CN104829697A - 一种与肿瘤坏死因子结合的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与肿瘤坏死因子(TNF-α)结合的多肽及其应用，本发明所述的多肽与TNF-α具有极高的亲合力，该多肽能够通过结合过量的TNF-α，使得与细胞凋亡相关的线粒体凋亡途径中促凋亡蛋白Bid下调，且抗凋亡蛋白Bcl-2上调，从而抑制TNF-α引起的细胞凋亡，可以用于制备治疗TNF-α相关疾病的药物。本发明还提供了一种在分子水平和细胞水平上筛选和研究多肽类拮抗剂对TNF-α生理作用的影响的方法及其应用，为开发低成本的抗TNF-α药物提供了有效方法。

Description

一种与肿瘤坏死因子结合的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种多肽及其应用，尤其涉及一种与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)有极高亲合力的多肽、试剂及其应用。
背景技术
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)是一种与系统性炎症密切相关的细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，其生物学功能复杂，与感染性疾病、自身免疫性疾病、器官衰竭等多种疾病有直接关系。比如，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种由自身免疫障碍引致的免疫系统攻击关节的长期慢性炎症。这种炎症会造成关节变形，并会因关节痛楚及磨损导致患者失去活动能力。由于在RA病人的关节滑液中可以检测到大量的TNF-α，以及TNF-α可以介导炎症反应导致疼痛，因此发展靶向TNF-α的生物制剂成为疾病治疗的重要策略之一。
目前以TNF-α为靶标的治疗药物，有的已经获准临床使用，在败血症、类风湿关节炎、克罗恩病、银屑病、心力衰竭等疾病的治疗中显示出特殊疗效。直接靶向TNF-α的药物主要是生物技术的重组蛋白类药物，具有副作用小、特异性很强、疗效好等特点，主要不足之处是需反复给药、用量大、并且价格昂贵。现有的直接靶向TNF-α的药物大致可分为两类：一类是TNF-α受体的融合蛋白药物；另一类是拮抗TNF-α的抗体类药物。前者如依那希普(Etanercept，TNF-αⅡ型受体融合蛋白)，后者如英夫利西(Infliximab，TNF-α选择性单克隆抗体)，均可用于活动性类风湿关节、活动性强直性脊柱炎等的治疗。
但是，目前靶向TNF-α的生物制剂仍面临以下问题：首先，单克隆抗体类的药物成本非常高，有研究者指出RA患者早期使用生物制剂治疗并不具有成本优势；其次，在对抗TNF-α治疗的安全性研究中发现，该类药物经中长期使用后会产生一些副作用，如在英夫利西和依那希普的临床实验中，患者上呼吸道感染，特别是结核感染的发病几率有所提高，心功能不全加重、超敏反应、神经损害和恶性肿瘤的危害亦有报道。因此，如何开发一种低成本、易合成、安全性高的靶向TNF-α药物，是实现有效治疗TNF-α相关疾病的关键。
发明内容
本发明提供了一种多肽及其应用，特别是一种与肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor，TNF-α)有极高亲合力的多肽、试剂及其应用。本发明通过合理设计能够特异性识别TNF-α的多肽片段，利用该多肽类拮抗剂的特点对TNF-α的生理作用进行调节，以替代现有的单克隆抗体，从而降低治疗成本，为抗TNF-α药物开发提供新思路和新方法。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种与肿瘤坏死因子(TNF-α)结合的多肽，所述多肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或具有所述多肽功能的、并对如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。
本发明中，所述变体为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的一个或多个精氨酸残基突变为其他种带正电的氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述其他种带正电的氨基酸残基为组氨酸、赖氨酸或精氨酸中的任意一种。
