KR102172222B1

KR102172222B1 - 단백질 약물 전달용 광가교 마이크로젤 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR102172222B1
Application number: KR1020180172019A
Authority: KR
Inventors: 기창석; 이기훈; 태현혁; 이소라
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-10-30
Also published as: KR20190082133A

Abstract

마이크로젤 및 베타글루칸 유도체를 포함하는 하이브리드 마이크로젤, 및 상기 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 하이브리드 마이크로젤은 약물 전달체로서 사용될 수 있다.

Description

단백질 약물 전달용 광가교 마이크로젤 및 그의 제조 방법{PHOTO-CROSSLINKED MICROGEL FOR PROTEIN DRUG DELIVERY AND FABRICATION METHOD THEREOF}

본원은, 단백질 약물 전달용 광가교 하이브리드 마이크로젤, 및 상기 광가교 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법에 관한 것이다.

마이크로젤은 마이크로 크기의 하이드로젤로, 친수성 고분자를 화학 또는 물리적으로 가교하여 네트워크 구조를 구축하여 제조된다. 일반적으로 계면활성제가 포함된 외상(outer phase)에 친수성 고분자가 포함된 내상(inner phase)을 분산시킨 후, 내상을 가교하여 마이크로젤을 제조한다. 다양한 가교 방법 중, 광가교법은 화학적 가교법의 일종으로써 가교도의 조절이 광조사 조건(파장, 광도, 시간)에 따라 매우 정밀하게 조절할 수 있기 때문에 마이크로젤의 물성 조절에 유리한 방법이다. 또한, 일반적으로 사용되는 광가교법은 다른 화학적 가교방법에 비해 독성 물질의 사용이 적기 때문에 생체재료로 사용되는 마이크로젤 제조에 더욱 적합하다.

대식세포는 식균작용뿐만 아니라 체내에서 다양한 역할을 담당한다. 또한, 여러 질병에도 관여하고 있어 대식세포를 표적으로 하는 약물전달 기술에 대한 요구가 있다. 대식세포는 외부 물질을 인식하기 위한 다양한 수용기를 지니고 있기 때문에 약물전달에 이들 수용기를 활용할 수 있다. 이와 관련하여, 베타글루칸은 균류나 식물의 세포벽을 구성하는 다당체로써 대식세포의 수용체에 효과적으로 인식되므로, 베타글루칸을 이용하여 대식세포에 특이적으로 약물을 전달하는 기술이 최근 각광 받고 있다.

그러나, 광가교에 의해 베타글루칸을 가교시키기 위해서는 광가교를 일으키는 화학 관능기를 베타글루칸에 도입하여 유도체를 제조하여야 한다. 이와 같은 기술은 다양한 고분자에 빈번하게 적용되는 공정이기는 하지만 베타글루칸에 대해서는 적용된 사례가 거의 없다.

대식세포를 표적으로 하는 베타글루칸 약물 전달체 관련 기술은, 크게 나노입자와 마이크로 입자를 활용하는 기술로 나뉜다. 나노입자의 경우, 나노입자 제조에 용이한 고분자로 나노입자를 제조한 후 나노입자를 베타글루칸으로 코팅하는 방식으로 이루어졌다. 한편, 마이크로 입자의 경우는 빵 효모균으로부터 얻어지는 베타글루칸 입자를 그대로 활용한 연구 사례가 있다. 베타글루칸 마이크로 입자는 속이 비어있는 다공성의 입자로, 직경은 2-4 μm이다. 표면의 대부분이 베타글루칸으로 이루어져 있기 때문에 내부에 약물이나 백신, 유전자를 담지하여 대식세포 표적 전달체로 개발하는 연구가 진행되었다. 하지만, 나노입자는 작은 크기 때문에 표적 조직뿐만 아니라 체내 다른 조직에도 잔류할 가능성이 있다. 그리고 베타글루칸 마이크로 입자는 내부가 비어 있기 때문에 담지를 위해 추가적인 처리를 해야 하고, 효모균으로부터 그대로 추출하기 때문에 크기나 형태, 물성 등을 조절할 수 없다는 단점이 있다.

