CN111334468A - 一种低分子量透明质酸片段诱发血红细胞钱串状聚集的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了低分子量透明质酸片段诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集的应用，其诱发红细胞钱串状聚集的最小浓度与透明质酸片段的分子量大小呈负相关关系，可用于测定低分子量透明质酸片段的分子量大小或测定其产品批间生产的分子量变异范围。本发明公开了低分子量透明质酸片段促进血红细胞沉降率，可用于测定产品批间生产的分子量变异程度。本发明公开了平均分子量35kDa的低分子量透明质酸片段诱发人红细胞钱串状聚集是通过结合人红细胞表面CD44，可利用其进行低分子量透明质酸片段的活性检测。本发明还公开了平均分子量35kDa的透明质酸片段对人中性粒细胞活化有抑制作用，可作为预防和治疗中性粒细胞活化和释放各种氧化物质相关炎症性疾病的药物应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种低分子量透明质酸片段诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集的应用。
背景技术
人用高分子透明质酸皮下组织注射液主要用于美容，有多种产品，包括Restylane，其分子量大于1.0x106daltons。人美容用透明质酸皮下组织注射液可用于隆鼻、丰唇和除皱纹等多种美容用途(1、2、3)。由于Restylane分子量大，粘度也大，其分子量都使用粘度计测定。还由于，Restylane分子量和粘度大，皮下注射局部不良反应也较多，包括局部注射炎症反应红、肿、硬、痛。较严重的不良反应是注射局部小血管凝血堵塞和由其引发的溃疡(4)。
理论上，较低分子量的透明质酸皮下注射产品局部不良反应也较小，即局部小血管堵塞的可能性较小。因此，较低分子量的透明质酸静脉血管注射也成为可能，如马专用Legend Multi Dose for intravenous use in horse only(Bayer Corporation)，其分子量3.0x105daltons(www.equinelegend.com)(5)。低分子量的透明质酸注射产品分子量用粘度计测定不准，目前主要使用凝胶电泳和多角度激光方法测定(6、7)。
文献研究(8、9、10、11)表明人初乳纯化出的透明质酸片段HA35的分子量平均35kDa。文献研究还表明人乳肪组织有透明质酸酶PH20(12)。本发明人使用重组人透明质酸酶PH20制造了平均分子量35±8kDa的透明质酸片段B-HA(13、14)。本发明人发现重组人透明质酸酶PH20充分酶解制造的透明质酸片段B-HA商业化产品(Medical device type1，LUQIN Food Drug Medical Device registration number:20190021)有明确的人皮肤和粘膜抗炎活性，包括对人皮肤粘膜临床炎症表现红肿硬痛有显著治疗作用(如图1所示)，并在本地报道了这个临床抗炎作用和申报了专利(14、15、16、17、18、19、20、21)。
以上文献研究提示HA35或平均分子量35±8kDa的透明质酸片段B-HA的商业化产品，需要敏感的低分子量透明质酸皮下组织注射产品分子量测定方法，以控制商业化产品分子量在可以接受的范围内。另外，针对低分子量透明质酸片段，尤其是平均分子量35±8kDa的透明质酸片段的生物活性的作用机制和新的生物活性以及潜在新临床应用的研究还有限(22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36)，还需进一步研究和开发。
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发明内容
本发明要解决的技术问题是研究低分子量透明质酸片段，尤其是平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的生物活性的作用机制和新的生物活性以及潜在新临床应用。
本发明意外地发现透明质酸片段诱发人和动物全血(末梢血和静脉血)红细胞钱串状聚集(见下方注解和参考图3)，其诱发红细胞钱串状聚集的最小浓度在低分子范围内与透明质酸片段的分子量负相关。本文针对这个发现进行了深入研究。注：红细胞聚集(Erythrocytes aggregate)是一种可以逆转的哺乳动物红细胞聚集现象。哺乳动物红细胞象多个硬币摞在一起形成的聚集叫红细胞钱串状聚集(erythrocyte rouleauxformation)。
基于上述研究获得如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种低分子量透明质酸片段诱发红细胞钱串状聚集的应用。
进一步地，利用低分子量透明质酸片段诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小之间呈负相关的关系，测定低分子量透明质酸片段的分子量大小或测定低分子量透明质酸片段产品批间生产的分子量变异范围。
进一步地，所述末梢血或静脉血为人、猫、犬或大鼠的末梢血或静脉血。
进一步地，所述低分子量透明质酸片段为平均分子量35±8kDa的透明质酸片段产品；其诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度为0.15％。
进一步地，利用低分子量透明质酸片段诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集程度不同造成的血红细胞沉降率不同，敏感测定低分子量透明质酸片段产品批间生产的分子量微小变异范围。
进一步地，所述末梢血或静脉血为人、犬或大鼠的末梢血或静脉血；所述低分子量透明质酸片段为平均分子量35±8kDa的透明质酸片段产品；测定批间生产的分子量变异范围时，所述平均分子量35±8kDa的透明质酸片段产品终浓度为0.075％。
