CN108102006B - 可交联的两亲性天然多糖及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可交联的两亲性天然多糖及其应用，具体是采用双键和疏水链对天然多糖聚合物进行双修饰从而得到可交联的两亲性天然多糖，并将其应用于荷载、递送蛋白药物。本发明的两亲性天然多糖在水溶液中可自组装形成具有蛋白荷载能力的纳米凝胶，再通过采用引发剂活化天然多糖修饰的双键产生自由基，触发双键互相交联形成新的共价键，从而利用共价键的作用力稳定得到的制剂，实现对蛋白药物的高效递送。

Description

可交联的两亲性天然多糖及其应用

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种采用双键和疏水链进行双修饰的可交联两亲性天然多糖及其在递送蛋白药物中的应用。

背景技术

近二三十年来，分子生物学和基因工程的发展推动了治疗型蛋白和多肽的产生并大规模生产。很多蛋白药物，比如细胞因子、生长因子、单克隆抗体、低分子量抗体和骨架蛋白等，一部分正处于临床研究，一部分已经投入市场。蛋白药物相对于小分子药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确等特点。然而蛋白药物通常具有复杂的三维结构，无论何种给药途径，都存在容易聚集、异构化、水解、氧化和易被清除等缺陷。并且蛋白药物体内半衰期短，需要反复多次给药以确保药物浓度维持在治疗窗口中。因此在蛋白药物的发展中，药物的递送是一大难关。

由于细胞增殖异常，肿瘤部位的血管增殖易构、淋巴管坍塌，导致其对大分子的渗透性增强、滞留性增加。基于此理论，纳米制剂成为靶向肿瘤组织的优良选择。天然多糖材料由于生物相容性好、来源广泛、品类众多等优点，得到了国内外研究人员的广泛关注。目前，用于药物递送方面研究较多的天然多糖主要有壳聚糖、直链/支链淀粉、透明质酸、纤维素、海藻酸钠等。天然多糖为亲水性的大分子，在水溶液中呈现线性，无法采用温和的方法形成纳米粒并实现蛋白药物的有效荷载。有研究显示，采用疏水基团修饰后的天然多糖大分子，可以在水溶液中组装成纳米结构。但是，仅依赖疏水性荷载水溶性蛋白药物稳定性较差，在条件苛刻的体内环境中，容易由于蛋白置换，稀释等原因诱导载体的解体和药物的突释。

参考文献：

Cleavable carbamate linkers for controlled protein delivery fromhydrogels Nadine Hammer,Ferdinand P.Brandl,Susanne Kirchhof,AchimM.Goepferich.Journal of Controlled Release.2014,183,67–76.

Tumor-specific delivery of siRNA using supramolecular assembly ofhyaluronic acid nanoparticles and 2bRNA-binding protein/siRNAcomplexes.Kyung-mi Choi,Mihue Jang,Jong Hwan Kim,Hyung JunAhn.Biomaterials.2014,35,7121-7132.

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是解决经疏水基团修饰的天然多糖大分子在荷载水溶性蛋白药物稳定性较差的技术问题，提供一种采用双键和疏水链进行双修饰的可交联两亲性天然多糖，能够在水溶液中自组装成纳米凝胶并且可交联，最终用于蛋白药物的高效递送。

技术方案：可交联的两亲性天然多糖，其结构式为A-R-B，A为含有不饱和双键的基团、R为天然多糖聚合物、B为疏水基团，A和R、B和R的连接方式为酰胺键、酯键、二硫键或三氮唑。

进一步地，所述A选自丙烯酸、甲基丙烯酸、2,3-二甲基马来酸、甲基丙烯酸羟乙酯、2,5-二甲基-1,5-己二胺、3-丁烯-1-醇、DL-2-氨基-4-戊烯酸、乙烯基乙酸、4-戊烯酸、2,2-二甲基-4-戊烯酸、9-癸烯酸、5-己烯酸、乙烯基乙酸、3-甲基-3-丁烯-1-醇或7-辛烯酸。

进一步地，所述R选自透明质酸、壳聚糖、海藻酸、葡聚糖、直链淀粉、支链淀粉、硫酸软骨素、肝素、纤维素或果胶质。

进一步地，所述B选自胆固醇、胆酸、C8-C18长链烷烃或疏水性药物。

上述可交联的两亲性天然多糖在蛋白药物递送中的应用。

一种纳米凝胶，由上述可交联的两亲性天然多糖在水中自组装形成。

一种荷载蛋白药物的纳米凝胶，由上述可交联的两亲性天然多糖在水中自组装形成。

进一步地，所述蛋白药物选自干扰素、白介素、凋亡素、铜绿假单胞菌外毒素A、人表皮生长因子、血管内皮生长因子、脱氧核糖核酸酶、核糖核苷酸酶、p53蛋白、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、细胞色素酶c、半胱天冬酶、粘菌素、杆菌肽、蜂毒肽、PD-1抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体。

