CN102321155A - Tnf结合肽和tnfr1封闭肽及其在治疗溃疡性结肠炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一条TNF结合环肽和一条TNFR1封闭环肽，其氨基酸序列分别为Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-lys-His-Cys；Cys-lys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys，其在体内外均能竞争性抑制TNF-α与TNFR1结合，从而拮抗TNF-α的生物学功能，并在TNBS诱导的实验性溃疡性结肠炎大鼠模型中取得较好的疗效。

Description

TNF结合肽和TNFR1封闭肽及其在治疗溃疡性结肠炎中的应用

本申请是申请号为200810236895.3的中国专利申请的分案申请，原申请的申请号为：200810236895.3；申请日为：2008年12月19日；发明名称为：TNF-α结合肽和TNFR1封闭肽及其在治疗TNF相关疾病中的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术，特别涉及能拮抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生物学活性的TNF结合肽、TNFR1封闭肽等小分子多肽及TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白。

背景技术

TNF-α是一类重要的促炎症细胞因子，是促炎细胞因子瀑布反应中的起始因子，可促进一系列促炎细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8等)的释放。临床研究证实：在多种感染或非感染性炎症及其并发症(如类风湿性关节炎等自身免疫病、内毒素休克、急性肝坏死、Crohn′s病等)的发生和发展中，全身或炎症局部TNF-α产生增加起着关键作用；体内TNF-α水平过高，往往预示病人预后不良。在动物实验中，单一应用大剂量TNF-α即可直接导致内毒素样休克，而用抗TNF抗体则可减轻及阻止内毒素性休克的发生。转TNF-α基因小鼠易患慢性关节炎；最近报道给大鼠输入TNF-α可诱导胰岛素抵抗，此为II型糖尿病发生的重要机制。(Williams RO，Methods Molecular Biology，2006，361：265-284；Yano Y等，Diabetes Care，2004，27(3)：844-845。)

与TNF发病相关的疾病的发病率在国内外呈大幅度上升的趋势。例如，全球II型糖尿病患者总人数已超过1.5亿人，预计到2025年将达到3亿人；在我国大城市中，20岁以上人群的II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)发病率达到10％，另有10％为糖调节异常，即每5个成年人中就有一个糖代谢异常。在我国，目前已有类风湿性关节炎患者400万以上，患病率达总人口的0.32-0.34％，Crohn′s病(人群溃疡性结肠炎)、银屑病、强直性脊柱炎以及系统性红斑狼疮等的与TNF发病相关的疾病的发病率在我国正在逐年上升。

由于TNF-α在多种疾病中有重要的致病作用，因此，以TNF-α或TNF受体为靶点设计药物，有效阻断上述病理过程，治疗TNF相关疾病，成为国际药学界研究开发的热点(Steed Paul M等，Science，2003，301，1895～1898；Scott D.L.等，The New EnglandJournal of Medicine，2006，355：704-712)。目前，国际上已获FDA和EMEA(EuropeanMedicines Evaluation Agency)正式批准，在美国和欧洲已进入临床试用阶段的抗TNF-α试剂主要有抗TNF抗体：鼠人嵌合单克隆抗体(IgG1)，商品名为infliximab、cA2、Remicade或Centocor，(Centocor，Inc，Malvern，PA，FDA licensed.#1242，8/24/1998)静脉注射，人源化抗TNF抗体adalimumab(商业名：Humira，CDP571 License 12/2002)，全人源化抗体(D2E7)也已问世。可溶性TNF受体：TNFR1-Fc融合蛋白(Etanercept、Enbrel或Immunex)(Immunex Corp，Seattle，WA，License#1132，6/6/2000)。

上述商品化的抗TNF-α试剂(抗TNF抗体、可溶性TNF受体)虽然已取得较好的临床治疗作用，但仍然存在一系列问题，如存在潜在的副作用、来源受到限制、生物稳定差、价格昂贵等。目前，临床试验已发现上述抗TNF-α试剂(抗TNF抗体、可溶性TNF受体)存在导致红细胞和血小板减少、结核感染、上呼吸道、尿路感染、皮疹、发热、低/高血压等副作用，严重者有可引发肿瘤。目前，研究开发安全性好、毒副作用小、成本低的小分子TNF-α拮抗剂已受到人们的关注。(Steed Paul M.等，Science，2003，301，1895～1898；Gonzale-Rey E等，Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(11)4228-4233。)

噬菌体表面呈现技术(phage display techniques，PDT)是九十年代初发展起来的一项新兴技术(Lowman H.B.等.Annu.Rev.Biophys.Biomol Struct 1997；26：401-24)，是研究蛋白质分子之间相互作用的一个有效工具。PDT所得到的肽均是来源于噬菌体肽库，氨基酸序列分析得到肽的序列，人工合成进行机制研究。随着肽库构建及筛选技术的不断发展、完善，使其对研究蛋白质识别机制、确定抗原决定簇、药物设计、疫苗研制等方面提供了全新的思路与先进的手段。现有的噬菌体随机肽文库主要有两种：非限制性肽库(线性肽库)和限制性肽库(例如半胱氨酸环限制的肽库、引入α-螺旋等二级结构的突变库等)。一般研究所选用的噬菌体随机肽库都是线性的。