另一方面，本发明还提供了一种平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的活性检测方法，所述低分子量透明质酸片段通过结合红细胞表面CD44诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集；所述检测方法为对平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段进行CD44结合活性测定。
进一步地，利用10ug/ml的抗人CD44抗体抑制平均分子量35±8kDa的透明质酸片段结合CD44。
再一方面，本发明还提供了一种平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的应用，所述低分子量透明质酸片段与人中性粒细胞快速结合并进入中性粒细胞；所述应用为在制备治疗中性粒细胞相关炎症性疾病药物中应用。
再一方面，本发明还提供了一种平均分子量35kDa的低分子量透明质酸片段的应用，所述低分子量透明质酸片段通过结合红细胞和/或白细胞表面CD44或白细胞表面直接和/或间接抑制人中性粒细胞活化和释放各种氧化物质；所述应用为作为抑制人中性粒细胞活化和释放各种氧化物质的抑制剂的应用或在制备治疗中性粒细胞活化和释放各种氧化物质相关炎症性疾病药物中应用；所述应用对人和其它动物效果不一样或有效的程度不一样。
综上所述，本发明发现透明质酸片段在低分子量范围内诱发人和动物末梢血和静脉血红细胞钱串状聚集，其诱发红细胞钱串状聚集的最小浓度与透明质酸片段的分子量大小负相关关系。本发明利用这个负相关关系测定低分子量透明质酸片段的分子量和测定低分子量透明质酸片段产品批间生产的分子量变异范围。具体可以使用猫、犬和大鼠静脉血和其诱发红细胞钱串状聚集来测定低分子量透明质酸片段产品的分子量和分子量变异情况。本发明也发现透明质酸片段在低分子量范围内促进血红细胞沉降速度。本发明首次利用这个透明质酸片段对血红细胞沉降速度的作用测定低分子量透明质酸片段产品批间生产的分子量变异程度，形成了透明质酸片段产品批间生产分子量变异质量检测方法。本发明进一步发现平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段B-HA诱发人红细胞钱串状聚集是通过结合人红细胞表面CD44，其本质反映了这个低分子量透明质酸片段结合红细胞表面CD44的活性，利用发现测定平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的生物活性。本发明还发现人中性粒细胞吞噬平均分子量35±8kDa的透明质酸片段B-HA，但不影响人中性粒细胞吞噬外源荧光颗粒的功能。本发明进一步发现低分子量的透明质酸片段与人血红细胞表面结合和影响人血细胞血液动力学行为或血细胞和白细胞互相间作用。平均分子量35±8kDa的透明质酸片段B-HA对人中性粒细胞活化有抑制作用，结合其组织渗透性好的特点，提示其对人体组织炎症有抑制作用。本发明还进一步发现低分子量透明质酸片段诱发红细胞钱串状聚集和促进血红细胞沉降的这种影响血管内血红细胞血液动力学和红细胞与白细胞互相间反应的作用有种属特异性，提示低分子量透明质酸片段的生理功能、治疗作用和副作用有种属特异性。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1为重组人透明质酸酶PH20充分酶解大分子透明质酸原料制造的平均分子量35±8kDa透明质酸片段B-HA抑制人皮肤红肿硬痛图解；
图2为不同分子量的透明质酸片段诱发人末梢血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线；
图3中，(a)是终浓度0.15％B-HA(或HA fragments 35kDa或HA35)诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；(b)是10ug/ml的抗人CD44抗体抑制B-HA诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；(c)是非特异性兔IgG抗体没有抑制B-HA诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；(d)是终浓度1927U/ml加入的重组人透明质酸酶PH20抑制B-HA诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；
图4为不同分子量的透明质酸片段诱发猫静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线；
图5为不同分子量的透明质酸片段诱发犬静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线；
图6为不同分子量的透明质酸片段诱发大鼠静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线；
图7为B-HA组和荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)50个多核中性粒细胞含有荧光颗粒和团块的单细胞照片和百分率图；
图8为B-HA和HA对人中性粒细胞吞噬荧光颗粒的效果图；
图9为不同批次的B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)产品的凝胶电泳分子量批间测定结果；
图10为HA fragments 24kDa(FRD)的凝胶电泳分子量批内变异测定结果图；