一种荷载抗肿瘤蛋白脱氧核糖核酸酶I的纳米凝胶，由甲基丙烯酸和胆固醇双修饰的透明质酸在水中自组装形成。

上述纳米凝胶的制备方法包括以下步骤：

步骤1，采用缩合反应通过酯键将甲基丙烯酸连接在透明质酸的羟基末端；

步骤2，采用缩合反应通过酰胺键将胆固醇己二胺连接在透明质酸的羧基末端，得到甲基丙烯酸和胆固醇双修饰的透明质酸；

步骤3，采用探头超声分散法将步骤2得到的透明质酸在水中分散制成纳米凝胶；

步骤4，将抗肿瘤蛋白抗肿瘤蛋白脱氧核糖核酸酶I荷载进纳米凝胶中；

步骤5，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺对纳米凝胶上修饰的甲基丙烯酸进行交联，即得。

有益效果：本发明的可交联两亲性天然多糖，能够在水溶液中自组装成纳米凝胶并且可交联，最终用于蛋白药物的高效递送。

附图说明

图1为实施例1中加入HP-β-CD的后cNG和pNG的粒径变化；

图2为实施例1中加入和未加入HP-β-CD时，DNase I从cNG和pNG中的释放曲线；

图3为实施例1中与FBS共孵不同时间后，DNaseI从pNG和cNG中的释放曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

多肽、蛋白质类药物是药用生物活性大分子物质，随着生物技术的飞速发展，此类药物已成为生物技术药物的主要品种。与传统的化学合成药物相比，其具有以下特点：(1)特异性高、活性强、毒性低；(2)分子量大、水溶性大、稳定性差、易变性失活；(3)生物半衰期短，不容易穿过生理屏障。

生物活性大分子药物通常制备成注射剂和冻干粉针，为了达到治疗效果常常需要频繁注射。近年来纳米技术发展迅速，将其应用于药用蛋白给药系统中的研究也日益增多。比如在蛋白质上插入单体并加入交联剂制备成纳米壳包裹的蛋白质；利用正负电荷相互吸引的原理，将正电荷的蛋白复合物载入负电荷的透明质酸等。然而，此类纳米粒都有载药量低，制备方法复杂等缺点。

水凝胶是一类以水为分散介质的凝胶。具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀。这一类交联聚合物形成高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状同时吸收大量的水。这种特征让水凝胶能够很好的将蛋白质荷载其中，并缓慢释放。纳米凝胶是纳米尺寸的水凝胶，相比于水凝胶，尺寸小，比表面积大，具有的疏水空腔可以将蛋白质荷载于其中，保护蛋白结构的完整及其活性，并且载药量大大提高。

本发明基于对天然多糖类大分子种类、可交联的基团修饰种类和疏水链段的选择等多方面考虑，构建了一种双键和疏水链段双修饰的天然多糖聚合物，其结构式为A-R-B。

具体地：

R代表天然多糖聚合物，例如：透明质酸、壳聚糖、海藻酸、葡聚糖、直链或支链淀粉、硫酸软骨素、肝素、纤维素、果胶质等。所选的天然多糖聚合物具有良好的亲水性、生物相容性、生物降解性和可修饰性，在水中有较高的溶解度，可被体内存在的酶降解，并且结构中含有羟基、羧基或氨基基团，作为基本骨架，可进行疏水性修饰。

A代表包括含有不饱和双键的基团，例如：丙烯酸、甲基丙烯酸、2,3-二甲基马来酸、甲基丙烯酸羟乙酯、2,5-二甲基-1,5-己二胺、3-丁烯-1-醇、DL-2-氨基-4-戊烯酸、乙烯基乙酸、4-戊烯酸、2,2-二甲基-4-戊烯酸、9-癸烯酸、5-己烯酸、乙烯基乙酸、3-甲基-3-丁烯-1-醇、7-辛烯酸等。所选基团不仅可发生自由基聚合反应，还可通过氨基、羟基或羧基与天然多糖R上的羧基或氨基连接。

