CN108912245B - 一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物，包括透明质酸主链和含氟酸酐侧链，所述的透明质酸和含氟酸酐通过酰胺键连接，所述的氟化透明质酸衍生物的分子量为35‑45kDa。本发明提供的透明质酸衍生物减少关节炎模型大鼠炎症细胞的浸润；降低关节炎模型大鼠脚掌组织匀浆中白介素IL‑1和白介素IL‑6的表达，无细胞毒性，是优质的抗炎药物或药物载体，其多阴离子特性可以和阳离子药物形成缀合物，也可与阳性脂质体包裹的非极性药物形成缀合物。

Description

一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及透明质酸衍生物，具体涉及一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸是在动物组织中分布广泛的高分子量多糖，在动物细胞表面合成，由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸的单糖单元交替组成。透明质酸具有多种功能，包括水合作用，提供细胞迁移基质和关节润滑。完整的透明质酸具有大于1000kDa的分子量，通常称为高分量透明质酸。但也以较低分子量形式存在，这些小分子量的透明质酸是透明质酸酶对高分子量透明质酸降解后得到的产物，例如100-250kDa，小于100kDa的透明质酸通常称为低分子量透明质酸。高分子量透明质酸具有高粘度，是细胞外基质的主要成分，具有关节的润滑、组织填充和细胞信息传导的重要生物功能。然而，大于1000kDa的透明质酸与小分子量形式的透明质酸呈现出不同的物理、化学性质，其表现形式为与细胞受体相互作用及亲和力的不同。
细胞表面有几种同源的透明质酸结合蛋白。这些透明质酸受体同属于hyaluronanand proteoglycan link proteins(HAPLN)的亚家族，在许多组织中广泛表达。包括CD44、LYVE-1(淋巴管内皮透明质酸受体)、HARE/STABILIN-2(肝透明质酸清除受体)和STABILIN-1。STABILIN-1活化的巨噬细胞均发现表达(
Figure BDA0001729230020000011
K.et al,2014Int J Clin ExpPathol.7(4):1625)。CD44在多种癌细胞表面均呈现表达量的上调(Bukowska B.et al,2015,Ginekol Pol.86(5):388)同时许多细胞表达CD44的变体RHAMM受体，它参与细胞运动和细胞转化与炎症和多种肿瘤、癌症的转移性扩散相关(Misra S.et al,2015,FrontImmunol.6:201)。Toll样受体或TLR介导的人体先天性免疫。TLR4突变体可以诱导NF-κB活化并因此增加促炎细胞因子的产生(Medzhitov，R.et al,1997，Nature 388：394)。通过先天性免疫系统识别细菌脂多糖(LPS)可导致以TNF，IL-1，IL-6和IL-8等细胞因子的产生为特征的炎症反应，以及ICAM-1的基因激活(Lu Y.C.et al.Cytokine.2008；42：145-51)。透明质酸可以结合细胞膜受体CD44和许多基质蛋白，特别是与蛋白聚糖核心蛋白连接的结构域。据报道CD44在某些类型的炎性关节炎如类风湿性关节炎中上调，小分子量透明质酸可与CD44相互作用参与活化TLR介导的炎症反应，影响细胞基质分子，促进炎性疾病的恶化，许多细胞因子cytokines被诱导并且在慢性炎症条件下具有较高的水平。相反对于高分子量透明质酸，情况则相反，高分子量透明质酸不会引发炎症反应(Horton MR.et al.1998，JBiol Chem.273:35088)。针对这些细胞因子在疾病中的高表达，一些人源化单克隆抗体已用于病症的治疗。