发明内容

本发明一方面选择噬菌体12线肽库，以rhTNFR1为诱饵，从中钓取出一条线性的12肽，该肽可与TNFR1结合，竞争性抑制TNF-α与TNFR1的结合，从而拮抗TNF-α的生物学效应，我们将此肽命名为“TNFR1封闭肽”。但人工合成短肽的成本昂贵，且短肽在人体内的半衰期较短，从而制约其临床应用。为了克服这些缺陷，本发明又在此工作的基础上，构建TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白表达载体pIG/3C-TNFR1BP，并借助可高表达外源蛋白的真核细胞COS7成功表达TNFR1BP/hFc融合蛋白。体外实验证实这种融合蛋白也能有效地竞争性抑制TNF-α与TNFR1结合，从而发挥拮抗TNF-α生物学活性的作用；体内实验也证实这种融合蛋白能预防和治疗高脂高糖诱导的肥胖和胰岛素抵抗大鼠模型。

另一方面，由于与线肽库相比噬菌体随机环肽库具有以下优点：(1)由于环肽固定了两个半胱氨酸残基，附加二硫键的限制可以帮助维持肽的折叠结构。因此，环肽库比线性肽库更可能筛选到高亲和力、高特异性的肽。因为它经历了构象的选择，使之尽可能与靶分子表面和内部结合。(2)环肽由于其构象的复杂性，故其降解速度较线肽慢，使之半寿期明显延长。(3)由于受到转化效率的影响，噬菌体肽库不可能达到完全的随机化，各种肽库的多样性就存在差异。因此，本发明又选择噬菌体C7C环肽库，分别以rhTNF-α和rhTNFR1为诱饵，从该环肽库中筛选TNF结合肽和TNFR1封闭肽。通过体外实验证实这两种环肽能抑制TNF-α介导的生物学效应；体内实验证实这两种环肽抑制三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠溃疡性结肠炎。

本发明的目的在于提供一种TNFR1封闭肽(线12肽)和TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白。

本发明的目的还在于提供编码所述TNFR1封闭肽和TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白的核酸分子。

本发明目的还在于提供制备本发明融合蛋白的方法。

本发明的目的还在于提供一种TNF结合肽(环9肽)与一条TNFR1封闭肽(环9肽)。

本发明的目的还在于提供上述TNF结合肽(环9肽)与TNFR1封闭肽(环9肽)的核酸分子。

本发明的目的还在于将上述TNF结合肽(环9肽)和TNFR1封闭肽(环9肽)应用于治疗溃疡性结肠炎；将TNF-α受体1封闭肽用于治疗关节炎；将TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白用于治疗II型糖尿病。

本发明技术方案内容如下：

一、TNFR1封闭肽(12线肽)和TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白

1.借助噬菌体展示技术，以hrTNFR1蛋白为诱饵从噬菌体12线肽库中筛选到可与TNFR1结合的含12个氨基酸的线肽(TNFR1封闭肽)；

2.体外实验证实人工合成的该封闭肽可以完全封闭大鼠腹腔巨噬细胞的呼吸爆发(何亚萍等，中国免疫学杂志，2003，19(6)：385-387)；

3.体内实验证实该封闭肽可有效减轻佐剂性关节炎大鼠模型的局部关节肿胀及炎症细胞的浸润，并可抑制促炎症细胞因子的产生，显示具有较好的治疗作用(何亚萍等，药学学报，2003，38(12)：889-892)。

4.构建TNF封闭肽-IgFc融合蛋白

(1)借助DNA合成技术，构建该封闭肽的编码DNA片段(并含内切酶位点)；

(2)借助分子克隆技术将目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表达载体中，构建TNFR1I封闭肽-IgFc的重组体，其技术路线见图36。

(3)将此重组体瞬时转染COS7细胞使之成功表达TNFR1封闭肽-hFc融合蛋白；利用间接免疫荧光、流式细胞技术、胞毒抑制实验证实此融合蛋白可与细胞表面TNFR1结合，从而抑制TNF-α的生物学活性；用RT-PCR及激光共聚焦显微镜检测证实此融合蛋白可明显抑制TNF诱导的单核细胞NF-KB核转位，从而抑制促炎细胞因子IL-1βmRNA和IL-8mRNA的转录。

(4)将重组体转染CHO-K1和BHK-21细胞并建立稳定表达的细胞株，对其分泌的肽-IgFc融合蛋白进行纯化并检测其稳定性和生物学效应；

5.融和蛋白的主要药效研究，如体外对炎性细胞活化的影响以及体内对高脂喂养大鼠引起的II型糖尿病的预防和治疗作用。

二、TNF结合肽(环9肽)与TNFR1封闭肽(环9肽)

1.采用噬菌体随机环9肽库展示技术分别以hrTNF-α和hrTNFR1为诱饵进行亲和筛选及生物学效应鉴定得到分别能与TNF-α和TNFR1特异性结合的TNF结合肽(环9肽)与TNFR1封闭肽(环9肽)。(尹丙姣等，华中科技大学学报医学版，2005，34(6)670-677)

2.外实验证实：人工合成的TNF结合肽与TNFR1封闭肽能抑制GFP-TNF融合蛋白与细胞膜上TNFR1结合；非变性聚丙烯凝胶电泳证明TNF结合肽与TNFR1封闭肽之间不互为配体和受体而相互结合；TNF结合肽与TNFR1封闭肽对TNF-α的细胞毒效应均有抑制作用，且随着剂量的增加而增强，二者联用的效果更好；TNF结合肽与TNFR1封闭肽联用能有效抑制TNF-α和IFN-γ诱导的单核细胞呼吸爆发强度，抑制TNF-α诱导的IL-1β、IL-8mRNA转录。(尹丙姣等，细胞与分子免疫学杂，2007，已校对，待发表)