本发明中，所述变体还可以为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的一个或多个天冬氨酸残基突变为其他种带负电的氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述其他种带负电的氨基酸残基为谷氨酸。
本发明中，所述变体进一步还可以为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的一个或多个色氨酸残基突变为其他种疏水性氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述其他种疏水性氨基酸残基为苯丙氨酸。
优选地，所述变体具有如SEQ ID NO：2～18所示的氨基酸序列。
本发明中所述多肽的氨基酸序列具体如下所示：
SEQ ID NO:1IDDPCQDRTPRGARADPWYRG
SEQ ID NO:2IEEPCQDRTPRGARADPWYRG
SEQ ID NO:3IDDPCQERTPRGARADPWYRG
SEQ ID NO:4IDDPCQDHTPRGARADPWYRG
SEQ ID NO:5IDDPCQDKTPRGARADPWYRG
SEQ ID NO:6IDDPCQDRTPHGARADPWYRG
SEQ ID NO:7IDDPCQDRTPKGARADPWYRG
SEQ ID NO:8IDDPCQDRTPRGAHADPWYRG
SEQ ID NO:9IDDPCQDRTPRGAKADPWYRG
SEQ ID NO:10IDDPCQDRTPRGARAEPWYRG
SEQ ID NO:11IDDPCQDRTPRGARADPWYHG
SEQ ID NO:12IDDPCQDRTPRGARADPWYKG
SEQ ID NO:13IEDPCQDRTPRGARADPWYRG
SEQ ID NO:14IDEPCQDRTPRGARADPWYRG
SEQ ID NO:15IDDPCQDRTPRGARADPFYRG
SEQ ID NO:16IEEPCQERTPRGARAEPWYRG
SEQ ID NO:17IDDPCQDHTPHGAHADPWYHG
SEQ ID NO:18IDDPCQDKTPKGAKADPWYKG。
本发明中，与肿瘤坏死因子(TNF-α)结合的多肽的基本序列为一种序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。因考虑到SEQ ID NO：1中的带电氨基酸残基和疏水性氨基酸残基在与TNF-α的相互作用中具有极为重要的作用，因此，本发明中所列多肽序列还包括具有所述多肽功能的对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的带电氨基酸残基和疏水性氨基酸残基进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。
本发明中的多肽与肿瘤坏死因子(TNF-α)有高亲合力并能抑制其引起的细胞凋亡。
本发明中的所述多肽能够通过结合过量的TNF-α，调节与细胞凋亡相关的通路，例如AnnexinV/PI双阳性细胞比例的减少，线粒体膜电位的升高，Bid蛋白表达的下调以及Bcl-2蛋白表达的上调等，从而抑制TNF-α引起的细胞凋亡。具体地说，本发明针对TNF-α与感染性疾病、自身免疫性疾病、器官衰竭等多种疾病有直接关系的特点，发明了一种直接靶向TNF-α的新型多肽类拮抗剂。该多肽可以在分子水平、细胞水平抑制TNF-α发生作用，从而达到治疗与TNF-α相关疾病的目的，与抗TNF-α的抗体类药物相比，可大大降低治疗成本。
第二方面，本发明还提供了一种核酸，其包括编码如第一方面所述的多肽的核苷酸序列。
第三方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的核酸。
第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明还提供了一种多肽抑制剂，其包含如第一方面所述的多肽。
本发明中，所述的多肽抑制剂用于抑制肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡。
