例2

耐久性和快速降解的水凝胶微粒最终产品的稳定性

介绍

耐久性对比快速降解的水凝胶微粒的描述取决于微粒的物理组成的稳定性。进行了体外和体内稳定性研究两者，以确定三种制剂(PEGDA、MeHA和AHA)之间是否存在差异。虽然CSS方法提供了对水凝胶以不同速率降解的详细调整，但以下提供了两种耐久性水凝胶的实例，其与降解更快的水凝胶相比，它们可以持续数月到数年。

方法

体外耐久性测试

对于MeHA、PEGDA和AHA，收集1.000克的水合微粒，然后将其放置于由10mM HEPES缓冲磷酸盐缓冲盐水和1％庆大霉素组成的降解缓冲液中。将降解溶液维持在pH 7.3+/-0.10。将溶液中的微粒在37℃下储存1、3和6周，然后收集并在60℃下干燥过夜以获得降解后的干质量。将降解后的干质量与第0天微粒的干质量进行比较以确定质量损失百分比。此外，在每个时间点测量溶胀比以评估凝胶强度和降解。

体内耐久性测试

犬胰岛分离

犬胰岛是从在征得器官捐赠的所有者同意的情况下的当地兽医诊所的安乐死捐赠者中局部获得的胰腺中分离出来的。采购和消化方案之前已详细发布。在取出和清洁器官之后，使用标准公布的方案进行胶原酶消化，紧接着进行密度梯度纯化。根据标准公布的方案，通过二硫腙染色将分离的胰岛转化为胰岛等效物或“IEQ”，用于量化目的。将犬胰岛在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM烟酰胺和1％抗生素抗真菌剂溶液的CMRL 1066中在37℃和5％CO₂中培养。

包封的胰岛异种移植

使用利用链脲菌素(streptozotocin)(STZ，220-250mg/kg)处理诱导糖尿病的免疫缺陷NOD/SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdc^scid,Jackson Laboratory)来评估通过CSS包封的犬胰岛的功能能力。六只小鼠接受了包封在PEGDA中的胰岛，两只小鼠接受了在PEGMAL中的胰岛(合成程序如下)，以及4只小鼠接受了相同剂量的包封在MeHA中的胰岛。两只小鼠移植(IP)有等剂量的未包封的胰岛，作为对照。在进入研究的10周时，所有接受MeHA包封的胰岛的小鼠连同未包封的胰岛组都出现高血糖并被终止。来自PEGDA组的四只小鼠也在10周时被终止，充当后续组织学研究的比较。剩余的两只PEGDA小鼠在另外6周后被终止。对两只PEGMAL小鼠的监测正在进行中(移植后超过16周)。

如上所述制造了包封胰岛的微粒的耐久性PEGDA和快速降解的MeHA制剂，除了将犬胰岛细胞混合到前体中之外。按照与上述ThHA微粒类似的方案制备化学交联(即非UV)的耐久性PEGMAL制剂。简言之，将由25％(w/w)8臂40kDa PEGMAL(JenKemUSA)和犬胰岛构成的水凝胶前体挤出到pH 6.6的藻酸盐浴中，该藻酸盐浴包含浓度为0.25％(m/v)的1kDa SH-PEG-SH交联剂(BiochemPEG)，并搅拌5分钟。5分钟之后，然后将交联藻酸盐浴液用HEPES缓冲胰岛培养基稀释一半至最终pH为～7.2并搅拌另外的30分钟以使水凝胶核完全交联。如所述然后去除藻酸盐壳。

包含胰岛的微粒通过18G导管给药到小鼠的腹腔内(IP)空间内。胰岛剂量基于先前的递增剂量研究，表明大约4000个胰岛当量/小鼠导致血糖量正常，并且与先前的将犬胰岛移植到小鼠体内的出版物一致。所有小鼠在移植后的14天内每天测量血糖水平，以及之后每两周测量一次。

在动物终止(10和16周)后，从IP空间中回收包含胰岛的微粒并将其放置于培养基中进行评估。包含胰岛的微粒用二硫腙染色以检测胰岛素的存在，以及用钙黄绿素(活细胞)和碘化丙啶(凋亡/坏死细胞)染色以评估外植组织的细胞生存力。使用Cytation 5成像多模式读取器(Biotek Instruments,Inc.)捕获染色微粒的颜色、明场和荧光图像。

在转移到PBS之前，从具有附连的微粒的腹膜中取出胰腺和组织样品，并将其在10％中性缓冲福尔马林中固定过夜。将组织嵌入在石蜡块中并适当切片以进行染色。对于苏木精/伊红(H&E)染色，将切片通过以下连续去石蜡：将切片放置于Clear Rite3溶液中3次，每次3分钟，然后在用苏木精和伊红染色之前进行后续脱水和再水合步骤。将切片在水中冲洗，紧接着应用发蓝试剂(Bluing Reagent)进一步用自来水冲洗。最后将切片浸入100％无水酒精和Clear Rite 3中以提高颜色稳定性并相应地施加盖玻片。在BioTekCytation 5细胞成像多模式读取器上检查载玻片并捕获图像。

包封的胰岛同种异体移植

最近诊断出患有糖尿病的两只成年雄性狗接受了用耐久性PEDGA或快速降解的MeHA包封的犬胰岛移植物(N＝1/组)。犬胰岛的包封按照前面描述的方案。每只狗都接受了由大约60mL的装填的微粒组成的移植物，这些微粒通过导管直接输注递送到腹膜。在移植后的前20天，每天监测狗的体重和血糖。