한편, 마이크로젤은 다양한 크기와 형태로 제조할 수 있으며, 가교 밀도 등 물성을 제어할 수 있기 때문에 약물 전달체로 좋은 후보가 될 수 있다. 하지만 종래 기술에서 베타글루칸은 분자량이 크고 가공성이 좋지 않았다. 또한, 물성을 균일하게 제어하는 데에도 어려움을 겪어 베타글루칸을 이용한 마이크로젤 제조 연구는 제한적으로만 시도되었다. 따라서 일반적으로 마이크로젤 이전에 베타글루칸 기반의 하이드로젤을 제조하기 위한 연구가 진행되었다. 물리적 가교를 이용할 경우, 베타글루칸 용액의 pH나 온도를 조절하여 가역적인 하이드로젤을 제조하거나 이온 결합을 이용한 하이드로젤을 제조한 사례가 있다. 하지만 물리적 가교를 이용한 경우 pH나 온도가 생체에 적합하지 않거나 하이드로젤 제조가 외부 환경 변화에 의해 영향을 쉽게 받았다. 또한, 일반적인 화학적 가교를 이용한 경우에는 가교제의 잠재적 독성이나 가교 조건이 생체재료로 이용하기에 적합하지 않은 단점이 있었다.

따라서 아직까지 베타글루칸 기반의 하이드로젤 연구는 기초 단계에 머무르고 있다.

[선행문헌]

대한민국 공개특허 제10-2015-0089426호.

본원은, 단백질 약물 전달용 광가교 하이브리드 마이크로젤, 및 상기 광가교 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 마이크로젤; 및 베타글루칸 유도체를 포함하는, 하이브리드 마이크로젤을 제공한다.

본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법으로서, 베타글루칸을 화학적으로 개질하여 베타글루칸 유도체를 제조하고; 및 마이크로젤과 상기 베타글루칸 유도체를 혼합하여 하이브리드 마이크로젤을 수득하는 것을 포함하는, 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 베타글루칸 유도체 및 이와 상이한 고분자를 혼합하여 마이크로젤을 제조하기 때문에, 두 가지 구성 고분자의 함량을 조절함으로써 서로 다른 대식세포 종류에 대한 표적 전달 효율을 손쉽게 최적화할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 이수상유화법(aqueous two-phase separation)을 이용하여 마이크로젤을 제조하기 때문에, 균일한 크기와 물리적 성질을 가진 대식세포용 마이크로젤을 제조할 수 있으며, 그에 따라 상기 마이크로젤은 약물 전달 효율이 높다는 장점을 갖는다.

본원의 일 구현예에 따르면, 노보닌기가 고정된 베타글루칸 유도체는, 광가교에 의해 고분자 네트워크 구조를 형성하며, 그에 따라 약물 전달체 외에도 다양한 분야에 폭 넓게 활용이 가능하다.

본원의 일 구현예에 따르면, 베타글루칸을 그대로 사용하지 않고, 베타글루칸을 화학적 개질한 후 마이크로젤에 복합화하거나, 또는 베타글루칸을 저분자화하고 화학적으로 개질한 후 마이크로젤에 복합화하였기 때문에, 대식세포 표적 전달 효율이 높다는 장점을 갖는다.

본원의 일 구현예에 따르면, 하이브리드 마이크로젤의 구성성분 중, 마이크로젤의 가교 밀도 조절이 용이하며, 따라서 다양한 약물 방출에 적합하고, 방출 거동의 제어가 쉽다는 장점을 갖는다.