第六方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述的多肽或如第五方面所述的多肽抑制剂。
本发明中的药物组合物还包括药学上可接受的载体，在此不作特别限定。
第七方面，本发明还提供了如第一方面所述的多肽、第五方面所述的多肽抑制剂或第六方面所述的药物组合物在制备用于抗肿瘤坏死因子的药物中的应用。
第八方面，本发明还提供了如第一方面所述的多肽、第五方面所述的多肽抑制剂或第六方面所述的药物组合物在制备用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病的药物中的应用。
本发明中，当利用所述多肽治疗TNF-α相关疾病时，优选地，所述多肽的使用浓度与TNF-α的质量比为1:10-10:1，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1。
本发明中，在分子水平和细胞水平评价靶向TNF-α的多肽类药物的方法包括以下步骤：
1)在分子水平上，通过表面等离激元共振(Surface plasma resonance，SPR)技术，分析所述的多肽抑制剂与TNF-α的结合解离特性，发现其与TNF-α间存在强结合力，计算得到平衡解离常数KD为1.02×10-9M，结合速率常数Ka为3.16×104(1/MS)。
2)以小鼠的成纤维细胞系L929为模型，在细胞水平上评价该多肽对TNF-α细胞毒性的抑制，发现该多肽可以明显降低TNF-α对L929细胞的毒性。
3)通过光学显微镜对培养的细胞进行观察，对比细胞数量和细胞形态，发现单独使用TNF-α处理的细胞增殖明显减少，且出现凋亡小体。TNF-α与上述多肽共同处理细胞，细胞数量和状态均有所恢复。
4)利用阳离子染料(3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide，DioC6)检测细胞的线粒体膜电位，发现与正常细胞相比，使用TNF-α处理的细胞线粒体膜电位下降，表明TNF-α诱导产生细胞凋亡级联反应；TNF-α与上述多肽共同处理细胞，膜电位上升并接近正常细胞的水平。
5)通过流式细胞术，利用Annexin V/PI双染的方法，区分处于不同凋亡阶段的细胞。发现TNF-α诱导的细胞凋亡多处于晚期，TNF-α与上述多肽共同处理细胞，可大大减少处于晚期凋亡阶段的细胞数量。
6)通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)分析与细胞凋亡相关的细胞通路的调节。发现上述多肽能够诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，而减少促凋亡蛋白Bid的表达。从而证实上述多肽发挥作用是由于影响了线粒体凋亡途径。
因此，本发明的多肽序列，可通过结合TNF-α，减少机体中TNF-α的有效浓度，从而进一步抑制TNF-α诱导的细胞凋亡，其对设计靶向TNF-α的多肽类药物具有非常重要的意义。
本发明的一个实施方案是测定设计多肽与靶标TNF-α之间的特异性识别作用，以及在细胞水平和分子水平上研究该多肽对TNF-α的细胞毒性，TNF-α诱导的细胞凋亡和与凋亡相关的细胞通路的影响，包括如下步骤：
1)通过SPR技术测定多肽与TNF-α间的亲合力，获得平衡解离常数和平衡结合常数。
2)通过细胞活力实验和光学显微镜观察，以小鼠的成纤维细胞系L929为模型评价该多肽对TNF-α细胞毒性的抑制。
3)通过流式细胞术检测该多肽对TNF-α诱导的细胞凋亡的影响，包括对线粒体膜电位的测定，对处于不同凋亡时期的细胞进行区分。
4)通过蛋白质免疫印迹法分析与细胞凋亡相关的细胞因子含量的变化，从而在分子水平上研究该多肽对TNF-α诱导的细胞凋亡抑制的机理。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明中的所述多肽能够通过结合过量的TNF-α，调节与细胞凋亡相关的通路，例如AnnexinV/PI双阳性细胞比例的减少，线粒体膜电位的升高，Bid蛋白表达的下调以及Bcl-2蛋白表达的上调等，从而抑制TNF-α引起的细胞凋亡；
(2)本发明针对TNF-α与感染性疾病、自身免疫性疾病、器官衰竭等多种疾病有直接关系的特点，设计了一种直接靶向TNF-α的新型多肽类拮抗剂，所述多肽可以在分子水平、细胞水平抑制TNF-α发生作用，从而达到治疗与TNF-α相关疾病的目的，与抗TNF-α的抗体类药物相比，可大大降低治疗成本。