结果

体外降解

将MeHA、PEGDA和AHA微粒放置于在37℃下的HEPES缓冲降解溶液中1、3或6周，然后干燥以确定干聚合物质量。6周的降解之后，据发现MeHA微粒仅保留了其起始质量的24％，而PEGDA和AHA分别保留了37％和53％(图8A)。虽然PEGDA损失了大量的质量(图8C)，但它在6周期间保持了凝胶强度，如通过溶胀比没有变化(图8B)所示的。相比之下，MeHA和AHA微粒示出了它们的溶胀比急剧增加，表明随着微粒降解，凝胶强度显著降低。基于PEGDA和HA的微粒之间凝胶强度的变化可能归因于交联密度和聚合物化学性质两者。对于PEGDA微粒，聚合物链通过若干个共价键以相对于HA微粒更高的交联密度紧紧保持在一起。此外，PEGDA聚合物链包含一些疏水部分的区域。交联密度和疏水区域两者都使水扩散到微粒中的速率比发生在微粒表面上的水解降解速率慢。自然地，如果降解仅发生在表面，内部凝胶网络将保持完整并保持凝胶强度。然而，在MeHA和AHA微粒中，交联密度要低得多，并且聚合物化学性质导致相对于PEGDA更亲水的结构。HA微粒的较低的交联密度和亲水性两者都促进了更高的水向微粒的扩散速率，导致了本体降解机制。在本体降解中，水深渗透到水凝胶网络中并导致水解降解，这损害凝胶网络的完整性。这种类型的降解可以解释为什么在6周的降解之后剩余的AHA微粒具有比PEGDA更高的聚合物质量。HA微粒中凝胶强度随时间推移的损失表明水解降解正在发生，但降解产物尚未扩散出凝胶网络。在这种情况下，剩余的聚合物质量不能准确评估降解程度，因为尽管聚合物在凝胶网络内部，但它不再有助于水凝胶完整性。

犬胰岛负载微粒在糖尿病小鼠中的功能

将包封在PEGDA或MeHA中的犬胰岛移植到糖尿病NOD/SCID小鼠体内。对照组接受未包封的胰岛。图9示出了移植后在初始研究群组期间每组的平均每日血糖水平。MeHA、PEGMAL和PEGDA组中的所有小鼠在移植后第二周是血糖量正常的。然而，尽管重新引入外源性胰岛素治疗，接受快速降解的MeHA微粒的动物逐渐恢复到高血糖水平(从移植后大约3周开始)。这些小鼠在大约10-11周时被安乐死。接受耐久性PEGDA和PEGMAL包封的胰岛的小鼠在整个研究期(PEGMAL进行中，16周)保持血糖量正常的，在没有外源性胰岛素的情况下具有出色的血糖控制。

相比之下，接受未包封的胰岛的所有小鼠在任何时间点都未能实现持续的血糖量正常。这些小鼠在移植前具有的初始平均血糖为386±23mg/dL，并且在移植当天血糖为494±61mg/dL。在移植与其他两组相同体积的胰岛后，一只动物的血糖在第2天只有一个正常读数，而另一只小鼠在第19-30天表现出血糖值波动，但是然后在研究的剩余时间内回复到持续的高血糖水平。

尸体剖检后，从小鼠的IP空间回收微粒。结果示出于图10A-D中。包含胰岛的耐久性PEGDA微粒在大约10周时容易回收，但快速降解的MeHA微粒数量很少且难以识别。发现回收的PEGDA微粒的样品随机分散在整个IP腔中，并保持透明和结构完整。回收的PEDGA微粒几乎没有示出降解迹象(即边缘光滑，大小没有明显变化，机械上稳定)，并且移植的细胞仍然包含在微粒中(图10A)。相比之下，快速降解的MeHA微粒畸形且直径较小，表明显著的水凝胶降解。MeHA微粒似乎不包含完整的胰岛(图10B)。在稍后的时间点(16周)，耐久性PEDGA微粒在尸体剖检时继续容易可回收。PEGDA微粒内的胰岛用二硫腙、钙黄绿素和碘化丙啶(PI)染色，以确认存在活的功能性胰岛。

移植后大约16周回收的PEGDA微粒包含通过深红色二硫腙染色鉴定的健康、有生存力的胰岛(图10C)。相同的胰岛用绿色钙黄绿素共同标记，绿色钙黄绿素是活细胞的常用指示物(图10D)。观察到一些阳性PI染色(红色；凋亡/坏死细胞)，但通常位于非胰岛(即二硫腙阴性)组织中，这些组织似乎粘附到回收的微粒表面。相反，胰岛(二硫腙阳性细胞)几乎完全没有PI(死细胞)染色(图10D)。

发现耐久性PEGDA微粒附连到组织，诸如肝脏和腹壁上，但通常不附连在腔内并在腔内自由漂浮。移植部位的组织学确定了PEGDA微粒的位置。虽然组织学处理方法破坏了PEGDA微粒的完整性，但附连部位没有明显的纤维化组织。图11图示了与两个微粒的相交处的健康脂肪细胞，其中微粒的位置由黑线表示。每个微粒位置中心的蓝灰色膜是处理之后剩余的水凝胶。相比之下，在MeHA组的组织学切片中没有能够识别凝胶材料。对于PEGDA组，微粒-网膜界面处普遍没有纤维化。为确保PEGDA处理的小鼠的血糖值正常化是由于移植物移植，而不是链脲菌素处理后留在胰腺内的内源性胰岛，检查了胰腺的组织学切片胰岛的存在。在每只小鼠的六个胰腺切片中仅鉴定出一种胰岛样结构(结果未示出)。

使用移植到两只糖尿病狗体内的犬胰岛完成了类似的研究。这些动物在移植前都患有糖尿病并且没有定期接受外源性胰岛素。一只狗接受了包封在耐久性PEGDA微粒中的犬胰岛，而另一只接受了包封在可降解MeHA水凝胶中的犬胰岛。图12示出了来自每天早上和下午获得的测量的平均非空腹血糖。接受耐久性水凝胶中的胰岛的狗缓慢恢复到正常范围内的较低血糖水平(实线)，并在实验(8周)持续时间维持该正常水平。相比之下，接受快速降解的水凝胶的动物在移植后20天内缓慢恢复到完全糖尿病状态(虚线)。