图11为B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)和HA原料1600kDa(FRD)(图中称HA)对PMA诱导的新鲜人白细胞活化(neutrophil activation)的作用。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明进行说明，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
目的：本发明使用的不同分子量的透明质酸片段和原料透明质酸的制备和分子量测定。
方法：
生物酶法制造低分子量透明质酸片段：采用预实验确定生物酶PH20足量或轻微过量充分酶解和非足量部分酶解透明质酸原料制造低分子量透明质酸片段。透明质酸酶足量或轻度过量充分酶解的定义为：(1)10-20分钟足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量和1-6小时足量或轻度过量充分酶解中和高分子透明质酸原料制造的透明质酸片段的分子量基本一致(变异系数CV<15％)；(2)>99％高或中分子透明质酸原料被足量或轻度过量充分酶解的低分子透明质酸片段产物被0.22um滤膜全部顺利滤过；(3)透明质酸酶活性经足量或轻度过量充分酶解反应后基本没有残留或少量残留(<15％)，80度45分钟全部灭活。透明质酸酶解制造的时间点包括：10分钟、20分钟、40分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时。
理化生产方法制造透明质酸片段结合了酸、碱、高温制造方法。
分子量测定：透明质酸片段采用凝胶电泳和18角度激光测定。原料透明质酸采用粘度计和18角度激光测定。
结果：
表1.本实验使用透明质酸片段和原料透明质酸平均分子量和分子量分布。
注1：HA fragments 35kDa或HA35或B-HA或B-HA(HH)是6个不同批次的B-HA等量混合物，18角度激光(GPC/SEC system equipped withan multi angle laser lightscattering(MALLS)detector)测定结果为35±8kDa(表16)。
注2：理化结合生物酶制造HA fragments(24kDa)原本是FRD公司的Oligo HA，经本发明反复测定，其分子量和>90％分子量分布分别为24kDa和10-40kDa。
结论：表1中本实验使用的透明质酸片段和透明质酸原料的平均分子量和分子量分布是经2-3种方法多次评估的可靠结果。
实施例2
目的：研究不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料对人新鲜末梢血和静脉血的作用。
方法：
人末梢血和静脉血采集：健康志愿者共有8人，年龄22±5岁，男女各4名，末梢血和静脉血采集经长春嘉和外科医院的医学伦理委员会批准和本人同意。动物末梢血和静脉血采集均经青岛农业大学动物医院许可。
使用不同分子量的透明质酸片段或透明质酸原料(表1)与人末梢血或静脉血按照1:2的比例混合，加上抗凝剂EDTA和PBS缓冲液至终浓度分别为1.2％、0.6％、0.3％、0.15％、0.075％、0.0375％，既最终达到人末梢血和静脉血3.5倍稀释。然后，使用显微镜观察不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料(表1)引发的红细胞钱串状聚集情况，得出其诱发人末梢血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度。
结果：
表2.不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料诱发人末梢血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度。注：使用静脉血红细胞结果相同。
注：黑体字和斜体字共同代表引起血红细胞钱串样聚集形成的最低分子量透明质酸片段的浓度；*代表严重细胞变形。Yes/Yes/Yes或No/No/No代表三次使用不同人末梢血标本的实验结果。
图2表示不同分子量的透明质酸片段诱发人末梢血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线。
讨论：
诱发红细胞钱串状聚集的B-HA(HA35)终浓度为0.15％,既1.5mg/ml。本发明使用刺激新鲜提取人中性粒细胞功能的B-HA浓度为10ug/ml(实施例4)。一个平均体重70kg正常人体内含有约15克透明质酸，其中每天1/3被降解(Stern R，Hyaluronan catabolism:anew metabolic pathway，2004，Eur.J.Cell Biol.83(7):317–25.doi:10.1078/0171-9335-00392)。文献报道正常人血清透明质酸含量为28.5ng/ml，既0.028ug/ml(Mi-SoonHan,Yongjung Park,Hyon-suk Kim,Evaluation of automated assays formeasuring serum hyaluronic acid:for the diagnosis of rheumatoid arthritis,LabMed Online,2014,4(2):98-104.)，比10ug/ml低375倍。正常人血清中28.5ng/ml的透明质酸对我们使用的10ug/ml血浓度的B-HA影响不大。因此，10ug/ml血浓度的B-HA在血清中结合红细胞表面有影响人血细胞血液动力学行为或血细胞和白细胞互相间作用的可能性。
结论：本发明发现低分子量的透明质酸片段诱发人末梢血和静脉血红细胞钱串状聚集(图3)，其诱发人红细胞钱串状聚集的最小浓度与透明质酸片段的分子量负相关，可以用来测定低分子量透明质酸片段的分子量和监测低分子量透明质酸片段产品分子量变异情况。这个结果还表明低分子量的透明质酸片段与人血红细胞表面结合和影响人血细胞血液动力学行为或血细胞和白细胞互相间作用。