附图说明
图1表明本发明所述的多肽与TNF-α的吸附解离曲线；
图2表明本发明所述多肽对TNF-α细胞毒性的抑制作用，其中(A)为TNF-α对L929细胞存活率的影响；(B)为所述多肽对L929细胞存活率的影响；(C)为所述多肽对10ng/mL的TNF-α引起的细胞毒性的抑制作用；
图3表明本发明所述多肽抑制TNF-α诱导的细胞数量减少的光学显微镜观察，其中，(A)为未经任何处理的正常L929细胞；(B)为使用10ng/mL的TNF-α处理的L929细胞；(C-E)为不同浓度的多肽与10ng/mL的TNF-α共同处理的L929细胞，多肽的浓度分别为0.1ng/mL(C)、10ng/mL(D)和1000ng/mL(E)；
图4表明本发明所述多肽对TNF-α诱导的线粒体膜电位下降的抑制作用，其中，(A)为未经任何处理的正常L929细胞；(B)为使用10ng/mL的TNF-α处理的L929细胞；(C-E)为不同浓度的多肽与10ng/mL的TNF-α共同处理的L929细胞，多肽的浓度分别为0.1ng/mL(C)、10ng/mL(D)和1000ng/mL(E)；
图5表明本发明所述多肽对TNF-α诱导的细胞凋亡的调控作用，其中，(A)为未经任何处理的正常L929细胞，(B)为使用10ng/mL的TNF-α处理的L929细胞；(C-D)为不同浓度的多肽与10ng/mL的TNF-α共同处理的L929细胞，多肽的浓度分别为10ng/mL(C)和1000ng/mL(D)；
图6表明本发明所述多肽对线粒体凋亡途径中相关蛋白质的表达影响，其中，(A)显示在TNF-α单独处理，以及与中和抗体，不同浓度的多肽(浓度分别为0.1，10，1000ng/mL)共同处理的情况中促凋亡蛋白Bid，抗凋亡蛋白Bcl-2和内参蛋白GAPDH的表达情况；(B)显示(A)图中Bid和Bcl-2相对于GAPDH表达量的定量图。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂，且可从正规渠道商购获得。
除非特别指明，以下实施例中所用的鼠的成纤维细胞L929细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。
除非特别指明，以下实施例中所用的肿瘤坏死因子TNF-α及其抗体、Annexin V/PI凋亡检测试剂盒均购自eBioscience公司；检测线粒体膜电位的DioC6试剂、以及蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自Sigma方式；用于WesternBlot的抗体Bcl-2、Bid、GAPDH、细胞裂解液等购自美国Cell SignalingTechnology(CST)公司。
除非特别指明，以下实施例中所用的多肽由上海科肽生物科技有限公司采用固相多肽合成法制备，其纯度>98％。
除非特别指明，以下实施中超纯水，水质参数为电阻率18.2MΩ.cm25℃。1×PBS的配制为0.4g NaCl，0.01g KCl，182mg Na2HPO4·12H2O，12mg KH2PO4，0.01g NaN3，使用50mL超纯水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤。
实施例中所使用物质的化学结构：
多肽序列为(SEQ ID NO：1)：IDDPCQDRTPRGARADPWYRG。
本发明中的所述多肽或氨基酸序列都可以通过人工合成获得，人工合成多肽的技术属于现有技术，本领域技术人员可以根据其具备的知识和技能自己合成，也可以委托相应公司合成。
本发明的多肽抑制剂可以溶解到缓冲液中制备混合溶液，可以使多肽抑制剂的终浓度为10-100μM，优选为50μM，所述缓冲液可以是pH为6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH7.2的磷酸盐缓冲液。
实施例1多肽对TNF-α的亲合力的测定
(1)将多肽用1×PBS配置成浓度为1mg/mL的溶液、将抗TNF-α的多肽配置成100μg/mL的溶液，取2.5μL将其滴在羧基化的SPR芯片(购自Plexera公司，Kx5型SPR标配基底)上，通过链霉亲合素和生物素的特异性反应将多肽固定在SPR芯片上。而后依次将浓度为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL的TNF-α溶液(1×PBS稀释)作为流动相通过芯片表面，结合时间150s，解离时间150s，重生时间250s。以1×PBS作为解离溶液，以0.5％磷酸作为重生液。在K×5型SPR仪(Plexera)上记录多肽与TNF-α的结合解离曲线，如图1所示。