B代表疏水基团，鉴于安全性，疏水基团选择胆固醇或C8-C18长链烷烃。

本发明的另外一个目的是提供一种用于蛋白质类生物药物递送的纳米递药系统，经不饱和双键和疏水基团双修饰的天然多糖聚合物能够在水溶液中自组装成纳米凝胶，用于蛋白药物递送。进一步地，还可以采用化学交联剂或光引发剂活化双键使其相互交联形成新的共价键，从而利用共价键的作用力稳定得到的制剂，在血液循环中保持高稳定性。为了避免化学或光引发剂的引入带来的威廉毒性，还可以采用在R上修饰环辛炔以及叠氮基团，通过分子间的无铜催化点击反应实现交联。

所形成的纳米递药系统可用于包载并递送的蛋白药物包括：干扰素、白介素、凋亡素(VP3蛋白)、铜绿假单胞菌外毒素A、人表皮生长因子、血管内皮生长因子、脱氧核糖核酸酶、核糖核苷酸酶、p53蛋白、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、细胞色素酶c、半胱天冬酶、粘菌素、杆菌肽、蜂毒肽、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体。

纳米递药系统荷载蛋白药物时，还可以与化学药物联用，此时B也可以进一步选择疏水性药物，例如：托泊替康、米托蒽醌、依托泊苷、替尼泊苷、甲氨蝶呤、紫杉醇、阿霉素、喜树碱、辛伐他汀、阿托伐他汀、全反式维甲酸、阿昔洛韦、泛昔洛韦、茚地那韦、灰黄霉素、磺胺嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺甲恶唑、萘啶酸、诺氟沙星、依诺沙星、利奈唑胺、伊曲康唑、匹美西林、地高辛、吲哚美辛、他莫昔芬、环孢霉素、金霉素、四环素、塞来昔布、替诺昔康、甲芬那酸、酮洛芬、羟布宗等。所选基团可通过氨基、羟基或羧基与R上的羧基或氨基连接；也可通过对B进行巯基或炔基修饰，R可修饰巯基或叠氮基团，两者通过二硫键或三氮唑相连。

在本发明的其中一个具体实施例中，A选用甲基丙烯酸，B选用胆固醇己二胺，R选用透明质酸；蛋白质药物选用牛血清白蛋白(BSA)或抗肿瘤蛋白脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)。先采用缩合反应通过酯键将含有双键的甲基丙烯酸连接在透明质酸的羟基末端，提供可交联的双键；再采用缩合反应通过酰胺键将胆固醇己二胺连接在透明质酸的羧基末端，提供疏水作用力，制得可交联的两亲性透明质酸。具体地：甲基丙烯酸酐和羧基的摩尔比为1:2，反应温度为0～4℃、反应时间为24h，反应结束后，采用有机溶剂沉淀法得到粗品，采用透析的方法除去残余的甲基丙烯酸酐和有机溶剂，透析时间24h，后冷冻干燥保存；胆固醇己二胺和羧基的摩尔比例范围为1:5～4:5、优选4:5，采用的主要溶剂是二甲基亚砜，反应助溶剂为二氯甲烷和甲醇，比例为1:1～3:1、优选3:1，反应温度为25～40℃、优选25℃，反应时间为12～48h、优选24h，反应结束后，采用透析的方法除去有机溶剂，透析时间3天，后冷冻干燥保存。

空白纳米凝胶的制备采用探头超声法制备。将可交联的两亲性透明质酸溶解于水溶液中，在冰浴下探头超声10min、超声强度240W。蛋白质的荷载在微量有机溶剂存在的情况下荷载，包括甲醇、乙醇、二甲基亚砜等，优选二甲基亚砜。本发明对蛋白荷载的效率采用多个蛋白质进行考察，纳米凝胶和蛋白质质量比1:0.2～1:1投料，以1:0.2为例，对多种模型蛋白包封率高达85-99％。