讨论

有趣的是，虽然两个小鼠组在IP注射微粒之后都实现了血糖量正常，但相同剂量和移植部位的未包封胰岛并未实现血糖量正常。由于动物模型包括免疫受损的小鼠，结果表明水凝胶基质提供了促进更好的细胞功能和存活的物理支持环境，特别是在通过注射入IP腔进行移植的情况下。通过观察到MeHA微粒随时间推移降解并同时恢复为高血糖症，进一步证实了这一结论。进一步值得注意的是，与MeHA移植相比，在MeHA组中的高血糖症复发之前，PEGDA和PEGMAL胰岛微粒(在结构上更稳健)导致在围移植期中的优异的血糖水平控制。

尽管狗的研究只包括两只动物，但结果是重要的，因为它们对比了免疫受损小鼠与有免疫活性的狗的反应差异。在完整的犬免疫系统情况下，较弱的水凝胶(MeHA)降解得更快，导致更快地恢复到高血糖血糖水平。结果确实表明，这种可降解水凝胶微粒的特定制剂具有大约数天到数周的体内持续时间，着取决于物质。然而，耐久性水凝胶微粒展现出至少2个月的体内持续时间。

实施例3

耐久性对比快速降解的微粒最终产品的珠粒内增殖

介绍

对细胞包封剂的物理和化学特性的操纵已成为体外组织工程研究的有力工具。已知，微环境的机械和化学特性改变多种细胞类型的行为，但最显著的是干细胞受到细胞周围机械特性的影响。干细胞在水凝胶内继续增殖的能力是治疗性治疗因创伤或继发于手术干预引起的软组织缺损的重要特征。例如，肌肉或皮肤创伤将受益于具有增殖干细胞的局部递送微珠。这将导致较小剂量的微粒，因为当在微粒中时细胞数量将继续增加。然而，并非所有水凝胶都允许细胞在微粒内增殖。本文中，我们示出了快速降解的水凝胶微粒允许在微粒内进行稳健的细胞增殖。

方法

将人胚肾细胞(HEK293)在具有高葡萄糖和胎牛血清的DMEM培养基中培养，并维持在37℃和5％CO2的培养箱中。当细胞达到适当的密度时，通过添加0.5％胰蛋白酶-EDTA持续2分钟将它们从培养瓶中分离。分离之后，将细胞转移到生长培养基中。为了测试细胞在水凝胶内增殖的能力，使用上述CSS制造方法将两种类型的水凝胶聚合物、快速降解的MeHA和耐久性PEGDA制造成微粒。将相同量的聚合物前体(1mL)与相同数目的增殖人胚肾细胞(HEK293；400万个细胞)混合，紧接着使用之前描述的方法形成微粒。微粒在培养条件下保持3周。为了评估微粒内细胞的增殖，使用BioTek Cytation 5细胞成像多模式读取器在34天内捕获图像。

结果

在配制微粒时，注意到细胞形态及其在微粒内的分布是独特的，这取决于水凝胶。最初，HEK293细胞在耐久性PEGDA微粒中聚在一起(图13A)。相比之下，以相同密度负载的相同细胞在可降解(MeHA)微粒中保持为单个细胞(图13C)。

随时间推移，PEGDA微粒中细胞的形态或数目几乎没有变化(图13B)。相比之下，可降解的MeHA微粒中的细胞在水凝胶内增殖，在微粒内产生大的簇，如培养34天后可以看到的(图13D)。簇似乎没有从MeHA珠粒的表面突出或附连到MeHA珠粒的表面，但仍然被包封在珠粒基质中。然而，耐久性PEGDA微粒内的相同细胞不会快速增殖或在PEGDA珠粒内形成增殖细胞簇。

讨论

在微粒的最终产品形式中的微粒阻止或允许微粒内的细胞增殖。使用本文呈现的数据，我们表明耐久性水凝胶阻止细胞增殖，而较软的快速降解的MeHA水凝胶允许胚细胞显著增殖。此外，根据所使用的制剂改变细胞的形态。这在包封增殖细胞对比非增殖细胞时可能重要，并且可以使用CSS技术进行调整。

实施例4

耐久性对比可降解微粒最终产品中的细胞迁移

介绍

在一些治疗例中，细胞或其产物从微粒中迁移出来是治疗的重要方面。例如，已示出内源性干细胞或祖细胞在正常发育过程中以及还在病理条件下(诸如脑损伤或疾病)迁移到脑。一些研究表明，天然干细胞实际上迁移或“磨练(hone)”到损伤区域以帮助其修复。然而，当控制到位测量非损伤组织中的干细胞数目时，大多数研究未能证实这种声称。

因此，为了让细胞帮助修复任何组织，它们必须在该区域定位延长的时间段。将未包封的干细胞放置在区域的治疗实践充满挑战，因为细胞是小的，并且它们将迅速扩散出该区域或受到免疫系统的攻击。因此，允许将细胞受控释放到特定区域的局部方法将具有巨大的治疗益处。在本文中，我们证明了可降解微粒的这些特性。

方法

使用上述CSS制造方法将三种类型的水凝胶聚合物MeHA、AHA和PEGDA制造成微粒。将人胚肾细胞(HEK293)在具有高葡萄糖和胎牛血清的DMEM培养基中培养，并维持在37℃和5％CO2的培养箱中。将大鼠骨髓干细胞(rBMSC)在高葡萄糖DMEM、胎牛血清和Glutagro中培养。当细胞达到适当的密度时，通过添加0.5％胰蛋白酶-EDTA持续2分钟将它们从培养瓶中分离。分离之后，将细胞转移到生长培养基中。将相同量的聚合物前体(1mL)与相同数目的HEK293细胞或rBMSC(400万个)混合，紧接着形成珠粒。