(2)以Langmuir公式拟合所述多肽与TNF-α的SPR曲线。经计算可以获得平衡结合/解离常数。如表1所示，所述多肽与TNF-α的平衡解离常数KD值为1.02×10-9M，表明该多肽与TNF-α的结合能力很强。
表1
实施例2 MTT方法评价所述多肽对TNF-α诱导的细胞毒性的影响
以鼠的成纤维细胞系L929作为研究模型，使用RPMI-1640培养基(含10％北美胎牛血清，1％青链霉素)进行细胞培养。在96孔细胞培养板(Corning)中，每孔培养1×104个细胞，在细胞种板后12小时，向培养板中加入一系列浓度梯度的TNF-α及所述多肽(具体浓度可见图2)。每孔中培养液的终体积为200μL。在孵育48小时后，向培养板中每孔加入20μL浓度为5mg/mL噻唑蓝(MTT)1×PBS溶液。在37℃反应4小时。将培养板中的溶液吸走，每孔加入100μL的二甲亚砜(DMSO)溶解甲瓒沉淀。在连续光谱多功能酶标仪(Tecan Infinite M200)中，测定其在490nm处的吸光度值。
如图2(A)所示，TNF-α对L929细胞系具有显著的细胞毒性。对于实验所述体系，在TNF-α的浓度为1ng/mL时，细胞存活率已不足50％(约为42％)，在TNF-α的浓度为10ng/mL时，细胞存活率下降至35％。因此，在后续实验中，TNF-α的浓度选择10ng/mL。如图2(B)所示，当所述多肽的浓度在10ng/mL～500μg/mL区间时，细胞存活率均大于90％，但是随着浓度的升高，细胞存活率仍呈现出下降的趋势。说明，在实验浓度下，该多肽对L929细胞并无显著的细胞毒性。如图2(C)所示，将10ng/mL的TNF-α与所述多肽共孵育L929细胞，可以显著提高细胞的存活率。当所述多肽的浓度为10ng/mL时，细胞存活率的提高最为明显(由35％提升至70％)，但是随着多肽浓度的进一步提高，细胞存活率的提高程度反而逐渐降低。表明所述多肽可以有效抑制TNF-α对L929细胞的毒性。
实施例3使用光学显微镜观察所述多肽对TNF-α诱导的细胞数量减少的影响
细胞培养方法如实施例2所述，不同的是使用6孔板进行细胞培养，每孔培养基的终体积为2mL。
在将TNF-α及所述多肽加入细胞并孵育48小时后，在光学显微镜下观察并拍照，如图3所示。(A)为未经处理的细胞，(B)为使用10ng/mL的TNF-α处理的细胞，与正常培养的细胞对比可发现，在相同的面积内，细胞的数量大大减少，且可见凋亡小体；(C-E)中分别用浓度为0.1ng/mL，10ng/mL，1000ng/mL的多肽与TNF-α共孵育，发现，0.1ng/mL的多肽对细胞的增殖并无显著的影响，当多肽的浓度提高到10ng/mL时，细胞数量大大增加，表明在该浓度下多肽已经能够明显抑制TNF-α的细胞毒性，促进细胞增殖；当多肽的浓度继续提高至1000ng/mL时，细胞数量并未继续增加。这一结果与实施例2中采用MTT方法评价所述多肽对TNF-α诱导的细胞毒性所得到的结果相一致。
实施例4使用流式细胞术检测线粒体膜电位
细胞培养方法如实施例3所述。
在将TNF-α及所述多肽加入细胞并孵育48小时后，加入终浓度为25nM的阳离子染料DioC6，在37℃的环境中避光平衡30min，PBS洗一次，之后使用流式细胞术检测细胞的荧光强度。
结果显示TNF-α的加入显著降低了细胞的线粒体膜电位，与我们观察到的凋亡现象吻合。结果如图4和表2所示。
在图4中，(A)为未经处理的细胞，(B)为使用10ng/mL的TNF-α处理的细胞；(C-E)中分别用浓度为0.1ng/mL，10ng/mL，1000ng/mL的多肽与TNF-α共孵育处理的细胞。
表2中分别对应图4(A-E)中荧光强度测量平均值的统计值，反映了线粒体膜电位的高低。
我们发现，与正常培养的细胞相比，使用10ng/mL的TNF-α处理的细胞线粒体膜电位大大降低。加入0.1ng/mL的多肽，细胞线粒体膜电位并未显著升高，当多肽的浓度提高到10ng/mL时，线粒体膜电位基本回升到与未处理的对照细胞一样的水平。但1000ng/mL的多肽未能进一步提升线粒体膜电位水平。
表2
样品名称 线粒体膜电位平均值(A.U.)