도 1은, 본원의 일 구현예에 있어서, 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 있어서, 베타글루칸 용액의 초음파 처리 시간에 따른 전단 점도(shear viscosity) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 본원의 일 구현예에 있어서, 관능기로서 노보닌이 도입된 베타글루칸 유도체의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 4는, 본원의 일 실시예에 있어서, 베타글루칸 유도체의 저분자화 및 화학적 개질 전 후의 ¹³C NMR 분광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 있어서, 마이크로젤의 초음파 처리 시간 및 강도에 따른 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 있어서, 광가교에 의해 제조된 마이크로젤의 현미경 사진이다(스케일 바=20 μm).
도 7은, 본원의 일 실시예에 있어서, 형광 물질이 부착된 베타글루칸 유도체와 마이크로젤의 복합화 후 유세포분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 은, 본원의 일 실시예에 있어서, 하이브리드 마이크로젤의 농도별 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 9는, 본원의 일 실시예에 있어서, LPS가 처리되지 않은 RAW264.7 세포의 PEG 하이브리드 마이크로젤 포식작용을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 10은, 본원의 일 실시예에 있어서, RAW264.7 세포의 PEG 하이브리드 마이크로젤 포식 여부를 정량적으로 나타내는 유세포분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은, 본원의 일 실시예에 있어서, 하이브리드 마이크로젤이 처리된 세포의 형광 현미경 사진이다.
도 12는, 본원의 일 실시예에 있어서, NIH3T3 세포와 RAW264.7 세포의 하이브리드 마이크로젤 포식 여부를 정량적으로 나타내는 유세포분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은, 본원의 일 실시예에 있어서, 하이브리드 마이크로젤의 BSA(bovine serum albumin) 방출 거동을 나타낸 그래프이다.
도 14는, 본원의 일 실시예에 있어서, 형광 물질로서 FAM가 부착된 BSA-담지 하이브리드 마이크로젤이 RAW264.7 세포에 포식된 모습을 나타낸 형광 현미경 사진이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.

도 1을 통해, 본원의 일 구현예에 따른 하이브리드 마이크로젤을 설명할 수 있다. 도 1 에 나타낸 바와 같이, 본원의 하이브리드 마이크로젤은 베타글루칸 유도체와 마이크로젤로부터 형성되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 마이크로젤과 상기 베타글루칸 유도체가 광가교를 통해 복합화되어 있는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로젤은 폴리에틸렌글리콜, 4-arm 폴리에틸렌글리콜-노보닌(4-arm PEG-norbornene), 8-arm 폴리에틸렌글리콜-노보닌(8-arm PEG-norbornene), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트, 히알루론산, 히알루론산 메타아크릴레이트, 히알루론산 노보닌, 젤라틴, 젤라틴 메타아크릴레이트, 젤라틴 노보닌, 실크, 실크 메타아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로젤은 광가교에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 마이크로젤 전구 용액을 마이크로튜브에 분주하고 자외선을 조사함으로써, 상기 마이크로젤이 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로젤은 이수상유화법에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 이수상분리(aqueous two-phase separation)에 의해 유화된 상기 마이크로젤 전구 용액에, 광개시제를 첨가하고 자외선을 조사함으로써 광가교하여 상기 마이크로젤이 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸 유도체는 베타글루칸이 화학적 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 다른 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸 유도체는 베타글루칸이 저분자화되고 화학적 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸 유도체는 상기 베타글루칸이 관능기를 이용하여 표면이 화학적으로 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 관능기는 노보닌기, 아크릴기, 메타아크릴기, 아릴에테르, 아세틸렌, 프로파인, 부타인, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로젤과 상기 베타글루칸 유도체는 화학적 결합에 의해 결합되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸에 관능기로서 노보닌기가 고정됨에 따라, 광조사에 의해 티올기와 당량의 노보닌기가 신속하게 반응하여 열역학적으로 안정한 공유결합을 형성하는 티올-노보닌 광클릭 반응에 의해 하이브리드 마이크로젤이 수득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 마이크로젤은 생리활성 물질을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 생리활성 물질은 항생제, 항암제, 진통제, 소염제, 항바이러스제, 항균제, 단백질, 펩타이드, 핵산, 다당, 지질, 탄수화물, 스테로이드, 세포 외 기질 물질, 세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 세포는 연골세포, 골세포, 섬유아세포, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 하이브리드 마이크로젤 표면에 상기 세포가 시딩(seeding)되어, 상기 하이브리드 마이크로젤이 스캐폴드(scaffold)로서 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 마이크로젤은 약물 전달체로 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 약물은 항암제, 호르몬, 항생제, 진통제, 항감염제, 단백질 또는 펩티드 의약, 핵산, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질은 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질 및 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 마이크로젤은 약물 전달체, 창상 피복, 경구용 제제, 조직배양용 생체재료, 또는 화장품 소재로서 활용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 하이브리드 마이크로젤의 크기는 약 0.2 μm 내지 약 10 μm 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 하이브리드 마이크로젤의 크기는 약 0.2 μm 내지 약 10 μm, 약 0.2 μm 내지 약 8 μm, 약 0.2 μm 내지 약 6 μm, 약 0.2 μm 내지 약 4 μm, 약 0.2 μm 내지 약 2 μm, 약 0.2 μm 내지 약 1 μm, 약 1 μm 내지 약 10 μm, 약 1 μm 내지 약 8 μm, 약 1 μm 내지 약 6 μm, 약 1 μm 내지 약 4 μm, 약 1 μm 내지 약 2 μm, 약 2 μm 내지 약 10 μm, 약 2 μm 내지 약 8 μm, 약 2 μm 내지 약 6 μm, 약 2 μm 내지 약 4 μm, 약 4 μm 내지 약 10 μm, 약 4 μm 내지 약 8 μm, 약 4 μm 내지 약 6 μm, 약 6 μm 내지 약 10 μm, 약 6 μm 내지 약 8 μm, 또는 약 8 μm 내지 약 10 μm 범위일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸의 화학적 개질 전에 상기 베타글루칸의 저분자화를 선택적으로 수행할 수 있다.