为了评估从微粒中迁移出来的细胞量，在定义的时间点将微粒从培养基中取出并在筛网上洗涤。收集洗涤培养基和微粒周围的培养基。使用Cytation 5成像多模式读取器(Biotek Instruments,Inc.)和EVE细胞计数器(EVE Cell Counter)对细胞进行计数。

结果

图14提供了在包封4天具有收集的用过的培养基以及具有单个细胞的洗涤培养基的孔的典型图像。在包封在PEGDA水凝胶中的HEK293细胞的培养基中，很少细胞被计数，并且它们中的许多已经死亡(红色)(图14A)。相比之下，可降解水凝胶允许释放高数目的活细胞，如图14B中留在孔中的高数目的活细胞(绿色)所示的。然而，与第2周累积的细胞释放相比，这些细胞数目是小的。

图15概括了来自关于累积细胞释放的研究的平均数据。在培养的前6天期间，只有几千个细胞从珠粒中释放出来。到第14天，通过快速降解的MeHA微粒释放了超过2000万个细胞，而从耐久性PEGDA微珠仅释放了220,000个细胞。累积地，到第21天，MeHA珠粒释放了3080万个细胞，而PEGDA释放的细胞小于它的5％。

讨论

从结果来看，从耐久性微粒对比可降解微粒中迁移出来的增殖细胞数目阐明了明显差异。最终的微粒产品允许细胞从微粒迁移到周围组织。与耐久性水凝胶相比，快速降解的制剂以更快且更大的方式实现。结果说明了快速降解的水凝胶在允许细胞迁移到局部损伤部位方面的效用，甚至在微粒发生物理降解之前。

实施例5

耐久性对比快速降解的微粒最终产品的生存力、形态和功能

介绍

耐久性或快速降解的/短期水凝胶制剂有许多应用。文献中已经证明，微囊化的间充质干细胞(MSC)在小鼠后肢损伤模型中显著增强了旁分泌介导的愈合，与未包封的MSC相比，示出增加的存活和促血管生成活性。一旦被包封，细胞必须保持生存力并且必须具有治疗功能。已经证明，与使用较软材料的软骨形成路径相比，增加包封基质的刚度引导MSC分化朝向更多的成骨路径。此外，与在相同材料上以2D生长的细胞相比，在3D胶原水凝胶中培养的大鼠神经元细胞示出更好的存活并且行为更像天然神经元网络。

方法

生存力和形态学

使用上述CSS制造方法将两种类型的水凝胶聚合物(快速降解的(MeHA和AHA)和耐久性(PEGDA))制造成微粒。将相同量的聚合物前体(1mL)与相同数目的小鼠MSC(1600万个)或胰岛素瘤细胞(3000万个细胞)混合，紧接着形成珠粒。珠粒在培养条件下保持2周。对于每种制剂，当在微粒内培养时，细胞的生存力和功能都是高的。包封后，使用荧光生存力染色剂测量微粒内MSC和胰岛素瘤细胞的生存力。将钙黄绿素添加到培养基中作为活细胞的量度，因为钙黄绿素只能进入具有完整细胞膜的细胞。碘化丙啶添加到培养基中以识别死细胞。在荧光团中30-60分钟或孵育后，在Cytation 5成像多模式读取器(BiotekInstruments,Inc.)上收集微粒的图像。

还使用包封在两种不同水凝胶中的非增殖性体细胞源(犬胰岛)进行了类似的实验。如上所述制造微粒，其中将细胞(胰岛或培养细胞)混合到前体中。对于犬胰岛，就在液滴生成之前，将1.1倍浓度的前体与犬胰岛浆液以10:1的体积比混合。胰岛微粒的制造是在封闭、无菌的生物反应器系统中无菌进行的。

完成的微粒用二硫腙染色以检测胰岛素的存在，以及用钙黄绿素(活细胞)和碘化丙啶(凋亡/坏死细胞)染色以评估外植组织的细胞生存力。使用Cytation 5成像多模式读取器(Biotek Instruments,Inc.)捕获染色微粒的颜色、明场和荧光图像。

结果

包封在PEGDA或MeHA中的MSC示出高生存力，如图16A和B所示的。在AHA中看到类似的结果(图16E)。绿色荧光团表示用钙黄绿素染色的活细胞。红色/黄色细胞表示用碘化丙啶染色的死细胞。有趣的是，这些细胞作为单个细胞被负载到微粒中，但它们在耐久性PEGDA凝胶中迅速聚在一起，但在可降解MeHA水凝胶中却没有，在其中它们主要作为单个细胞保持。在制造过程期间对细胞形态的监测表明，细胞是在微粒制造期间而不是在制造后聚集的。

在使用犬胰岛的研究中，细胞在两种水凝胶微粒中都具有高生存力(图16C–PEDGA和16D-MeHA)。如通过对它们的胰岛素含量染色所证明的，它们继续在任一水凝胶中起作用。胰岛作为细胞簇被负载到微粒中。任一制剂中的聚集频率或簇大小似乎没有任何变化。

使用大鼠胰岛素瘤细胞系获得了类似的结果。图17示出了细胞在包封后一天内的高生存力，特别是当包封在AHA中时。在接下来的7天内，AHA中细胞的生存力下降到大约50％。相比之下，PEGDA中的胰岛素瘤细胞以较低的生存力开始，但在整个研究中维持接近该平均值。

通过对细胞内的胰岛素进行染色来进行胰岛细胞的功能测试。二硫腙染色是胰岛素产生的标准指示物。它将胰岛素阳性细胞染成红色/棕色色调。图18中的图像说明了在包封后大约1周，耐久性PEGDA和可降解MeHA微粒两者中的胰岛的阳性胰岛素染色，表明它们在包封在任一微粒中后继续产生胰岛素的能力。与小鼠MSC不同，这些体胰岛细胞的形态在任一水凝胶制剂中都没有明显变化。