研究表明TLR4参与炎症反应过程中活性氧分子ROS的产生和调控，降低ROS的产生可以通过下调TLR4来实现(Jiang K.et al,2018,Front Pharmacol.9:142,Sahnoun S.etal,2017,J Assist Reprod Genet.34:1067)。体内动物实验表明，TLR4的缺陷可以减少ROS的产生，同时增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的抗氧化活性，从而减轻炎症反应。此外，TLR4信号通路还负责参与炎症的趋化因子(MCP-1，MIP-2)和细胞因子(TNF-α，IL-6)的产生(Pushpakumar S.et al,2017,Sci Rep.7:6349)。TLR4抑制剂的开发和阻断TLR4信号传导的策略显示了治疗炎症和氧化应激相关疾病的潜力(Carrillo-Sepulveda M.A.et al,2015,J MolMed(Berl).93:1341,Hsu H.Y.et al,2017,Sci Rep.7:44990)，表明TLR4信号传导与氧化应激之间存在密切关系。
关节炎主要分为感染性关节炎和非感染性关节炎，非感染性关节炎主要分为类风湿性关节炎、骨关节炎和痛风性关节炎。关节炎症状包括肿胀、疼痛、僵硬和运动范围缩小。症状可能会出现并消失，可以是轻度，中度或重度。炎症症状可能会停留几年，但随着时间的推移可能会进一步恶化。严重的关节炎会导致剧烈疼痛，无法进行日常活动，包括行走或爬楼梯。关节炎可以导致永久性关节改变，这些变化可能是可见的，如手指关节的变形，但通常只能在X射线上看到损伤。某些类型的关节炎也影响心脏、眼、肺、肾和皮肤甚至引发炎症因子风暴。关节炎的主要致病机制涉及许多类型的细胞，尤其是巨噬细胞，T和B细胞，纤维母细胞，软骨细胞和树突状细胞。大多数患者的炎症反应表现为细胞白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子大量的分泌，炎症因子大量涌入炎症细胞加强炎症反应。IL-1β是痛风性关节炎发病机制中的重要炎症因子，因此抑制其产生被广泛认为是实现抗炎的有效手段。
根据类风湿性关节炎的病理学，通常用于治疗类风湿性关节炎的药物为非甾体抗炎药(NSAIDs)和皮质激素类抗炎药。大多数非甾体类抗炎药作为环氧合酶的非选择性抑制剂发挥抗炎和镇痛作用，副作用包括胃肠不适、腹泻、并增加心脏病的风险以及其他副作用导致肾衰竭，而激素类药物又会使患者产生依赖反应。因此迫切需要开发了一种全面和安全的用于治疗痛风的替代药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物，包括透明质酸主链和含氟酸酐侧链，所述的透明质酸和含氟酸酐通过酰胺键连接，所述的氟化透明质酸衍生物的分子量为35-45kDa，具有溶解性强，无毒、无免疫原性的优点。
进一步的，所述的一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物的结构式如下：
Figure BDA0001729230020000031
其中R可以为：
-CF3-CHF2-CH2F
Figure BDA0001729230020000032
本发明的另一个目的是提供一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物的制备方法如图1，具体步骤如下：
步骤1：透明质酸的去乙酰化反应
6g的完整透明质酸与3g的硫酸联氨溶于300mL的一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在55-65℃水浴条件下反应72-96h后，反应在冰冷水浴中淬灭反应，产物用冷乙醇沉淀。该产物用冷乙醇洗涤两次并在室温下真空干燥，抽滤后冻干。将干燥的聚合物重新溶解于100mL的5％的乙酸和60mL的0.5mol/L的碘酸的混合液中，将混合物放置在4℃条件下保持1-2h。向化合物中加入17.5mL的57％碘甲烷，搅拌反应15min。将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用150mL乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色。用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.0-7.5，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥。然后将产物溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品5天，冷冻后，真空冷冻干燥，所得去乙酰化的比例为30-40％，分子量为40-50kDa。