3.体内实验证实：人工合成的TNF结合肽与TNFR1封闭肽联用可显著减轻TNBS诱导大鼠实验性溃疡性结肠炎的病理损伤，改善症状，有效抑制大鼠血清和结肠组织中NO含量以及结肠组织中MP0活性的活性，抑制大鼠腹腔巨噬细胞中I1-1β、IL-8的mRNA转录和结肠组织中TNF-α蛋白的表达，对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有治疗作用。(尹丙姣等，免疫学杂志，2007，已投稿)

通过以上所述并结合后文实施方式，本领域技术人员不难看出本发明的特征和优点。

附图说明

一、图1至图22：TNFR1封闭肽(12线肽)和TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白

图1TNFR1封闭肽(12线肽)对TNF-α诱导的大鼠腹腔MΦ呼吸爆发的影响(抑制作用)

图2.TNFR1封闭肽对TNF-α诱导大鼠腹腔MΦIL-1βmRNA的影响

图3.TNFR1封闭肽对TNF-α诱导大鼠腹腔MΦTNF-αmRNA的影响

图4.TNFR1封闭肽对TNF-α诱导大鼠腹腔MΦNF-κBp65核转位的影响

图5.TNFR1封闭肽对大鼠佐剂性关节炎踝关节病理改变的影响(×200)

图6.TNFR1封闭肽对佐剂性关节炎大鼠腹腔MΦIL-1βmRNA的影响

图7.TNFR封闭肽对佐剂性关节炎大鼠腹腔MΦTNF-αmRNA的影响

图8.重组表达载体pIG/3C-TNFRBP的酶切鉴定图谱

图9.融合蛋白TNFRI-hIgGFc的表达浓度与转染时间的关系

图10.融合蛋白TNFRI-IgGFc的Western-Blotting鉴定

图11.间接免疫荧实验检测融合蛋白与TNFR的结合

图12.流式细胞术检测TNFR封闭肽-hIgGFc融合蛋白与TNFR的结合能力

图13.胞毒实验检测融合蛋白对TNF-α胞毒效应的拮抗作用

图14.融合蛋白对TNF-α诱导人单核细胞IL-1βmRNA转录的影响

图15.融合蛋白对TNF-α诱导人单核细胞IL-8mRNA转录的影响

图16.融合蛋白对TNF-α诱导单核细胞NF-κB核转位的影响

图17.高脂高糖诱导大鼠肥胖和胰岛素抵抗

图18.融合蛋白可抵抗高脂高糖诱导的大鼠肥胖

图19.融合蛋白对肥胖大鼠糖耐量的影响

图20.融合蛋白能提高胰岛素的敏感性

图21.融合蛋白抑制TNF-α的产生

图22.融合蛋白促进组织中胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸磷酸化

二、图23至图图35：TNF结合肽(环9肽)与TNFR1封闭肽(环9肽)

图23.不同噬菌体克隆对TNF-α诱导U937细胞毒效应的抑制率作用

图24.噬菌体联用对TNF-α诱导U937细胞毒效应的抑制作用

图25.各噬菌体与靶蛋白结合的特异性

图26.TNFR封闭噬菌体对TNF-α诱导IL-1βmRNA水平的抑制作用，图中：

1.阴性对照；    2.TNF-α；    3.TNF-α+pha.X2；    4.TNF-α+pha.X4；

5.pha.X2；      6.pha.X4；    M.Marker

图27.TBP和TRBP对GFP-TNF融合蛋白与L929细胞TNF受体结合的影响，图中：

A：GFP-TNF  B：GFP-TNF+无关肽  C：GFP-TNF+pep.38+X4

图28.TBP和TRBP的非变性聚丙烯凝胶电泳图，图中：1：pep.38  2：pep.X4  3：pep.38+X4

图29.TBP和TRBP对TNF-α介导的U937细胞毒效应抑制作用的剂量反应关系

图30.TBP和TRBP对TNF-α和IFN-γ诱导单核细胞呼吸爆发的影响

图31.TBP和TRBP对TNF-α诱导Mo的IL-1β、IL-8mRNA的抑制作用，图中：

1：正常对照       2：TNFα对照    3：TNF-α+pep.X4；

4：TNF-α+pep.38  5：TNF-α+pep.38+X4

图32.各种治疗对溃疡性结肠炎大鼠结肠病理改变的影响

图33.各实验组大鼠结肠组织病理改变(10×)，图中：

A.正常对照组；        B.模型组；      C.无关肽对照组

D.联合多肽治疗组；    E.抗体治疗组    F.5-氨基水杨酸治疗组

图34.各种治疗对结肠炎大鼠腹腔Mφ中IL-1β和IL-8mRNA水平的影响，图中：

1.生理盐水对照组    2.模型组        3.多肽治疗组

4.无关肽对照组      5.抗体治疗组    6.5-氨基水杨酸治疗组

图35.各种治疗对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中TNF-α蛋白表达的影响(40×)，图中：