实施例3
目的：研究低分子量透明质酸片段HA fragments35kDa或HA35或B-HA诱发人末梢血和静脉血红细胞钱串状聚集的分子机制。
方法：
人末梢血和静脉血采集：健康志愿者共有8人，年龄22±5岁，男女各4名，末梢血和静脉血采集经长春嘉和外科医院的医学伦理委员会批准和本人同意。动物末梢血和静脉血采集均经青岛农业大学动物医院许可。
使用表1中的低分子量透明质酸片段B-HA(又称HA fragments35kDa或HA35)与人末梢血或静脉血按照1:2的比例混合至终浓度为0.15％，最终达到人末梢血或静脉血3.5倍稀释。然后，使用显微镜观察和验证低分子量透明质酸片段B-HA(又称HA fragments35kDa或HA35)引发的红细胞钱串状聚集。
使用小体积的抗人CD44抗体(0.5mg/ml,ab157107,Abcam)和对照非特异性兔IgG抗体(0.5mg/ml,ab171870，Abcam)或重组人透明质酸酶PH20(27000U/ml，HH Technology)与人末梢血或静脉血混合并37℃孵育25分钟，再加低分子量透明质酸片段B-HA，最终达到诱发人末梢血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和人末梢血或静脉血稀释3.5倍。然后，使用显微镜观察相关红细胞钱串状聚集程度。
结果：
图3中，(a)是终浓度0.15％B-HA(或HA fragments 35kDa或HA35)诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；(b)是10ug/ml的抗人CD44抗体抑制B-HA诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；(c)是非特异性兔IgG抗体没有抑制B-HA诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；(d)是终浓度1927U/ml加入的重组人透明质酸酶PH20抑制B-HA诱发人末梢血红细胞钱串状聚集图；注：使用静脉血红细胞结果相同。
讨论：
低分子透明质酸片段B-HA(HA35)诱发红细胞钱串状聚集。终浓度1927U/ml加入的PH20酶解阻断B-HA诱发红细胞钱串状聚集。这个结果表明B-HA(HA35)诱发的红细胞钱串状聚集是通过B-HA分子实现。另有实验结果表明终浓度1927U/ml加入的PH20在完全酶解B-HA(HA35)。
10ug/ml的抗人CD44抗体阻断B-HA(HA35)诱发红细胞钱串状聚集。这个结果表明B-HA诱发红细胞钱串状聚集是通过结合红细胞表面CD44。这个实验也是透明质酸片段和透明质酸结合CD44活性检测实验。
结论：本发明表明透明质酸片段B-HA(HA35)通过与红细胞表面CD44结合诱发红细胞钱串状聚集。
实施例4
目的:研究不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料诱发猫、犬和大鼠静脉血红细胞钱串状聚集的作用。
方法：
大鼠、犬和猫静脉血采集均经青岛农业大学动物医院许可。使用不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料(表1)与大鼠、犬或猫静脉血按照1:2的比例，加上抗凝剂EDTA和PBS缓冲液至终浓度分别为1.2％、0.6％、0.3％、0.15％、0.075％、0.0375％，最终达到大鼠、犬和猫静脉血3.5倍稀释。然后，使用显微镜观察不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料(表1)引发的红细胞钱串状聚集情况，得出其诱发大鼠、犬和猫静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度。
结果：
表3.不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料诱发猫静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度。
注：黑体字和斜体字共同代表引起血红细胞钱串样聚集形成的最低低分子量透明质酸片段的浓度；*代表严重细胞变形；#代表大块血红细胞钱串样聚集形成。
图4是不同分子量的透明质酸片段诱发猫静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线。
表4.不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料诱发犬静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度。
注：黑体字和斜体字共同代表引起血红细胞钱串样聚集形成的最低低分子量透明质酸片段的浓度；*代表严重细胞变形；#代表大块血红细胞钱串样聚集形成。
图5为不同分子量的透明质酸片段诱发犬静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线。
表5.不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料诱发大鼠静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度。
注：黑体字和斜体字共同代表引起血红细胞钱串样聚集形成的最低低分子量透明质酸片段的浓度；*代表严重细胞变形。
图6为不同分子量的透明质酸片段诱发大鼠静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小的相关曲线。