步骤2：氟化透明质酸衍生物的合成
称取0.1g的去乙酰化的透明质酸溶于30mL的蒸馏水中，加入6mL的饱和碳酸氢钠溶液，配置6mL 10％(v/v)含氟酸酐的无水乙醇溶液，并加入到碳酸氢钠和乙酰化的透明质酸的混合溶液中在室温下搅拌反应1.5min-4h，随后，反应在沸水浴中淬灭5min。旋转蒸发掉反应混合物中的残余乙醇，将剩余的混合物透析5天，冷冻后，真空冷冻干燥得到氟化透明质酸衍生物。
进一步的：所述的步骤1中的将冻干后的聚合物重新溶解于5％的乙酸和0.5mol/L的碘酸的混合液中，放置在4℃条件下保持1.5h。
进一步的：所述的步骤2中的加入到碳酸氢钠和去乙酰化的透明质酸的混合溶液中在室温下搅拌反应3h。
本发明还有一个目的是提供一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物在治疗关节炎中的应用。
有益效果如下：
本发明涉及的具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物，透明质酸的去乙酰化反应得到的去乙酰化的透明质酸与含氟的酸酐反应，得到抗炎药物或药物载体，其分子量约为35-45kDa，修饰度为20％-40％。
本发明提供的透明质酸衍生物减少关节炎模型大鼠炎症细胞的浸润；降低关节炎模型大鼠脚掌组织匀浆中白介素IL-1和白介素IL-6的表达，无细胞毒性，是优质的抗炎药物或药物载体，其多阴离子特性可以和阳离子药物形成缀合物，也可与阳性脂质体包裹的非极性药物形成缀合物。
附图说明
图1为本发明的具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物合成路线图；
图2为三氟乙酰化透明质酸的核磁分析图(1H NMR)，10mg透明质酸(HA)、去乙酰化透明质酸(DHA)和三氟乙酰化透明质酸(TFHA)分别溶在重水中；
图3为三氟乙酰化透明质酸的核磁分析图(19F NMR)；
图4为三氟乙酰化透明质酸的质谱图，其中A-B TFHA的两个特征片段的质荷比分别为450.1182和472.1021，C-D TFHA的两个特征片段质荷比的同位素模式；
图5为TFHA的琼脂糖凝胶电泳图；
图6为动物实验流程图；
图7大鼠组织样品白介素-1ELISA结果对比图；&p<0.05,TFHA高剂量组对比TFHA低剂量组，TFHA与模型组、地塞米松组均无显著性差异；
图8为大鼠组织样品白介素-6ELISA结果对比图；**p<0.01,TFHA高剂量组对比模型组；**p<0.01,TFHA低剂量组对比模型组；TFHA与地塞米松组无显著性差异；
图9为关节炎组织H&E染色情况图；
图10为在TFHA浓度在5-700μg PC-3的细胞活跃性MTT检测曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进一步详细的说明。
制备实施例1
步骤1：透明质酸的去乙酰化反应
6g的完整透明质酸与3g的硫酸联氨溶于300mL的一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在65℃水浴条件下反应72h后，反应在冰冷水浴中淬灭反应，产物用冷乙醇沉淀。该产物用冷乙醇洗涤两次并在室温下真空干燥，抽滤后冻干。将干燥的聚合物重新溶解于100mL的5％的乙酸和60mL的0.5mol/L的碘酸的混合液中，将混合物放置在4℃条件下保持1.5h。向化合物中加入17.5mL的57％碘甲烷，搅拌反应15min。将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用150mL乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色。用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.0，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥。然后将产物溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品5天，冷冻后，真空冷冻干燥；所得去乙酰化的比例为40％，分子量为50kDa。