본원의 제 2 측면에 따른 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸 유도체는 베타글루칸이 화학적 개질된 것이거나, 또는 베타글루칸이 저분자화되고 화학적으로 개질된 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸 유도체는 상기 베타글루칸이 관능기를 이용하여 화학적으로 개질된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 관능기는 노보닌기, 아크릴기, 메타아크릴기, 아릴에테르, 아세틸렌, 프로파인, 부타인, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 베타글루칸에 관능기로서 노보닌기가 고정됨에 따라, 티올-노보닌 광클릭 반응에 의해 하이브리드 마이크로젤이 수득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

<베타글루칸 유도체 제조>

베타글루칸 정제 및 저분자화

먼저, 시조필리움콤뮨 용해물(Schizophyllum commune lysate)을 여과용 부직포(Miracloth^TM)로 여과한 뒤, 이소프로판올(isopropanol, IPA)로 침전하여 진공 건조하였다. 건조된 침전물을 0.1 M 수산화나트륨(sodium hydroxide) 수용액을 이용하여, 80℃에서 2시간 동안 용해하였다.

그 후, 알칼리 처리된 상기 용액을 당량의 염산(hydrochloric acid)으로 중화하고 여과하였다. 여과된 것을 IPA에 2회 침전하고 클로로포름(chloroform)에 1회 수세하여 진공 건조를 진행하여 베타글루칸을 수득하였다. 상기 베타글루칸은 분지 구조를 지니고 있는 시조필란(schizophyllan)이며, 본 실시예에서는 SPG로 표기하였다.

상기 SPG의 저분자화를 위해, 건조된 SPG를 10 mg/mL 농도로 초순수에 재용해하고, 30 mL의 베타글루칸 용액을 50 mL 코니칼 튜브에 옮겨 초음파파쇄기(VCX-130, SONICS)로 초음파 처리를 진행하였다. 초음파 처리 시간은 전단 점도의 변화를 측정하여 결정되는 것으로(도 2), 본 실시예에서는 40 분간 처리하여 저분자화를 실시하였다.