实施例6

耐久性对比快速降解的微粒最终产品的局部细胞给药

介绍

耐久性或快速降解的水凝胶制剂有许多应用。文献中已经证明，微囊化的MSC在小鼠后肢损伤模型中显著增强了旁分泌介导的愈合，与未包封的MSC相比，示出增加的存活和促血管生成活性。使用MSC旁分泌释放的问题之一是未包封的MSC不会停留在损伤区域，并迅速从体内去除。因此，使用粘性水凝胶包封将在植入区域捕获细胞，其中它们可以分泌有利的化合物。我们进行了实验，以确定微粒的耐久性或可降解制剂在它们粘到周围组织和留在该区域的能力上是否显示出差异。

方法

对组织的粘附

在到狗的网膜中的移植程序期间测试了即时组织粘附。四只狗移植有包含犬胰岛的微粒。在移植当天，使用标准兽医程序麻醉动物，程序包括用于在外科手术之前、期间和之后输注流体的头静脉导管。外科医生将微粒注射到网膜面纱(veil)中。小心不要进入或损坏任何肠组织、血管、结或淋巴管。1mL的水凝胶微粒中包含总共10,000个胰岛当量。先前描述了包含胰岛的PEGDA微粒的制造。在将网膜轻轻放回腹部并使腹壁闭合紧接着进行皮内缝合以使皮肤闭合之前获得照片。

组织粘附的另一实例是通过将微珠注射到大鼠膝中来证明的。简言之，将PBS中的100uL的300微米PEGDA微粒通过25G针挤出到Sprague-Dawley大鼠膝关节的关节囊中。在挤出之前，将溶液和珠粒染成蓝色，以确认关节囊内微粒的存在。

粘附组织的组织学

使用健康的Sprague-Dawley大鼠来评估微粒在腹腔内的急性生物相容性和位置(每种微粒制剂N＝2)。按照先前描述的程序将空的微粒植入网膜周围。将微粒通过注射器作为DPBS中的悬浮液递送。大约1mL的松散堆积的微粒沉积在大鼠的网膜周围和内部。在植入微粒后的10天内，每天监测大鼠的疼痛标志物和活动水平并对其评分。

植入后14天处死大鼠以评估植入部位以确定腹腔内的微粒位置并检查可能的组织异常。收集组织样品并将其保存在中性缓冲福尔马林中，嵌入在石蜡中并以7微米厚度切片。将切片用H&E染色并在显微镜下评估。

结果

PEDGA微粒被输注到腹部网膜内和周围，如图19A所示并由方法部分描述。在培养基中的微粒被输注到网膜内和周围后，立即收集图像，示出微粒附着在组织上(即使当手动操作网膜时)。图19B和19C图示了来自两只不同狗的结果，两者都示出了微粒的粘性性质。

染色的PEGDA微粒被注射到大鼠的膝中。在手动操作关节后，解剖关节。即使通过肌肉，来自微粒的蓝色也可见(图20A)。进一步解剖，微粒可见并被发现仍在膝关节内(图20B和C)。

将耐久性PEGDA和可降解MeHA和AHA微粒(无细胞)植入健康的Sprague-Dawley大鼠中，以评估使用CSS方法生产的微粒的安全性和生物相容性，以及与周围组织的位置和附连。在2周和10周之后进行尸体剖检，并且在整个腹腔中没有观察到急性炎症、多余液体或组织异常的迹象，尽管在网膜与胃壁缝合处确定了一些组织粘附。在网膜中发现两种微粒制剂都是完整的，并且在视觉上是半透明的，并且似乎被非常薄的膜状层包围。发现少量微粒粘附在肝脏表面。然而，绝大多数微粒附连在网膜上，具有一些自由漂浮的微粒。

对于三个微粒组，外植组织的苏木精和伊红染色示于图21中。组之间没有指出显著差异。微粒通常是完整的，但是作为组织学的组织处理的结果，其大小似乎已经收缩并且在一些情况下被压碎/变形。通常发现在微粒周边周围微粒具有薄层的细胞，通常两到三个细胞厚，并且所有内部都没有细胞，考虑到将空的微粒注射到动物体内。大多数单个微粒被正常的网膜组织包围，这表明响应于各种制剂的微粒没有炎症反应。

图22图示了对网膜中微粒的异物反应的量化。由低细胞结构和较高胶原含量确定的纤维化区域的宽度在AHA中最小，并且在PEGDA微粒周围更高。尽管如此，PEGDA微粒周围的纤维化环的厚度仍然小于针对其他水凝胶制剂(诸如藻酸盐)所报道的。同样，AHA微粒中的淋巴细胞区域较少。淋巴细胞区域被定义为在微粒周围迁移的细胞免疫细胞。对于PEGDA微粒，它们也更高，但仍被认为是最小的(图22)。

讨论

最终产品的独特且有利的特征是无论是由耐久性还是由可降解水凝胶基质构成，它都是粘性的。这种粘性特征允许它快速附连到周围组织上并保留在该区域直至降解。除了将胰岛附连到腹膜空间的周围组织之外，还用于给药MSC或其他释放抗炎或促愈合细胞因子的细胞的粘性水凝胶的使用，可以被注射到关节或其他发炎组织中将细胞因子延长递送到局部区域，而无需担心重新分布到身体的其他区域。