步骤2：氟化透明质酸衍生物的合成
称取0.1g的去乙酰化的透明质酸溶于30mL的蒸馏水中，加入6mL的饱和碳酸氢钠溶液，配置6mL 10％(v/v)含氟酸酐的无水乙醇溶液，并加入到碳酸氢钠和乙酰化的透明质酸的混合溶液中在室温下搅拌反应3h，随后，反应在沸水浴中淬灭5min。旋转蒸发掉反应混合物中的残余乙醇，将剩余的混合物透析5天，冷冻后，真空冷冻干燥得到氟化透明质酸衍生物。
制备实施例2
步骤1：透明质酸的去乙酰化反应
6g的完整透明质酸与3g的硫酸联氨溶于300mL的一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在55℃水浴条件下反应96h后，反应在冰冷水浴中淬灭反应，产物用冷乙醇沉淀。该产物用冷乙醇洗涤两次并在室温下真空干燥，抽滤后冻干。将干燥的聚合物重新溶解于100ml的5％的乙酸和60mL的0.5mol/L的碘酸的混合液中，将混合物放置在4℃条件下保持1h。向化合物中加入17.5mL的57％碘甲烷，搅拌反应15min。将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用150mL乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色。用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.5，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥。然后将产物溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品5天，冷冻后，真空冷冻干燥。所得去乙酰化的比例为30％，分子量为40kDa。
步骤2：氟化透明质酸衍生物的合成
称取0.1g的去乙酰化的透明质酸溶于30mL的蒸馏水中，加入6mL的饱和碳酸氢钠溶液，配置6mL 10％(v/v)含氟酸酐的无水乙醇溶液，并加入到碳酸氢钠和乙酰化的透明质酸的混合溶液中在室温下搅拌反应1.5，随后，反应在沸水浴中淬灭5min。旋转蒸发掉反应混合物中的残余乙醇，将剩余的混合物透析5天，冷冻后，真空冷冻干燥得到氟化透明质酸衍生物。
制备实施例3
步骤1：透明质酸的去乙酰化反应
6g的完整透明质酸与3g的硫酸联氨溶于300mL的一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在60℃水浴条件下反应79h后，反应在冰冷水浴中淬灭反应，产物用冷乙醇沉淀。该产物用冷乙醇洗涤两次并在室温下真空干燥，抽滤后冻干。将干燥的聚合物重新溶解于100ml的5％的乙酸和60mL的0.5mol/L的碘酸的混合液中，将混合物放置在4℃条件下保持至少2h。向化合物中加入17.5mL的57％碘甲烷，搅拌反应15min。将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用150mL乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色。用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.2，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥。然后将产物溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品5天，冷冻后，真空冷冻干燥。所得去乙酰化的比例为35％，分子量为45kDa。
步骤2：氟化透明质酸衍生物的合成