A.正常对照组；    B.模型组；      C.无关肽对照组

D.多肽治疗组；    D.抗体治疗组    E.5-氨基水杨酸治疗组

三、图36.借助分子克隆技术将目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表达载体中，构建TNFR1I封闭肽-IgFc重组体的技术路线图。

具体实施方式

一、TNFR1封闭肽(12线肽)和TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白

实施例1 TNFR1封闭肽的筛选及其特异性鉴定

借助噬菌体展示技术，以hrTNFR1蛋白为诱饵从噬菌体12线肽库中筛选到可与TNFR1结合的含12个氨基酸的线肽(TNFR1封闭肽)，其具体筛选过程同下述实施例7之7.1。

实施例2 TNF受体封闭肽(12线肽)对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

以下TNFR1封闭肽(12线肽)粉剂均由由第三军医大学合成。

2.1TNF受体封闭肽对TNF-α诱导的大鼠腹腔MΦ呼吸爆发的影响采用NBT法检测：常规分离大鼠腹腔巨噬细，向3×105/ml大鼠腹腔巨噬细胞加入TNF-α(5ng/ml)100μl和/或TNFR1封闭肽(10μg/ml)100μl，每组设3个复孔；然后加入100μl/孔NBT(2mg/ml)，放37℃CO2培养箱中45分钟；再加入70％甲醇溶液100μl/孔，固定5min；弃上清，用70％甲醇溶液洗3次；空气干燥，最后加入120μ/孔2M的KOH溶液和140μl/孔的DMSO，立即混匀，在波长630nm下测其OD值。结果如图1：外源性TNF2α可明显增强Mφ的呼吸爆发，约为对照组的3倍(P＜0.05)，而TNF受体封闭肽则能完全阻断TNF-α诱导的Mφ呼吸爆发，其值几乎接近于其基础值，提示该肽可竞争性抑制TNF-α诱导的Mφ呼吸爆发。

2.2TNFR1封闭肽对大鼠腹腔MΦIL-1β、TNF-αmRNA的影响采用RT-PCR检测IL-1βmRNA和TNF-αmRNA：常规分离大鼠腹腔巨噬细，用TRIzolRNA分离试剂盒提取细胞总RNA，逆转录按照Boerhinger Mannheim公司逆转录试剂盒说明书进行。取2μl上述逆转录产物作模板，分别用IL-1β特异性引物(P1-GATAACCTGCTGGTGTGTGA；P2-CTTGTGAGGTGCTGATGTAC)、TNF-α特异性引物(P1-GCGGATCATGGTCAGATCATCTTCTCGAA；P2-CCCAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAGTA)、β-actin特异性引(P1-AACGGCTCCGGCATGTGCAA；P2-CTTCTGACCCATGCCCACCA)进行PCR扩增，IL-1的PCR循环为：94℃30s，62℃1min，72℃1min，26个循环，74℃10min；TNF-α的PCR循环如下：94℃30s，58℃30s，72℃1min，28个循环，74℃10min。取5μl PCR产物加入1μl 6×上样缓冲液混合，在80伏恒压下进行2％琼脂糖凝胶(含EB)电泳，在短波紫外灯下观察结果并照相。结果如图2所示：对照组Mφ未见IL-1βPCR产物出现(泳道4)，TNF-α刺激3h后的Mφ可见明显的IL-1βcDNA特异性条带(泳道2)，而TNF受体封闭肽则可显著抑制TNF-α诱导的IL-1βmRNA的表达(泳道3)，因为其PCR产物条带明显减弱，通过密度扫描进行相对定量，证实TNFR1封闭肽的抑制率达50％以上，提示TNFR1封闭肽可有效抑制活化的Mφ表达IL-1βmRNA。同时，结果还显示(如图3)，未受刺激的Mφ不表达TNF-αmRNA(泳道4)，TNF-α可诱导Mφ强表达TNF-αmRNA，因为图中可见一条强的特异性PCR产物条带(泳道2)，而用TNFR1封闭肽则可使TNF-α的PCR产物条带明显减弱(泳道3)，其抑制率约为50％，提示TNFR1封闭肽可部分阻断TNF-α的正反馈作用。

2.3TNFR1封闭肽对TNF-α诱导大鼠腹腔MΦNF-κBp65核转位的影响NF-κBp65核转位的检测：取用TNFα(5ng/ml)和/或TNFR1封闭肽(10μg/ml)刺激1h后的大鼠腹腔巨噬细胞(1×107)，用冷PBS洗涤，12000r/min，1min离心，收集细胞；加入400μl细胞膜裂解液重悬细胞；冰上肿胀10min加入0.5％NP240至终浓度为0.1％～0.125％；振荡10s，12000r/min，1min离心；加入10μl核膜裂解液重悬沉淀物；冰上放置30min，12000r/min，1min离心，收集上清，按常规方法做Western blot。免疫染色的抗体为兔抗人IgGNF-κB p65多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG抗体，均购自北京中山生物技术有限公司。结果如图4所示。未加任何刺激的对照组无条带出现，提示在正常情况下腹腔巨噬细胞核内无NF-κBp65存在(泳道1)，单独给予TNF-α刺激1h后，大量NF-κBp65向细胞核内转位，因为出现明显的NF-κB特异性条带(泳道3)；用TNFR1封闭肽后，则使TNF-α诱导的NF-κB条带明显减弱(泳道2)，提示TNFR1封闭肽能部分抑制TNF-α诱导的NF-κBp65核转位。