对照 1240.97
TNF-α(10ng/mL) 805.96
TNF-α+多肽(0.1ng/mL) 818.21
TNF-α+多肽(10ng/mL) 1128.78
TNF-α+多肽(100ng/mL) 1151.80
实施例5使用流式细胞术区分处于不同凋亡阶段的细胞
细胞培养方法如实施例2所述。
具体检测步骤包括：
(1)在将TNF-α及所述多肽加入细胞并孵育48小时后，收集一定数量的细胞。使用冷冻离心机在4℃，转速800rpm的条件下离心5min。使用预冷的PBS洗一次，之后用结合缓冲液重悬细胞。
(2)按照Annexin V/PI双染试剂盒的说明依次加入5μLAnnexin V-FITC和10μL PI染料(针对每106个细胞)。4℃避光孵育10min，使用流式细胞仪检测。Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
实验结果如图5和表3所示。在图5中：左下分区是Annexin V-PI双阴性细胞，表示细胞没有出现凋亡；右下分区是Annexin V阳性，PI阴性的细胞，表示早期凋亡细胞；右上分区是Annexin V-PI双阳性细胞，表示晚期凋亡细胞和死细胞。图5(A)为未经处理的细胞，(B)为使用10ng/mL的TNF-α处理的细胞；(C)和(D)中为分别用浓度为10ng/mL，1000ng/mL的多肽与TNF-α共孵育处理的细胞。表3对应了图5(A-D)右上分区(UR)中细胞数量的统计值，代表了晚期凋亡的细胞数量。结果表明，10ng/mL的TNF-α能够显著增加晚期凋亡细胞的比例，而多肽的加入能够有效地减少该种群比例，说明多肽在体外中和了TNF-α之后的确能够抑制由TNF-α引起的凋亡。
表3
样品名称 晚期凋亡(％)UR
对照 6.31
TNF-α(10ng/mL) 30.96
TNF-α+多肽(10ng/mL) 23.55
TNF-α+多肽(100ng/mL) 13.72
实施例6采用免疫印迹法测定线粒体凋亡途径中相关蛋白的表达量细胞培养方法如实施例2所述。
具体步骤包括：
(1)细胞培养48小时后，使用细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)置于冰上裂解30min，之后-4℃离心(12000g，5min)。收集离心后的上清液备用。
(2)蛋白定量与变性：首先使用BCA试剂盒对所有样品进行蛋白定量，将样品与5×上样缓冲液以及二硫苏糖醇(DTT)混匀，95℃加热8min，之后冷却至室温备用。
(3)制备聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶，其中分离胶浓度为12％，每一道上样为20μg蛋白。首先70V电泳约30min，待样品跑进分离胶后加大电压至120V再电泳约90min，使溴酚蓝条带接近胶的底部为宜。之后使用半干转电泳将胶上的蛋白样品转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(15V，20min)。
(4)将含有目标条带的PVDF膜浸入5％脱脂牛奶的TBST溶液中室温封闭1小时。TBS缓冲液洗三次，之后用特异性的一抗(Bid，Bcl-2，GAPDH)孵育条带，4℃过夜。TBS缓冲液洗三次，之后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1小时。之后在电化学发光(ECL)超敏发光液的作用下进行曝光，得到最终的条带。
结果如图6所示，(A)图中的条带对应经过不同的药物(正常细胞，10ng/mL的TNF-α，TNF-α+中和抗体，TNF-α+0.1ng/mL多肽，TNF-α+10ng/mL多肽，TNF-α+1000ng/mL多肽)处理后的细胞；(B)图为使用软件对(A)中条带的灰度进行数值统计得到的柱状图。结果表明，相对于未处理的对照细胞，TNF-α处理后胞内与线粒体凋亡途径相关的促凋亡蛋白Bid表达量上升，相反的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量下降。而中和抗体或不同浓度的多肽处理组细胞中表现出明显的抑制凋亡现象，即促凋亡蛋白Bid的表达量下降，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量有所回升。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种与肿瘤坏死因子结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，或具有所述多肽功能的、并对如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述变体为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的一个或多个精氨酸残基突变为其他种带正电的氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述其他种带正电的氨基酸残基为组氨酸、赖氨酸或精氨酸中的任意一种；
优选地，所述变体为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的一个或多个天冬氨酸残基突变为其他种带负电的氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述其他种带负电的氨基酸残基为谷氨酸；
优选地，所述变体为将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的一个或多个色氨酸残基突变为其他种疏水性氨基酸残基所获得的变体，优选地，所述其他种疏水性氨基酸残基为苯丙氨酸；
优选地，所述变体具有如SEQ ID NO：2～18所示的氨基酸序列。
3.一种核酸，其特征在于，其包括编码如权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求3所述的核酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的表达载体。