实施例7

影响水凝胶特性的参数的研究

在该实施例中，研究了各种参数以更好地理解它们彼此的关系以及对所得水凝胶微粒的特性和特征的影响。如下文更详细讨论的，各种微粒特征可以根据具体所需治疗方案和结果进行微调和调节。值得注意的是，这些参数中的每一个都是水凝胶微粒制造中的动态因素，这意指其影响将与制剂中使用的其他组分的量或比率和/或其他加工参数有关。进一步地，对某些参数的修改不一定在所得水凝胶中产生成比例的变化。同样，然而，不同微粒制剂和加工参数的细微差别允许许多不同的可定制特征，这取决于待包封的细胞类型、植入位置和待治疗或预防的病症以及其他期望结果。

为了探索这些不同的参数，溶胀比(Q)被用作微粒的相对降解速率的代表。

A.核聚合物物质的质量分数

质量分数是指用于聚合物主链的水凝胶前体溶液中反应性聚合物物质的按质量计％组成(例如，10克前体溶液中的2.5g PEGMAL＝25％质量分数)。调节前体溶液中反应性聚合物的质量分数对所得Q值具有一致的影响。质量分数越低，Q值越高，并且凝胶越软。这通过将各种多臂PEGMAL物质与500Da PEG二硫醇交联来说明。该实施例中的交联剂浓度在藻酸盐浴中保持恒定在0.25％的质量分数。非反应性PEG物质(PEG 8000)包括在较低质量分数组中以维持恒定的溶液粘度。结果示出于图23中。

B.藻酸盐浴中交联物质的浓度

藻酸盐浴中交联剂(例如PEG二硫醇、DTT)的浓度将影响所得的水凝胶微粒。然而，交联剂与水凝胶基质的关系并不简单明了，因为在浴中可具有太少或太多的交联剂。交联剂不足产生交联不足的弱凝胶；然而，太多的交联剂也将使聚合物主链上的反应位点饱和，同样阻止交联并产生弱凝胶。因此，该参数还必须与用于主链的聚合物前体的量和类型相平衡。

1.增加交联剂浓度导致更低的Q值。

在该实施例(核聚合物＝4臂10kDa PEGMAL)中，增加交联剂浓度(DTT)产生更低的Q值。这表明交联剂浓度从未达到发生核聚合物饱和的水平。结果示出于图24A中。

2.增加交联剂浓度导致更高的Q值。

在该实施例(核聚合物＝8臂40kDa PEG-乙烯基砜)中，增加交联剂(BMA，CAS 123-81-9)浓度最初导致更低的Q值，但进一步增加导致更高的Q值，与在实施例1中观察到的形成对照。值得注意的是，交联剂(硫醇)与核反应基团(乙烯基砜)的相对摩尔浓度与前面的实施例不同。因此，实施例2中的条件可能导致核聚合物分子饱和，以及因此导致低效交联，导致较弱的凝胶网络和更高的Q。结果示出于图24B中。

C.藻酸盐浴pH

硫醇-烯(Thiol-ene)反应受环境pH的影响强烈。较高的pH水平显著增加硫醇-烯反应动力学。因此，调节藻酸盐浴的pH可以极大地影响凝胶交联的动力学和所得Q值。

1.增加pH导致更高的Q值。

在该实施例(核聚合物＝8臂40kDa PEG-乙烯基砜；交联剂＝BMA)中，增加浴pH导致更高的Q值。结果示出于图25A中。增加的反应速率可导致更快的与核聚合物的反应以及核聚合物的最终部分饱和，因此凝胶网络较弱，以及Q值较高。

2.增加pH导致更低的Q值。

在该实施例(核聚合物＝8臂40kDa PEGMAL；交联剂＝500Da PEG二硫醇)中，增加pH导致更低的Q值。平衡聚合物和交联剂以避免饱和。因此，在这种情况下，pH的增加导致更快的反应动力学和更有效的交联。结果示出于图25B中。注意，与实施例1中非常急剧的增加相比，实施例2中Q值相对于pH的增加相当小。因此，pH对Q值影响的方向和大小两者似乎受到交联剂和核聚合物反应位点的相对量的高度影响。

D.交联物质的分子量

交联物质的分子量影响扩散到核-壳构建体中的速率以及凝胶网络中交联之间的距离两者。因此，交联物质的MW的差异可以影响所得凝胶微粒的最终Q值，这取决于方法中使用的其他参数。

1.增加MW导致更高的Q值。

在该实施例(核聚合物＝8臂40kDa PEG-乙烯基砜)中，将交联物质的MW从154Da增加到500Da导致Q值显著增加。两种制剂的交联剂物质的摩尔浓度均为10mM。结果示出于图26A中。

2.增加MW导致Q值没有变化。

在该实施例(核聚合物＝8臂40kDa PEGMAL)中，交联剂的增加的MW导致所得凝胶的Q值没有明显差异。与聚合物反应位点相比，交联剂MW变化的影响可能抵消调节所用交联剂的相对量。结果示出于图26B中。

E.核聚合物物质的分子量

假设保持了每克聚合物的反应位点，核聚合物物质的分子量似乎比交联剂的分子量更可预测地影响Q值。例如，8臂40kDa PEGMAL和4臂20kDa PEGMAL具有相同数目的反应位点(马来酰亚胺)/克。然而，如下所示，当在其他相同的情况下制备时，40kDa的物质产生更强的凝胶(更低的Q值)。

1.在恒定反应位点/克下核聚合物的MW的影响。

此实施例使用三个并列比较证明了核聚合物分子量对通过CSS制备的凝胶微粒的Q值的影响。在所有制剂中，尽管具有相同的质量分数和反应位点/克，但当核MW增加时，Q值降低。注意，随着交联剂浓度降低(和大小增加)，核MW的影响更加明显。结果示出于图27A中。

2.在不相等反应位点/克下核聚合物的MW的影响。

在此实施例中，比较了由8臂40kDa或4臂10kDa PEGMAL核物质制成的微粒。在所有情况下，核聚合物溶液的质量分数均为10％。4臂10kDa物质具有与8臂40kDa相比2倍的反应位点/克，然而尽管潜在交联密度较低，但8臂40kDa微粒具有与4臂10kDa微粒相比更低的Q值(即较强凝胶)。结果示出于图27B中。

