ES2895947T3

ES2895947T3 - Composición y conjuntos para matrices de microgel pseudoplástico

Info

Publication number: ES2895947T3
Application number: ES16780565T
Authority: ES
Inventors: Joseph Salamone; Ann Salamone; Katelyn Reilly; Laura Suggs; Eunna Chung; Kelly Leung
Original assignee: Rochal Technologies LLC
Current assignee: Rochal Technologies LLC
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2022-02-23
Anticipated expiration: 2036-04-12
Also published as: EP3283057A1; PT3283057T; US20160303281A1; US11590259B2; EP3283057B1; CN107708675A; US20210308323A1; CA2982352A1; CN107708675B; BR112017022045B1; MX2017013002A; WO2016168196A1; KR20170140274A; JP2018511622A; EP3283057A4; BR112017022045A2; KR102592242B1; HK1245663A1; JP6930733B2; AU2016250012B2

Abstract

Una composición que comprende: partículas de microgel insolubles en agua que son pseudoplásticas cuando se hidratan, en donde las partículas de microgel comprenden proteínas conjugadas con PEG reticuladas y/o macromoléculas biológicas a base de proteínas conjugadas con PEG reticuladas, en donde, cuando se hidrata, un grupo de partículas de microgel disminuye en viscosidad con el cizallamiento aplicado y se conforman de nuevo en un grupo de microgel en ausencia de cizallamiento, en donde, cuando están hidratadas, dichas partículas de microgel hidratadas tienen propiedades sólidas viscoelásticas, un módulo de almacenamiento mayor que el módulo de pérdida y un valor de tangente de pérdida menor de 1, en donde dichas partículas de microgel tienen una forma seleccionada del grupo que consiste en elíptica, angular o irregular, en donde dichas proteínas y macromoléculas biológicas a base de proteínas se seleccionan del grupo que consiste en matrices extracelulares, glicoproteínas, proteínas estructurales, proteínas fibrosas, enzimas, proteoglicanos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, proteínas globulares, proteínas de membrana, proteínas plasmáticas, péptidos, oligopéptidos, péptidos antimicrobianos, hormonas peptídicas, chaperonas, metaloproteínas, hemoproteínas, proteínas de coagulación, proteínas del sistema inmunológico, proteínas del canal iónico, proteínas de adhesión celular, neuropéptidos, nucleoproteínas, escleroproteínas, cromoproteínas, proteínas conjugadas, complejos proteína-proteína, complejos proteína-polisacárido, complejos proteína-lípido, proteínas motoras, mucoproteínas, fosfoproteínas, proteínas contráctiles, proteínas de transporte, proteínas de señalización, proteínas reguladoras, proteínas de factores del crecimiento, proteínas sensoriales, proteínas de defensa, proteínas de almacenamiento, proteínas receptoras, anticuerpos, proteínas recombinantes, fibrinógeno, fibrina, trombina, colágeno, elastina, albúmina, gelatina, queratina, laminina y combinaciones de los mismos, en donde dicho agente de reticulación de proteína conjugada con PEG se selecciona del grupo que consiste en α-succinimidiloxiglutaril- ω-succinimidiloxiglutariloxipolioxietileno (SG-PEG-SG), α-aminopropil-ω-aminopropoxipolioxietileno, α- aminopropil-ω-carboxipentiloxipolioxietileno, α,ω-bis{2-[(3-carboxi-1-oxopropil)amino]etil} polietilenglicol, α- [3-(3-maleimido-1-oxopropil) amino]propil-ω-[3-(3-maleimido-1-oxopropil)amino] propoxipolioxietileno, pentaeritritol tetra(aminopropil) polioxietileno, α-[3-(3-maleimido-1-oxopropil) amino]propil-ω- (succinimidiloxicarboxi) polioxietileno, pentaeritritol tetra(succinimietilidilo) polioxietileno, pentaeritritol tetra(mercaptoetil) polioxietileno, hexaglicerol octa (succinimidiloxiglutaril) polioxietileno, hexaglicerol octa(4- nitrofenoxicarbonil) polioxietileno, poli(etilenglicol) tetraacrilato de 4 brazos, succinimidiloxiglutaril) polioxietileno de 4 brazos, bis(polioxietileno bis[imidazoil carbonil]), O-(3-carboxipropil)-O'-[2-(3- mercaptopropionilamino)etil] polietilenglicol, O,O'-bis[2-(N-succinimidilsuccinilamino)etil] polietilenglicol, O,O'- bis(2-azidoetil) polietilenglicol, poli(etilenglicol) diacrilato, poli(etilenglicol) diglicidil éter, poli(etilenglicol) di(p- nitrofenil carbonato), poli(etilenglicol) di(vinil sulfona), poli(etilenglicol) di(propionaldehído), poli(etilenglicol) di(benzotriazolil carbonato) y combinaciones de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición y conjuntos para matrices de microgel pseudoplástico

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a partículas de microgel de proteínas y macromoléculas biológicas a base de proteínas reticuladas, hinchables en agua que son pseudoplásticas y fluyen en medios acuosos bajo cizallamiento y que se pueden revestir, inyectar, pulverizar, pintar o implantar en tejidos, órganos y espacios vacíos de heridas, así como en sustitutos de tejido circundantes, donde las partículas de microgel se agregan como un grupo de microgel monolítico en ausencia de fuerzas de cizallamiento. Las partículas de microgel funcionan como una matriz viscoelástica para apoyar el crecimiento, la viabilidad y la proliferación celular.

Antecedentes

El campo de los hidrogeles para su uso como macromoléculas biológicamente compatibles se ha investigado intensamente, comenzando su uso comercial como materiales reticulados monolíticos para lentes de contacto blandas (Documento de Patente de los EE.UU. de Número 3.408.429). Debido a su naturaleza suave y flexible, los hidrogeles son materiales excelentes para muchas aplicaciones biomédicas, que incluyen lentes de contacto de hidrogel de silicona de uso prolongado, administración de medicamentos y de otros ingredientes farmacéuticamente activos, desarrollo de nuevos biomateriales, revestimiento de biomateriales, bioadhesivos y selladores para encapsulación y suministro celular y sustratos y matrices de cultivo celular para la regeneración de tejidos.

Se pueden usar polímeros tanto naturales como sintéticos para crear soportes para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Los polímeros naturales a menudo tienen una biocompatibilidad inherente y pueden ser biológicamente activos. Los polímeros naturales comúnmente usados que se pueden usar como soportes celulares incluyen colágeno, hialuronano, fibrina, fibrinógeno, seda, alginato, quitosano, dextrano y agarosa, entre otros.

Las matrices celulares a base de polímeros sintéticos permiten el control de las propiedades físicas y químicas, tales como la estabilidad, la cinética de degradación, las propiedades físicas y la resistencia mecánica. Se han investigado muchos polímeros sintéticos para su uso como una matriz para soportes de ingeniería de tejidos, que incluyen poli(etilenglicol) (PEG), el poli(ácido láctico), el poli(ácido glicólico), el poli(ácido láctico-co-glicólico), policaprolactona, poli(hidroxialcanoatos) y poli(alcohol vinílico). En particular, el PEG se ha usado ampliamente como un material matriz debido a sus propiedades químicas y físicas únicas, tales como solubilidad en agua y en disolventes orgánicos, no toxicidad, baja adhesión a proteínas y no inmunogenicidad. Además, el PEG incluye grupos terminales hidroxilo que facilitan la modificación del polímero, creando nuevas estructuras y arquitecturas con diferentes propiedades químicas, físicas, y biológicas, particularmente con restos biológicos para mejorar su actividad biológica. El poli(etilenglicol) se ha usado a menudo en combinación con otros polímeros, para crear matrices con el fin de regenerar varios tejidos, incluidos cartílago, hueso, nervio, vasculatura y músculo.

Las composiciones y métodos para formar hidrogeles in situ se describen en el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 6.818.018 a través de una combinación de procesos de reticulación físicos y químicos. Los hidrogeles formados in situ se pueden aplicar junto con moléculas bioactivas que se disuelven o dispersan dentro de los hidrogeles. También se presentan métodos para usar dichos hidrogeles como revestimientos de tejidos para prevenir la adhesión posquirúrgica, como ayudas para el aumento de tejidos o la oclusión luminal, como matrices para transportar células, fármacos u otras especies bioactivas, como selladores de tejidos o adhesivos y como revestimientos de dispositivos médicos.

En los Documentos de Patente de los EE.UU. de Números 7.776.240 y 8.323.794, se describen microesferas de hidrogel inyectables mediante la formación de una emulsión donde los precursores del hidrogel que están en una fase acuosa dispersa se polimerizan, produciendo microesferas reticuladas. Preferiblemente, los precursores del hidrogel son diacrilato de poli(etilenglicol) y N-isopropilacilamida y la fase continua de la emulsión es una disolución acuosa de dextrano y un reductor de la solubilidad del dextrano. En las microesferas se pueden cargar proteínas, tales como las citocinas.

La Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. de Número 2004/0220296 describe una formulación de gel que comprende poli(N-isopropilacrilamida), que también es inyectable en forma líquida. Las disoluciones de este polímero, los copolímeros o las mezclas del polímero con un segundo polímero tal como poli(etilenglicol), polivinilpirrolidona o poli(alcohol vinílico) son líquidos a temperatura ambiente y sólidos a temperatura corporal. Se describen métodos para implantar un hidrogel en un mamífero mediante la inyección de la disolución como un líquido a una temperatura por debajo de la temperatura corporal, que luego experimenta una transición de fase térmica para formar un hidrogel sólido in situ en el cuerpo a medida que el implante se calienta a la temperatura corporal.

En la Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. de Número 2008/0268056 se describe una sustancia biocompatible que es útil para reparar una fractura de compresión vertebral. La sustancia biocompatible se puede preparar a partir de dos o más hidrogeles poliméricos biocompatibles mediante reticulación física. La sustancia biocompatible así fabricada responde térmicamente y exhibe una temperatura de disolución crítica más baja. Sufre cambios de volumen y de fase con la temperatura en el intervalo de 25°C-34°C. La sustancia biocompatible puede estar en una forma líquida inyectable a temperatura ambiente y puede gelificar dentro del cuerpo humano a temperatura más alta. En la Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2009/0053276 se describen otros hidrogeles para inyección a base de polímeros sintéticos que responden térmicamente.

Los procesos para la preparación de hidrogeles de hialuronano inyectables se describen en la Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2005/0281880. Los procesos incluyen reticular uno o más polímeros y lavar el gel formado posteriormente, seguido de purificación y homogeneización mediante agitación con impulsor para producir un hidrogel inyectable. El grado de hinchamiento de los geles en disolución salina tamponada de fosfato puede ser de aproximadamente 4.000-5.000 %. Los geles pueden tener tamaños de partículas del orden de 500 micrómetros. La reacción de reticulación se puede llevar a cabo con un agente de reticulación bifuncional o polifuncional, tal como un epóxido, aldehído, poliaziridilo o divinil sulfona. El agente de reticulación puede ser 1,4-butanodiol diglicidil éter. El proceso se puede llevar a cabo a un pH de 11 o superior y a una temperatura de 37-60°C.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 4.172.066, se describen microgeles esferoidales de un polímero reticulado, hinchable en agua o hinchado en agua, constituido esencialmente por monómeros etilénicamente insaturados solubles en agua que se dispersan en agua o en otros medios acuosos y que son agentes espesantes eficaces que, cuando se dispersan en un medio acuoso, exhiben una reología pseudoplástica. Debido a su tamaño de partícula pequeño y uniforme, con diámetros hinchados por el agua generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 200 micrómetros, y su capacidad para absorber proporciones sustanciales de agua, los microgeles son particularmente adecuados para aplicaciones que requieren de agentes espesantes, tales como la absorción rápida de fluidos acuosos, por ejemplo, en artículos sanitarios tales como pañales, protectores de cinturón y similares, para aplicaciones en donde las propiedades de hinchamiento o la obturación parcial del polímero son particularmente importantes, por ejemplo, en la obturación de formaciones o estructuras porosas.

El Documento de Patente de los EE.UU. de Número 8.038.721 describe un relleno tisular suave y no tóxico que consiste en partículas sólidas de forma esférica con una superficie texturizada en un intervalo de tamaño de entre aproximadamente 32 y 90 micrómetros. Las partículas se suspenden uniformemente en un gel como vehículo, donde las partículas sólidas son preferiblemente un polímero curado no cerámico, tal como poli(metacrilato de metilo). El gel es una combinación de un polisacárido de celulosa, tal como carboximetilcelulosa, y un alcohol, tal como poli(alcohol vinílico), disuelto en agua o en algún otro disolvente. El relleno se usa mediante inyección para aumentar el tejido blando de un paciente, así como para corregir defectos de tejido blando.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número EE.UU. 8.574.629 se describe un gel inyectable que comprende una matriz a base de un biopolímero reticulado en la que las partículas del biopolímero previamente reticuladas se han correticulado con la matriz, donde el biopolímero se selecciona del grupo que consiste en hialuronato de sodio, condroitín sulfato, queratano, queratán sulfato, heparina, sulfato de heparano, celulosa y sus derivados, alginatos, xantano, carragenano, proteínas, ácidos nucleicos y mezclas de los mismos, y en donde el agente reticulante es butanodiol diglicidil éter.

La Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2012/0034271 describe un hidrogel reticulado con enlaces disulfuros inyectable in situ, cuyo proceso de gelificación se completa en una jeringa, en donde los grupos tiol se oxidan a enlaces disulfuro para formar el hidrogel reticulado por el oxígeno disuelto en la disolución activa de reticulación en el recipiente inyectable sellado, donde el hidrogel reticulado in situ es un derivado de polisacáridos, proteínas o macromoléculas sintéticas producidas por una o más modificaciones químicas.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 6.129.761 se describe un polímero biodegradable, biocompatible y polimerizable de forma lenta capaz de reticular para formar un hidrogel que suministra células aisladas a un paciente para crear un órgano o tejido equivalente, tal como cartílago. El polímero se selecciona del grupo que consiste en ácidos hialurónicos modificados, alginatos modificados sintéticos, polímeros que se pueden reticular covalentemente mediante una reacción de radicales y polímeros que gelifican mediante la exposición a iones monovalentes. Se informa que los geles promueven el injerto y proporcionan plantillas tridimensionales para el crecimiento de nuevas células. En una realización, las células se suspenden en una disolución de polímero y se inyectan directamente en un sitio en un paciente, donde reticula el polímero para formar una matriz de hidrogel con las células dispersas en el mismo. En otra forma de realización, las células se suspenden en una disolución de polímero que se vierte o inyecta en un molde con una forma anatómica deseada, luego reticula para formar una matriz de hidrogel con células dispersas en la misma, que se puede implantar en un paciente.

En la Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2013/0209370 se describe una composición microporosa inyectable, elástica, blanda, completamente reabsorbible a base de fibrina para su uso como un lumen de tejido blando y relleno de huecos. La composición combina un componente de fibrinógeno, un componente de trombina, un plastificante y partículas que contienen calcio con un diámetro promedio entre 0,01 gm y 200 gm. La preparación de una composición inyectable para el relleno de huecos de tejido blando se describe mediante la mezclan de los componentes y/u la homogeneización de dichos componentes.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 6.290.729, se describen polímeros tixotrópicos y pseudoplásticos que exhiben adelgazamiento por cizallamiento, por el cual un polímero se vuelve más fluido bajo cizallamiento y vuelve a una forma de alta viscosidad o gelificada al cesar el cizallamiento. El Documento de Patente 729 describe la formación de revestimientos que se pueden controlar mediante la introducción de agentes reticulantes, agentes gelificantes o catalizadores reticulantes junto con el material fluido, o mediante el comportamiento de respuesta térmica en el polímero, y luego alterando las condiciones de tal manera que se produzca reticulación y/o la gelificación in situ. Se describe un método para controlar la reparación o el crecimiento de tejido que incluye la aplicación de un material polimérico, en un sitio donde se puede producir el crecimiento de tejido, en donde el material polimérico se aplica en un primer estado fluido y luego se convierte in situ en un segundo estado no fluido.

Los métodos para preparar un polvo de matriz extracelular se describen en la Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2012/0264190. En la Publicación 190, las composiciones se pueden usar para la formación de construcciones de injertos tridimensionales para implantación, inyección, o el material de matriz extracelular en polvo o particulado se puede dispersar en un gel o pomada para uso tópico para inducir la reparación de los tejidos dañados o enfermos en un huésped. La composición es un hidrogel que responde térmicamente y que está en una forma líquida a temperatura ambiente y en la forma de gel a una temperatura mayor que la temperatura ambiente o a la temperatura corporal normal.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 8.802.436, se presentan métodos mejorados de fabricación de geles bioactivos a partir de una matriz extracelular que retiene suficiente bioactividad para ayudar en la reparación del tejido mediante el procesado a partículas de la matriz extracelular a un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 1 gm a aproximadamente 1.000 gm, solubilizando el polvo en forma de partículas en hidróxido de sodio, neutralizando la matriz extracelular solubilizada con ácido clorhídrico y, opcionalmente, congelando o liofilizando la matriz extracelular congelada y, opcionalmente, reconstituyendo el gel liofilizado en agua o disolución salina. La consistencia final de todos los geles es similar a una espuma.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 7.582.311 se describen vehículos de inyección adecuados para administrar las suspensiones de partículas. Los ejemplos incluyen formulaciones a base de polímeros, formulaciones farmacéuticas asociadas, artículos de fabricación y conjuntos. Se informa que los vehículos de inyección incluyen una composición pseudoplástica que mejora la inyectabilidad. El vehículo de inyección comprende una molécula flexible, tal como ácido hialurónico o un derivado del mismo, disuelta en una disolución tampón fisiológico, tal como disolución salina.