结论：本发明发现不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料诱发猫、犬和大鼠静脉血红细胞钱串状聚集。这个结果和低分子量的透明质酸片段诱发人末梢血和静脉血红细胞钱串状聚集的结果基本相同。本发明表明可以使用猫、犬和大鼠静脉血和其诱发红细胞钱串状聚集来测定低分子量透明质酸片段产品的分子量和分子量变异情况。
实施例5
目的：研究B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)与新鲜人血中性粒细胞的互相间作用。
方法：采用新鲜采集的人指尖血或静脉血与抗凝混匀，去除上层血清，用红细胞裂解液对红细胞进行裂解2次，PBS清洗一次，最后用PBS重悬，加入B-HA组和荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)15分钟内随机使用激光共聚焦显微镜观察50个多核中性粒细胞。
结果：本发明结果表明B-HA组50个中性粒细胞里边没有一个细胞内有荧光颗粒和团块。荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)组50个中性粒细胞里边有36个细胞有强荧光颗粒和团块。
图7为B-HA组和荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)50个多核中性粒细胞含有荧光颗粒和团块的单细胞照片和百分率。本发明使用荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)与人红细胞培养没有发现红细胞表面荧光标记现象。这个结果表明荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)的发光强度不足以探测其红细胞表面的结合。本发明使用荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)与提取人中性粒细胞或全血细胞培养。研究结果表明人中性粒细胞胞内颗粒有荧光标记现象(图7)。这个结果表明中性粒细胞吞噬和胞内浓缩了荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)或人中性粒细胞快速结合并摄入荧光标记B-HA(Cy5.5B-HA)。
结论：1.本研究表明低分子量透明质酸片段B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)快速结合人中性粒细胞和进入人中性粒细胞；2.本研究表明人中性粒细胞吞噬低分子量透明质酸片段B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)。
因此，本发明进一步探索了10ug/ml的B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)对人中性粒细胞吞噬异物荧光颗粒的作用。
方法：
本实验还使用糖密度梯度离心法，即人静脉血白细胞分离试剂盒(内毒素<0.1EU)(天津灏洋华科生物科技有限公司)，分离人静脉血。常温下采集人静脉血1800rpm离心25分钟，吸取单个核细胞层(淋巴细胞和少部分单核细胞)和多核细胞层(中性粒细胞为主)混合，充分裂解红细胞，反复清洗两次，用3ml含10％FBS的1640培养基重悬备用。采用白细胞分类染色液染色观察细胞形态，调整密度至1×106个/ml，再备用。每次采集不同志愿者的血液排除个体差异和确保实验可重复。
人中性粒细胞用含有10％FBS的RPMI-1640培养基，调整细胞密度至2×106个/ml。每孔加入200ul细胞，接种于24孔板中，加入10ug/ml B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)或10ug/ml HA或1ng/ml LPS刺激中性粒细胞。直径2um乳胶珠，羧酸盐改性聚苯乙烯(L3030Sigma-Aldrich)每孔加入3.5ul，调节荧光颗粒密度为2×107个/ml，建立中性粒细胞与荧光颗粒的最佳吞噬模型，37℃吞噬培养1h后，流式细胞仪(FACSCalibur美国PE公司)488nm波长激光器，收集波长为575nm的红色荧光，得出中性粒细胞的吞噬率，从而研究中性粒细胞的吞噬能力。实验完成后，再新鲜提取另外一人静脉血白细胞重复实验，确保实验结果可重复。
图8为B-HA和HA对人中性粒细胞吞噬荧光颗粒的效果。
10ug/ml的B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)与Blank相比较，P>0.05，无显著性差异。10ug/ml的HA原料1600kDa(FRD)(这里简称HA)与Blank相比较，P>0.05，无显著性差异；LPS与Blank相比较，0.01<P<0.05，显著性差异，验证本实验方法可靠。
结论：10ug/ml的B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)对人中性粒细胞吞噬异物荧光颗粒的作用没有影响。本发明表明人中性粒细胞吞噬B-HA(HA fragments 35kDa或HA35)，提示表面结合B-HA的红细胞和中性粒细胞有互相间作用(本段参考文献)。
本段参考文献：
1.Anel Lizcano,Ismael Secunodino,Simon Dohrmann,Ross Corriden,Cristina Rohena,Sandra Diaz,Pradipta Ghosh,Lingquan Deng,Victor Nizet andAjit Varki(2017),Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9on neutrophilsto supress activation,Blood,129(23):3100-3110.doi:10.1182/blood-2016-11-751636.