F.UV交联时间的影响

在此实施例中，在不同的UV暴露时间下生产了不同分子量的AHA和MeHA微球。简言之，将2.5％1MDa或200kDa AHA或1MDa MeHA溶液(各自具有1％3.4kDa PEGDA)逐滴挤出到如上所述的搅拌的藻酸盐浴中，并暴露于UV光下2.5、5或7.5分钟。对每种聚合物类型的所得直径和水凝胶溶胀比进行量化。结果示出于图28A和图28B中，其中微球直径和溶胀比随着UV暴露时间的变化而变化。这些结果表明，随着UV暴露时间增加，直径和溶胀比两者都下降。值得注意的是，1MDa MeHA水凝胶微球溶胀比在暴露于UV光7.5分钟后与5分钟相比显著降低，其中溶胀比分别为509.1和113.4。这种趋势对于每种聚合物类型和分子量来说都是恒定的，并证明了通过UV暴露时间的变化对水凝胶耐久性的控制。

G.通过交联物质的水解稳定性对水凝胶降解的潜在控制，无论Q值如何。

1.BMA作为更水解不稳定的交联剂。

某些交联剂可用于影响微粒的降解概况。例如，二硫醇酯交联剂分子BMA可能潜在地充分用作以加速硫醇-烯型水凝胶的水解降解的方式。

制备了一系列由通过DTT或BMA交联的PEG-乙烯基砜构成的水凝胶微粒，并将其储存在50mL聚丙烯管中，在室温(～27℃)下在DPBS中持续至少6个月。下表3列出了每种制剂的组成和相应的溶胀比以供参考。储存6个月之后，定性地再检查微粒降解的迹象。值得注意的是，所有通过BMA交联的微粒都在6个月内完全降解。通过DTT交联的那些在6个月后看起来相对没有变化，尽管此时尚未进行正式表征。此外，完全降解的BMA交联的微粒中的两种先前表现出该表中包括的所有微粒的最低Q值，但与具有更高Q值的DTT交联的微粒相比，仍然完全降解。此结果表明，BMA交联剂可能是一种有用的工具，用于产生最初非常强(低Q)，但比其他具有类似初始强度的通过DTT或PEG二硫醇交联的微粒降解得更快的微粒。

表3.用DTT或BMA交联的微粒的长期耐久性。

下表4提供了额外的二硫醇物质和相应的一个或多个硫醇基团pKa的列表。由硫醇-烯反应产生的键的水解不稳定性与反应性硫醇的pKa相关。因此，这些物质可用作硫醇-烯反应方案中的化学交联剂，以控制水解不稳定性以及因此控制微粒的降解速率。

表4.具有不同程度水解不稳定性的二硫醇交联剂物质的实例。

化学名称	pKa
		二硫代乙醇酸甘油酯	7.9-8.1
二醇二巯基乙酸酯	7.9-8.1
		PEG-二酯-二硫醇-1	7.9-8.1
(S)-2氨基丁烷1,4二硫醇	8.5
		二硫苏糖醇	9.2
二醇二(3巯基丙酸酯)	9.4-9.5
		2,2'-硫代二乙硫醇	9.4-9.5
PEG-二酯-二硫醇-2	9.4-9.5
		2-巯基乙醚	10.5-10.7
2,2'-(亚乙基二氧基)二乙二醇	10.5-10.7
		四乙二醇二硫醇	10.5-10.7
六乙二醇二硫醇	10.5-10.7
		PEG-二硫醇	10.5-10.7

。

Claims (66)

1.一种用于在植入部位局部递送和持续释放治疗性细胞和/或组织的非藻酸盐水凝胶微粒，所述微粒包括共价交联的非藻酸盐聚合物化合物的3维基质以及包埋在其中的治疗有效量的细胞和/或组织，其中所述细胞具有至少约50％的生存力，并且其中所述微粒具有大于约30μm的大小。

2.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒具有大于300μm的大小。

3.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述聚合物化合物选自慢胶凝聚合物前体，所述慢胶凝聚合物前体选自由以下组成的组：支链或非支链的透明质酸、支链或非支链的官能化的透明质酸、支链或非支链的官能化的聚乙二醇、透明质多糖、纤维蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸、聚(L-乳酸)、聚乳酸-co-乙醇酸、聚己内酯、聚乙烯醇及其组合。

4.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质进一步包括与所述非藻酸盐聚合物化合物交联的交联剂，所述交联剂选自由以下组成的组：二硫苏糖醇、支链或非支链的官能化的聚乙二醇、二硫醇、乙二醇双-巯基乙酸酯及其组合。

5.根据权利要求4所述的微粒，其中，所述官能化的聚乙二醇选自由以下组成的组：聚乙二醇二硫醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二乙烯基砜、聚乙二醇二马来酰亚胺及其组合。

6.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由共价交联的官能化的透明质酸和官能化的聚乙二醇前体化合物组成。

7.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由自交联的官能化的聚乙二醇前体化合物组成。

8.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由自交联的官能化的透明质酸前体化合物组成。

9.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由共价交联的第一和第二官能化的聚乙二醇前体化合物组成，其中所述第一和第二官能化的聚乙二醇前体化合物彼此不同。

10.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由共价交联的甲基丙烯酸酯化的透明质酸和聚乙二醇二丙烯酸酯前体化合物组成。

11.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由共价交联的硫醇化的透明质酸和聚乙二醇二丙烯酸酯前体化合物组成。

12.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由共价交联的聚乙二醇马来酰亚胺和聚乙二醇二硫醇前体化合物组成。