En la Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2004/0208938, se describen composiciones inyectables con una capacidad de inyección mejorada y métodos para la preparación de tales composiciones inyectables. En la Publicación 938, las micropartículas secas con un vehículo de inyección acuoso forman una suspensión, y la suspensión se mezcla luego con un agente mejorador de la viscosidad para aumentar la viscosidad de la fase fluida de la suspensión al nivel deseado para mejorar la inyectabilidad.

La Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2010/0330184 describe vehículos de inyección adecuados para administrar suspensiones de partículas, tales como formulaciones a base de polímeros, así como formulaciones farmacéuticas asociadas, artículos de fabricación y conjuntos. Los vehículos de inyección de la Publicación 184 son supuestamente superiores a los vehículos de inyección convencionales en el sentido de que incluyen una composición pseudoplástica de polímero flexible, tales como disoluciones del ácido hialurónico, derivados del ácido hialurónico y combinaciones de los mismos, que mejoran la inyectabilidad, facilitando la administración de la dosis deseada.

En la Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. de Número 2013/0189230 se describe una composición de polímero inyectable para su uso como vehículo de administración de células. La composición de polímero inyectable de la Publicación 230 incluye al menos un polímero gelificante térmico (metilcelulosa), al menos un polímero gelificante aniónico (hialuronano) y un vehículo a base de agua, y se informa que es susceptible de adelgazamiento por cizallamiento, tixotrópico y reabsorbible.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 8.357.402, se presenta un material de matriz capaz de fluir para heridas que está compuesto por partículas de una matriz de colágeno, preferiblemente una matriz de colágeno/glicosoaminoglicano (GAG, por sus siglas en inglés), que, cuando se hidrata, según se informa, se puede administrar de manera efectiva al sitio de la herida. Según se informa, la matriz capaz de fluir para heridas se puede administrar de manera efectiva en heridas con diferentes profundidades y geometrías y proporciona un marco estructural que sirve como matriz para el crecimiento celular.

En el Documento de Patente de los EE.UU. de Número 7.442.397, se presentan métodos y materiales relacionados con biomatrices a base de fibrina, donde las células madre o células progenitoras se pueden administrar a un corazón enfermo usando una biomatriz a base de fibrina para ayudar o restaurar la función cardíaca. Según se informa, el Documento de Patente 397 proporciona un método para reparar tejido dañado en un mamífero mediante la introducción, sobre o dentro de un tejido que necesita reparación, de una disolución de fibrinógeno con células madre o progenitoras en condiciones tales que se forma en o cerca del sitio de introducción una biomatriz de fibrina que incluye las células. En una realización, la disolución de fibrinógeno está conjugada con PEG. Las condiciones para formar la biomatriz de fibrina pueden incluir la introducción de una disolución con un agente de conversión de fibrinógeno (por ejemplo, una serina proteasa tal como la trombina) en la disolución de fibrinógeno.

El Documento de Patente de los EE.UU. de Número 5.733.563 informa de geles hidrófilos hinchables en agua que consisten en una mezcla reticulada de un poli(óxido de etileno) bifuncionalizado, activado con un agente activante adecuado, disuelto en una disolución acuosa y una proteína de tipo albúmina. Los hidrogeles resultantes se basan en la reticulación de una proteína, a saber, albúmina de diversas fuentes que incluyen, por ejemplo, albúmina de suero bovino, con un poli(óxido de alqueno) bifuncional, preferentemente poli(óxido de etileno) y lo más preferentemente poli(etilenglicol), o una mezcla de poli(óxidos de alqueno) bifuncionales de varias masas moleculares. Las propiedades mecánicas de los hidrogeles se pueden mejorar mediante la adición de poli(etilenglicol) no reactivo o bien de otros polímeros inertes de masas moleculares elevadas. Los nuevos hidrogeles se pueden usar para fabricar lentes de contacto, dispositivos de liberación controlada de fármacos, matrices de inmovilización para encimas o células de interés terapéutico, apósitos para heridas y piel artificial.

En la Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2011/0238000 se describe un sistema de hidrogel que comprende moléculas de albúmina conjugadas con polímero para la liberación controlada de agentes terapéuticos. El polímero es un polímero sintético funcionalizado, preferiblemente diacrilato de PEG. La albúmina conjugada con polímero es preferiblemente albúmina monoconjugada con PEG. El sistema de hidrogel puede comprender una matriz a la que se unen las moléculas de albúmina conjugada con polímero a través de un segundo grupo funcional del polímero. La matriz se puede formar a partir del mismo polímero del conjugado polímeroalbúmina.

La Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2010/0137510 describe una molécula precursora de polímero-proteína que comprende una proteína tiolada y al menos dos polímeros sintéticos unidos covalentemente a los grupos tiol de la proteína tiolada, teniendo cada uno de los al menos dos polímeros sintéticos un grupo funcional, seleccionándose el grupo funcional de modo que sea capaz de reticularse con un grupo funcional del al menos otro polímero sintético que está unido covalentemente a la menos otra molécula precursora de polímeroproteína para así formar una matriz. El grupo funcional puede ser un acrilato o vinil sulfona, que se reticulan por fotoiniciación. Las proteínas solubles de PEG-colágeno, PEG-albúmina y PEG-fibrinógeno se podrían combinar y fotoreticular para formar matrices de hidrogel.

La Publicación de Solicitud de Documento de Patente de los EE.UU. de Número 2003/0166867 describe nanopartículas de fibrina con un diámetro promedio de 200-2000 nm (0,2-2,0 gm), y se pueden obtener mediante la mezcla de una disolución acuosa que comprende fibrinógeno, trombina y Factor XIII en una emulsión de aceite a una temperatura de 50-80°C, sin la adición de un agente reticulante químico exógeno. El Documento de Patente de los EE.UU. de Número 6.150.505 informa de la preparación de microperlas de fibrina de 50-200 gm de diámetro mediante la reacción de fibrinógeno y trombina, en aceite vegetal caliente (70-80°C), en presencia del Factor XIII endógeno.

El Documento de Patente de los EE.UU. de Número 8.858.925, según se informa, describe matrices biodegradables compuestas por una cadena principal proteica de fibrinógeno de origen natural reticulada mediante una modificación del polímero sintético poli(etilenglicol) que genera una matriz de fibrinógeno conjugado con PEG para su uso en el tratamiento de trastornos que requieran de la regeneración tisular. El Documento de Patente 925 usa una molécula precursora que comprende una proteína de fibrinógeno que está desnaturalizada y que retiene la actividad de formar una matriz y al menos dos moléculas de poli(etilenglicol) conectadas covalentemente a los grupos tiol libres de la proteína de fibrinógeno desnaturalizada, donde cada una de las al menos dos moléculas de PEG comprenden un grupo funcional de reticulación con el fin de formar matrices de hidrogel. La reticulación se realiza sometiendo las moléculas precursoras a una reacción de polimerización por radicales libres, preferiblemente mediante fotoiniciación de los PEG acrilados, que se realiza ex vivo o in vivo.

El Documento de Patente de Número WO 9401483 describe conjugados formados mediante la unión covalente de polímeros biológicamente inertes, naturales e insolubles (colágeno) y derivados de los mismos a polímeros hidrófilos sintéticos tales como el polietilenglicol. La composición es gomosa y por lo tanto no se adelgaza por cizallamiento.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra imágenes del proceso para la preparación de polvos de microgel de fibrina conjugada con PEG o de fibrinógeno conjugado con PEG.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento de microgeles de PEG-fibrina de relación molar 10:1 y de PEG-fibrinógeno de relación molar 20:1. Los microgeles criomolidos se rehidrataron a 300 mg/ml en disolución salina tamponada de fosfato. Los valores de las pendientes son los siguientes: PEG-fibrinógeno (-0,90) y PEG-fibrina (-0,98). Pendientes de aproximadamente -1 indican materiales perfectamente capaces de ser adelgazados por cizallamiento.

La Figura 3 es un gráfico del módulo frente a frecuencia para partículas de microgel de PEG-fibrinógeno 20:1 rehidratadas a 300 mg/ml en disolución salina tamponada de fosfato. Las propiedades viscoelásticas se pueden recuperar después de una exposición repetida a una deformación del 1 %. Los módulos de almacenamiento y de pérdida ligeramente más altos para las pruebas repetidas son una medida de la deshidratación del microgel a lo largo del tiempo.

La Figura 4 es un gráfico que compara los módulos de almacenamiento (G') y de pérdida (G") de los microgeles de PEG-fibrina 10:1 y PEG-fibrinógeno 20:1 en un gráfico del módulo frente a frecuencia. Los microgeles se rehidrataron a una concentración de 300 mg/ml en disolución salina tamponada de fosfato.

La Figura 5 es un gráfico de la viscosidad frente a velocidad de cizallamiento que muestra el comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento de partículas de microgel de PEG-fibrinógeno 50:1 molidas con mortero y maja, así como por criomolienda. Los microgeles se rehidrataron a 300 mg/ml en disolución salina tamponada de fosfato.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la proliferación de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC, por sus siglas en inglés) en partículas de microgel de PEG-fibrinógeno (PEG-FGN) y PEG-fibrina durante 1,4 y 7 días.

La Figura 7 muestra imágenes de tinción de células vivas de ADSC humanas en microgeles de PEG-fibrinógeno y PEG-fibrina 10:1,20:1 y 50:1 el día 7, lo que demuestra que las ADSC son viables en microgeles de PEG-fibrinógeno 20:1 y en microgeles de PEG-fibrinógeno 50:1.

La Figura 8 muestra imágenes de la inyección subcutánea ex vivo (rata) de microgeles teñidos de PEG-FGN 20:1. El microgel actúa como un sólido después de la inyección, conservando su forma y permaneciendo en el lugar de la inyección.

La Figura 9 es un gráfico de la viscosidad frente a velocidad de cizallamiento que muestra el comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento de geles de PEG-FGN 20:1 sin y con PHMB incorporado a una concentración rehidratada de 1.000 ppm de PHMB. Los microgeles se rehidrataron en disolución salina tamponada de fosfato a 300 mg/ml.

La Figura 10 es un gráfico del módulo frente a frecuencia que muestra los módulos de almacenamiento y de pérdida de los geles de PEG-FGN 20:1 sin y con PHMB incorporado a una concentración rehidratada (50 mg/ml) de 1.000 ppm de PHMB. Los microgeles se rehidrataron en disolución salina tamponada de fosfato a 300 mg/ml.

La Figura 11 muestra imágenes de tinción de la actina de músculo liso (SMA, por sus siglas en inglés) de microgeles de PEG-FGN 20:1, que demuestran angiogénesis a los 7 y 14 días en el centro de los microgeles, solo y con incorporación de ADSC o amnios triturado.

La Figura 12 muestra imágenes de ADSC de rata marcadas con CM-dil, que indican la viabilidad de las células trasplantadas en microgeles de PEG-FGN 20:1 después de 7 y 14 días. La DAPI y la tinción de la actina de músculo liso (SMA) muestran núcleos celulares y formación microvascular.

Resumen

El alcance de la protección se define por las reivindicaciones.

Se describen partículas de microgel conjugadas con PEG reticuladas, deformables e insolubles en agua pero hinchables en agua de proteínas, de macromoléculas a base de proteínas o de ambas. Las proteínas y las macromoléculas a base de proteínas se pueden seleccionar de matrices extracelulares, glicoproteínas, proteínas estructurales, proteínas fibrosas, enzimas, proteoglicanos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, proteínas globulares, proteínas de membrana, proteínas plasmáticas, péptidos, oligopéptidos, péptidos antimicrobianos, hormonas peptídicas, chaperonas, metaloproteínas, hemoproteínas, proteínas de coagulación, proteínas del sistema inmunológico, proteínas de canal iónico, proteínas de adhesión celular, neuropéptidos, nucleoproteínas, escleroproteínas, cromoproteínas, proteínas conjugadas, complejos proteína-proteína, complejos proteínapolisacárido, complejos proteína-lípido, complejos proteína-enzimas, complejos de proteína-polímero, proteínas motoras, mucoproteínas, fosfoproteínas, proteínas contráctiles, proteínas de transporte, proteínas de señalización, proteínas reguladoras, proteínas de factores del crecimiento, proteínas sensoriales, proteínas de defensa, proteínas de almacenamiento, proteínas receptoras, anticuerpos, proteínas recombinantes, fibrinógeno, fibrina, trombina, colágeno, elastina, albúmina, gelatina, queratina, laminina y combinaciones de los mismos, que son pseudoplásticos y fluyen en medios acuosos bajo cizallamiento y las cuales se pueden inyectar o hacer fluir, en donde las partículas de microgel se pueden conformar de nuevo como un grupo de partículas de microgel cuando se eliminan las fuerzas de cizallamiento.

Las partículas de microgel conjugado con PEG reticulado también se pueden usar en su estado seco y se pueden colocar en o sobre un defecto corporal, herida, quemadura o en, sobre o alrededor de un sustituto de tejido, en donde las partículas de microgel se pueden hidratar por vía de fuentes endógenas o exógenas.

De particular interés es el uso de tales partículas de microgel a base de proteínas como materiales revestidos, inyectados o implantados en tejidos, órganos, espacios vacíos de heridas, sustitutos de tejidos y productos de reemplazo de la piel, donde las partículas de microgel hidratadas bajo cizallamiento en medios acuosos son pseudoplásticas y se pueden conformar de nuevo a un grupo de microgel cohesivo cuando se elimina el cizallamiento. Las partículas de microgel se pueden aplicar en su estado seco como un polvo o como partículas hidratadas. Los materiales descritos en la presente invención se pueden usar en métodos que incluyen el relleno de huecos biológicos, fisuras y lúmenes de tejidos blandos, y proporcionar un revestimiento y soporte para sustitutos de la piel, donde las partículas de microgel funcionan como una matriz celular.

Ejemplos de huecos incluyen, pero no se limitan a, lesiones, fisuras, fístulas y divertículos. Estos huecos pueden ser fisiológicos o el resultado de una infección, cirugía, quiste, extirpación de tumores o de lesiones traumáticas o de la remodelación de tejidos blandos, tales como en la curación de heridas y de piel, cirugía plástica, cirugía estética, cirugía reconstructiva, revestimiento/sellado de productos de reemplazo de la piel, reparación de tendones, reparación de hernias, cirugía craneofacial, cirugía oftálmica, ritidectomía cervicofacial, abdominoplastia, aumento de senos, reparación de miocardio, reparación de cartílago, reparación de nervios, reparación de la médula espinal, regeneración del tejido hepático, reparación de la vejiga, reparación muscular, mastopexia, reumatología, reducción de ginecomastia, contorno corporal, rejuvenecimiento de la piel, estiramiento de la piel, microcirugía, dermatocosmética para el relleno de arrugas, enmascaramiento de cicatrices o aumento de labios, y similares.

El reemplazo de la piel que usa sustitutos de piel elaborados con tejidos y células en forma de aerosol se usa para reparar la piel en heridas difíciles de curar, tales como heridas crónicas debidas a diabetes, quemaduras de tercer grado y heridas por traumatismos. La no incorporación del producto de reemplazo de la piel y la infección de la herida pueden ser determinantes clave de la falta de éxito en la cicatrización de las heridas con productos de reemplazo de la piel. Los productos de reemplazo de piel a menudo rellenan aproximadamente el 60 % del vacío de la herida, dejando el 40 % del área de la herida sin contacto continuo para la movilidad celular, así como áreas abiertas para la desecación/maceración y el desarrollo de infecciones. Las formulaciones que contienen partículas de microgel descritas en la presente invención forman un revestimiento que se adapta a los tejidos circundantes, rellenando el espacio vacío de la herida cuando se aplica como un polvo que se hidrata in situ o cuando se aplica como partículas de microgel hidratado, dichas partículas de microgel hidratadas mejoran la movilidad celular entre los productos de reemplazo de la piel y el lecho de la herida, disminuyendo la desecación y la maceración. Cuando se añade un agente antimicrobiano a las partículas de microgel, se puede reducir o eliminar la infección, mejorando así la efectividad de la curación, particularmente para heridas perforantes y debilitantes, quemaduras, y de los productos de reemplazo de la piel lo que produce una mayor tasa de recuperación en el resultado clínico.

Las partículas de microgel se derivan de proteínas naturales u obtenidas genéticamente y de macromoléculas biológicas a base de proteínas seleccionadas de colágeno, matriz extracelular, albúmina, plasma, fibrinógeno, fibrina, trombina, factores de coagulación, factor de Von Willebrand, hemoglobina, elastina, gelatina, queratina, dermis acelular, membrana amniótica, tejido adiposo, Matrigel, fascia cadavérica, válvulas cardíacas, vasos sanguíneos, piel, nervios, músculo esquelético, mucina, agrecano, actina, vitronectina, elastina, perlecano, queratina, espectrina, placenta, hígado, páncreas, fibronectina, elastina, laminina, reticulina, corion, cordón umbilical, submucosa del intestino delgado, intestino grueso, matriz acelular de la vejiga, tejido de la submucosa del estómago, próstata, decorina, biglicano, perlecano, lumicano, fibromodulina, integrinas, cadherinas, agrina, entactina, epificano, actina, pericardio, placenta, tejido fetal de cualquier órgano de mamífero, derivados de virus, combinaciones de los mismos y similares.