实施例3 TNFR1封闭肽对大鼠佐剂性关节炎的影响

3.1大鼠佐剂性关节炎的建立Wistar大鼠，♂，体重150～200g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。弗氏完全佐剂。实验分组：对照组：注射生理盐水0.1ml/只；模型组：在大鼠右足垫部皮内注射弗氏完全佐剂(F5881，购自美国Sigma公司)0.1ml/只；治疗1组：注射佐剂后，立即注射TNFR1封闭肽0.1ml/只，剂量分别为0.5和1.0mg/kg体重，qd，每个剂量4只，连续治疗10d，治疗2组：方法与剂量同治疗组1，连续治疗20d后用游标卡尺测量大鼠踝关节肿胀度(cm)并取关节组织按常规做组织切片，HE染色。注射佐剂后，大鼠烦躁不安，右脚不敢着地行走，18h后出现右后肢踝关节明显红肿，走路缓慢，进食减少等临床表现；d3右后肢踝关节肿胀减轻，但d8红肿再度加重(表1)；在接种10～18d后，形成多发性关节炎，表现为未注射佐剂一侧(左后肢)的踝关节轻度红肿(结果未显示)，与人类RA的发病过程极为相似。而注射TNF受体封闭肽后数天，大鼠情绪稳定，行走基本自如，踝关节肿胀有所减轻等。病理切片显示，大鼠佐剂性关节炎的踝关节滑膜组织中有大量的炎性细胞、浆细胞的浸润，血管翳形成并伸向关节表面，关节腔腔隙缩小，关节软骨发生破坏(如图5)。说明大鼠佐剂性关节炎模型建立成功。

3.2TNF受体封闭肽对大鼠佐剂性关节炎关节肿胀的影响用游标卡尺测量大鼠踝关节肿胀度(cm)。结果(表1)显示大鼠踝关节注射佐剂后18h明显肿胀，但d3则有所减轻，d10肿胀再度明显，此后肿胀程度随时间延长而加重；用TNF受体封闭肽(1mg/kg体重)后，前3d无明显疗效，但10d后，治疗组踝关节肿胀基本消退，与未注射佐剂对照组相似。所用两种药物剂量组之间的疗效无显著性差异。

3.3TNF受体封闭肽对佐剂性关节炎病理变化的影响按常规做组织切片，HE染色。结果显示：经每日1mg/kg体重的TNF受体封闭肽持续治疗20d后，与未用药的佐剂性关节炎大鼠相比，其踝关节滑膜细胞层增生程度减小，滑膜组织充血、水肿好转，关节腔内炎性细胞浸润明显减少以及关节软骨破坏程度减轻等。但与正常大鼠的踝关节切片相比，治疗组尚未完全恢复正常(如图5)。

表1.TNFR1封闭肽对大鼠佐剂性关节炎踝关节肿胀程度的影响

*模型组与正常组相比：P＜0.001    **治疗组与模型组相比：P＜0.001

3.4TNF受体封闭肽对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞IL-1βmRNA的影响取对照组、模型组与治疗20d的大鼠腹腔巨噬细胞5×10⁹/ml，RT-PCR分析方法同实施例1.2。结果如图6所示：正常大鼠腹腔巨噬细胞没有IL-1βmRNA的转录，因为未检测到RT-PCR产物；注射佐剂后的模型组大鼠的腹腔MΦ出现一条强的IL-1βcDNA特异性条带(泳道4)，而用TNF受体封闭肽治疗后的大鼠腹腔MΦ的IL-1βcDNA条带则明显减弱(泳道2)，通过密度扫描进行相对定量，证实TNF受体封闭肽的抑制效率为50％。同样的方法测得结果如图7所示：正常大鼠腹腔MΦ未检测到TNF-α的RT-PCR产物(泳道3)，佐剂性关节炎组大鼠的腹腔Mφ有明显TNF-α特异性RT-PCR产物条带出现(泳道2)，而经TNF受体封闭肽治疗大鼠的腹腔MΦ的TNF-α条带则明显减弱(泳道4)。通过密度扫描进行相对定量，证实TNF受体封闭肽的抑制率达30％以上。

实施例4 TNFR1封闭肽-hIgGFc真核表达载体(pIG/3C-TNFR1BP)构建和鉴定

经上述体内外实验证实此条TNFR1封闭肽(线12肽)能抑制TNF-α的生物学活性，并对大鼠佐剂性关节炎有较好的治疗作用。但是，由于人工合成短肽的成本昂贵，且短肽在人体内的半衰期较短，从而制约其临床应用，因此本发明通过人工合成编码TNFR1封闭肽的寡核苷酸，将其插入真核细胞Fc表达载体pIG/3C，从而成功构建TNFR1封闭肽-人Fc表达载体pIG/3C-TNFR1BP，并在真核细胞COS7中成功表达TNFR1封闭肽-Fc融合蛋白(TNFR1BP/hIgFc)。具体实施方案如下：

4.1合成TNFR1封闭肽基因TNFR1封闭肽基因片段由美国PE公司391型DNA自动合成仪合成(上海生物工程技术有限公司)，在封闭肽寡核苷酸正负链5’端和3’端分别引入KpnI酶切粘性末端序列和BamH I酶切后粘性末端序列。