저분자화된 베타글루칸 용액은 셀룰로오스 아세테이트 투석막(MWCO: 12,000-14,000)에 담아 3 일간 흐르는 증류수에서 투석한 후, 동결건조를 진행하였다.

베타글루칸 유도체 제조

상기 초음파 처리된 SPG를 20 mg/mL 농도로 초순수에 용해하였다. 그 후, 상기 SPG를 구성하는 피라노오스(pyranose, 단량체)에 대하여 24 당량에 해당하는 수산화나트륨을 첨가하여 SPG의 수산기를 활성화시키고, 초순수와 동량의 이소프로판올을 첨가하였다.

다음으로, 14 당량의 클로로아세트산(chloroacetic acid)를 천천히 떨어뜨려 베타글루칸에 카복실기(carboxyl group)를 도입하는 합성 반응을 60℃에서 3 시간 동안 진행하였다. 반응을 종결하기 위해, 전체 부피의 2배에 해당하는 초순수를 첨가하여 셀룰로오스 투석막(MWCO: 12 내지 14 kDa)에 담아 3 일간 초순수에 투석 후, 용액을 동결건조하여 스펀지 형태의 카복실-베타글루칸(SPG-COOH)을 수득하였다.

상기 SPG-COOH를 0.1 M, pH 6의 MES 버퍼(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)에 16 mg/mL 농도로 용해하고 1 당량의 EDC(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide)를 첨가하여 1 시간 교반하여 완전히 용해시켰다. 그 후, 2 당량의 노보닌아민 용액을 첨가하고 염산을 이용하여 혼합물의 pH를 6으로 조정하였다. 합성 반응은 18 시간 동안 진행되었고, 3 일간 pH 6의 초순수에서 투석 후 용액을 동결건조 하였다(도 3).

상기와 같이 제조된 베타글루칸 유도체의 저분자화 및 화학적 개질 전 후의 ¹³C-NMR 분광 분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

<하이브리드 마이크로젤 제조>

먼저, 노보닌 관능기에 의하여 화학적 개질된 PEG(4arm PEG-norbornene, PEG4NB)를 광개시제인 리튬 아릴포스피네이트(lithium arylphosphinate, LAP)과 가교제인 DTT(dithiothreitol)가 포함된 pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)에 용해하여 전구 용액을 제조하였다. 이 때, 상기 PEG4NB의 농도는 5 wt%이었으며, LAP의 농도는 1 mM로 고정하고 DTT의 티올기와 PEG4NB의 노보닌기의 몰농도를 일정 비율로 맞춰주었다(여분 [SH] = 2 mM).

그 후, 50 μL의 전구용액을 동일 농도의 DTT와 LAP이 포함된 40 wt% 농도의 덱스트란(M.W. 6000 Da) 용액 450 μL에 첨가하고, 혼합 용액을 10 초간 교반한 후, 초음파 파쇄기로 초음파 처리하였다.

다음으로, 이수상분리(aqueous two-phase separation)에 의해 유화된 용액에 20 초간 자외선(Omnicure S1000, 365 nm, 10 mW/cm²)을 조사하여 광중합 PEG 마이크로젤을 제조하였다(도 6). 상기 제조된 PEG 마이크로젤(500 μL)은, pH 7.4의 PBS로 수회 수세하였으며, 각 수세 단계에서 원심분리(3000 rpm, 10 분) 후 상등액을 제거하였다. 이 때, 초음파 처리되는 시간과 강도에 따른 상기 PEG 마이크로젤의 크기 변화를 측정하여 도 5에 나타내었다.

상기 PEG 마이크로젤은 1 mM 농도의 LAP과 1 wt% 농도의 SPG-NB가 포함된 pH 7.4의 PBS에 담지되었으며, 초음파 처리 되어 분산된 후 20초간 자외선(Omnicure S1000, 365 nm, 10 mW/cm²)을 조사하여 하이브리드 마이크로젤을 제조하고 pH 7.4의 PBS로 수회 수세하였다.