Un microgel hidratado a base de partículas inyectable es ventajoso para el relleno de defectos de tejidos blandos. Las composiciones que contienen partículas de microgel pueden fluir a través de una aguja de inyección mediante la deformación del microgel, si así lo requieren las dimensiones internas de la aguja de inyección, y se adelgazan por cizallamiento para permitir el relleno de las heridas perforantes y debilitantes porque se pueden separar partículas discretas del microgel a partir de un grupo de partículas en reposo bajo una fuerza móvil reduciendo así la viscosidad, y debido a que el grupo de partículas se puede conformar de nuevo cuando se elimina el cizallamiento, regenerando la matriz pseudoplástica mediante la formación de un sólido viscoelástico conformable y moldeable. Las características de fluidez de las partículas de microgel hidratadas, junto con su comportamiento viscoelástico de tipo sólido resultante, permiten que la matriz inyectable pseudoplástica rellene superficies de heridas irregulares o rellene defectos en tejidos.

La preparación de proteínas derivatizadas mediante conjugación con PEG incluye la conversión del componente proteico a un estado más hidrófilo que es hinchable pero insoluble en medios acuosos. La proteína derivatizada funciona como un hidrogel; sin embargo, la reticulación de las proteínas derivatizadas mediante conjugación con PEG de tipo multifuncional puede dar como resultado una gelificación monolítica en medios acuosos. A continuación, el gel monolítico se puede liofilizar y moler hasta obtener un polvo que, al hidratarse, forma partículas de microgel. La conjugación con PEG de proteínas y de macromoléculas a base de proteínas puede ocurrir mediante la reacción con los grupos amino o sulfhidrilo disponibles, que están predominantemente en el componente proteico. Los agentes de conjugación con PEGs a menudo comprenden grupos funcionales reactivos, que incluyen azida, carbonato, éster, aldehído, acrilato, carboxilo, carbodiimida, carbonilimidazol, diclorotriazina, epoxi, isocianato, isotiocianato, maleimida, nitrofenil carbonato, ortopiridil disulfuro, piridiniloxicarbonilo, succinimidil carbonato, succinimidil glutarato, succinimidil metil butanoato, succinimidil succinato, ácido succínico, sulfhidrilo, tresilato, vinil sulfona y similares. Dependiendo del tipo de agente de conjugación a base de PEG usado para derivatizar las proteínas y/o las macromoléculas a base de proteínas, también se pueden conjugas con PEG otros grupos funcionales disponibles, tales como grupos carboxilo, guanidino, hidroxilo, imidazol o tirosina (fenólicos). El peso molecular del componente de PEG y su relación molar con respecto a la proteína o a la macromolécula a base de proteína a conjugar con PEG determina el grado de hidratación a obtener, el grado de reticulación, así como las propiedades físicas, mecánicas y biológicas resultantes del material compuesto conjugado con PEG. En general, cuanto más grande sea el segmento de PEG, mayor será la hidratación (hinchamiento) del gel resultante, más fuerte será el gel, mayor será la estabilidad del componente proteico del gel frente a la degradación de la proteasa y menor será la actividad biológica del compuesto. La actividad biológica reducida del componente proteico del material compuesto puede estar relacionada con el impedimento estérico causado por las unidades de poli(etilenglicol) y por la dilución total en la composición.

Las propiedades mecánicas de los microgeles se pueden estudiar mediante análisis reométrico. En reometría, el módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") de materiales biológicos débiles, tales como los tejidos oculares (por ejemplo, vítreo) y la grasa, son sustancialmente más bajos que los valores relacionados para materiales fuertes, tales como músculos, tendones, y cartílago. En este sentido, los valores de G' varían de 1 Pa a 1 MPa y los valores de G" varían de 0,1 Pa a 1 MPa. En algunas realizaciones descritas en la presente invención, el módulo de almacenamiento varía de 10 Pa a 250.000 Pa, o de 50 Pa a 175.000 Pa, o de 100 Pa a 100.000 Pa. En algunas realizaciones, el módulo de pérdida varía de 5 Pa a 100.000 Pa, o de 7,5 Pa a 50 Pa, o de 10 Pa a 10.000 Pa.

Las partículas de microgel conjugadas con PEG, hidratadas y reticuladas muestran pseudoplasticidad bajo cizallamiento. Este fenómeno pseudopástico se basa en las propias partículas hidratadas insolubles en agua y no en las macromoléculas solubles. Además, el comportamiento reológico de las partículas de microgel hidratado descritas en la presente invención está sorprendentemente relacionado con su comportamiento similar a un sólido, como lo demuestran valores de la tangente de pérdida (tangente delta) (G’’/G’) inferiores a 1, en lugar de ser más similar a un fluido.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona partículas de microgel reticuladas, hinchables en agua, de macromoléculas biológicas derivadas a base de proteínas.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona macromoléculas biológicas a base de proteínas que están reticuladas mediante conjugación con PEG de tipo difuncional a multifuncional.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona que la relación molar de agente de conjugación a base de PEG a proteína varía de 1:1 a 100:1.

La descripción proporciona partículas de microgel hidratadas que son pseudoplásticas bajo cizallamiento en medios acuosos.

La descripción proporciona composiciones donde, cuando se elimina el cizallamiento de las partículas de microgel hidratadas, se conforman de nuevo en un grupo de partículas de microgel.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona un polvo de microgel seco y partículas de microgel hidratadas.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona partículas de microgel que se pueden revestir, inyectar, pulverizar, pintar o implantar en o sobre tejidos, órganos, espacios vacíos de heridas, sustitutos de tejidos, vendajes y dispositivos médicos.

La descripción proporciona partículas de microgel que son insolubles en agua pero hinchables en agua y deformables bajo cizallamiento o compresión.

La porción proteica de las partículas de microgel se selecciona de matrices extracelulares, glicoproteínas, proteínas estructurales, proteínas fibrosas, enzimas, proteoglicanos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, proteínas globulares, proteínas de membrana, proteínas plasmáticas, péptidos, oligopéptidos, péptidos antimicrobianos, hormonas peptídicas, chaperonas, metaloproteínas, hemoproteínas, proteínas de coagulación, proteínas del sistema inmunológico, proteínas de los canales iónicos, proteínas de adhesión celular, neuropéptidos, nucleoproteínas, escleroproteínas, cromoproteínas, proteínas conjugadas, complejos proteína-proteína, complejos proteínapolisacárido, complejos proteína-lípido, complejos proteína-polímero, proteínas motoras, mucoproteínas, fosfoproteínas, proteínas contráctiles, proteínas de transporte, proteínas de señalización, proteínas reguladoras, proteínas de factores del crecimiento, proteínas sensoriales, proteínas de defensa, proteínas de almacenamiento, proteínas receptoras, anticuerpos, proteínas recombinantes, fibrinógeno, fibrina, trombina, colágeno, elastina, albúmina, gelatina, queratina, laminina y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la porción proteica de las partículas de microgel se selecciona de fibrinógeno, fibrina, albúmina, plasma, matriz extracelular y colágeno.

En algunas realizaciones, las partículas de microgel inducen angiogénesis in vivo.

En algunas realizaciones, las partículas de microgel promueven la supervivencia de las células trasplantadas in vivo.

El agente de conjugación a base de PEG de proteínas es tipo multifuncional.

En algunas realizaciones, el agente de conjugación a base de PEG de las proteínas es a-succinimidiloxiglutaril-wsuccinimidiloxiglutariloxipolioxietileno (SG-PEG-SG).

En algunas realizaciones, se incorporan agentes biológicamente activos en el microgel de proteína conjugada con PEG.

En algunas realizaciones, los agentes biológicamente activos son células.

En algunas realizaciones, las células son de origen humano y son autólogas o alogénicas.

En algunas realizaciones, las células son células madre de origen humano y son autólogas o alogénicas.

En algunas realizaciones, es un objeto adicional de la invención que el agente biológicamente activo sea tejido cutáneo descelularizado y micronizado.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es tejido micronizado o fragmentado, tal como, pero no limitado a, médula espinal, vejiga, submucosa del intestino delgado, piel, dermis, epidermis, grasa, cartílago, placenta, matriz extracelular, tendón, cordón umbilical, córnea, corazón, miocardio, hígado, páncreas y músculo.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es tejido amniótico fragmentado.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es tejido picado.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es tejido micronizado.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es colágeno de tendón bovino reticulado y granulado y/o glicosoaminoglicano.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es líquido amniótico.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es la gelatina de Wharton.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es tejido cutáneo micronizado.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo es un factor del crecimiento.

En algunas realizaciones, el agente biológicamente activo tiene propiedades antimicrobianas.

En algunas realizaciones, el agente antimicrobiano es poli(hexametilen biguanida) y sus sales.

En algunas realizaciones, se añaden polímeros solubles en agua a las partículas de microgel conjugado con PEG. En algunas realizaciones, se añaden aceites esenciales a las partículas de microgel conjugado con PEG.

En algunas realizaciones, las partículas de microgel conjugado con PEG reticulado se pueden aplicar como un polvo, líquido, gel, pasta, crema, emulsión o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el módulo de almacenamiento reológico (G') es mayor que el módulo de pérdida (G") para las partículas de microgel hidratado, con una tangente de pérdida menor que la unidad.

Descripción detallada

Se proporcionan composiciones que incluyen partículas de microgel insolubles en agua seleccionadas entre proteínas conjugadas con PEG reticuladas y macromoléculas biológicas a base de proteínas que son pseudoplásticas en disolución acuosa. La disolución de partículas de microgel hidratadas disminuye su viscosidad con el cizallamiento aplicado y se conforman de nuevo en un grupo de microgel en ausencia de cizallamiento. La relación molar de agente de conjugación a base de PEG a proteínas y a macromoléculas biológicas a base de proteínas es de 1:1 a 100:1. En algunas realizaciones, la concentración de partículas de microgel en la composición es de 10 mg/ml a 1.000 mg/ml, o de 25 mg/ml a 800 mg/ml, o de 50 mg/ml a 750 mg/ml, o de 100 mg/ml a 500 mg/ml. Las partículas de microgel hidratadas individuales y agrupadas, ya sea solas o en una mezcla, tienen propiedades viscoelásticas de sólidos, un módulo de almacenamiento mayor que el módulo de pérdida, y valores de tangente de pérdida menores de 1.

El uso de la conjugación con PEG monofuncional convencional para la preparación de proteínas conjugadas con PEG insolubles en agua e hinchables en agua no es parte de la presente invención porque a menudo se obtienen geles solubles que no proporcionan las propiedades mecánicas deseadas. Dichos geles solubles pueden proporcionar una matriz pobre para las células añadidas. En algunas realizaciones para la preparación de los hidrogeles monolíticos de proteína conjugada con PEG insolubles en agua e hinchables en agua descritos en la presente invención, se usa la conjugación con PEG mediante grupos reactivos multifuncionales, en los extremos de un polietilenglicol (PEG) de múltiples brazos, lineal o ramificado, para producir un gel monolítico en un medio acuoso que se puede convertir en partículas de microgel insolubles después del secado y convertir en partículas, tal como mediante molienda, por ejemplo, mediante mortero y maja o criomolienda. En algunas realizaciones, las partículas de microgel se pueden obtener directamente durante la preparación de la conjugación con PEG de las proteínas mediante una agitación rápida o cizallamiento del gel resultante. En algunas realizaciones, se prefiere el aislamiento del gel monolítico porque los componentes que no han reaccionado se pueden separar mediante extracción antes de la formación de las partículas de microgel.

Los agentes de conjugación con PEG se seleccionan entre a-succinimidiloxiglutaril-wsuccinimidiloxiglutariloxipolioxietileno (SG-PEG-SG), a-aminopropil-w-aminopropoxi polioxietileno, a-aminopropil-wcarboxipentiloxipolioxietileno, a-w-bis{2-[(3-carboxi-1 -oxopropil)amino]etil} polietilenglicol, a-[3-(3-maleimido-1 -oxopropil)amino] propil-w-[3-(3-maleimido-1-oxopropil)amino] propoxipolioxietileno, pentaeritritol tetra(aminopropil) polioxietileno, a-[3-(3-maleimido-1-oxopropil)amino] propil-w-(succinimidiloxicarboxi) polioxietileno, pentaeritritol tetra(succinimidiloxiglutaril) polioxietileno, pentaeritritol tetra(mercaptoetil) polioxietileno, hexaglicerol octa(succinimidiloxiglutaril) polioxietileno, hexaglicerol octa(4-nitrofenolcarbonil) polioxietileno, poli(etilenglicol) tetraacrilato de 4 brazos, succinimidiloxiglutaril) polioxietileno de 4 brazos, bis(polioxietilen bis[imidazoil carbonilo]), O-(3-carboxipropil)-O'-[2-(3-mercaptopropionilamino)etil] polietilenglicol, O,O'-bis [2-(W-succinimidilsuccinilamino)etil] polietilenglicol, O,O'-bis(2-azidoetil) polietilenglicol, poli(etilenglicol) diacrilato, poli(etilenglicol) diglicidil éter, poli(etilenglicol) di(p-nitrofenil carbonato), poli(etilenglicol) di(vinil sulfona), poli(etilenglicol) di(propionaldehído), poli(etilenglicol) di(benzotriazolil carbonato) y similares, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente de conjugación a base de PEG es a-succinimidiloxiglutaril-w-succinimidiloxiglutariloxipolioxietileno (SG-PEG-SG), disponible de NOF America Corporation bajo la marca SUNBRIGHT® DE-034GS, con un peso molecular de 3.400 Daltons (Número CAS: [154467-38-6]). Se cree que SG-PEG-SG reticula las proteínas vía eliminación de la N-hidroxisuccinimida de los grupos amino de las proteínas, formando puentes de carbamato entre los múltiples segmentos de las proteínas y los agentes de conjugación con PEG. Por tanto, se cree que el agente de conjugación a base de PEG forma un puente entre los restos de fibrinógeno.

En algunas realizaciones, las partículas hidratadas de microgel de fibrinógeno conjugado con PEG y de fibrina conjugada con PEG proporcionan un formato de administración conveniente para su uso como relleno, revestimiento, implantación o inyección de tejidos blandos en o sobre tejidos, órganos y espacios vacíos de heridas, así como un revestimiento conformable para sustitutos de tejido, que sirven como matrices degradables para gestionar el entorno de la herida y promover la angiogénesis durante la cicatrización. La angiogénesis y la neovascularización son determinantes críticos de los resultados de la curación de heridas, ya que los vasos sanguíneos recién formados participan en el proceso de curación, proporcionando oxígeno y nutrientes a las células y a los tejidos en crecimiento. Se sabe que los fibrinopéptidos, los productos de degradación del fibrinógeno y la fibrina, facilitan la cicatrización de la heridas, con un papel conocido en la mejora de la angiogénesis y en el recrecimiento de los tejidos.

En contraste con un hidrogel monolítico, las partículas hidratadas de microgel individuales tienen tamaños de poro grandes y áreas superficiales grandes para la unión celular. Además de las propiedades de flujo únicas descritas en la presente invención, la flexibilidad y apertura del sistema de las partículas de microgel permite la movilidad celular. En algunas realizaciones de las partículas de microgel secas, los tamaños de poro varían de 0,9 gm a 40,7 gm, mientras que la longitud de las partículas varía de 10,9 gm a 1.347,7 gm y una anchura de 2,2 gm a 874,2 gm. En algunas realizaciones de partículas de microgel secas, los tamaños de poro varían de 0,9 gm a 23,7 gm, mientras que la longitud de las partículas varía de 5,3 gm a 1.832,8 gm y una anchura de 1,6 gm a 894,2 gm. En algunas realizaciones, las partículas de microgel secas se preparan mediante criomolienda o mediante mortero y maja.

En algunas realizaciones, cuando se usa como una matriz celular, el microgel seco se rehidrata rápidamente mediante una disolución que contiene células. En algunas realizaciones, el polvo de microgel seco se carga previamente en una jeringa y las células se introducen en la jeringa para hidratar el polvo de microgel antes de inyectar la composición cargada de células en una herida o defecto. En otras realizaciones, el polvo de microgel seco se carga previamente en un vial, luego las células en disolución se inyectan a través del tabique en el vial para hidratar los microgeles, antes de que el sistema cargado de células se extraiga en una jeringa y se inyecte en el tejido, en un hueco, o en una herida que lo necesite. En algunas realizaciones, la composición hidratada y pseudoplástica de las células se puede inyectar a través de una jeringa o cánula en un tejido, en un hueco o en una herida o se puede aplicar mediante revestimiento para una administración localizada. Tras la aplicación, las partículas de microgel hidratadas se agregan para formar un grupo de microgel adhiriéndose entre sí y al tejido circundante. El grupo de microgel forma una red de hidrogel cohesiva que contiene espacios vacíos en y sobre las partículas del microgel, así como entre las partículas del microgel. Las características del adelgazamiento por cizallamiento y de la rápida autoagregación de las partículas del microgel, junto con su capacidad para acomodar células y otros agentes biológicos en los espacios vacíos, junto con su capacidad para rellenar la forma de la cavidad con una interfaz entre el microgel y el tejido, proporciona una red superior para la suministro de agentes biológicos. Como resultado, las composiciones de partículas de microgel insolubles en agua descritas en la presente invención proporcionan un sistema excelente para el suministro celular.

Las partículas de fibrinógeno conjugado con PEG que se han liofilizado y molido a un polvo exhiben un comportamiento fluido y de adelgazamiento por cizallamiento cuando se rehidratan. En algunas realizaciones, las partículas de microgel adsorben aproximadamente 15 veces su peso en disoluciones salinas (93 % en peso de disolución salina), y están más hidratadas que las partículas análogas de fibrina conjugada con PEG, que adsorben aproximadamente 7 veces su peso en disolución salina (89 % en peso de disolución salina) para el mismo grado de conjugación con PEG (relación molar de 50:1, Tabla 1). En lugar de formar un solo gel sólido, estas partículas de microgel de PEG-fibrinógeno interactúan con partículas de microgel de PEG-fibrinógeno adyacentes a través de enlaces de hidrógeno para formar un sólido "similar a un gel" con propiedades de adelgazamiento por cizallamiento.