13.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质基本上由共价交联的聚乙二醇乙烯基砜和二硫苏糖醇或乙二醇双-巯基乙酸酯前体化合物组成。

14.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒体积的最高达50％包括所述细胞或组织。

15.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒具有的在37℃下在PBS中的储存稳定性小于6个月。

16.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒具有的在37℃下在PBS中的储存稳定性大于6个月。

17.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒是当被植入体内时将在小于3个月内分解的可降解微粒。

18.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒是当被植入体内时将至少3个月不会分解的耐久性微粒。

19.根据权利要求1所述的微粒，进一步包括细胞培养基组分。

20.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述细胞是非增殖性的或增殖性的。

21.根据权利要求1所述的微粒，进一步包括与所述细胞一起分泌的细胞产物，包括信号传导分子、细胞因子、趋化因子、治疗性蛋白质、激素、囊泡、抗体、病毒、胞外体等。

22.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述细胞是工程化或转基因细胞。

23.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述细胞是多个聚集细胞的簇。

24.根据权利要求23所述的微粒，其中，所述簇包括两种或更多种不同类型的细胞。

25.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质是均质的，包括一种类型的共价交联的聚合物主链。

26.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述基质是异质的，包括两种或更多种聚合物前体的混合物，诸如高和低分子量聚合物前体的组合和/或两种或更多种交联剂的混合物。

27.根据权利要求1所述的微粒，其中，所述微粒具有的大小为约50μm至约5mm。

28.一种用于在植入部位局部递送和持续释放治疗性细胞和/或组织和/或细胞产物的组合物，包括分散或悬浮在生物相容性递送载体中的多个根据权利要求1-27中任一项所述的水凝胶微粒。

29.根据权利要求28所述的组合物，进一步包括多个水凝胶微粒，所述水凝胶微粒包括具有的大小大于约30μm的共价交联的非藻酸盐聚合物化合物的3维基质且基本上不含任何细胞或组织。

30.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述多个水凝胶微粒包括分散或悬浮在所述生物相容性递送载体中的可降解和耐久性水凝胶微粒的混合物。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中，所述耐久性水凝胶微粒包括产生胰岛素的细胞和/或组织，并且其中所述可降解水凝胶微粒包括干细胞。

32.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述多个水凝胶微粒包括多个第一水凝胶微粒和多个第二水凝胶微粒，所述第一水凝胶微粒包括第一细胞和/或组织类型，所述第二水凝胶微粒包括不同于所述第一细胞和/或组织类型的第二细胞和/或组织类型。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中，所述第一细胞和/或组织类型包括产生胰岛素的细胞和/或组织，并且所述第二细胞和/或组织类型包括干细胞或产生胰高血糖素的细胞和/或组织。

34.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述多个水凝胶微粒包括具有第一大小的多个第一水凝胶微粒和具有不同于所述第一大小的第二大小的多个第二水凝胶微粒。

35.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述载体是生物相容性液体悬浮液或凝胶。

36.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述载体是细胞培养基溶液或凝胶。

37.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述组合物通过导管可注射或可植入。

38.根据权利要求28所述的组合物，包括治疗有效量的所述微粒。

39.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述组合物呈腻子、糊剂或凝胶的形式。

40.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述组合物呈液体悬浮液的形式。

41.一种用于在植入部位局部递送和持续释放治疗性细胞和/或组织的方法，所述方法包括向受试者的植入部位给药多个根据权利要求1-27中任一项所述的微粒或根据权利要求28-40中任一项所述的组合物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述给药包括将所述组合物注射到所述植入部位中或附近。

43.根据权利要求41所述的方法，其中，所述注射是关节内注射。

44.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位是所述受试者的炎症、损伤、关节炎、退化等的区域。

45.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位是关节。

46.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位是腺体附近的区域，所述微粒在所述腺体附近释放细胞产物，诸如激素。

47.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位在囊状空间或生理上包含的空间中，例如在心脏囊或肾囊中。

48.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位是所述受试者的网膜或腹膜。

49.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位在肿瘤中或邻近肿瘤。

50.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位在肿瘤切除后的部位中或邻近肿瘤切除后的部位。

51.根据权利要求41所述的方法，所述植入部位是脓毒症部位。

52.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后约3个月内生物降解。

53.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后至少6个月内不生物降解。

54.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位是关节，其中所述微粒在所述给药后约3个月内机械降解。

55.根据权利要求41所述的方法，其中，所述植入部位是关节，其中所述微粒在所述给药后至少6个月内不机械降解。

56.根据权利要求41所述的方法，其中，所述水凝胶微粒粘附到所述植入部位的组织，从而使植入的细胞在所述植入部位保持治疗量的时间。

57.根据权利要求41所述的方法，其中，所述细胞和/或组织和/或细胞产物通过所述微粒中的孔和/或所述微粒的生物降解从所述微粒缓慢释放到所述植入部位的局部区域以缓解或减轻所述受试者的病症的严重程度。

58.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后约5天或更短内生物降解。

59.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后约24小时内生物降解。

60.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后约1周内生物降解。

61.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后约1个月内生物降解。

62.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后小于6个月内生物降解。

63.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后生物降解，其中所述生物降解包括聚合物主链水解。

64.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后生物降解，其中所述生物降解包括交联剂水解。

65.根据权利要求41所述的方法，其中，所述微粒在所述给药后生物降解，其中降解速率可以通过改变选自由以下组成的组的参数来控制：聚合物前体分子量、交联剂分子量、交联剂与聚合物前体的比率、交联剂水解、交联动力学、UV暴露时间及其组合。

66.一种用于减轻关节中的疼痛和/或提供关节中的粘弹性补充的方法，所述方法包括将多个水凝胶微粒引入到所述关节，所述水凝胶微粒包括具有的大小大于约30μm的共价交联的非藻酸盐聚合物化合物的3维基质且基本上不含任何细胞或组织。

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