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实施例6
目的：研究不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发动物静脉血红细胞钱串状聚集的种属特异性。
方法：采集猴、羊、猪、牛、马、水貂、羊驼等不同动物的静脉血采集均经青岛农业大学动物医院许可。使用不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料(表1)与猴、羊、猪、牛、马、水貂、羊驼等不同动物的静脉血按照1:2的比例混合，加上抗凝剂EDTA和PBS缓冲液至终浓度分别为1.2％、0.6％、0.3％、0.15％、0.075％、0.0375％，既最终达到猴、羊、猪、牛、马、水貂、羊驼等不同动物的静脉血3.5倍稀释。然后，使用显微镜观察不同分子量的透明质酸片段和透明质酸原料(表1)引发的红细胞钱串状聚集情况，得出其诱发猴、羊、猪、牛、马、水貂、羊驼等不同动物的静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度。
结果：
表6.不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发猴静脉血红细胞钱串状聚集的结果。
注：黑体字和斜体字共同代表引起血红细胞聚集形成的最低透明质酸片段的浓度；*代表严重细胞变形；#代表大块血红细胞钱串样聚集形成。
讨论：猴血液红细胞在正常状态下也会存在红细胞两两相连的现象。HAfragments 24kDa(FRD)在终浓度0.6％时没有红细胞聚集现象。HA fragments35kDa或B-HA或HA35在终浓度0.3％、0.15％虽然诱发红细胞聚集，但是没有明显的钱串状聚集存在，其聚集程度也比较轻，与人HA fragments35kDa或B-HA或HA35诱发红细胞钱串状聚集明显不同。
表7.不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发羊静脉血红细胞钱串状聚集的结果。
表8.不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发猪静脉血红细胞钱串状聚集的结果。
注：黑体字和斜体字共同代表引起血红细胞钱串状聚集形成的最低透明质酸片段的浓度；*代表严重细胞变形；#代表大块血红细胞钱串样聚集形成。
表9.不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发牛静脉血红细胞钱串状聚集的结果。
注：Yes/Yes或No/No代表两次使用不同个体末梢血标本的实验结果。
表10.不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发马静脉血红细胞钱串状聚集的结果。
注：黑体字和斜体字共同代表引起血红细胞聚集形成的最低透明质酸片段的浓度；*代表严重细胞变形；#代表大块血红细胞钱串样聚集形成；Yes/Yes或No/No或No/Yes代表两次使用不同个体末梢血标本的实验结果。
表11.不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发水貂静脉血红细胞钱串状聚集的结果。
注：*代表严重细胞变形；#代表大块血红细胞钱串样聚集形成。
讨论：水貂血红细胞状态不好，加入被生理盐水稀释的血液中立刻皱缩变形。所以水貂血红细胞观察时，存在许多皱缩细胞。
表12.不同分子量透明质酸片段和透明质酸原料诱发羊驼静脉血红细胞钱串状聚集的结果。
注：Yes/Yes或No/No或Yes/No代表两次使用不同个体末梢血标本的实验结果；羊驼红细胞为椭圆形。
讨论：
本发明发现透明质酸片段诱发人和动物末梢血和静脉血红细胞钱串状聚集和促进血红细胞沉降。本发明进一步发现平均分子量35kDa的低分子量透明质酸片段B-HA诱发人红细胞钱串状聚集是通过结合人红细胞表面CD44(图3)，其本质反映了这个低分子量透明质酸片段结合红细胞表面CD44的活性。文献研究表明人白细胞(包括中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)通过其血液动力学改变从血管内移走渗出进入组织炎症区发挥炎症作用(本节参考文献1-8)。文献研究还支持透明质酸片段影响红细胞的血液动力学行为和影响白细胞功能(本节参考文献9-14)。例如，人体组织的低分子量透明质酸片段在炎症组织中产生并可能进入血循环被清理。文献研究还表明低分子量透明质酸片段结合的红细胞被肝和脾中性粒细胞和巨噬细胞吞噬清理(本段参考文献9-14)，提示中性粒细胞和巨噬细胞吞噬低分子量透明质酸片段和被低分子量透明质酸片段标记的红细胞。炎症组织中产生的低分子量透明质酸片段进入血循环与红细胞结合，可能与红细胞寿命有关。
本发明提示低分子量透明质酸片段诱发红细胞钱串状聚集和提示表明低分子量透明质酸片段的生理功能、治疗作用和副作用有种属特异性。换句话说，对人皮肤粘膜有抗炎作用的透明质酸片段HA fragments 35kDa或B-HA或HA35，对牛和羊甚至猴没有作用。
本段参考文献：
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结论：表2-5和6-12表明牛和羊与猴、马、猪、犬、大鼠、猫等其它动物完全不一样。这个结果表明低分子量透明质酸片段诱发红细胞钱串状聚集和红细胞沉降的这种影响血管内血红细胞血液动力学和红细胞与白细胞互相间行为的作用有种属特异性。这个种属特异性表明低分子量透明质酸片段的生物活性、治疗作用和副作用有种属特异性。换句话说，这个种属特异性表明低分子量透明质酸片段的生物活性对人和其它动物效果不一样或有效的程度不一样。
实施例7
目的：利用低分子量透明质酸片段诱发红细胞钱串状聚集造成的红细胞沉降率不同来测定透明质酸片段B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)产品的批间生产分子量变异程度。