Entre las ventajas de las partículas de microgel descritas en la presente invención con respecto a un hidrogel monolítico preparado in situ en un huésped se encuentran que el producto inyectado se puede purificar previamente para eliminar los componentes que no han reaccionado; se puede inyectar en forma de un microgel hidratado en un lugar designado en función de las propiedades de adelgazamiento por cizallamiento, lo que facilita el relleno de defectos de tejidos blandos; se puede almacenar a temperatura ambiente en forma de polvo; y se puede mezclar con células durante un procedimiento clínico mediante la introducción de la disolución celular en la jeringa con el polvo de microgel o poniendo en contacto de otro modo la disolución de las células con el polvo de microgel. La red porosa de las partículas de microgel hidratado también permite la movilidad celular y mejora la supervivencia celular mediante el intercambio de nutrientes y la infiltración de la célula huésped a través de sus poros y espacios vacíos. Esta flexibilidad contrasta directamente con un hidrogel monolítico, tal como se ha informado para los hidrogeles de poli(etilenglicol) (PEG) como matrices, que pueden ser difíciles de infiltrar para las células, debido a la densidad del hidrogel de PEG (Documento de Patente de los EE.UU. de Número 8.557.288).

Además, la preparación in situde un gel monolítico a menudo usa la fotopolimerización de los grupos acrilato colgantes sobre materiales conjugados con PEG u otros monómeros de tipo vinilo. Aunque tal procedimiento es engorroso en un entorno clínico, el inicio de una polimerización por radicales libres in situ también genera calor, que puede ser perjudicial para el tejido circundante o para las células añadidas. Dicho proceso también presenta la posibilidad de que quede monómero residual sin reaccionar en el cuerpo, que puede tener un comportamiento citotóxico.

En algunas realizaciones, las partículas de microgel descritas en la presente invención pueden tener una forma irregular o pueden ser una elipse. En algunas realizaciones, las partículas de microgel pueden ser microporosas, mesoporosas o macroporosas. Dependiendo de la realización, las partículas de microgel pueden tener por tanto un tamaño ajustable, un grado de hidratación ajustable, un área superficial grande para la unión celular o la adición de un agente biológico y una red porosa interior para la incorporación de otras biomoléculas. Además, las partículas de microgel son inherentemente biodegradables. Además, a diferencia de un hidrogel monolítico (a granel), debido a su tamaño más pequeño, ocurren fácilmente la flexibilidad, la deformación y la compresión, y las partículas de microgel responden a los cambios ambientales.

En algunas realizaciones, las composiciones pseudoplásticas de partículas de microgel pueden incluir una disolución acuosa con líquido amniótico, tejido amniótico fragmentado, tejido picado, tejido micronizado, tejido descelularizado micronizado, plasma, sangre, colágeno granulado de tendón bovino reticulado y glicosaminoglicanos, células y células madre en medio de cultivo celular, componentes de la matriz extracelular sintéticos o de origen natural, incluidos colágeno, glicosaminoglicanos, fibrina, laminina y fibronectina, hidroxiapatita, miel, polisacáridos, polímeros biodegradables, incluidos poliglicólidos, polilactidas, poli(lactida-co-glicólido), polidioxanona, policaprolactona, poli(carbonato de trimetileno), poli(fumarato de propileno), poliuretanos, poli(ésteramidas), poli(ortoésteres), polianhídridos, poli(aminoácidos), polifosfacenos y poliésteres bacterianos, y combinaciones de los mismos, y que se pueden inyectar en un tejido blando, un hueco o en una herida.

En algunas realizaciones, el tejido picado se selecciona de tejido cutáneo, tejido muscular, tejido vascular, tejido nervioso, tejido graso, tejido cartilaginoso, tejido óseo, tejido tendinoso, tejido vesical, tejido intestinal, tejido cardíaco, tejido pulmonar, tejido renal, tejido hepático, tejido pancreático y tejido de las cuerdas vocales. En algunas realizaciones, los tejidos micronizados y los tejidos descelularizados micronizados se seleccionan de tejido cutáneo, tejido muscular, tejido vascular, tejido nervioso, tejido graso, tejido cartilaginoso, tejido óseo, tejido tendinoso, tejido vesical, tejido intestinal, tejido cardíaco, tejido pulmonar, tejido renal, tejido hepático, tejido pancreático y tejido de las cuerdas vocales. La matriz pseudoplástica de microgel se puede usar, por ejemplo, para el tratamiento de úlceras del pie diabético con perforación y debilitación, o en otras heridas o procedimientos quirúrgicos donde sea deseable una matriz viscoelástica fluida.

El fibrinógeno es una glicoproteína soluble en agua en los vertebrados que ayuda en la formación de coágulos sanguíneos. La molécula de fibrinógeno es una glicoproteína plasmática de 340 kDa soluble en agua que se convierte a fibrina insoluble en agua por la trombina durante la formación del coágulo sanguíneo. El fibrinógeno tiene forma de varilla con dimensiones de aproximadamente 9 x 47,5 x 6 nm con una carga neta negativa en pH fisiológico (punto isoeléctrico de pH 5,2). El fibrinógeno está disponible comercialmente a partir de plasma humano, plasma bovino, plasma de salmón, plasma de babuino, plasma de murino, plasma de ratón, plasma de rata, plasma canino y plasma de gato. En algunas realizaciones, se prefiere el plasma humano. En algunas realizaciones, se usa fibrinógeno de Sigma-Aldrich (F3879) procedente de plasma humano que contiene 50-70 % de proteína, en donde >80 % de la proteína es coagulable. En algunas otras realizaciones, el fibrinógeno se puede usar de fuentes autólogas, alogénicas o xenogénicas. En otras realizaciones adicionales, se puede usar fibrinógeno recombinante. En algunas realizaciones, se prefiere el fibrinógeno humano autólogo.

La trombina es una enzima proteolítica que actúa como una serina proteasa para convertir el fibrinógeno en hebras insolubles de fibrina, así como para catalizar muchas otras reacciones relacionadas con la coagulación. La trombina está disponible a partir de varios tipos de plasma, tales como humano, bovino, porcino, equino, de rata, de conejo y de fuentes recombinantes. En algunas realizaciones, se prefiere la trombina de plasma humano, ^ 1.000 unidades NIH/mg de proteína de Sigma Aldrich (T7009), para la conversión del fibrinógeno conjugado con PEG a fibrina conjugada con PEG.

En algunas realizaciones, la composición de microgel se compone de partículas molidas de fibrinógeno o de fibrina que están reticuladas con agentes de conjugación con PEG de tipo di- a multifuncional, creando partículas de gel insolubles en agua compuestas de varias combinaciones de sustituyentes de poli(etilenglicol) entre, predominantemente, grupos amino colgantes entre las cadenas proteicas de fibrinógeno o fibrina. Cada partícula de microgel es un material compuesto de una multitud de cadenas de proteínas de fibrinógeno o fibrina, intercaladas entre las cadenas de poli(etilenglicol) más cortas, pero más numerosas. La formación de las partículas de microgel ocurre antes de la aplicación a tejidos, órganos, heridas y sustitutos de tejidos, lo que evita la instrumentación in situ para la polimerización, brinda la capacidad de eliminar los monómeros e iniciadores contaminantes antes de la introducción en el cuerpo y evita la generación del calor de polimerización en el sitio de introducción. Esta combinación ayuda a facilitar el éxito de la inyección.

La conjugación con PEG de los sustituyentes de las proteínas y/o de las macromoléculas a base de proteínas se puede realizar a relaciones molares de 100:1, 75:1, 50:1, 35:1, 20:1, 15:1, 10:1, 7,5:1, 5:1, 2,5:1 y 1:1 de agente de conjugación a base de PEG a componente proteico, o cualquier intervalo que comience o termine con cualquiera de estas relaciones molares (por ejemplo, de 100:1 a 1:1, o de 50:1 a 2,5:1, o de 50:1 a 10:1, o de 35:1 a 5:1). En algunas realizaciones, las relaciones molares de agente de conjugación a base de PEG a componente proteico son 10:1,20:1, 35:1 y 50:1. En algunas realizaciones, después de liofilizar los geles monolíticos, los polímeros liofilizados se pulverizan mediante mortero y maja o criomolienda, y se separan adicionalmente mediante tamizado, dando tamaños de partícula promedios de partículas secas de microgel que varían de 10 gm a 1.000 gm, o de 50 gm a 500 gm, o de 75 gm a 250 gm. En algunas realizaciones, después de liofilizar los geles monolíticos, los polímeros liofilizados se pulverizan mediante mortero y maja o criomolienda, dando longitudes promedio de tamaño de partícula de las partículas secas que varían de 10 gm a 1.000 gm, o de 50 gm a 500 gm, o de 75 gm a 250 gm.

En algunas realizaciones, las partículas de microgel se hidratan con un fluido. En algunas realizaciones, la fase móvil del fluido es agua, disolución salina isotónica, disolución salina equilibrada, disolución tampón, disolución de Ringer, medios de cultivo celular, medios de células madre, suero, plasma, líquido amniótico, gelatina de Wharton, caldo nutritivo, disoluciones antisépticas, o una combinación de los mismos. El grado de hidratación de las partículas de microgel depende de al menos la relación molar de agente de conjugación a base de PEG a proteína derivatizada, del grado de porosidad y del área superficial de las partículas de microgel resultantes y del pH, de la osmolalidad y de la temperatura de la fase móvil. En algunas realizaciones, donde el fluido es un medio acuoso, el medio acuoso puede tener un pH en el intervalo de 4,5 a 8,0 o de 5,5 a 7,5. En algunas realizaciones, el grado de hidratación (hinchamiento) de las partículas de microgel puede ser al menos 50 veces, al menos 40 veces, al menos 30 veces, al menos 20 veces, al menos 10 veces, al menos 5 veces o al menos 2 veces el peso seco de la partícula de microgel, cuando se mide con una disolución salina.

En algunas realizaciones, se añade un agente antimicrobiano a las partículas de microgel para dificultar el desarrollo y la proliferación de microorganismos. En algunas realizaciones, la adición de un agente antimicrobiano ayuda a reducir o eliminar las colonias microbianas y la formación de biopelículas. Debido a la posibilidad de infección en huecos, heridas y quemaduras, la composición de microgel de proteína conjugada con PEG puede incluir un agente biológico en una cantidad suficiente para impedir o erradicar los microorganismos.

Ejemplos de agentes biológicos incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, antisépticos, agentes antiinfecciosos, agentes antimicrobianos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antivirales, agentes antiprotozoarios, agentes esporicidas y agentes antiparasitarios. En algunas realizaciones, el agente biológico es biodegradable, no citotóxico para las células humanas y animales, o tanto biodegradable como no citotóxico.

Ejemplos de agentes biocidas incluyen, pero no se limitan a, biguanidas, tales como poli(hexametilen biguanida) (PHMB, por sus siglas en inglés) y sus sales, un polímero de biguanida catiónico sintético de bajo peso molecular, clorhexidina y sus sales, tales como digluconato de clorhexidina y alexidina y sus sales, tales como el diclorhidrato de alexidina, donde los dos últimos son bis(biguanidas), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, monolaurato de glicerol, capril glicol, sulfato de gentamicina, yodo, povidona yodada, almidón yodado, sulfato de neomicina, polioxidina B, bacitracina, tetraciclinas, clindamicina, gentamicina, nitrofurazona, acetato de mafenida, nanopartículas de plata, sulfadiazina de plata, nitrato de plata, clorhidrato de terbinafina, nitrato de miconazol, cetoconazol, clotrimazol, itraconazol, metronidazol, péptidos antimicrobianos, polcuaternario-1, policuaternio-6, policuaternio-10, sales de los mismos y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la biguanida antimicrobiana es hidrocloruro de poli(hexametilen biguanida) (PHMB). El PHMB se puede usar por su alta actividad biocida contra microorganismos, combinada con su biodegradabilidad y baja citotoxicidad. El PHMB es principalmente activo contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, hongos y virus. A diferencia de los antibióticos, que se consideran medicamentos farmacéuticos regulados y a los que puede ocurrir resistencia bacteriana, dicha resistencia no ocurre con el PHMB. Como se usa en la presente invención, un "agente antimicrobiano" es una sustancia que mata a los microorganismos o inhibe su crecimiento o replicación, mientras que un "agente antiinfeccioso" es una sustancia que contrarresta la infección al matar a los agentes infecciosos, tales como los microorganismos, o evitar que se propaguen. A menudo, los dos términos se usan indistintamente. Como se usa en la presente invención, el PHMB se considera un agente antimicrobiano.

En algunas realizaciones, las composiciones que contienen partículas hidratadas o rehidratadas de microgel de proteína conjugada con PEG descritas en la presente invención pueden incluir PHMB biocida a una concentración que varía del 0,0001 % en peso (1 ppm) al 1 % en peso (10.000 ppm), o que varía del 0,01 % en peso (100 ppm) al 0,75 % en peso (7.500 ppm), o del 0,05 % en peso (500 ppm) al 0,5 % en peso (5.000 ppm), o del 0,1 % en peso (1.000 ppm) al 0,25 % en peso (2.500 ppm), basado en el peso total de la composición. En algunas realizaciones, las composiciones secas de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG descritas en la presente invención pueden incluir PHMB biocida a una concentración que varía del 0,002 % en peso (20 ppm) al 25,0 % en peso (250.000 ppm), o del 0,20 % en peso al 15,0 % en peso (150.000 ppm), o del 1,0 % en peso (10.000 ppm) al 10,0 % en peso (100.000 ppm), o en el intervalo del 2,0 % en peso (20.000 ppm) al 4,0 % en peso (40.000 ppm), basado en el peso total de la composición.

En algunas realizaciones, se pueden añadir bis(biguanidas), tales como alexidina y sus sales y clorhexidina y sus sales, a las composiciones antimicrobianas de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG en concentraciones del 0,001 % en peso (10 ppm) al 4,0 % en peso (40.000 ppm).

En algunas realizaciones, se pueden añadir agentes antimicrobianos de tipo tensioactivo, tales como cloruro de bencetónio o cloruro de benzalconio, a las composiciones antimicrobianas de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG en concentraciones del 0,001 % en peso (10 ppm) al 2,0 % en peso (20.000 ppm).

En algunas realizaciones, se pueden añadir agentes antimicrobianos de tipo lipófilo, tales como monolaurato de glicerol o capril glicol, a las composiciones antimicrobianas de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG en concentraciones del 0,1 % en peso (1.000 ppm) al 2,0 % en peso (20.000 ppm).

En algunas realizaciones, los agentes antimicrobianos con grupos funcionales reactivos, tales como grupos amino, imino, imidazoilo, sulfhidrilo, hidroxilo, fenólico, indolilo, guanidio, guanidinio y carboxilo, se pueden incorporar covalentemente sobre la partícula de microgel de proteína conjugada con PEG, formando un material compuesto ternario de proteína conjugada con PEG/agente antimicrobiano. En algunas realizaciones, se forman materiales compuestos ternarios unidos covalentemente de partículas de microgel de fibrinógeno conjugado con PEG/PHMB.

En algunas realizaciones, las composiciones acuosas de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG pueden tener una osmolalidad de 10-340 mOsm/kg. En algunas realizaciones donde la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG es una disolución, gel, pasta, emulsión o espuma a base de agua, se puede añadir un polímero soluble en agua para aumentar la viscosidad de la disolución y prolongar el tiempo de residencia en la superficie de un tejido, hueco, o herida, o por vía subcutánea en un hueco o herida. En algunas realizaciones, los polímeros solubles en agua útiles incluyen, pero no se limitan a, poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico) y copolímeros, poli(N-vinilpirrolidona) y copolímeros, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, goma guar, hidroxietilguar, hidroxipropilguar, gelatina, albúmina, hidroxipropilmetilguar, carboximetilguar, carboximetilquitosano, goma de algarrobo, carragenina, goma xantana, goma gellan, pululano, alginato, condroitín sulfato, dextrano, sulfato de dextrano, gel de aloe vera, escleroglucano, esquizofano, goma arábiga, goma de tamarindo, poli(metil vinil éter), copolímeros de bloque de óxido de etileno-óxido de propileno-óxido de etileno, hialuronano, sulfato de condroitina, queratán sulfato, dermatán sulfato, sulfato de heparano, dextrano, carbómero y sus sales, poli(ácido acrílico) y sus sales, poli(ácido metacrílico) y sus sales, poli(etileno-co-ácido acrílico), poli(vinil metil éter), sales del poli(ácido vinilfosfórico), sales del poli(ácido vinilsulfónico), poli(2-acrilamido-2-metilpropanosulfonato) de sodio, poliacrilamida(s), poli(N,N-dimetilacrilamida), poli(N-vinilacetamida), poli(N-vinilformamida), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de glicerilo), poli(2-etil-2-oxazolina), poli(N-isopropilacrilamida) y poli(N-vinilcaprolactama), los dos últimos hidratados por debajo de sus temperaturas inferiores de disolución crítica, policuaternio-1, policuaternio-6, policuaternio-10, polímeros de ioneno, guar catiónico, polímeros de piridinio, polímeros de imidazolio, polímeros de dialildimetilamonio, poli(L-lisina), polímeros de acriloil-, metacriloil- y estiril-trimetilamonio y polímeros de acriloamido- y metacrilamido-trimetilamonio, péptidos antimicrobianos y similares, y derivados y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la preparación de composiciones de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG en forma de disoluciones viscosas, geles, cremas, pastas, emulsiones, bálsamos y aerosoles, se puede facilitar mediante la inclusión de mejoradores de la viscosidad de polímeros solubles en agua en cantidades que varían de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 50,0 % en peso, del 0,1 al 45 % en peso, del 0,5 al 25 % en peso o del 1,0 al 10,0 % en peso.