4.2TNFR1封闭肽单链DNA的复性由于经DNA合成仪合成的TNFR1封闭肽基因为正负两条DNA单链，为使其形成双链DNA分子构像和完整的限制性酶BamHI和KpnI酶切后粘性末端序列，需将正负两链在一定条件下进行复性。复性方法如下：将合成的TNFR1I封闭肽基因的正负链分别溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.5)溶液内，使两链的终浓度均为10μmol/L。取正负链各20μl，置同一1.5ml离心管内，加4.4μl 10×PCRbuffer，100℃煮沸3min，置室温自然冷却，即得复性的双链TNFR1封闭肽基因。

4.3质粒pIG/3C的转化、扩增及大量提取主要方法均参照卢圣栋主编的《现代分子生物学实验技术》(第2版)(精)一书进行。

4.4TNFR1封闭肽-hIgG真核表达载体(PIG/3C-TNFR1BP)构建将提取的质粒pIG/3C经BamH I和KpnI酶切后以低熔点琼脂糖电泳回收目的片段。利用合成的TNFR1封闭肽基因两端的酶切粘性末端序列，与pIG/3C经BamH I和KpnI酶切回收产物进行连接反应。取连接反应液转化感受态Mc1061，挑选6个氨苄和四环素抗性的菌落，小量法提取质粒，酶切产物行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，长波紫外灯下观察。结果图8所示：3号克隆酶切产物在泳道上可见一大小约为90bp的酶切片段，其分子量与插入的目的基因片段大小相符(泳道3)。

4.5重组载体pIG/3C-TNFR1BP导入COS7细胞采用Lipofectin2000介导的转染技术(参阅其产品说明书)。取对数生长期的COS7细胞，使90％长满。实验前，在12×75mm无菌玻璃管内制备下列溶液：Solution A：10ng质粒DNA(pIG/3C、pIG/3C-TNFR1BP)溶于50μl的OPTI-MEMI无血清培养基中；Solution B：2μl Lipofectin加入50μlOPTI-MEMI培养基中，充分混匀，室温放置5min；合并Solution A和Solution B，混匀，室温下放置20min，以便形成DNA-脂质体复合物。弃细胞培养液，加脂质体-DNA混合液。5％CO2，37℃培养；分别在转染24h、48h、72h、96h和120h收集细胞培养上清检测。

4.6ELISA检测融合蛋白TNFR1封闭肽-hIgGFc的表达以羊抗人IgG(2ug/ml，100ul)包被酶标板，4℃24小时，分别加入不同稀释浓度的IgG标准品、PIG/3C-TNFR1BP转染各时段收集上清、未转染COS7细胞培养上清，4℃过夜，PBS-T洗板×3，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgGFc抗体(1∶2000)，37℃1h，PBS-T洗板×3，然后加入显色液，室温5min，2mol/L H2SO4终止反应，酶标仪测定D490。结果表明：重组质粒pIG/3C-TNFR1BP转染上清中可见人IgG蛋白表达；而未转染上清中IgG表达为阴性。提示转染pIG/3C-TNFR1BP的真核细胞表达TNFR11封闭肽-hIgGFc融合蛋白。根据IgG标准曲线计算的结果图9，可见在各组重组体转染上清中均有一定量融合蛋白表达，其中转染48h上清中融合蛋白表达量最高(8.6μg/ml)，后续实验中收集转染上清时间均为转染后48小时。

4.7Western印迹鉴定融合蛋白TNFR1封闭肽-hIgGFc SDS-PAGE采用垂直板不连续凝胶电泳法。常规灌制12％分离胶和5％浓缩胶，取重组载体转染上清和未转染COS7细胞培养上清和蛋白分子量标准以每孔20ul加样，80v电泳至分离胶，120V继续电泳6小时，考马斯亮蓝染色。Western印记：SDS-PAGE电泳结束后，取下凝胶，将蛋白质转印至PVDF膜(200mA，4℃，1小时)，3％脱脂奶粉-吐温封闭过夜，PBS-T漂洗×3，每次10分钟，加入HRP-羊抗人IgG抗体(1∶5000稀释)，37℃30分钟，显影。结果见图10。

实施例5 融合蛋白TNFR1封闭肽-hIgGFc生物学活性鉴定

5.1间接免疫荧光法检测融合蛋白TNFR1封闭肽-hIgGFc与TNFR1的结合在预先铺入六孔板中每孔加入L929细胞1×106个，37℃，5％CO2培养箱培养过夜，使细胞均匀贴壁。分别加入融合蛋白上清、空载体转染上清和合成TNFR1封闭肽37℃作用2小时，经固定、封闭后加入兔抗人抗TNFR1一抗(1∶100)，4℃过夜，加入FITC标记羊抗兔二抗(1∶100)，37℃避光孵育1h，再以甘油封片荧光显微镜下观察并照相。结果见图11所示：阳性对照组即只加入一抗(兔抗人TNFR1抗体)和二抗(FITC-羊抗兔IgG)作用，L929细胞表面TNFR1与相应抗体结合，表现为强荧光(图11b)，而加入含融合蛋白TNFR1封闭肽-hIgGFc的细胞培养上清、合成TNFR11封闭肽则表现为荧光着色的细胞明显减少(图11c和d)，仅加入pIG/3C转染空载体上清的则未见任何抑制性效应(图11e)。此结果提示融合蛋白、合成TNFR11封闭肽能够特异性识别L929细胞上表达的TNFR1，从而竞争性抑制抗TNFR1抗体与该细胞上的TNFR1结合。