方法：本发明利用低分子量透明质酸片段诱发血红细胞钱串状聚集的程度不同造成的红细胞沉降率不同来定量测定批间生产的透明质酸片段产品的分子量变异。利用血红细胞钱串状聚集程度不同造成的血球沉降率不同来定量测定批间生产的透明质酸片段产品的分子量变异。低分子量透明质酸片段B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)与新鲜采集的犬静脉血按照1:2的比例混匀加上抗凝剂EDTA和PBS缓冲液至终浓度分别为0.15％、0.11％、0.075％，既最终达到犬静脉血3.5倍稀释，吸取400ul混合好的血液至血沉管中，静置25min，过后计数血沉管中血液的下沉距离，计算血球的沉降率。
具体还包括18角度激光测定和凝胶电泳测定低分子量透明质酸片段B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)的分子量。
表13.测定终浓度0.15％、0.11％和0.075％的B-HA(又称HA35或HA fragments35kDa)对3.5倍稀释的人静脉血红细胞25分钟沉降率(cm/25minutes)的影响。
结论：1.使用B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)的终浓度(0.15％)高时批间变异小和测定灵敏度低；2.使用B-HA或HA35或HA fragments35kDa的终浓度(0.075％)低时批间变异大和测定灵敏度也高。
表14.测定终浓度0.15％、0.11％和0.075％的B-HA(又称HA35或HA fragments35kDa)对3.5倍稀释的犬静脉血红细胞25分钟沉降率(cm/25minutes)的影响。
结论：1.使用B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)的终浓度(0.15％)高时批间变异小和测定灵敏度低；2.使用B-HA(又称HA35或HA fragments35kDa)的终浓度(0.075％)低时批间变异大和测定灵敏度也高。
表15.测定终浓度0.15％、0.11％和0.075％的B-HA(又称HA35或HA fragments35kDa)对3.5倍稀释的大鼠静脉血红细胞25分钟沉降率(cm/25minutes)的影响。
结论：1.使用B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)的终浓度(0.15％)高时批间变异小和测定灵敏度低；2.使用B-HA(又称HA35或HA fragments35kDa)的终浓度(0.075％)低时批间变异大和测定灵敏度也高。
图9.不同批次的B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)产品的凝胶电泳分子量批间测定结果。
结果表明不同批次生产的B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)产品的凝胶电泳分子量批内测定变异小于30％。
表16.不同批次的B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)产品的18角度激光(GPC/SEC system equipped with an multi angle laser light scattering(MALLS)detector)测定结果。
结果表明批间变异CV＝22％。
图10为HA fragments 24kDa(FRD)的凝胶电泳分子量批内变异测定结果。
结果表明同一HA fragments 24kDa(FRD)样品的凝胶电泳分子量批内测定变异几乎观测不到。这个结果还表明凝胶电泳测定低分子量透明质酸片段方法稳定。
讨论：本发明进一步利用低分子量透明质酸片段诱发大鼠、犬和人血红细胞钱串状聚集程度不同造成的血球沉降率不同来定量测定批间生产的透明质酸片段产品的分子量变异，其测定灵敏度比观察红细胞钱串状聚集高。B-HA(又称HA35或HA fragments35kDa)商业化产品需要敏感的测定较低分子量的透明质酸片段皮下组织注射产品分子量的方法来监测产品分子量的变异情况。本发明首次利用低分子量透明质酸片段引发红细胞钱串状聚集造成的血球沉降速度不同，建立透明质酸片段产品批间生产分子量变异质量检测方法。
结论：利用低分子量透明质酸片段诱发大鼠、犬和人红细胞钱串状聚集造成的红细胞沉降率不同，其测定灵敏度高，可以用来测定透明质酸片段B-HA(又称HA35或HAfragments35kDa)产品的批间生产分子量微小变异程度，其灵敏度比18角度激光测定和凝胶电泳测定的灵敏度更好。
实施例8
目的：探索B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)结合人红细胞表面对人白细胞活化(neutrophil activation)的生物学和临床意义。
方法：先使用含有Ca2+和Mg2+和5.5mM glucose的HBSS(Thermo Scientific)将2x106新鲜提取的人中性粒细胞混合均匀。加入10ug/ml的OxyBURST Green H2HFF BSA(Molecular Probes)培育30分钟。每井接种5x105(24-well plate)或1.2x107(6-wellplate)人中性粒细胞，先加入10ug/ml HA(又称HA原料1600kDa)或B-HA(又称HA35或HAfragments 35kDa)或盐水培养30分钟，再加入终浓度25nM的Phorbol-12myristate13-acetate(PAM)活化30分钟。采用流式细胞仪测定中性粒细胞释放的ROS(reactive oxygenspecies)，结果表达为Mean florescence intensity(Mean±SD)。
结果
图11.B-HA(又称HA35或HA fragments 35kDa)和HA原料1600kDa(FRD)(图中称HA)对PMA诱导的新鲜人白细胞活化(neutrophil activation)的作用。