En algunas realizaciones, se pueden añadir aceites esenciales a las composiciones de partículas de microgel como fragancias o agentes aromáticos y/o como agentes antimicrobianos. Ejemplos de aceites esenciales útiles en las composiciones de partículas de microgel descritas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, timol, mentol, sándalo, alcanfor, cardamomo, canela, jazmín, lavanda, geranio, enebro, mentol, pino, limón, rosa, eucalipto, clavo, naranja, orégano, menta, linalol, menta verde, menta piperita, hierba limón, bergamota, citronela, ciprés, nuez moscada, abeto, árbol del té, gaulteria (salicilato de metilo), vainilla y similares. En algunas realizaciones, los aceites esenciales se pueden seleccionar entre timol, aceite de sándalo, aceite de gaulteria, eucaliptol, aceite de pino y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los aceites esenciales pueden estar presentes en una cantidad que varía del 0 % al 5 % en peso basado en el peso de la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG. En algunas realizaciones, los aceites esenciales pueden estar presentes en una cantidad de al menos el 0,1 % en peso, o al menos el 0,25 % en peso, o al menos el 0,5 % en peso, basado en el peso de la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG.

En algunas realizaciones, la clorofilina, un derivado semisintético soluble en agua de la clorofila, también se puede usar para controlar el olor de las heridas y para proporcionar propiedades antiinflamatorias. En algunas realizaciones, la clorofilina puede estar presente en una cantidad que varía del 0 % al 5 % en peso basado en el peso de la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG. En algunas realizaciones, la clorofilina puede estar presente en una cantidad de al menos 0,1 % en peso, o al menos 0,25 % en peso, o al menos 0,5 % en peso basado en el peso de la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG.

En algunas realizaciones, la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG también puede incluir agentes humectantes, disoluciones tampón, agentes gelificantes o emulsionantes. Otros excipientes podrían incluir varias disoluciones tampón a base de agua que varían en el pH de 5,0 a 7,5, tensioactivos, siliconas, copolímeros de poliéter, grasas y aceites vegetales y de plantas, alcoholes hidrófilos e hidrófobos, vitaminas, monoglicéridos, ésteres de laurato, ésteres de miristato, ésteres de palmitato y ésteres de estearato. En algunas realizaciones, la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG puede estar en una forma que incluye, pero no se limita a, líquido, gel, pasta, crema, emulsión, combinaciones de las mismas y similares. En algunas realizaciones, la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG se liofiliza a un polvo seco. La composición liofilizada de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG se puede usar en forma de polvo, o el polvo se puede procesar adicionalmente (por ejemplo, rehidratado) en disoluciones, suspensiones, cremas, lociones, geles, pastas, emulsiones, bálsamos, pulverizaciones, espumas, aerosoles, películas o en otras formulaciones.

En algunas realizaciones, las partículas de microgel de proteína conjugada con PEG están en la forma de nanopartículas, nanocápsulas, nanovarillas y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, las partículas de microgel de proteína conjugada con PEG deshidratadas o liofilizadas están en la forma de nanopartículas, nanocápsulas, nanovarillas y combinaciones de las mismas.

Como se usa en la presente invención, "medios acuosos" se refiere a un espectro de disoluciones a base de agua que incluyen, pero no se limitan a, disoluciones homogéneas en agua con componentes solubilizados, disoluciones de medios celulares, disoluciones tampón, disoluciones isotónicas, disoluciones salinas, disoluciones emulsionadas, disoluciones tensioactivas, fluidos amnióticos, gelatina de Wharton, suero, polímeros hidrofílicos y disoluciones viscosas o gelificadas homogéneas o emulsionadas en agua.

Como se usa en la presente invención, "tensioactivo" tiene su significado estándar e incluye compuestos que reducen la tensión superficial (o tensión interfacial) entre dos líquidos o entre un líquido y un sólido, e incluye agentes emulsionantes, emulsionantes, detergentes, agentes humectantes, y agentes tensioactivos.

Como se usa en la presente invención, "hidrófilo" tiene su significado estándar e incluye compuestos que tienen afinidad por el agua y pueden ser iónicos o neutros o tener grupos polares en su estructura que atraen al agua. Por ejemplo, los compuestos hidrófilos pueden ser miscibles, hinchables, absorbibles o solubles en agua, con un ángulo de contacto estacionario con el agua de < 90° en agua a temperatura ambiente.

Como se usa en la presente invención, "hidrófobo" se refiere a que repele el agua, siendo insoluble o relativamente insoluble en agua, y que carece de afinidad por el agua con un ángulo de contacto estacionario con el agua de > 90° en agua a temperatura ambiente. Los compuestos hidrófobos con sustituyentes hidrófilos, tales como dioles vecinales, pueden formar emulsiones en agua, con o sin tensioactivo añadido, con el sustituyente hidrófilo en la interfaz del agua y la porción hidrófoba del compuesto en el interior de la emulsión.

Como se usa en la presente invención, "hinchable" se refiere a materiales que captan, absorben y/o adsorben fluidos en sus grupos funcionales, superficies, poros, microporos, nanoporos, agujeros y redes intersticiales.

Como se usa en la presente invención, el término "conjugación con PEG" se refiere a la modificación de una proteína o de una macromolécula a base de proteínas mediante la unión covalente del poli(etilenglicol) (PEG) con sus sustituyentes reactivos a los grupos funcionales reactivos disponibles de la proteína, tales como los grupos amino o grupos sulfhidrilo, mientras que "conjugada con PEG" se refiere a una proteína con un sustituyente PEG unido a la misma.

Como se usa en la presente invención, "proteínas" pretende incluir macromoléculas a base de proteínas e incluye matrices extracelulares, glicoproteínas, proteínas estructurales, proteínas fibrosas, enzimas, proteoglicanos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, proteínas globulares, proteínas de membrana, proteínas plasmáticas, péptidos, oligopéptidos, péptidos antimicrobianos, hormonas peptídicas, chaperonas, metaloproteínas, hemoproteínas, proteínas de coagulación, proteínas del sistema inmunológico, proteínas del canal iónico, proteínas de adhesión celular, neuropéptidos, nucleoproteínas, escleroproteínas, cromoproteínas, proteínas conjugadas, complejos proteína-proteína, complejos proteína-polisacárido, complejos proteína-lípido, complejos proteína-enzima, complejos proteína-polímero, proteínas motoras, mucoproteínas, fosfoproteínas, proteínas contráctiles, proteínas de transporte, proteínas de señalización, proteínas reguladoras, proteínas de factores del crecimiento, proteínas sensoriales, proteínas de defensa, proteínas de almacenamiento, proteínas receptoras, anticuerpos, proteínas recombinantes, fibrinógeno, fibrina, trombina, colágeno, elastina, albúmina, gelatina, queratina, laminina y combinaciones de las mismas.

Como se usa en la presente invención, "proteínas derivatizadas" son componentes de proteínas añadidos, unidos, coordinados o complejados con otro material, tales como otras proteínas, polisacáridos, oligosacáridos, glicosaminoglicanos, lípidos, fosfolípidos, liposomas, polipéptidos sintéticos, ADN, ARN, polímeros sintéticos, tensioactivos, átomos de metal, nanopartículas, agentes antimicrobianos, antibióticos, fármacos, sales de los mismos y similares.

Como se usa en la presente invención, un "hidrogel" es una red polimérica insoluble compuesta de macromoléculas normalmente solubles en agua que existen en un estado reticulado o pseudo-reticulado por interacción covalente, iónica o física entre las cadenas macromoleculares, donde la red insoluble adsorbe al menos el 10 % de su peso en agua. Un hidrogel puede contener una o más especies poliméricas hidrófilas.

Como se usa en la presente invención, un hidrogel "monolítico" consiste en una única red grande de polímero o de polímeros hidrófilos reticulados, que se pueden subdividir en partículas de microgel reticulado más pequeñas.

Como se usa en la presente invención, un "microgel" es una partícula hidrófila gelatinosa e insoluble en agua, que varía en longitud de 1 micrómetro a 1.000 micrómetros, con diámetros de 1 micrómetro a 1.000 micrómetros o una partícula deshidratada capaz de exhibir esas propiedades.

Como se usa en la presente invención, las "partículas de microgel" son partículas mixtas de fragmentos de gel insolubles en agua e hinchables en agua que tienen formas variadas, incluidas formas esféricas, elípticas, angulares, regulares (organizadas) o irregulares, bien huecas, microporosas, mesoporosas, macroporosas, o con espacios vacíos, o una combinación de las mismas, dependiendo del método de formación.

Como se usa en la presente invención, la frase "microporosas" se refiere a materiales que tienen diámetros de poro menores de 2 nm, las partículas "mesoporosas" tienen diámetros de poro entre 2 y 50 nm y las partículas "macroporosas" tienen diámetros de poro mayores de 50 nm.

Como se usa en la presente invención, "fluido" se refiere a un volumen de fluido o gel que es capaz de fluir a través de un pasaje de cualquier dimensión dada, tal como a través de un tubo de compresión, bomba, cánula o jeringa.

Como se usa en la presente invención, "inyectable" describe la capacidad de una disolución, suspensión, gel, emulsión o microgel para pasar a través de una aguja o cánula hipodérmica.

Como se usa en la presente invención, un "fluido newtoniano" exhibe una viscosidad que es independiente de las condiciones de cizallamiento estudiadas.

Como se usa en la presente invención, un "fluido no newtoniano" exhibe una viscosidad que depende de las condiciones de cizallamiento estudiadas.

Como se usa en la presente invención, "pseudoplástica" se refiere a una composición fluida con una viscosidad que disminuye al aumentar la velocidad de cizallamiento, es decir, es susceptible de adelgazamiento por cizallamiento.

Como se usa en la presente invención, la "velocidad de cizallamiento" (también llamada velocidad de deformación por cizallamiento) es la velocidad de cambio de la deformación en función del tiempo.

Como se usa en la presente invención, el "módulo de pérdida (G")" es una medida de la energía disipada en un material bajo deformación (por ejemplo, cizallamiento). G" es atribuible al flujo viscoso, más que a la deformación elástica. El módulo de pérdida también se conoce como módulo viscoso.

Como se usa en la presente invención, el "módulo de almacenamiento (G')" es una medida de la energía almacenada en un material bajo deformación (por ejemplo, cizallamiento). G' es atribuible a la deformación elástica. El módulo de almacenamiento también se conoce como módulo elástico.

Como se usa en la presente invención, la "tangente de pérdida" (también llamada tan delta, tan 5) es la tangente del ángulo de fase (5), que es la relación entre el módulo de pérdida (viscoso) (G") y el módulo de almacenamiento (elástico) (G'), es decir, tan 5 = G"/G'. La tangente de pérdida es un cuantificador útil de la presencia y del grado de elasticidad en un fluido. Valores de tangente de pérdida inferiores a la unidad indican un comportamiento dominante elástico (es decir, similar a un sólido) y los valores superiores a la unidad indican un comportamiento dominante viscoso (es decir, similar a un líquido).

Como se usa en la presente invención, "agentes biológicamente activos" tiene su significado estándar e incluye sustancias químicas o biológicas o formulaciones que afectan de manera beneficiosa a la salud y al bienestar de los seres humanos o animales o que están destinadas a ser usadas en la cura, mitigación, tratamiento, prevención o en el diagnóstico de infección o enfermedad, o son destructivos o inhiben el crecimiento de microorganismos.

Como se usa en la presente invención, "agente antimicrobiano" tiene su significado estándar e incluye una sustancia que mata microorganismos o inhibe su crecimiento o replicación, mientras que un "agente antiinfeccioso" se define como una sustancia que contrarresta la infección al matar agentes infecciosos, tales como microorganismos, o evita que se propaguen. A menudo, los dos términos se usan indistintamente.

Como se usa en la presente invención, "antibiótico" tiene su significado estándar e incluye aquellas sustancias que fueron originalmente producidas por un microorganismo o sintetizadas con propiedades activas que pueden matar o prevenir el crecimiento de otro microorganismo. El término antibiótico se usa comúnmente para referirse a casi cualquier medicamento recetado que intente eliminar la infección.

Como se usa en la presente invención, "excipiente" tiene su significado estándar e incluye sustancias inertes que forman un vehículo, tal como un líquido, fluido o gel, que solubiliza o dispersa una composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG, que puede incluir otros ingredientes añadidos.

Como se usa en la presente invención, "viscoelasticidad" es la propiedad de los materiales que exhiben características tanto viscosas como elásticas cuando sufren deformación.

Como se usa en la presente invención, los "sólidos viscoelásticos" son capaces de volver a su forma original cuando se elimina una carga de cizallamiento aplicada, mientras que los fluidos viscoelásticos no.

Como se usa en la presente invención, "tejido blando" tiene su significado estándar e incluye tejido biológico que conecta, sostiene o rodea otras estructuras y órganos del cuerpo, pero no incluye hueso. Ejemplos de tejido blando incluyen tendones, ligamentos, fascia, piel, tejidos fibrosos, grasa, membranas sinoviales, músculos, nervios y vasos sanguíneos.

Como se usa en la presente invención, las "nanopartículas" son partículas entre 1 y 500 nanómetros de tamaño y también incluyen partículas entre 1 y 100 nanómetros de tamaño.

Como se usa en la presente invención, las "nanocápsulas" son núcleos esféricos de un compuesto particular rodeados por una cubierta o revestimiento exterior de otro, con unos pocos nanómetros de espesor.

Como se usa en la presente invención, las "nanovarillas" son partículas en forma de varilla que tienen una longitud de al menos dos veces un radio o un ancho, y son típicamente de 1 a 100 nm de longitud.

Como se usa en la presente invención, las "micropartículas" son partículas de diversas dimensiones entre 0,1 y 100 gm de tamaño.

Como se usa en la presente invención, las "microesferas" son partículas esféricas, con diámetros típicamente de 1 gm a 1.000 gm. Las microesferas a veces se denominan micropartículas.

En algunas realizaciones, se pueden incorporar uno o más agentes observables o detectables en la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG para proporcionar una visualización mejorada o facilitar la colocación adecuada. Los agentes pueden comprender, en otras realizaciones, tintes, sustancias fluorescentes, absorbentes de ultravioleta, sustancias radiactivas, pigmentos o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, se pueden incorporar uno o más agentes biológicamente activos en la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG para proporcionar un beneficio médico a un huésped mamífero. Ejemplos de agentes biológicamente activos que se pueden incorporar en la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG incluyen, pero son no limitan a, células, células madre, tejido amniótico, células amnióticas, factores del crecimiento, tejido cutáneo descelularizado micronizado, colágeno granulado de tendón bovino reticulado y glucosaminoglicanos, antibióticos, antisépticos, agentes antiinfecciosos, agentes antimicrobianos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antivirales, agentes antiprotozoarios, agentes esporicidas, agentes antiparasitarios, agentes de neuropatía periférica, agentes neuropáticos, agentes quimiotácticos, agentes analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antialérgicos, agentes antihipertensivos, antibióticos de tipo mitomicina, agentes antifúngicos poliénicos, agentes antitranspirantes, descongestionantes, agentes anticinetósicos, agentes del sistema nervioso central, agentes de cicatrización de heridas, agentes anti-VEGF, agentes antitumorales, agentes escaróticos, agentes antipsoriasicos, agentes antidiabéticos, agentes antiartritis, agentes antipruriginosos, agentes antipruriginosos, agentes anestésicos, agentes antipalúdicos, agentes dermatológicos, agentes antiarrítmicos, anticonvulsivos, agentes antieméticos, agentes antireumatoides, agentes antiandrógenos, antraciclinas, agentes antitabaco, agentes antiacné, agentes anticolinérgicos, agentes antienvejecimiento, antihistamínicos, agentes antiparasitarios, agentes hemostáticos, vasoconstrictores, vasodilatadores, agentes trombogénicos, agentes anticoagulantes, agentes cardiovasculares, agentes de angina, agentes de disfunción eréctil, hormonas sexuales, hormonas de crecimiento, isoflavonas, secuencia de unión a integrinas, ligandos biológicamente activos, mediadores de unión celular, inmunomoduladores, alfa-factor de necrosis tumoral, agentes anticancerígenos, agentes antineoplásicos, agentes antidepresivos, agentes antitusivos, agentes antineoplásicos, antagonistas narcóticos, anti- agentes para la hipercolesterolemia, agentes inductores de apoptosis, agentes anticonceptivos, agentes bronceadores sin sol, emolientes, ácidos alfa-hidroxilados, miel de manuka, retinoides tópicos, hormonas, anticuerpos específicos de tumores, oligonucleótidos antisentido, ARN pequeño de interferencia (ARNip), adaptámero ARN anti-VEGF, ácidos nucleicos, ADN, fragmentos de ADN, plásmidos de ADN, Si-ARN, agentes de transfección, vitaminas, aceites esenciales, liposomas, nanopartículas de plata, nanopartículas de oro, nanopartículas que contienen fármacos, nanopartículas a base de albúmina, nanopartículas que contienen quitosano, nanopartículas a base de polisacáridos, nanopartículas de dendrímero, nanopartículas de fosfolípidos, nanopartículas de óxido de hierro, nanopartículas de bismuto, nanopartículas de gadolinio, nanopartículas metálicas, nanopartículas de cerámica, nanopartículas a base de sílice, nanopartículas a base de virus, nanopartículas similares a virus, nanopartículas que contienen antibióticos, nanopartículas que contienen óxido nítrico, nanocápsulas, nanovarillas, micelas poliméricas, sales de plata, sales de zinc, nanopartículas de puntos cuánticos, micropartículas a base de polímeros, microesferas a base de polímeros, micropartículas que contienen fármacos, microesferas que contienen fármacos, micropartículas que contienen antibióticos, microesferas que contienen antibióticos, micropartículas antimicrobianas, microesferas antimicrobianas, ácido salicílico, peróxido de benzoilo, 5-fluorouracilo, ácido nicotínico, nitroglicerina, clonidina, estradiol, testosterona, nicotina, agentes para el mareo por movimiento, escopolamina, fentanilo, diclofenaco, buprenorfina, bupivacaina, ketoprofeno, opioides, cannabinoides, enzimas, inhibidores de enzimas, oligopéptidos, ciclopéptidos, polipéptidos, proteínas, profármacos, inhibidores de proteasa, citocinas, ácido hialurónico, condroitín sulfato, dermatán sulfato, agentes parasimpaticolíticos, agentes quelantes, agentes para el crecimiento del cabello, lípidos, glicolípidos, glicoproteínas, hormonas endocrinas, hormonas del crecimiento, factores del crecimiento, factores de diferenciación, proteínas de choque térmico, modificadores de la respuesta inmunológica, sacáridos, polisacáridos, insulina y derivados de la insulina, esteroides, corticosteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos o materiales similares, ya sea en su forma de sal o en su forma neutra, ya sea hidrófilo de forma inherente o esté encapsulado dentro de una micropartícula hidrófila o nanopartícula. Dichos agentes biológicamente activos podrían estar en la configuración (R)-, (R, S)- o (S)-, o en una combinación de las mismas.