형광물질이 부착된 상기 베타글루칸 유도체와, 상기 PEG 마이크로젤의 복합화 후, 제조된 하이브리드 마이크로젤의 유세포분석 결과를 도 7에 나타내었다.

<하이브리드 마이크로젤의 세포 독성 평가>

상기 실시예에서 제조된 하이브리드 마이크로젤의 세포 독성 평가를 위해, 웰(well) 당 25,000 마리의 대식세포(RAW264.7)와 섬유아세포(NIH-3T3)를 하루 동안 10%의 소혈청을 함유하는 배지(Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)에 배양 한 후 다음에 해당하는 배지를 하루 동안 처리하여 대조군(세포배양접시) 대비 상대적 세포활성(relative cell viability)을 트립판블루염색법(trypan blue exclusion assay)를 통해 측정하였다. 이 때, 대조군 대비 상대적 세포활성이 50%인 지점에 해당하는 농도를 반수치사량(lethal dose 50, LD₅₀)으로 설정하였다. 상기 하이브리드 마이크로젤의 자체적인 세포 독성을 평가하기 위해, 시료를 3.125-100 x 10⁴ number/mL의 농도로 배지에 분산하였다(도 8).

<하이브리드 마이크로젤의 대식세포 포식작용 평가>

상기 실시예에서 제조된 하이브리드 마이크로젤의 포식작용을 평가하기 위해, LPS가 처리되지 않은 대식세포(RAW264.7)의 PEG 하이브리드 마이크로젤의 형광 현미경 사진을 도 9에 나타냈다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 붉은색의 PEG 하이브리드 마이크로젤이 대식세포 내로 포식되지 않았음을 확인할 수 있다.

도 10은, 상기 실시예에서 제조된 PEG 하이브리드 마이크로젤의 포식 여부를 정량적으로 나타내는 유세포분석 결과 그래프이다. 도 10을 통해, 대식세포인 RAW264.7가 상기 하이브리드 마이크로젤의 포식 여부를 확인할 수 있다. LPS 처리 유무에 관계 없이, 본 실시예의 하이브리드 마이크로젤은 대식세포 내로 거의 포식되지 않았음을 확인할 수 있다.

<하이브리드 마이크로젤의 대식세포 표적 성능 평가>

상기 실시예에서 제조된 하이브리드 마이크로젤의 대식세포 표적 성능 평가를 위해, 웰(well) 당 10,000개의 대식세포(RAW264.7)와 섬유아세포(NIH-3T3)를 하루 동안 10%의 소혈청을 함유하는 배지(Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM)에 배양한 후 100 x 10⁴ number/mL 농도의 마이크로젤이 포함된 배지를 4시간 동안 처리하였다.

그 후, 세포의 F-액틴과 세포핵, 마이크로젤을 관찰하기 위해 세포를 PBS로 3 회 수세 후 4%(v/v)의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 5 분간 침지시켜 세포를 고정화하였다. 다음으로, 0.25%(v/v) Triton X-100 용액을 처리하여 세포 투과가 가능하도록 하며, 이후 1% (v/v)의 BSA 용액을 2 시간 처리하였다. 이후 FITC 팔로이딘(Fluorescein Phalloidin) (Molecular Probes)과 다피(4,6-diamidino-2-phenylindol), DAPI) (Molecular Probes) 용액을 처리하여 상온에서 5분씩 반응시킴으로써, 각각 F-액틴과 세포핵을 염색하고 이를 형광현미경을 통해 관찰하였다(도 11).

도 12는, NIH3T3세포 및 RAW264.7세포의 하이브리드 마이크로젤 포식 여부를 정량적으로 나타내는 유세포분석 결과를 나타낸 것이다. 섬유아세포인 NIH3T3는 본 실시예의 하이브리드 마이크로젤을 거의 포식하지 않은 반면, 대식세포와 유사한 RAW264.7는 본 실시예의 하이브리드 마이크로젤을 포식하였다(도 12).