5.2流式细胞术检测融合蛋白TNFR1封闭肽-hIgGFc与TNFR1的结合将分别以融合蛋白上清、空载体转染上清和合成TNFR1封闭肽作用后的L929细胞以常规方法先后加入加入兔抗人TNFR1一抗(1∶100)和FITC标记羊抗兔二抗(1∶100)，流式细胞仪检测各组细胞荧光表达情况。结果如图12所示：与只加入FITC标记二抗空白对照组图12a相比，加入转染空载体上清的荧光阳性细胞率显著增高至99.12％，提示其无受体拮抗作用；但加入转染融合蛋白重组载体上清和合成受体封闭肽的荧光阳性细胞率均明显降低，其中融合蛋白拮抗率为77.74％；合成TNFR1封闭肽拮抗率为69.75％。提示两种封闭肽均可竞争性抑制抗TNFR1抗体与TNFR1的结合，从而使荧光阳性细胞率下降。

5.3细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNF-α胞毒效应的抑制作用以L929为靶细胞，先分别加入融合蛋白、合成TNFR1封闭肽及转染空载体的细胞培养上清37℃作用2h，再加入sTNF，并设一组只加sTNF标准品作为参照。sTNF标准品的含量为15u/孔，细胞数为2×104/孔/100μl DMEM培养基，10μg/μl放线菌素D(ACT-D)10μl/孔，每个样品设3复孔。5％CO2，37℃培养24h后，加5mg/ml MTT 10μl/孔，继续培养4h，每孔100μl DMSO溶解结晶，酶标仪测OD570nm值。结果如图13所示：融合蛋白、合成TNFR1封闭肽均可抑制TNF-α的胞毒效应，且在一定范围内呈剂量依赖性。其中，合成TNFR1封闭肽的胞毒抑制率可达62.63％(图13a)，在50％抑制率时的浓度为约1μg/ml(图13c)；而融合蛋白的抑制率最高为73.51％(图13c)，在50％抑制率时的浓度为0.47μg/ml(图13c)。

5.4融合蛋白对TNF-α诱导人单核细胞促炎细胞因子mRNA水平的影响：采用TR-PCR方法检测促炎细胞因子IL-1β、IL-8mRNA水平，具体方法同实施例2.2。IL-8的引物：P1：5’-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAA-3’，P2：5’-TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA-3’，扩增片段长约250bp。结果如图14a所示：TNF-α刺激的单核细胞可见一条强的IL-1βcDNA特异性条带(600bp)(泳道2)；而静止单核细胞则有少量IL-1βmRNA表达(泳道2)，应用融合蛋白(泳道3)、合成封闭肽(泳道4)所出现的IL-1βcDNA条带明显减弱，加入转染空载体上清的单核细胞IL-1βPCR产物条带的亮度与TNF刺激组相似(泳道5)。通过密度扫描进行相对定量(图13b)，证实融合蛋白的抑制率为70.9％；合成封闭肽的抑制率为59.26％。提示两种封闭肽均可有效阻断TNF诱导单核细胞表达IL-1βmRNA。与IL-1βRT-PCR结果相似，各组封闭肽作用后，IL-8 RT-PCR电泳条带与阳性对照(TNF-α刺激组，图15a泳道1)相比明显减弱，通过密度扫描进行相对定量(图15b)；融合蛋白的抑制率为68.67％；合成封闭肽的抑制率为58.47％。提示两种封闭肽也可有效抑制TNF诱导单核细胞表达IL-8mRNA。

5.5激光共聚焦显微镜检测融合蛋白对TNF-α诱导人单核细胞NF-κB核转位的影响分离人单核细胞分别加入融合蛋白(8.6μg/ml)、合成封闭肽(8.6μg/ml)、于37℃、5％CO2培养箱内作用2h；加入TNF-α(150u/ml)继续作用30min；70％冰乙醇-20℃固定24h，加入100μl含2μg的兔抗人NF-κB抗体，室温孵育2h，加入100μl羊抗兔FITC标记的二抗，室温避光孵育30min；加入10μl PI(50μg/ml)，室温避光孵育30min；置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜进行观察。PI将胞核染为红色，FITC标记的抗体可将NF-κB染为绿色。结果见图16所示：TNF-α可诱导单核细胞NF-κB从胞浆转位至胞核，因为胞核区出现黄色斑点(图16a)，空质粒转染上清组亦见明显NF-κB转位(图16d)；合成短肽(图16b)和TNFR1BP/hIgFc融合蛋白(图16c)处理的单核细胞胞浆呈绿色，而胞核呈红色，胞核边缘有少量黄色斑点，提示两种封闭肽可有效抑制TNF诱导的NF-κB核转位。