Como se usa en la presente invención, "inyección" tiene su significado estándar e incluye procedimientos intradérmicos, subcutáneos, orales, intramusculares, submucosales, subcutáneos, intranasales, vaginales, bucales, intratecales, epidurales, intraparenquimatosa, oculares, subretiniana, dentales, intratumorales, intracardíacos, intraarticulares, intravenosos, intracavernosos, intraóseos, intraperitoneales, intraabdominales, intrafasciales, intraórganos e intravítreos.

Como se usa en la presente invención, las inyecciones se pueden hacer en cavidades/huecos creados quirúrgicamente, en cavidades/huecos resultantes de enfermedades y en cavidades/huecos resultantes de lesiones.

Como se usa en la presente invención, "cultivo celular" tiene su significado estándar e incluye la transferencia de células, tejidos u órganos desde un animal o planta y su posterior colocación en un entorno propicio para su supervivencia y/o proliferación.

En algunas realizaciones, la composición inyectable de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG puede incluir células. Ejemplos de células útiles en las composiciones de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG descritas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos, queratinocitos, neuronas, células gliales, astrocitos, células de Schwann, ganglios de la raíz dorsal, adipocitos, células endoteliales, células epiteliales, condrocitos, fibrocondrocitos, miocitos, cardiomiocitos, mioblastos, hepatocitos, tenocitos, células epiteliales intestinales, células de músculo liso, células del estroma, neutrófilos, células de la médula ósea, plaquetas y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, las células son eucariotas o de mamífero. En algunas realizaciones, las células son de origen humano. En algunas realizaciones, las células pueden ser autólogas o alogénicas.

En algunas realizaciones, la composición inyectable de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG puede incluir células madre adultas, células madre embrionarias, células madre amnióticas, células madre pluripotentes inducidas, células madre fetales, células madre tisulares, células madre derivadas de tejido adiposo, células madre de médula ósea, células madre de sangre de cordón umbilical humano, células progenitoras de sangre, células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre epidérmicas, células progenitoras endoteliales, células madre epiteliales, células madre del epiblasto, células madre cardíacas, células madre pancreáticas, células madre neurales, células madre limbares, células madre perinatales, células satélite, células de población secundaria, células madre multipotentes, células madre unipotentes y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, las células madre son de mamífero. En algunas realizaciones, las células madre son de origen humano. En algunas realizaciones, las células madre pueden ser autólogas o alogénicas.

En algunas realizaciones, las composiciones inyectables de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG descritas en la presente invención se pueden usar como una matriz de soporte para administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de entre 10.000 células y aproximadamente 1.000 millones de células.

En algunas realizaciones, se pueden incorporar productos derivados de tejido placentario a la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG para su inyección en un huésped mamífero. Los tejidos placentarios son una fuente de colágeno, elastina, fibronectina y factores del crecimiento, incluidos el factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), el factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), el factor del crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), el factor del crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés) y el beta-factor del crecimiento de transformación (TGF-p, por sus siglas en inglés), que pueden apoyar en la reparación y regeneración de tejidos. En particular, el tejido amniótico tiene propiedades antiadherentes y antimicrobianas, y se ha demostrado que dicho tejido apoya la reparación del tejido blando, reduce la inflamación y minimiza la formación de tejido cicatricial, que son beneficios significativos en el tratamiento de las lesiones del tejido blando.

Los tejidos amnióticos se ha descrito como agentes inmune-privilegiados en el sentido de que rara vez se produce una respuesta inmunitaria en el cuerpo humano en respuesta a la introducción de tejido amniótico. En algunas realizaciones, se puede añadir un aloinjerto de tejido fluido y fragmentado derivado de tejidos amnióticos, disponible de BioD, LLC, comercializado como BioDRestore™ Elemental Tissue Matrix, a la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG para un revestimiento o inyección en tejido blando, o colocación alrededor un sustituto de tejido. Por ejemplo, las composiciones de partículas de microgel de fibrinógeno conjugado con PEG pueden incluir un aloinjerto de tejido fluido y fragmentado derivado de tejidos amnióticos.

En algunas realizaciones, la composición de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG puede incluir factores del crecimiento. Ejemplos de factores del crecimiento útiles incluyen, pero no se limitan a, factor del crecimiento epidérmico (EGF), beta-factor del crecimiento transformante (TGF-p), factor del crecimiento de fibroblastos (FGF), factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en inglés), factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor del crecimiento del tejido conectivo (CTGF, por sus siglas en inglés), factor del crecimiento similar a la insulina (IGF, por sus siglas en inglés), factor del crecimiento de queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés), familia de interleucinas (IL, por sus siglas en inglés), factor derivado de células estromales ( SDF, por sus siglas en inglés), factor del crecimiento de unión a heparina (HBGF, por sus siglas en inglés), factor del crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés), factor de diferenciación del crecimiento (GDF, por sus siglas en inglés), factor morfogénico muscular (MMF, por sus siglas en inglés) y alfa-factor de necrosis tumoral (TNFa, por sus siglas en inglés).

En algunas realizaciones, la composición multicomponente de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG se puede usar como relleno inyectable de huecos de tejido blando y también puede incluir cualquier otro componente adecuado para aumentar, fortalecer, soportar, reparar, reconstruir, curar, ocluir o rellenar un tejido blando.

Las propiedades de flujo de las composiciones de partículas hidratadas de microgel se pueden determinar mediante reometría, en donde el módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G") de materiales biológicamente débiles (blandos), tales como tejidos oculares (vítreo) y grasa, son sustancialmente más bajos que los valores relacionados para materiales fuertes, tales como músculos, tendones y cartílagos. En este sentido, los valores de G' varían de 1 Pa a 1 MPa y los valores de G" varían de 0,1 Pa a 1 MPa, que incluyen las propiedades de la composición particular de partículas hidratadas de microgel (por ejemplo, partículas individuales de microgel y grupos de partículas de microgel, ya sean solas o con componentes líquidos o sólidos libres). En algunas realizaciones, el módulo de almacenamiento para las composiciones de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG descritas en la presente invención varía de 10 Pa a 250.000 Pa, de 50 Pa a 175.000 Pa y de 100 Pa a 100.000 Pa. En algunas realizaciones, el módulo de pérdida varía de 5 Pa a 100.000 Pa, de 7,5 Pa a 50 Pa, y de 10 Pa a 10.000 Pa. Las partículas de microgel reticuladas, hidratadas y conjugadas con PEG muestran pseudoplasticidad bajo cizallamiento, disminuyendo la viscosidad al aumentar la velocidad de cizallamiento. Este fenómeno pseudoplástico se basa en las propias partículas hidratadas insolubles en agua y no en el medio fluido que contiene las macromoléculas solubles. Además, el comportamiento reológico de las composiciones de partículas de microgel, incluidas las partículas de microgel individuales y agrupadas, descritas en la presente invención, está sorprendentemente relacionado con su comportamiento similar al de un sólido, en lugar de ser más similar al de un fluido, como lo demuestran valores de tangente de pérdida (G"/G') menores de 1.

También se describen usos de las composiciones descritas en la presente invención para tratar una lesión o daño de tejido blando. Se puede usar cualquiera de las composiciones descritas en la presente invención. En particular, las composiciones se pueden usar para inyección en tejidos blandos. La inyección puede ser intradérmica, subcutánea, oral, intramuscular, submucosa, intranasal, vaginal, bucal, intratecal, epidural, intraparenquimatosa, ocular, subretiniana, dental, intratumoral, intracardíaca, intraarticular, intravenosa, intracavernosa, intraósea, intraperitoneal, intra- abdominal, intrafascial, intraórganos e intravítrea. En algunas realizaciones, las partículas de microgel insolubles en agua de las composiciones descritas en la presente invención están en forma de un polvo seco, y el uso y/o el método comprende además hidratar dicho polvo seco antes de dicha etapa de inyección. En tales realizaciones, después de la inyección, la composición promueve la angiogénesis.

Parte experimental

En la sección Experimental se usan los siguientes materiales y abreviaturas:

ADSC: Células madre derivadas de tejido adiposo, células primarias de abdominoplastia humana.

AHF: Factor antihemofílico crioprecipitado, South Texas Blood & Tissue Center, Lote W1409114 212930.

BSA: Albúmina de suero bovino, bioWORLD, 22070004-1, Lote V11121401.

Cloruro de Calcio: Sigma C4901, Lote 110M0105V.

Carbopol: Lubrizol, Carbopol® Aqua SF-2, Lote 0101014502.

Colágeno de Tipo I: Corning Incorporated, producto 354236, tendón de cola de rata, Lote 3298599.

ECM: Matriz extracelular, sarcoma de murino de Engelbreth-Holm-Swarm, Sigma E1270, Lote 093M4006V.

Goma Gellan: CP Kelco, Kelcogel CO-LA, Lote 1E0566A.

Goma Guar: Making Cosmetic, Lote 1092118.

Fibrinógeno Humano (FGN): Sigma F3879, lotes 061M7010, 071M7032V, SLBH0223V, SLBK3747V.

Trombina Humana: Sigma T7009, lotes 041M7007V, 011M7009V, SLBB4394V.

Hidroxietilcelulosa, catiónica: Dow Chemical Company, UCare™ Polymer JR-30M, Lote XL2850GRXA.

Hidroxipropilmetilcelulosa: Amerchol Methocel K15M, Lote WF15012N01.

Amnios fragmentado: BioD, LLC, BioDRestore™, ID del tejido R0925131.

NaOH: hidróxido de sodio, Puritan Products 7705, Lote 011043.

Aguja: 18 G. BD 305195, Lote 2089215.

PBS: disolución salina tamponada de fosfato: pH 7,8-8,0 (sin calcio ni magnesio), INCELL ZSOL: F, Lotes A2014SEP10-01, Z2015JAN05-01; o Sigma-Aldrich D8537, Lotes RNBB9451, RNBC1143, RNBC8400.

PHMB: Clorhidrato de poli(hexametilen biguanida): Arch Chemicals, Cosmocil CQ™, Lotes 9PL211280, 137261 o Lotioncrafter Biguanide 20, Lote 14RC169159-6380.

Diacrilato de poli(etilenglicol): MW 575, Sigma-Aldrich 437441, Lote MKBN7800V.

Poli(alcohol vinílico): DuPont, Elvanol®, Lote 910113.

PSG-(PEO)4: Pentaeritritol tetra(succinimidiloxiglutaril) polioxietileno, 4 brazos (tetrafuncional), NOF America Corporation, Sunbright® PTE-050GS (PM 5.000), Lote M8N526; PTE-100GS (PM 10.000), Lote M9D105; y PTE200-GS (PM 20.000), Lote M119691.

Pululano: Hayashibara, Lote 1G3021.

SG-PEG-SG (PEG): NOF America Corporation, a-succinimidiloxiglutaril-w-succinimidiloxiglutariloxipolioxietileno, (difuncional), No F America Corporation; Sunbright® DE-034GS (PM 3.400), Lote M83541; DE-100GS (PM 10.000), Lote M107543; DE-200GS (PM 20.000), Lote M115700.

SG-PEG: a-succinimidiloxiglutaril-w-metoxipolioxietileno, (monofuncional), NOF America Corporation, Sunbright® ME-050GS (PM 5.000), Lote M10N587.

Goma Xantana: Bobs Red Mill, Lote 143454.

Protocolos para la formación del hidrogel inicial:

Ejemplo 1: Poli(etilenglicol)-Fibrinógeno humano (PEG-FGN)

La preparación de diversas relaciones molares de fibrinógeno conjugado con PEG (PEG-fibrinógeno, PEG-FGN) se ilustra mediante la preparación de PEG-FGN de 20:1 molar. Se disolvió fibrinógeno (FGN, PM 340 kDa) a 80 mg/ml en PBS estéril de pH 7,8-8,0 (sin calcio ni magnesio). El fibrinógeno se disolvió a temperatura ambiente o a 37°C. Se disolvió SG-PEG-SG (PM 3,4 kDa) a 16 mg/ml en PBS estéril de pH 7,8-8,0 (sin calcio ni magnesio) a temperatura ambiente (~22°C). Todos los lotes de fibrinógeno analizados se comportaron de manera similar. La disolución de PEG reactivo de tipo difuncional de SG-PEG-SG se esterilizó por filtración con un filtro de 0,20-0,22 gm. A continuación, se mezcló el SG-PEG-SG con el FGN a una relación de 1:1 v/v (equivolumen). La gelificación ocurrió dentro de 5-30 minutos a temperatura ambiente o a 37°C.

También se preparó PEG-FGN a relaciones molares de 10:1, 35:1 o 50:1. Se ha determinado que los niveles más bajos de conjugación con PEG dan como resultado una mayor concentración de la incorporación del fibrinógeno (más agente bioactivo en la matriz del soporte), aumenta la facilidad de fabricación (más PEG retiene más agua, dificultando la liofilización y haciendo muy difícil la molienda en partículas pequeñas), y una adhesión y proliferación preferenciales in vitro de las células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) en el soporte de PEG-FGn 20:1 en comparación con los soportes de PEG-FGN 35:1 y 50:1.

También se preparó PEG-FGN a una relación molar de 20:1 usando los siguientes agentes de conjugación con PEG: Diacrilato de PEG (difuncional);

SG-PEG-SG, Sunbright DE-034GS (PM 3.400), DE-100GS (PM 10.000), DE-200GS (PM 20.000) (difuncional); SG-PEG: Sunbright^®ME-050GS (PM 5.000) (monofuncional);

PSG-(PEO)⁴, PTE-050GS (PM 5.000), Sunbright PTE-100GS (PM 10.000), PTE200-GS (PM 20.000) (tetrafuncional);

dónde

DE: NHS-OCO(CH²)³COO-PEG-CO(CH²)³COO-NHS;

ME: PEG-CO(CH²)³COO-NHS;

PTE: PEG-(CO(CH²)³COO-NHS)⁴; y

NHS: N-hidroxisuccinimida.

El aumento del peso molecular del agente de conjugación a base de PEG produjo un gel más firme. El PEG de tipo difuncional produjo geles rígidos, en comparación con el PEG monofuncional, que produjo un fluido. El aumento de la funcionalidad del PEG produjo geles más rígidos en las mismas relaciones molares. El diacrilato de PEG no formó un gel en las condiciones de reacción estudiadas.

Ejemplo 2: PEG-FGN-PHMB

Se prepararon hidrogeles de PEG-FGN (20:1 molar) con la adición de PHMB presente en cantidades que variaban de 0 a 1.000 ppm. La preparación de los compuestos de PEG-FGN-PHMB se ilustra mediante la incorporación de 100 ppm de PHMB (concentración donde el microgel se rehidrata a 50 mg/ml), preparándose las otras concentraciones de PHMB de forma análoga.

Se diluyó PHMB en PBS estéril de pH 7,8-8,0 sin calcio ni magnesio. La cantidad calculada de la disolución de PHMB a añadir se basó en PHMB al 0,01 % p/p en el polvo rehidratado final (el producto en polvo se rehidrata a 50 mg/ml). Esto requiere la incorporación en el hidrogel inicial de 48 gl de disolución de PHMB por 100 ml de volumen total de gel. Para un lote de 100 ml, se añadieron 0,048 ml (48 gl) de PHMB (Cosmocil CQ) a 50 ml de disolución salina tamponada de fosfato. El agente de conjugación a base de PEG se disolvió a 16 mg/ml en esta disolución diluida de PHMB. La formación del gel se inició mediante la adición de 50 ml de disolución de fibrinógeno a 80 mg/ml.