<하이브리드 마이크로젤의 약물 담지 및 방출>

상기 실시예에서 제조된 하이브리드 마이크로젤의 약물 방출 거동을 살펴보기 위해, 단백질 약물인 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 PEG 전구 용액과 덱스트란 용액에 동일 농도(1 wt%)로 첨가하여 PEG 마이크로젤을 제조하였다.

제조된 PEG 마이크로젤은, 1 mM 농도의 LAP과 1 wt% 농도의 SPG-NB, 1 wt%의 BSA가 포함된 pH 7.4의 PBS에 담지하여 베타글루칸-PEG 하이브리드 마이크로젤을 제조하고, pH 7.4의 PBS로 수회 수세하였다.

그 후, 상기 하이브리드 마이크로젤을 pH 7.4의 PBS 용액 1 mL에 분산시킨 후, 37℃에서 14 일간 교반하였으며, 정해진 시간에 3000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 100 μL의 상등액을 취한 뒤, 새로운 PBS 용액 100 μL를 추가하였다.

방출된 BSA 양은 마이크로플레이트리더기(Synergy HT, BioTek)를 이용한 BCA 방법(Thermo Scientific)을 통해 정량하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 14는, 단백질 약물인 소혈청알부민(BSA)을 담지한 후, 형광 표지자로서 FAM 을 결합하여 제조한 PEG 하이브리드 마이크로젤의 형광 현미경 이미지이다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 모델 단백질 약물을 담지한 본 실시예의 하이브리드 마이크로젤이 대식세포인 RAW264.7에 잘 포식되었음을 확인할 수 있다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

마이크로젤; 및 베타글루칸 유도체
를 포함하는, 하이브리드 마이크로젤로서,
상기 하이브리드 마이크로젤은, 상기 베타글루칸 유도체와 상기 마이크로젤이 광가교를 통해 복합화되어 있는 것인, 하이브리드 마이크로젤.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 마이크로젤은 폴리에틸렌글리콜, 4-arm 폴리에틸렌글리콜-노보닌(4-arm PEG-norbornene), 8-arm 폴리에틸렌글리콜-노보닌(8-arm PEG-norbornene), 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 메타아크릴레이트, 히알루론산, 히알루론산 메타아크릴레이트, 히알루론산 노보닌, 젤라틴, 젤라틴 메타아크릴레이트, 젤라틴 노보닌, 실크, 실크 메타아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 하이브리드 마이크로젤.
제 1 항에 있어서,
상기 베타글루칸 유도체는 베타글루칸이 화학적 개질된 것이거나, 또는 베타글루칸이 저분자화 및 화학적 개질된 것인, 하이브리드 마이크로젤.
제 1 항에 있어서,
상기 하이브리드 마이크로젤은 생리활성 물질을 추가 포함하는 것인, 하이브리드 마이크로젤.
제 1 항에 있어서,
상기 하이브리드 마이크로젤은 약물 전달체로서 사용되는 것인, 하이브리드 마이크로젤.
제 1 항에 있어서
상기 하이브리드 마이크로젤의 크기는 0.2 μm 내지 10 μm 범위인 것인, 하이브리드 마이크로젤.
제 1 항, 및 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법으로서,
베타글루칸을 화학적 개질하여 베타글루칸 유도체를 제조하고; 및
상기 마이크로젤과 상기 베타글루칸 유도체를 혼합하여 하이브리드 마이크로젤을 수득하는 것
을 포함하는, 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 베타글루칸의 화학적 개질 전에 상기 베타글루칸을 저분자화하는 것을 추가 포함하는, 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 화학적 개질은 상기 베타글루칸과 결합할 수 있는 관능기를 이용하여 상기 베타글루칸의 표면을 화학적으로 개질하는 것인, 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 관능기는 노보닌기, 아크릴기, 메타아크릴기, 아릴에테르, 아세틸렌, 프로파인, 부타인, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 하이브리드 마이크로젤은, 상기 베타글루칸 유도체와 상기 마이크로젤을 혼합한 후 광가교를 통해 복합화하는 것인, 하이브리드 마이크로젤의 제조 방법.