称取0.1g的去乙酰化的透明质酸溶于30mL的蒸馏水中，加入6mL的饱和碳酸氢钠溶液，配置6mL10％(v/v)含氟酸酐的无水乙醇溶液，并加入到碳酸氢钠和乙酰化的透明质酸的混合溶液中在室温下搅拌反应4h，随后，反应在沸水浴中淬灭5min。旋转蒸发掉反应混合物中的残余乙醇，将剩余的混合物透析5天，冷冻后，真空冷冻干燥得到氟化透明质酸衍生物。
对透明质酸、去乙酰化透明质酸和三氟乙酰化透明质酸的核磁共振检测如下：
HA，透明质酸；DHA，部分去乙酰HA；TFHA，部分三氟乙酰化HA；GlcA，D-葡萄糖醛酸；GlcNAc，N-乙酰-D-葡糖胺；GlcN，D-葡糖胺；GlcNBu，N-丁基-D-葡糖胺。在重水(D2O)中制备10mg/ml的溶液。使用500MHz Bruker核磁共振仪在348K下记录10mg样品在重水中的1H NMR谱。在透明质酸多糖中，每个二糖单元(-N-乙酰葡糖胺-葡萄糖醛酸-,GlcNAc-GlcA)中有两个端基质子，GlcNAc中有三个甲基质子，对应于甲基质子的信号与对应于端基质子的信号的积分比为1.5。在去DHA的1H NMR谱中，2.4-2.5ppm处的三个甲基质子对4.9-5.3ppm处GlcNAc和GlcA的两个端基质子在处的积分比为Y，如图2所示，去乙酰化程度可根据下式计算：去乙酰化(％)＝[1.0-(Y/1.5)]·100％。TFHA的1H NMR谱除显示两个端基质子质子信号的化学位移与DHA相比有略微的改变。在19F NMR谱中可以看到TFHA的信号在-75.6ppm，如图3所示。
对的三氟乙酰化透明质酸的核磁分析如下：
如图2所示，透明质酸二糖单位(GlcNAc-GlcA)部分去乙酰化，即部分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)转化为氨基葡萄糖(GlcN)。在5.09-5.08ppm处观察到GlcNAc-GlcA单元中对应于GlcNAc的端基质子作为双重峰。观察到GlcNAc-GlcA单元中GlcA的端基质子也在4.94-4.93ppm处呈双重峰。在5.18-5.31ppm处新近可见的较小峰，对应GlcN-GlcA单元的端基质子。观察到GlcN-GlcA单元中GlcN的端基质子在5.09-5.08ppm，呈双重峰。GlcNAc-GlcA单元中GlcA的端基质子也在4.94-4.93ppm被观察到呈双重峰。而在5.18-5.31ppm处可见新出现的较小峰，对应GlcN-GlcA单元的端基质子。在5.09-5.08ppm观察到GlcN-GlcA单元中GlcN的端基质子呈双重峰。在4.94-4.93ppm观察到，GlcN-GlcA单元中的GlcA的端基质子也呈双峰。在谱图中，三个甲基质子与端基质子的积分比计算为1.13。从这个比例计算出HA的去乙酰化的百分比为35％。NMR数据如下，HA:δ2.50(s,-CH3),δ4.40-3.83(m,other Hs onsugar ring),δ5.09-5.08(d,anomeric H on GlcNAc of HA),δ4.94-4.93(d,anomeric Hon GlcA of HA)。DHA:δ2.50(s,-CH3),δ4.45-3.84(m,other Hs on sugar ring),δ5.10-(d,anomeric H on GlcNAc of HA),δ4.95(d,anomeric H on GlcA of HA),δ5.31(d,anomeric H on GlcNAc of DHA),δ5.18(d,anomeric H on GlcA of DHA)。TFHA:δ2.50(s,-CH3),δ4.40-3.83(m,other Hs on sugar ring),δ5.10-5.09(d,anomeric H onGlcNAc of HA),δ4.94-4.93(d,anomeric H on GlcA of HA),δ5.22(d,anomeric H onGlcNAc of TFHA),δ5.13(d,anomeric H on GlcA of TFHA)。δ-75.6(3F of TFHA)如图3所示。
对制备实施例1得到的三氟乙酰化透明质酸的质谱分析如下：