Ejemplo 3: PEG-FGN-Polímeros

Se prepararon hidrogeles de PEG-FGN-polímero soluble en agua (relación molar de PEG a FGN, 20:1) con la incorporación de los siguientes polímeros solubles en agua: Carbopol a 27,6 mg/ml, pululano a 27,6 mg/ml, goma guar a 20,7 mg/ml, hidroxietilcelulosa a 3,4 mg/ml y Colágeno de Tipo I a 1,4 mg/ml. El Carbopol es un polímero sintético reticulado basado en ácido acrílico; el pululano y la goma guar son polisacáridos naturales; la hidroxietilcelulosa es un polisacárido modificado; y el Colágeno de Tipo I es una proteína y el colágeno más abundante del cuerpo humano. Los polímeros solubles en agua se añadieron antes de la conjugación con el PEG.

Ejemplo 4: PEG-fibrina

Se prepararon geles de PEG-fibrina a relaciones molares de 10:1 a 50:1. Al aumentar la conjugación con PEG más de allá de una relación molar de 20:1 se obstaculizó la actividad de la trombina y la formación de geles de fibrina, y se necesitaron tiempos de reacción más largos. Se añadió trombina al PEG-fibrinógeno para la reticulación del fibrinógeno con concentraciones de trombina de 2,5-12,5 U/ml de gel.

La preparación de los geles de PEG-fibrina se ilustra para la PEG-fibrina de relación molar 10:1 con 2,5 U/ml de trombina. Se disolvió el fibrinógeno (PM 340 kDa) a 80 mg/ml en una disolución estéril salina tamponada de fosfato de pH 7,8-8,0 (sin calcio ni magnesio). Se disolvió el SG-PEG-SG (PM 3,4 kDa) a 8 mg/ml en PBS estéril de pH 7,8 8,0 (sin calcio ni magnesio) a temperatura ambiente. La disolución del PEG reactivo se esterilizó por filtración con un filtro de 0,20-0,22 gm. Se mezcló el PEG con el FGN a una relación 1:1 v/v (equivolumen) y se hizo reaccionar durante 5 min (disolución de fibrinógeno conjugado con PEG). Se diluyó la trombina (100 U/ml en agua desionizada) a 5 U/ml en cloruro cálcico 40 mM. Los geles de PEG-fibrina se formaron mezclando 1 parte de la disolución de fibrinógeno conjugado con PEG con 1 parte de PBS y 2 partes de trombina de 5 U/ml en cloruro de calcio. La gelificación se produjo en 5 minutos a temperatura ambiente o a 37°C.

También se preparó PEG-fibrina a relaciones molares de 10:1, 35:1 o 50:1 con concentraciones de trombina de 2,5 12,5 U/ml de gel según el procedimiento anterior. Anteriormente, se han reportado hidrogeles monolíticos de PEG-fibrina a relaciones molares de PEG a fibrinógeno, convertidos en fibrina a través de la trombina, de 1:1, 2,5:1, 5:1, 7,5:1, 10:1, 15:1,20:1, 100:1 (Zhang et al., Tissue Engineering, 12(1), 9-19, 2.006).

Ejemplo 5: PEG-Fibrina-Polímeros

Se prepararon hidrogeles de fibrina conjugada con PEG (10:1) con los siguientes polímeros solubles en agua incorporados a 2 mg/ml: goma xantana, goma gellan, goma guar, hidroxietilcelulosa catiónica, hidroxipropilmetilcelulosa y poli(alcohol vinílico). La goma xantana, la goma gellan y la goma guar son polisacáridos naturales, la hidroxietilcelulosa catiónica y la hidroxipropilmetilcelulosa son polisacáridos modificados y el poli(alcohol vinílico) es un polímero sintético a base de vinilo.

También se prepararon hidrogeles de fibrina conjugada con PEG (10:1) con los siguientes polímeros incorporados: Carbopol a 20 mg/ml, pululano a 20 mg/ml, goma guar a 15 mg/ml, hidroxietilcelulosa a 2,5 mg/ml y Colágeno de Tipo I a 1 mg/ml.

Los hidrogeles de PEG-Fibrina-polímeros se prepararon como sigue: el fibrinógeno se conjugó con PEG mezclando el agente de conjugación a base de PEG y el fibrinógeno a una relación molar de 10:1. Después de la conjugación con PEG durante 5 minutos, se añadió el polímero soluble en agua a la disolución y luego se añadió la trombina para iniciar la reticulación.

Ejemplo 6: PEG-Proteínas

Las siguientes proteínas se conjugaron con PEG a una relación molar de 20:1: fibrinógeno, albúmina de suero bovino, Colágeno de Tipo I, Factor Antihemofílico Crioprecipitado (AHF, por sus siglas en inglés) y matriz extracelular usando un procedimiento análogo al del Ejemplo 1. La Conjugación con PEG indujo a la formación de gel cuando se aumentó el pH a >7,0 con NaOH 1 M. Para las aplicaciones in vivo y la estabilidad de las proteínas, se pueden emplear intervalos de pH de 6,6 a 8,0. Los geles conjugados con PEG hidratados se convirtieron en partículas de microgel mediante agitación mecánica rápida. La pseudoplasticidad de las partículas de microgel resultantes se demostró cargando las partículas de microgel hidratadas en una jeringa e inyectando los microgeles con PBS a través de una aguja de calibre 18, en donde se formó un grupo de microgeles a medida que se eliminaba el cizallamiento.

Alternativamente, las siguientes proteínas se conjugaron con PEG a una relación molar de 20:1: albúmina de suero bovino, Colágeno de Tipo I y matriz extracelular. Los hidrogeles se secaron, rehidrataron y mezclaron mecánicamente para formar microgeles. La pseudoplasticidad de los microgeles se demostró cargando las partículas de microgel hidratadas resultantes en una jeringa e inyectando las partículas de microgel con PBS a través de una aguja de calibre 18, en donde se formó un grupo de microgeles a medida que se eliminaba el cizallamiento.

Protocolos para la formación de partículas de microgel

Los hidrogeles a base de fibrinógeno y fibrina conjugados con PEG se liofilizaron de 24 a 96 horas. A continuación, los geles liofilizados se molieron usando un mortero y maja o un 6870 CryoMill de Spex SamplePrep (Metuchen, Nueva Jersey). El polvo seco de microgel se podría tamizar a tamaños de partículas (<250 pm, <150 pm, <106 pm o <75 pm) usando tamices de prueba de acero inoxidable de Tyler o Retsch. El polvo de microgel seco se rehidrató con PBS (con y sin calcio y magnesio), disolución salina normal (cloruro de sodio al 0,9 %), agua desionizada, medio de cultivo celular (con y sin células) o amnios triturado.

En la Figura 1 se muestra el proceso para la preparación de microgel usando una fibrina conjugada con PEG reticulada con un contenido molar de PEG:fibrina de 10:1, en donde el gel monolítico inicial (PEG-fibrina gelificada) se liofiliza (PEG-fibrina liofilizada), seguido de pulverización hasta obtener un polvo mediante criomolienda (PEG-fibrina molida), y rehidratación a partículas de microgel (PEG-fibrina rehidratada). Todos los polvos de microgel se prepararon mediante este procedimiento.

Comportamiento de hinchamiento de los microgeles de PEG-fibrinógeno y de PEG-fibrina

En la Tabla 1 se presenta el comportamiento de hinchamiento de las partículas de microgel de PEG-FGN 20:1 y de PEG-fibrina 10:1. El hinchamiento se determina sobre la base de la absorción de agua de una partícula de microgel seca, es decir, peso de microgel hidratado/peso de microgel seco. En comparación con las formulaciones de PEG-FGN y PEG-fibrina 50:1, la formulación de fibrinógeno es más hidrófila que la formulación de fibrina. Esto quizás esté relacionado con la reticulación adicional en PEG-fibrina debido a la conversión de fibrinógeno en fibrina por la trombina.

Cuando se incorporaron los polímeros solubles en agua en las partículas de microgel de PEG-fibrina 10:1 y de microgel de PEG-fibrinógeno 20:1, aumentó la absorción de agua. La incorporación de estos polímeros hidrófilos solubles en agua aumentó la hidrofilia de la red de partículas del microgel, aumentando el grado de hinchamiento. Los polímeros hidrófilos examinados incluyen PHMB, Carbopol, pululano, goma guar, hidroxietilcelulosa (HEC, por sus siglas en inglés) y Colágeno de Tipo I. Los geles de PEG-fibrina contenían Carbopol a 20 mg/ml, pululano a 20 mg/ml, goma guar a 15 mg/ml, hidroxietilcelulosa a 2,5 mg/ml y Colágeno de Tipo I a 1 mg/ml. Se prepararon geles de PEG-FGN con Carbopol a 27,6 mg/ml, pululano a 27,6 mg/ml, goma guar a 20,7 mg/ml, hidroxietilcelulosa a 3,4 mg/ml y Colágeno de Tipo I a 1,4 mg/ml.

Tabla 1. Hinchamiento y % de hidratación del microgel de PEG-fibrina y de PEG-fibrinógeno

Comportamiento reológico

Se determinó que las partículas de microgel hidratadas se adelgazan por cizallamiento. Esta propiedad inesperada las hace particularmente útiles para facilitar la inyección fluida o la colocación en un sitio específico, y permite que la composición de las partículas de microgel actúe como un sólido viscoelástico inmediatamente después de la inyección para mantener la forma y ajustarse al tejido circundante nativo. Para determinar el comportamiento pseudoplástico y las propiedades viscoelásticas de las composiciones de partículas de microgel Se usó un reómetro (MCR 101 de Anton-Paar, o MCR 302 de Anton-Paar, Ashland, Va.). Al usar partículas rehidratadas de microgel de PEG-fibrinógeno de relación molar 20:1 y partículas rehidratadas microgel de PEG-fibrina de relación molar 10:1 como ejemplos realizados por criomolienda (o mortero y maja), la viscosidad frente a la velocidad de cizallamiento que se muestra en la Figura 2 demuestra que las composiciones de partículas de microgel de proteína conjugada con PEG reticulada se adelgazan rápidamente, como lo ilustran los valores absolutos de las pendientes de estos gráficos, en donde la pendiente de PEG-fibrinógeno es -0,90 y la de PEG-fibrina es -0,98, donde una pendiente de aproximadamente -1 indica un material de adelgazamiento por cizallamiento perfecto.

Por ejemplo, para el PEG-fibrinógeno 20:1, las propiedades mecánicas se recuperan completamente sin pérdida de viscoelasticidad después de una exposición repetida a una deformación del 1 % (Figura 3).

Además, las composiciones hidratadas de partículas de microgel de PEG-fibrinógeno y de PEG-fibrina actúan como sólidos viscoelásticos con un módulo de almacenamiento mayor que los módulos de pérdida (Figura 4, G' > G", o tangente de pérdida <1) (Tabla 2).

Tabla 2. Tangentes de pérdida para PEG-fibrina 10:1, PEG-fibrinógeno, y PEG-FGN-PHMB a una frecuencia de 11/s

En la Figura 5 se muestra el comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento de un microgel de PEG-fibrinógeno 50:1 molido con mortero y maja y mediante criomolienda para una gráfica de la viscosidad frente a la velocidad de cizallamiento. Las partículas secas de microgel obtenidas mediante mortero y maja eran más planas y en forma de escamas, mientras que las partículas secas obtenidas mediante criomolienda eran más esféricas. Los microgeles se rehidrataron a 300 mg/ml en disolución salina tamponada de fosfato. Las pendientes de las gráficas son -0,86 para mortero y maja y -0,84 para criomolienda. Las partículas criomolidas eran algo más viscosas, presumiblemente debido a la una reducida distribución del tamaño de partícula y a un reducido tamaño promedio de partícula.

Células madre derivadas de tejido adiposo humano

Se aislaron células madre derivadas de tejido adiposo humano (ADSC) de la grasa abdominal humana y se subcultivaron en el medio MesenPRO RS™ (Life Technologies) con suplemento de crecimiento y penicilinaestreptomicina al 1 %. Las muestras en polvo de PEG-FGN y PEG-fibrina a 10:1,20:1 y 50:1, (15 mg) se combinaron con 400 gl de 2,5 x 105 células/ml de suspensión en insertos de cultivo celular (tamaño de la membrana de PET transparente = 8,0 gm, BD Biosciences) en una placa de 12 pocillos (n = 3). Se añadieron otros 600 gl de medio al inserto y otro 1 ml en el exterior, lo que dio como resultado un volumen total promedio de 2 ml. El medio de cultivo se intercambió diariamente y el crecimiento celular se examinó usando el Ensayo de Proliferación Celular (MTS) en una Disolución Acuosa CellTiter 96® (Promega) según el protocolo del fabricante. Posteriormente, las células se tiñeron con colorante para células vivas Calcein AM (4 mM) durante 45 minutos y se fijaron con formalina al 10 %. La imagen macroscópica y fluorescente de cada muestra se adquirió usando una cámara digital y microscopía confocal, respectivamente.

La Figura 6 muestra que las células madre aumentaron significativamente en número en los microgeles desde el día 1 hasta el día 4. Las células continuaron proliferando en las formulaciones 20:1 y 50:1 desde el día 4 hasta el día 7. La tinción de las células vivas presentada en la Figura 7 muestra que las ADSC son viables en todas las composiciones de partículas de microgel ensayadas. Las células parecen estar formando redes en los microgeles de PEG-fibrinógeno 20:1 y de PEG-fibrinógeno 50:1.

Por tanto, un uso significativo de las composiciones de partículas de microgel es su capacidad para conformarse de nuevo en un grupo de partículas de microgel después de la inyección o del movimiento por fluido. En la Figura 8 se muestran microgeles de fibrinógeno conjugado con PEG 20:1 inyectados subcutáneamente ex vivo en ratas, en donde las partículas de microgel formaron un sólido cohesivo y mantuvieron su forma en el sitio de inyección.

Propiedades antimicrobianas

Para conferir propiedades antimicrobianas a las composiciones de partículas de microgel conjugadas con PEG, se incorporó PHMB en la reacción de conjugación del PEG con el fibrinógeno. La Figura 9 muestra la pseudoplasticidad del complejo ternario de PEG-FGN-PHlVIB 20:1 a 1.000 ppm de PHMB, en comparación con PEG-FGN 20:1. Los valores de las pendientes son -1,01 para PEG-FGN y -1,06 para PEG-FGN-PHMB, con pendientes de aproximadamente -1 lo que indica materiales perfectamente capaces de ser adelgazados por cizallamiento.

La Figura 10 muestra un gráfico del módulo frente a frecuencia para los módulos de almacenamiento y de pérdida de los geles de PEG-FGN 20:1 sin y con PHMB. La tangente de pérdida para el gel de PEG-FGN fue de 0,25 mientras que la del gel de PEG-FGN-PHMb fue de 0,21 a una frecuencia angular de 1 s-1. El datos del módulo ilustra que la adición del PHMB aumentó el comportamiento de tipo sólido del complejo PEG-FGN-PHMB en comparación con el del PEG-FGN, lo que indica que el PHMB se incorporó covalentemente en la reacción de conjugación con PEG.

La unión covalente del PHMB en el complejo de fibrinógeno conjugado con PEG, formando un complejo ternario PEG-FGN-PHMB unido covalentemente, está respaldada en un estudio antimicrobiano de la actividad biocida en un estudio de zona de inhibición (ZOI, por sus siglas en inglés) del PHMB que se incluyó en la conjugación con el PEG del fibrinógeno (PHMB unido covalentemente) y del PHMB que se añadió posteriormente a la formación de PEG-fibrinógeno (PHMB no unido) frente al Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA, ATCC #700787). El ZOI para el material compuesto de PEG-fibrinógeno con PHMB no unido fue <1,0 mm, mientras que el material compuesto ternario con el PHMB unido covalentemente no tuvo una ZOI medible, con inhibición solo bajo el polvo del microgel. Se espera que el PHMB catiónico no unido tenga una ZOI significativamente mayor debido a la movilidad del PHMB libre, que puede estar unido iónicamente, no unido covalentemente, a sitios aniónicos en el fibrinógeno, mientras que el PHMB unido covalentemente requiere que el microorganismo esté en contacto directo con la partícula de microgel.

Inyección subcutánea in vivo

Se evaluó el PEG-FGN (20:1 molar) solo y en combinación con células madre autólogas (ADSC de rata) o amnios triturado de BioDRestore™. Los microgeles esterilizados con óxido de etileno en la región subcutánea dorsal de la rata se inyectaron con una aguja de calibre 21. Se evaluaron cinco grupos de prueba por duplicado: ADSC de rata, BioDRestore™, PEG-FGN, PeG-FGN con ADSC de rata y PEG-FGN con BioDRestore™. Los resultados indican que los microgeles se inyectaron fácilmente, formaron un sólido cohesivo y permanecieron en el lugar de la inyección en los días 7 y 14.

Se usó hematoxilina y eosina (H&E) para teñir las secciones de tejido fijadas en los días 7 y 14 para visualizar las células, el colágeno y la remodelación del tejido. La tinción con H&E mostró una respuesta inflamatoria mínima con la remodelación de los microgeles de la célula huésped. La remodelación de los microgeles fue aún más evidente en el día 14, especialmente en combinación con ADSC o BioDRestore™.

La tinción de actina de músculo liso (SMA), un indicador de pericitos, mostró infiltración de vasos sanguíneos en microgeles en los días 7 y 14. La formación de vasos sanguíneos se mejoró mediante la incorporación de ADSC alogénico o producto de amnios triturado (BioD) en el sistema del microgel. La Figura 11 demuestra infiltración de vasos sanguíneos en el centro de los microgeles. Con los sistemas de hidrogel monolíticos, si se produce angiogénesis, rara vez llega al centro del hidrogel.