已有文献报道采用胆固醇单独修饰透明质酸可以用于蛋白质的荷载(T.Nakai,T.Hirakura,Y.Sakurai,T.Shimoboji,M.Ishigai,K.Akiyoshi.Injectable hydrogel forsustained protein release by salt-induced association of hyaluronic acidnanogel.Macromol.Biosci.2012,12,475-483.)。在单独采用胆固醇单修饰透明质酸纳米粒时，当胆固醇的疏水作用力遭到干扰时，例如：加入了胆固醇的配体，纳米粒将很快解体，并且释放出内部荷载的蛋白质，所以采用胆固醇单独修饰透明质酸，在稳定性上存在一定的缺陷。为了提高制剂的稳定性，本发明在胆固醇修饰的透明质酸上进一步修饰上甲基丙烯酸，利用胆固醇的疏水力，在水溶液中首先自组装形成具有蛋白荷载能力的纳米凝胶，将蛋白荷载进入纳米凝胶后，再采用APS/TEMED活化透明质酸上修饰的双键、产生自由基，触发甲基丙烯酸酯基上的双键的互相交联形成新的共价键，从而利用共价键的作用力稳定得到的制剂。这样一来，最终制剂的稳定性得到了很大的提高，在正常状态下，其能够维持纳米凝胶所具有的蛋白荷载的性质；在存在破坏疏水力的条件下，双键交联后形成的共价键能起到缓冲作用，起到稳定制剂的作用。

实施例1

一、甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰的透明质酸的合成

第一步，胆固醇己二胺的制备：

向溶解于二氯甲烷的1,6-己二胺中滴加溶解于二氯甲烷的胆固醇氯甲酸酯，1,6-己二胺和胆固醇氯甲酸酯的摩尔比10:1。滴加完毕后，室温反应2h。反应完的产物用水清洗后收集有机相并用无水硫酸钠干燥半小时，抽滤以除去无水硫酸钠，旋蒸后得到淡黄色固体为粗产物。采用层析柱纯化，精制产物得到胆固醇己二胺(产物一)。

第二步，甲基丙烯酸修饰透明质酸的合成：

100mL的20mg/mL透明质酸水溶液中加入1.6mL 2-甲基丙烯酸酐并用5M氢氧化钠溶液调节反应体系的pH至pH 8，反应24h后，用丙酮沉淀法得到产物，乙醇清洗两遍后，除去剩余有机溶剂。所得沉淀溶解后透析冻干得到甲基丙烯酸修饰的透明质酸(产物二)。

第三步，甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰透明质酸的合成：

将产物二在0.01M稀盐酸溶液中透析后，转移到去离子水中透析，接着用四丁基氢氧化铵滴定到pH 7，冻干得到改性后的甲基丙烯酸修饰的透明质酸(产物三)。

取产物三溶解于二甲基亚砜中，而后向其中加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)固体完全溶解，最后逐滴缓慢加入溶解于二氯甲烷/甲醇(3:1)的产物一(透明质酸羧基数：DMTMM：胆固醇己二胺＝1:N:N)，室温反应24h。所得产物在DMSO、150mM氯化钠溶液和去离子水中分别透析后冻干，得到的白色粉末为中产物甲基丙烯酸胆固醇己二胺双修饰的透明质酸钠盐(mCHA)。

二、甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰的透明质酸荷载的牛血清白蛋白(BSA)纳米凝胶或脱氧核糖核酸酶(DNase I)的制备

取2mg甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰的透明质酸完全溶解于2mL去离子水中自组装得到淡蓝色有乳光的纳米凝胶水溶液。室温下加入80μL二甲基亚砜，再滴加溶解于去离子水中的牛血清白蛋白溶液，终浓度为0.2mg/mL，同时加入20μL APS和2μL TEMED进行交联，溶液转移到冰浴中搅拌1h后，透析得到荷载牛血清白蛋白的纳米凝胶(B-cNG)水溶液。

同上，将牛血清白蛋白溶液替换为脱氧核糖核酸酶溶液，得到荷载脱氧核糖核酸酶的纳米凝胶(D-cNG)水溶液。

采用动态光散射粒径仪(DLS)对制剂的粒径进行考察，所得B-cNG的粒径为158±6nm，多分散系数(PDI)为0.188±0.018。所得D-cNG的粒径为90.7±3.8nm，多分散系数(PDI)为0.274±0.006。

采用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质的荷载进行考察。纳米凝胶对BSA的包封率为73.8±3.3％，载药率为15.1±0.7％；对DNase I的包封率为90.7±3.8％，载药率为18.2±1.0％。

说明甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰的透明质酸可以很好的荷载蛋白药物。

三、交联的纳米凝胶相对于未交联的纳米凝胶粒径稳定性提高

取2mg甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰的透明质酸完全溶解于2mL去离子水中自组装得到淡蓝色有乳光的纳米凝胶水溶液。其中一份加入20μL APS和2μL TEMED进行交联，溶液转移到冰浴中搅拌1h后，透析得到交联后的纳米凝胶水溶液(cNG)。

同样的方法不加入APS/TEMED制备未交联的对照纳米凝胶(pNG)