6.一种多肽抑制剂，其特征在于，其包含如权利要求1或2所述的多肽。
7.根据权利要求6所述的多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽抑制剂用于抑制肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1或2所述的多肽或如权利要求6所述的多肽抑制剂。
9.根据权利要求1或2所述的多肽、权利要求6所述的多肽抑制剂或权利要求8所述的药物组合物在制备用于抗肿瘤坏死因子的药物中的应用。
10.根据权利要求1或2所述的多肽、权利要求6所述的多肽抑制剂或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病的药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106831944A (zh) * 2017-01-12 2017-06-13 复旦大学 一种肿瘤坏死因子alpha的高亲和性肽及其应用
CN108250267A (zh) * 2018-01-26 2018-07-06 北京大学深圳研究生院 一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1121927A (zh) * 1994-09-01 1996-05-08 中国科学院上海生物工程研究中心 高效低毒人肿瘤坏死因子
CN1220997A (zh) * 1997-12-26 1999-06-30 中国人民解放军第二军医大学 重组人肿瘤坏死因子及制备方法
WO2000021981A2 (de) * 1998-10-09 2000-04-20 Bioserv Ag TNFα BINDENDE PEPTIDE UND IHRE ANWENDUNG FÜR DIE DETEKTION, INAKTIVIERUNG UND/ODER ENTFERNUNG VON TNFα AUS BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN
US6344443B1 (en) * 1998-07-08 2002-02-05 University Of South Florida Peptide antagonists of tumor necrosis factor alpha
US20050260201A1 (en) * 1993-01-29 2005-11-24 Centocor, Inc. Methods of treating rheumatoid arthritis using anti-TNF receptor fusion proteins
CN102321155A (zh) * 2008-12-19 2012-01-18 华中科技大学 Tnf结合肽和tnfr1封闭肽及其在治疗溃疡性结肠炎中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050260201A1 (en) * 1993-01-29 2005-11-24 Centocor, Inc. Methods of treating rheumatoid arthritis using anti-TNF receptor fusion proteins
CN1121927A (zh) * 1994-09-01 1996-05-08 中国科学院上海生物工程研究中心 高效低毒人肿瘤坏死因子
CN1220997A (zh) * 1997-12-26 1999-06-30 中国人民解放军第二军医大学 重组人肿瘤坏死因子及制备方法
US6344443B1 (en) * 1998-07-08 2002-02-05 University Of South Florida Peptide antagonists of tumor necrosis factor alpha
WO2000021981A2 (de) * 1998-10-09 2000-04-20 Bioserv Ag TNFα BINDENDE PEPTIDE UND IHRE ANWENDUNG FÜR DIE DETEKTION, INAKTIVIERUNG UND/ODER ENTFERNUNG VON TNFα AUS BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN
CN102321155A (zh) * 2008-12-19 2012-01-18 华中科技大学 Tnf结合肽和tnfr1封闭肽及其在治疗溃疡性结肠炎中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周新明: "肿瘤坏死因子-α抑制剂的设计、合成与筛选", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *
曹颖男: "多肽类肿瘤坏死因子alpha抑制剂的设计、合成及抗炎活性研究", 《中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106831944A (zh) * 2017-01-12 2017-06-13 复旦大学 一种肿瘤坏死因子alpha的高亲和性肽及其应用
CN108250267A (zh) * 2018-01-26 2018-07-06 北京大学深圳研究生院 一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途
CN108250267B (zh) * 2018-01-26 2021-04-20 北京大学深圳研究生院 一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体及其用途

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