使用配备有以扫描模式操作的电喷雾离子源的Triple-TOF 5600质谱仪(SCIEX，Concord，Canada)对样品进行分析。注射泵优化的MS参数如下：源温度＝550℃；离子喷雾电压＝-4500V；喷雾器气体(N 2)压力＝25psi，加热器气体(N 2)压力＝50psi，帘式气体压力＝25psi，DP＝-100V和CE＝-35eV。通过注射泵将浓度为10μg/ml的样品注射到质谱仪中，以TOF-MS扫描模式扫描HA及其衍生物的特定片段，如表1所示。数据采集由Analyst 1.6.1软件控制。在通过注射泵输注到Q-TOF MS系统后，以TOF-MS模式扫描样品溶液。从中可以观察到，质子数/电荷数的比值(m/z)值与预测的m/z非常相似，如表1所示。在HA样品的质谱中观察到GlcNAc和GlcA的m/z为396.1160，GlcNAc和GlcA的四糖观察到单电荷的m/z为(775.2257,797.2076)，双电荷的m/z为387.1089。通过TOF-MS光谱观察到的GlcN和GlcA另外的单电荷二糖(m/z 354.1053)，显示DHA样品由部分脱乙酰HA组成。如图4的A-D所示，A-BTFHA的两个特征片段的质荷比分别为450.1182和472.1021，C-D TFHA的两个特征片段质荷比的同位素模式，在TFHA的TOF-MS谱中观察到的另外的单电荷二糖GlcNTF和GlcA(m/z472.1024)显示样品含有部分三氟乙酰化的HA。在这些特定片段中，所有样品中GlcNAc和GlcA的单电荷双糖(理论值m/z 396.1142)是最充足的，因此我们使用该信号作为目标峰。如表1所示，根据目标峰计算其他相关峰的相对强度。得出透明质酸的三氟乙酰化程度为29％。
表1：
TFHA 分子式 理论值 观测值 百分比
C14H22NO12(-) 396.1142 396.112 5459 100％
C14H19NO12F3(-) 450.0865 450.1184 222.5 4％
C14H18NO12F3Na(-) 472.0684 472.1024 1593 29％
C28H37N2O23F6(-) 883.1697 NA
C28H36N2O23F6Na(-) 905.1516 NA
C28H36N2O23F6(2-) 441.0812 NA
对三氟乙酰化透明质酸分子量的测定如下：
通过琼脂糖凝胶电泳测得HA及其衍生物的分子量，使用含有400mM Tris，50mM乙酸和9mM EDTA的Tris-乙酸盐-EDTA(TAE)缓冲液中的0.75(w/v)的琼脂糖凝胶对样品进行表征。称量Tris 48.4g，乙二胺四乙酸二钠7.44g，混合装入1L的烧杯中，向烧杯中加入800mL蒸馏水并搅拌至完全溶解，然后加入11.4mL的冰醋酸，充分搅拌后用去离子水定容至1L。用TAE缓冲液配置0.02wt％溴酚蓝和2M蔗糖制备样品上样缓冲液。称量6.846g蔗糖和0.002g溴酚蓝放置于于15mL的离心桶中，加入1mL的10×的TAE缓冲液和9mL的去离子水，震荡至完全溶解。待测样品制备成浓度为1mg/ml,将15μL样品和3μL上样缓冲液混合，加样。样品在100V下迁移90min，直到跟踪染料迁移到凝胶边缘。迁移结束后，将凝胶用0.005％(w/v)Stains-All在50％(v/v)乙醇中，量取200mL的无水乙醇和200mL的蒸馏水混合，配置成50％(v/v)乙醇溶液，称量Stains-All 0.02g并溶于50％(v/v)乙醇溶液中。待完全溶解后，将凝胶移入染色液中染色48h，期间保持在避光。染色后，将凝胶置于10％(v/v)乙醇中。量取160ml的无水乙醇和240ml的蒸馏水混合，配制成40％(v/v)的乙醇溶液，对凝胶进行脱色48h，期间保持在避光，在此期间脱色溶液需更换三次。如图5所示，通过琼脂糖凝胶电泳估计TFHA分子量。以15-30kDa HA作为标准品，测得TFHA的分子量为20-30kDa。
如图6建立所示关节炎大鼠模型，雄性Sprague-Dawley大鼠，4周，体重在180g，距足踝0.5cm处脚掌皮下注射100μg完全弗氏佐剂。建模后2h剂建模后第2天给药，距足踝0.5cm处脚掌皮下注射阳性对照药地塞米松50μg或TFHA25μg，50μg，第2到5天测量右脚踝的大小。