向制剂中加入羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)使得最终浓度为10^-2M后于在37℃不同时间点，采用动态光散射粒径仪考察两者粒径变化。

如图1所示，根据两者的粒径变化可知，双键交联后，在不利环境下(添加了HP-β-CD)，交联的纳米凝胶稳定性大大增强。

四、交联的纳米凝胶相对于未交联的纳米凝胶的药物泄漏率降低

取2mg甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰的透明质酸完全溶解于2mL去离子水中自组装得到淡蓝色有乳光的纳米凝胶水溶液。室温下加入80μL二甲基亚砜，再滴加溶解于去离子水中的罗丹明修饰的脱氧核糖核酸酶I(Rho-D)溶液使得终DNase I浓度为0.2mg/mL，同时加入20μL APS和2μL TEMED进行交联，溶液转移到冰浴中搅拌1h后，透析得到荷载Rho-D的纳米凝胶水溶液(Rho-D-cNG)。

同样的方法不加入APS/TEMED制备不交联的对照纳米凝胶(Rho-D-pNG)。

向制剂中加入β-CD使得最终浓度为1mM后于在37℃孵育一定时间后考察Rho-D从上述两种制剂中的泄漏情况。

如图2所示，根据两者的释放变化可知，双键交联后，在HP-β-CD存在的情况下，交联的纳米凝胶中蛋白药物的泄漏率大大降低。

五、交联的纳米凝胶的血液稳定性提高。

取2mg甲基丙烯酸和胆固醇己二胺双修饰的透明质酸完全溶解于2mL去离子水中自组装得到淡蓝色有乳光的纳米凝胶水溶液。室温下加入80μL二甲基亚砜，再滴加溶解于去离子水中的罗丹明修饰的脱氧核糖核酸酶I(Rho-D)溶液使得终DNase I浓度为0.2mg/mL，同时加入20μL APS和2μL TEMED进行交联，溶液转移到冰浴中搅拌1h后，透析得到荷载Rho-D的纳米凝胶水溶液(Rho-D-cNG)。

同样的方法不加入APS/TEMED制备不交联的对照纳米凝胶(Rho-D-pNG)。

将胎牛血清(FBS)与制剂等体积混合，37℃孵育一定时间后考察Rho-D从上述两种制剂中的泄漏情况，并与不添加FBS的制剂进行对比。

如图3所示，根据两者的释放变化可知，双键交联后，在FBS存在的情况下，交联的的纳米凝胶中蛋白药物的泄漏率大大降低。

Claims (5)

1.一种纳米凝胶，其特征在于：由可交联的两亲性天然多糖在水中自组装形成；

所述的可交联的两亲性天然多糖，其结构式为A-R-B，A为含有不饱和双键的基团、R为天然多糖聚合物、B为疏水基团，A和R的连接方式为酯键、B和R的连接方式为酰胺键；

所述A选自丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟乙酯、4-戊烯酸、2,2-二甲基-4-戊烯酸、9-癸烯酸、5-己烯酸或7-辛烯酸；

所述R为透明质酸；

所述B为胆固醇或胆酸。

2.根据权利要求1所述的纳米凝胶，其特征在于：还荷载有蛋白药物。

3.根据权利要求2所述的纳米凝胶，其特征在于：所述蛋白药物选自干扰素、白介素、凋亡素、铜绿假单胞菌外毒素A、人表皮生长因子、血管内皮生长因子、脱氧核糖核酸酶、核糖核苷酸酶、p53蛋白、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、细胞色素酶c、半胱天冬酶、粘菌素、杆菌肽、蜂毒肽、PD-1抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体。

4.一种荷载抗肿瘤蛋白脱氧核糖核酸酶I的纳米凝胶，其特征在于：由甲基丙烯酸和胆固醇双修饰的透明质酸在水中自组装形成。

5.权利要求4所述的纳米凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，采用缩合反应通过酯键将甲基丙烯酸连接在透明质酸的羟基末端；

步骤2，采用缩合反应通过酰胺键将胆固醇己二胺连接在透明质酸的羧基末端，得到甲基丙烯酸和胆固醇双修饰的透明质酸；

步骤3，采用探头超声分散法将步骤2得到的透明质酸在水中分散制成纳米凝胶；

步骤4，将抗肿瘤蛋白抗肿瘤蛋白脱氧核糖核酸酶I荷载进纳米凝胶中；

步骤5，加入过硫酸铵和四甲基乙二胺对纳米凝胶上修饰的甲基丙烯酸进行交联，即得。

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