结果表明10ug/ml的B-HA和HA原料1600kDa(又称HA原料1600kDa,FRD)(图中称HA)都抑制了PMA诱导的新鲜人白细胞活化(neutrophil activation)。换句话说，低分子量的B-HA和高分子量的HA都抑制了能够移走到有病组织中性粒细胞的活化(neutrophilactivation)和其释放ROS自由基(free radicals)破坏人体组织。考虑到低分子量的B-HA渗透性远比高分子量的HA的渗透性好，低分子量的B-HA的临床应用价值更高。另外，即使高分子量的HA进入人体组织，也因其分子太大难于接近细胞和结合细胞相关受体产生作用。
人血液中红细胞数量比白细胞多1000倍。人血液中红细胞数量和白细胞表面保持密切接触。文献研究表明红细胞表面的Sialic acid结合白细胞表面的Ig-like lectins(Siglecs)抑制白细胞活化制造炎症。本发明意料之外地发现B-HA诱发红细胞钱串状聚集，参与了白细胞静止和活化的调解。不适当的白细胞活化诱发炎症性疾病，抑制不适当的白细胞活化可能是治疗炎症性疾病的一个有效途径。进一步使用新鲜人全血做B-HA ex vivo临床研究很有必要。
有文献表明sialic acid或表达sialic acid的细菌Group B steptococcus和透明质酸或表达透明质酸的细菌Group A steptococcus都与人中性粒细胞表面的Siglec-9结合，抑制人中性粒细胞oxydative burst,既产生强氧化物ROS或自由基参与人中性粒细胞相关的炎症反应(见本段参考文献9)。除了Siglec-9,本发明不排除透明质酸和透明质酸片段还可能通过其它受体和结合蛋白产生功能(见本段参考文献1-9)。
另外，本申请实施例6的研究表明这个B-HA抑制人白细胞活化的作用有种属特异性，既这个B-HA抑制人白细胞活化的作用对人和动物效果不同或有效的程度不同。
本段参考文献：
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结论：1.本发明结果提示渗透性好的低分子量的B-HA或HA35或HAfragments35kDa注射液有利于控制白细胞活化(neutrophil activation)程度在一个适当的水平范围内，有可能成为一个副作用小的抗炎(anti-inflammation)候选药物；2.这个B-HA抑制人白细胞活化的作用有种属特异性，既这个B-HA抑制人白细胞活化的作用对人和动物效果不同或有效的程度不同。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种低分子量透明质酸片段诱发红细胞钱串状聚集的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用低分子量透明质酸片段诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度和分子量大小之间呈负相关的关系，测定低分子量透明质酸片段的分子量大小或测定低分子量透明质酸片段产品批间生产的分子量变异范围。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述末梢血或静脉血为人、猫、犬或大鼠的末梢血或静脉血。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述低分子量透明质酸片段为平均分子量35±8kDa的透明质酸片段产品；其诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集的最小百分比浓度为0.15％。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用低分子量透明质酸片段诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集程度不同造成的血红细胞沉降率不同，敏感测定低分子量透明质酸片段产品批间生产的分子量微小变异范围。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在，所述末梢血或静脉血为人、犬或大鼠的末梢血或静脉血；所述低分子量透明质酸片段为平均分子量35±8kDa的透明质酸片段产品；测定批间生产的分子量变异范围时，所述平均分子量35±8kDa的透明质酸片段产品终浓度为0.075％。
7.一种平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的活性检测方法，其特征在于，所述低分子量透明质酸片段通过结合红细胞表面CD44诱发末梢血或静脉血红细胞钱串状聚集；
所述活性检测方法为对平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段进行CD44结合活性测定。
8.根据权利要求7所述的平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的活性检测方法，其特征在于，利用10ug/ml的抗人CD44抗体抑制平均分子量35±8kDa的透明质酸片段结合CD44。
9.一种平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的应用，其特征在于，所述低分子量透明质酸片段与人中性粒细胞快速结合并进入中性粒细胞；
所述应用为在制备治疗中性粒细胞相关炎症性疾病药物中应用；
所述应用对人和其它动物效果不一样或有效的程度不一样。
10.一种平均分子量35±8kDa的低分子量透明质酸片段的应用，其特征在于，所述低分子量透明质酸片段通过结合红细胞和/或白细胞表面CD44或白细胞表面直接和/或间接抑制人中性粒细胞活化和释放各种氧化物质；
所述应用为作为抑制人中性粒细胞活化和释放各种氧化物质的抑制剂的应用或在制备治疗中性粒细胞活化和释放各种氧化物质相关炎症性疾病药物中应用；
所述应用对人和其它动物效果不一样或有效的程度不一样。
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