三氟乙酰化透明质酸抗炎活性的评价如下：
第6天处死后取脚掌组织，采用ELISA试剂盒检测脚掌组织匀浆中细胞炎症因子，IL-1、IL-6和TNTα的水平。图7为组织样品IL-1的ELISA结果，&p<0.05，TFHA高剂量组对比TFHA低剂量组，高剂量TFHA可以降低关节炎模型大鼠脚掌组织匀浆中IL-1的表达。图8为组织样品IL-6ELISA结果，**p<0.01,TFHA高剂量组对比模型组；**p<0.01,TFHA低剂量组对比模型组；TFHA与地塞米松组无显著性差异。TFHA可以降低关节炎模型大鼠脚掌组织匀浆中IL-6的表达。大鼠脚掌组织切片染色结果如图9所示，建模组呈现大量炎症细胞组织浸润，且肌肉纤维组织杂乱无章。地塞米松给药组相对于模型组并无明显治疗效果，低剂量和高剂量的TFHA给药组明显减少模型大鼠脚掌组织中炎症细胞的浸润，并且使得部分组织纤维恢复条理性。基于TFHA和市售抗炎药地塞米松对炎症大鼠脚掌组织促炎因子水平及组织切片炎症细胞浸润程度的影响的综合分析，得出TFHA的抗炎活性优于地塞米松，且具有成为新型、多效性的生物类似物抗炎药物的潜质。
三氟乙酰化透明质酸细胞毒性的评价如下：
采用MTT检测在TFHA浓度在5-700μg PC-3的细胞活跃性。如图10所示，三氟乙酰化透明质酸无细胞毒性，可用于靶向性药物载体的制备，其多阴离子特性可以和阳离子药物形成缀合物，也可与阳性脂质体包裹的非极性药物形成缀合物。

Claims (5)

1.一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物，其特征在于：包括透明质酸主链和含氟酸酐侧链，所述的透明质酸和含氟酸酐通过酰胺键连接，所述的氟化透明质酸衍生物的分子量为20-30kDa；所述的氟化透明质酸衍生物包括如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中R为：
-CF3、-CHF2或-CH2F。
2.一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物的制备方法，具体步骤如下：
步骤1、透明质酸的去乙酰化反应
将透明质酸与硫酸联氨溶于一水合肼中，搅拌至完全溶解后，在55-65℃水浴条件下反应72-96h后，在冰冷水浴中淬灭反应，得到的产物用冷乙醇沉淀，并用冷乙醇洗涤两次，在室温下真空干燥，抽滤后冻干；将冻干后的聚合物重新溶解于5％的乙酸和0.5mol/L的碘酸的混合液中，放置在4℃条件下保持1-2h；再加入57％碘甲烷，搅拌反应15min；将深紫色溶液转移到分液漏斗中，使用乙醚萃取紫色混合液，回收含部分脱乙酰透明质酸的水层，并用乙醚重复萃取直至完全褪色；用盐酸和氢氧化钠调节聚合物溶液的pH至7.0-7.5，用冷乙醇使脱乙酰透明质酸沉淀，用冷乙醇洗涤并干燥；将干燥后的产物溶于蒸馏水中，用8kDa分子透析袋透析样品，冷冻后再真空冷冻干燥得到去乙酰化的透明质酸；
步骤2：氟化透明质酸衍生物的合成
称取步骤1中的去乙酰化的透明质酸溶于蒸馏水中，加入饱和碳酸氢钠溶液，配置10％v/v含氟酸酐的无水乙醇溶液，再将含氟酸酐的无水乙醇溶液加入到碳酸氢钠和去乙酰化的透明质酸的混合溶液中在室温下搅拌反应15min-4h，随后反应在沸水浴中淬灭5min，旋转蒸发掉反应混合物中的残余乙醇，将剩余的混合物透析5天，冷冻后，真空冷冻干燥得到氟化透明质酸衍生物。
3.如权利要求2所述的一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中的将冻干后的聚合物重新溶解于5％的乙酸和0.5mol/L的碘酸的混合液中，放置在4℃条件下保持1.5h。
4.如权利要求2所述的一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中的再将含氟酸酐的无水乙醇溶液加入到碳酸氢钠和去乙酰化的透明质酸的混合溶液中在室温下搅拌反应3h。
5.如权利要求1所述的一种具有靶向性和抗炎活性的氟化透明质酸衍生物在制备治疗关节炎药物中的应用。
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