Además, se mejoró la viabilidad celular mediante la inyección con el sistema de partículas de microgel, que parece proteger a las células del esfuerzo de cizallamiento. Las composiciones inyectadas de microgel PEG-FGN con ADSC de rata marcado con CM-dil (2,0 x 105 células/ml) se retuvieron en el lugar de la inyección en los días 7 y 14. La Figura 12 demuestra la viabilidad de las células madre en los microgeles después de 7 y 14 días in vivo. La tinción nuclear con DAPI y la tinción con SMA para la angiogénesis mostraron que las células de los microgeles estaban conectadas, extendidas, viables y con angiogénesis promovida, incluso después de 14 días in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Una composición que comprende:

partículas de microgel insolubles en agua que son pseudoplásticas cuando se hidratan, en donde las partículas de microgel comprenden proteínas conjugadas con PEG reticuladas y/o macromoléculas biológicas a base de proteínas conjugadas con PEG reticuladas,

en donde, cuando se hidrata, un grupo de partículas de microgel disminuye en viscosidad con el cizallamiento aplicado y se conforman de nuevo en un grupo de microgel en ausencia de cizallamiento,

en donde, cuando están hidratadas, dichas partículas de microgel hidratadas tienen propiedades sólidas viscoelásticas, un módulo de almacenamiento mayor que el módulo de pérdida y un valor de tangente de pérdida menor de 1, en donde dichas partículas de microgel tienen una forma seleccionada del grupo que consiste en elíptica, angular o irregular,

en donde dichas proteínas y macromoléculas biológicas a base de proteínas se seleccionan del grupo que consiste en matrices extracelulares, glicoproteínas, proteínas estructurales, proteínas fibrosas, enzimas, proteoglicanos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, proteínas globulares, proteínas de membrana, proteínas plasmáticas, péptidos, oligopéptidos, péptidos antimicrobianos, hormonas peptídicas, chaperonas, metaloproteínas, hemoproteínas, proteínas de coagulación, proteínas del sistema inmunológico, proteínas del canal iónico, proteínas de adhesión celular, neuropéptidos, nucleoproteínas, escleroproteínas, cromoproteínas, proteínas conjugadas, complejos proteína-proteína, complejos proteína-polisacárido, complejos proteína-lípido, proteínas motoras, mucoproteínas, fosfoproteínas, proteínas contráctiles, proteínas de transporte, proteínas de señalización, proteínas reguladoras, proteínas de factores del crecimiento, proteínas sensoriales, proteínas de defensa, proteínas de almacenamiento, proteínas receptoras, anticuerpos, proteínas recombinantes, fibrinógeno, fibrina, trombina, colágeno, elastina, albúmina, gelatina, queratina, laminina y combinaciones de los mismos, en donde dicho agente de reticulación de proteína conjugada con PEG se selecciona del grupo que consiste en a-succinimidiloxiglutarilw-succinimidiloxiglutariloxipolioxietileno (SG-PEG-SG), a-aminopropil-w-aminopropoxipolioxietileno, aaminopropil-w-carboxipentiloxipolioxietileno, a,w-bis{2-[(3-carboxi-1 -oxopropil)amino]etil} polietilenglicol, a-[3-(3-maleimido-1 -oxopropil) amino]propil-w-[3-(3-maleimido-1 -oxopropil)amino] propoxipolioxietileno, pentaeritritol tetra(aminopropil) polioxietileno, a-[3-(3-maleimido-1-oxopropil) amino]propil-w-(succinimidiloxicarboxi) polioxietileno, pentaeritritol tetra(succinimietilidilo) polioxietileno, pentaeritritol tetra(mercaptoetil) polioxietileno, hexaglicerol octa (succinimidiloxiglutaril) polioxietileno, hexaglicerol octa(4-nitrofenoxicarbonil) polioxietileno, poli(etilenglicol) tetraacrilato de 4 brazos, succinimidiloxiglutaril) polioxietileno de 4 brazos, bis(polioxietileno bis[imidazoil carbonil]), O-(3-carboxipropil)-O'-[2-(3-mercaptopropionilamino)etil] polietilenglicol, O,O'-bis[2-(N-succinimidilsuccinilamino)etil] polietilenglicol, O,O'-bis(2-azidoetil) polietilenglicol, poli(etilenglicol) diacrilato, poli(etilenglicol) diglicidil éter, poli(etilenglicol) di(pnitrofenil carbonato), poli(etilenglicol) di(vinil sulfona), poli(etilenglicol) di(propionaldehído), poli(etilenglicol) di(benzotriazolil carbonato) y combinaciones de los mismos.
2. La composición según la reivindicación 1, en donde la relación molar de agente de conjugación a base de PEG a proteína y a macromoléculas biológicas a base de proteínas es de 1:1 a 100:1.
3. La composición según la reivindicación 1, en donde las partículas de microgel tienen una forma irregular.
4. La composición según la reivindicación 1, en donde dichos valores del módulo de almacenamiento de la composición, de las partículas de microgel hidratadas e insolubles en agua, o de ambas, están entre 10 Pa y 250.000 Pa y dichos valores del módulo de pérdida están entre 5 Pa y 100.000 Pa.
5. La composición según la reivindicación 1 que comprende además un agente antibacteriano, agente antifúngico, agente antiprotozoario, agente antivírico, antibiótico, monoacilglicerol, monoalquilglicol, bis(biguanida) y sus sales, poli(hexametilen biguanida) y sus sales, monolaurato de glicerol, clorhexidina, digluconato de clorhexidina, diacetato de clorhexidina, alexidina, clorhidrato de alexidina, sales de plata, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, sulfato de gentamicina, yodo, povidona yodada, almidón yodo, sulfato de neomicina, polimixina B, bacitracina, tetraciclinas, clindamicina, gentamicina, nitrofurazona, acetato de mafenida, sulfadiazina de plata, clorhidrato de terbinafina, nitrato de miconazol, ketoconazol, clotrimazol, itraconazol, metronidazol, péptidos antimicrobianos, policuaternio-1, policuaternio-6, policuaternio-10, guar catiónico, derivados de citosano solubles en agua, sales de los mismos, y combinaciones de los mismos.
6. La composición según la reivindicación 1, que comprende además polímeros solubles en agua a una concentración de desde el 0,01% en peso al 25% en peso, en donde los polímeros solubles en agua se seleccionan del grupo que consiste en poli(etilenglicol), poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico) y copolímeros, poli(N-vinilpirrolidona) y copolímeros, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, goma guar, hidroxietilguar, hidroxipropilguar, gelatina, albúmina, hidroxipropilmetilguar, carboximetilguar, carboximetilcitosa, goma de algarrobo, carragenano, goma xantana, goma gellan, pululano, dextrano, sulfato de dextrano, gel de aloe vera, escleroglucano, esquizofilano, goma arábiga, goma de tamarindo, poli(metil vinil éter), copolímeros en bloque de óxido de etileno-óxido de propileno-óxido de etileno, hialuronato, sulfato de condroitina, queratán sulfato, dermatán sulfato, sulfato de heparano, dextrano, carbómero y sus sales, poli(ácido acrílico) y sus sales, poli(ácido metacrílico) y sus sales, poli(etileno-co-ácido acrílico), poli(vinil metil éter), sales del poli(ácido vinilfosfórico), sales del poli(ácido vinilsulfónico), poli(2-acrilamido-2-metilpropanosulfonato) de sodio, poliacrilamida(s), poli(N,N-dimetilacrilamida), poli(N-vinilacetamida), poli(N-vinilformamida), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de glicerilo), poli(N-isopropilacrilamida) y poli(N-vinilcaprolactama), los dos últimos hidratados por debajo de sus Temperaturas inferiores de disolución crítica, policuaternio-1, policuaternio 6, policuaternio-10, polímeros de ioneno, guar catiónico, polímeros de piridinio, polímeros de imidazolio, polímeros de dialildimetilamonio, poli(L-lisina), polímeros de acriloil-, metacriloil- y estiril-trimetilamonio, polímeros de acrilamido- y metacrilamido- trimetilamonio y péptidos antimicrobianos.
7. La composición según la reivindicación 1, que comprende además un componente biológico seleccionado del grupo que consiste en células; células madre; tejido amniótico triturado; tejido placentario; tejido picado, incluido tejido cutáneo picado, tejido muscular, tejido vascular, tejido nervioso, tejido graso, tejido cartilaginoso, tejido óseo, tejido tendinoso, tejido vesical, tejido intestinal, tejido cardíaco, tejido pulmonar, tejido renal, tejido hepático, tejido pancreático, y tejido de las cuerdas vocales; tejido micronizado y tejido micronizado descelularizado, incluido tejido cutáneo, tejido muscular, tejido vascular, tejido nervioso, tejido graso, tejido cartilaginoso, tejido óseo, tejido tendinoso, tejido vesical, tejido intestinal, tejido cardíaco, tejido pulmonar, tejido renal, tejido hepático, tejido pancreático, tejido de las cuerdas vocales; componentes de matriz extracelular sintéticos o de origen natural, que incluyen colágeno, glicosaminoglicanos, fibrina, laminina, fibronectina; hidroxiapatita; colágeno granulado de tendón bovino reticulado y glicosaminoglicanos; miel; polisacáridos; polímeros biodegradables, incluidos poliglicólidos, polilactidas, poli(lactidaco-glicólido), polidioxanona, policaprolactona, poli(carbonato de trimetileno), poli(fumarato de propileno), poliuretanos, poli(éster amidas), poli(ortoésteres), polianhídridos, poli(aminoácidos), polifosfacenos, poliésteres bacterianos; y combinaciones de los mismos.
8. La composición según la reivindicación 7, en donde las células madre se seleccionan del grupo que consiste en células madre adultas, células madre embrionarias, células madre amnióticas, células madre pluripotentes inducidas, células madre fetales, células madre tisulares, células madre derivadas de tejido adiposo, células madre de la médula ósea, células madre de sangre del cordón umbilical humano, células progenitoras de sangre, células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre epidérmicas, células progenitoras endoteliales, células madre epiteliales, células madre epiblasto, células madre cardíacas, células madre pancreáticas, células madre neurales, células madre limbares, células madre perinatales, células satélite, células de población secundaria, células madre multipotentes, células madre unipotentes y mezclas de las mismas.
9. La composición según la reivindicación 7, en donde las células se seleccionan del grupo que consiste en fibroblastos, queratinocitos, neuronas, células gliales, astrocitos, células de Schwann, ganglios de la raíz dorsal, adipocitos, células endoteliales, células epiteliales, condrocitos, fibrocondrocitos, miocitos, cardiomiocitos, mioblastos, hepatocitos, tenocitos, células epiteliales intestinales, células de músculo liso, células estromales, neutrófilos, linfocitos, células de médula ósea, pericitos, plaquetas y mezclas de las mismas.
10. La composición según la reivindicación 1, que comprende además agentes biológicamente activos seleccionados del grupo que consiste en antisépticos, agentes antiinfecciosos, agentes antimicrobianos, agentes esporicidas, agentes antiparasitarios, agentes de neuropatía periférica, agentes neuropáticos, agentes quimiotácticos, agentes analgésicos, agentes antiinflamatorios, agentes antialérgicos, agentes antihipertensivos, antibióticos de tipo mitomicina, agentes antifúngicos poliénicos, agentes antitranspirantes, descongestionantes, agentes anticinetósicos, agentes del sistema nervioso central, agentes curativos de heridas, agentes anti-VEGF, agentes antitumorales, agentes escaróticos, agentes antipsoriasis, agentes antidiabéticos, agentes antiartritis, agentes antipicor, agentes antipruriginosos, agentes anestésicos, agentes antimalaria, agentes dermatológicos, agentes antiarrítmicos, anticonvulsivos, agentes antieméticos, agentes antireumatoides, agentes antiandrógenos, antraciclinas, agentes antitabaco, agentes antiacné, agentes anticolinérgicos, agentes antienvejecimiento, antihistamínicos, agentes antiparasitarios, agentes hemostáticos, vasoconstrictores, vasodilatadores, agentes trombogénicos, agentes anticoagulantes, agentes cardiovasculares, agentes para la angina, agentes para la disfunción eréctil, hormonas sexuales, hormonas del crecimiento, isoflavonas, secuencia de unión a integrinas, ligandos biológicamente activos, mediadores de unión celular, inmunomoduladores, alfa-factor de necrosis tumoral, agentes anticancerígenos, agentes antineoplásicos, agentes antidepresivos, agentes antitusivos, agentes antineoplásicos, antagonistas narcóticos, agentes antihipercolesterolemia, agentes inductores de apoptosis, agentes anticonceptivos, agentes bronceadores sin sol, emolientes, ácidos alfa-hidroxilados, miel de manuka, retinoides tópicos, hormonas, anticuerpos específicos de tumores, oligonucleótidos antisentido, ARN pequeño de interferencia (ARNip), adaptámero ARN anti-VEGF, ácidos nucleicos, ADN, fragmentos de ADN, plásmidos de ADN, ARN-Si, agentes de transfección, vitaminas, aceites esenciales, liposomas, nanopartículas de plata, nanopartículas de oro, nanopartículas que contienen fármacos, nanopartículas a base de albúmina, nanopartículas que contienen quitosano, nanopartículas a base de polisacáridos, nanopartículas de dendrímero, nanopartículas de fosfolípidos, nanopartículas de óxido de hierro, nanopartículas de bismuto, nanopartículas de gadolinio, nanopartículas metálicas, nanopartículas de cerámica, nanopartículas a base de sílice, nanopartículas a base de virus, nanopartículas similares a virus, nanopartículas que contienen antibióticos, nanopartículas que contienen óxido nítrico, nanocápsulas, nanovarillas, micelas poliméricas, sales de plata, sales de zinc, nanopartículas de puntos cuánticos, micropartículas a base de polímeros, micropartículas a base de polímeros, micropartículas que contienen fármacos, microesferas que contienen fármacos, micropartículas que contienen antibióticos, microesferas que contienen antibióticos, micropartículas antimicrobianas, microesferas antimicrobianas, ácido salicílico, peróxido de benzoilo, 5-fluorouracilo, ácido nicotínico, nitroglicerina, clonidina, estradiol, testosterona, nicotina, agentes para el mareo por movimiento, escopolamina, fentanilo, diclofenaco, buprenorfina, bupivacaina, ketoprofeno, opioides, cannabinoides, enzimas, inhibidores de enzimas, oligopéptidos, ciclopéptidos, polipéptidos, proteínas, profármacos, inhibidores de proteasas, citocinas, ácido hialurónico, condroitín sulfato, dermatán sulfato, agentes parasimpaticolíticos, agentes quelantes, agentes para el crecimiento del cabello, lípidos, glicolípidos, glucoproteínas, hormonas endocrinas, hormonas del crecimiento, factores del crecimiento, factores de diferenciación, proteínas de choque térmico, modificadores de la respuesta inmunológica, sacáridos, polisacáridos, insulina y derivados de la insulina, esteroides, corticosteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroides, ya sea en su forma de sal o en su forma neutra, y combinaciones de los mismos.
11. La composición según la reivindicación 1, en donde las partículas de microgel insolubles en agua están en la forma de un polvo seco.
12. La composición según la reivindicación 1, que comprende además el medio acuoso seleccionado entre agua, disolución salina isotónica, disolución salina equilibrada, disolución tampón, disolución de Ringer, medio de cultivo celular, medio de células madre, suero, plasma sanguíneo, líquido amniótico, gelatina de Wharton, caldo nutritivo, disoluciones antisépticas o combinaciones de las mismas.
13. Un método para preparar partículas de microgel insolubles en agua, que comprende:

proporcionar un material de partida biológico que comprende una proteína, una macromolécula biológica a base de proteínas o una combinación de ambas;

hacer reaccionar dicho material de partida biológico con un agente de conjugación a base de PEG y conjugar dicho material de partida biológico con PEG mediante la reticulación de dicho material de partida biológico con dicho agente de conjugación a base de PEG para formar una conjugación con PEG de tipo difuncional a multifuncional,

moler dicho material de partida biológico conjugado con PEG en condiciones deshidratadas para producir una pluralidad de partículas de microgel, en donde dichas partículas de microgel son pseudoplásticas en disolución acuosa,

en donde una disolución de dichas partículas de microgel hidratadas disminuye en viscosidad con el cizallamiento aplicado y se conforman de nuevo en un grupo de microgel en ausencia de cizallamiento,

en donde la relación molar de agente de conjugación a base de PEG a material de partida biológico es de 1:1 a 100:1,

en donde las partículas de microgel hidratadas tienen propiedades sólidas viscoelásticas, un módulo de almacenamiento mayor que el módulo de pérdida y valores de tangente de pérdida menores de 1

y en donde dichas proteínas y macromoléculas biológicas a base de proteínas se seleccionan del grupo que consiste en matrices extracelulares, glicoproteínas, proteínas estructurales, proteínas fibrosas, enzimas, proteoglicanos, polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, proteínas globulares, proteínas de membrana, proteínas plasmáticas, péptidos, oligopéptidos, péptidos antimicrobianos, hormonas peptídicas, chaperonas, metaloproteínas, hemoproteínas, proteínas de coagulación, proteínas del sistema inmunológico, proteínas del canal iónico, proteínas de adhesión celular, neuropéptidos, nucleoproteínas, escleroproteínas, cromoproteínas, proteínas conjugadas, complejos proteína-proteína, complejos proteína-polisacárido, complejo proteína-lípido, proteínas motoras, mucoproteínas, fosfoproteínas, proteínas contráctiles, proteínas de transporte, proteínas de señalización, proteínas reguladoras, proteínas de factores del crecimiento, proteínas sensoriales, proteínas de defensa, proteínas de almacenamiento, proteínas receptoras, anticuerpos, proteínas recombinantes, fibrinógeno, fibrina, trombina, colágeno, elastina, albúmina, gelatina, queratina, laminina y combinaciones de las mismas.