实施例6 融合蛋白TNFR1封闭肽-hIgGFc对高脂高糖诱导的大鼠II型糖尿病的治疗作用

6.1大鼠肥胖和胰岛素抵抗模型的制备和、实验分组和样品的采集雄性Wistar大鼠，4周龄，体重110～130g，首先随机分为正常饮食(normal diet，ND)组和高脂高糖饮食(high fat and sucrose，HFS)组。HFS中含而20％重量/重量的猪油(33％的能量)，24.5％重量/重量的蔗糖(20％的能量)。饲养16周后，将HFS组再随机分为3组，共4组，在继续给予原来的饲料基础上，每组8只，分别经尾静脉给予0.1ml的生理盐水或0.1ml的生理盐水中含500μg的融合蛋白或含500μg的Fc蛋白，即ND组、HFS组、HFS+融合蛋白组和HFS+Fc蛋白组等共4组。每周给药2次，连续4周。总体重、空腹血糖和胰岛素的检测均在禁食16h后进行。实验结束后(共饲养20周)，在麻醉下经眼眶后静脉丛采血，并收集肝脏、肾脏、胰腺、股四头肌和附睾的脂肪垫等，所有器官和组织分装后冻存于液氮中。

6.2高脂高糖诱导大鼠肥胖和胰岛素抵抗糖耐量和胰岛素耐量试验都在大鼠禁食24h后清醒状态下进行。经腹腔注射3.0g/kg体重的糖或1IU/kg猪胰岛素(Sigma)后，在不同时间点剪尾巴采血，用One-Touch Profile血糖计测血糖(Lifescan，Inc.，Milpitas，CA)；血清的胰岛素和C反应蛋白水平采用双抗体包被试管RIA试剂盒检测(chemclin，Inc.，Beijing，China)。其具体操作按试剂盒说明书进行。抗人的胰岛素抗体和C反应蛋白抗体都与大鼠有交叉反应。胰岛素抵抗采用稳态模型指数(Homoeostasis Model Assessment Index，HOMA-IR)进行评价，其计算公式为HOMA-IR＝空腹胰岛素(μIU/ml)×空腹血糖(mmol/l)/22.5。血浆甘油三酯和总胆固醇采用commercially available color enzymatic assays检测(Sigma and Wako Pure Chemicalindustries Ltd.，Richmond，VA)。结果显示：HFS喂养4周后大鼠体重开始以每月增长1.4倍的速度增加，与同期的生理盐水组比较体重增加18％(如图17A)(P＜0.05)，同时，血浆的胰岛素水平显著增加，并且随HFS喂养的时间延长而增加(如图17C)以便维持正常的血糖水平(如图17B)，然而，HOMA-IR在给予HFS喂养8周后就显著高于AD组(如图17D)，提示HFS能诱导大鼠肥胖相关的胰岛素抵抗。

6.3融合蛋白能抑制高糖和高脂诱导的大鼠肥胖给HFS喂养的大鼠经尾静脉注射融合蛋白TNFR1-Fc治疗4周后，可使其体重较NS处理的大鼠(HFS组)下降26％，而Fc蛋白处理并不影响其体重(如图18A)；HFS+融合蛋白组的附睾脂肪垫重量较HFS组显著减少(P＜0.05)(图18B)，但HFS组的附睾脂肪垫重量较HFS+Fc组低；同样地，脂肪组织HE染色也显示HFS+融合蛋白组的脂肪细胞大小明显小于HFS组，HFS组和HFS+Fc组的脂肪细胞大小显著大于正常组(图18C)；另外，其他组织如肝脏、肾脏和胰腺等器官的重量无改变(结果未显示)。提示融合蛋白能减少脂肪的沉积、减轻体重。采用commercially available color enzymatic assays(Sigma and Wako Pure Chemicalindustries Ltd.，Richmond，VA)检测大鼠血浆甘油三酯和总胆固醇，结果显示HFS+融合蛋白组的甘油三酯显著低于HFS组和HFS+Fc组(图18D)，但血浆总胆固醇水平在各组之间无显著差异(结果未显示)。

6.4融合蛋白能提高外周胰岛素敏感性因为肥胖与胰岛素抵抗密切相关，而脂肪组织中的TNF-α是影响胰岛素活性的主要因素，因此我们进一步研究了在肥胖状态下TNF-α对糖耐量和全身胰岛素。结果发现在整个实验过程中各实验组大鼠空腹血糖在均基本保持在正常水平(图19A)。相反，HFS组和HFS+Fc组的空腹胰岛素水平(图19B)和C反应蛋白(图19C)在HFS饮食喂养20周后较正常ND组增加达2倍(p＜0.01)，胰岛也代偿性肥大(图19E)；而融合蛋白能抑制HFS饮食诱导的空腹胰岛素水平和C反应蛋白增高，其抑制率达50％(p＜0.05)，也能使胰岛保持在中等大小。这种在血糖水平正常的情况下血清胰岛素水平升高的现象是因为肥胖诱导的胰岛素抵抗的一个代偿性反应，因此，HFS+融合蛋白的HOMA-IR较HFS组和HFS+Fc组的显著降低(图19D)，提示融合蛋白能有效抑制肥胖相关的胰岛素抵抗。为了检测融合蛋白是否直接抑制胰岛素抵抗，我们进行了腹膜内糖耐受和胰岛素耐受试验。结果：各组大鼠的血糖在注射30min后能达到最高水平，然后缓慢下降。其中，HFS组在30-120min之间的血糖水平较ND组显著增高(图20A)，同样地，对胰岛素的低血糖反应较ND组显著降低(图20B)，但与Fc蛋白相比，融合蛋白在给予胰岛素后能显著加强低血糖对胰岛素的反应(p＜0.05)，注射葡萄糖后能较快地降低血糖水平(p＜0.05)，提示融合蛋白能增加胰岛素的敏感性。

6.5融合蛋白对局部和全身TNF-α产生的影响为了进一步研究融合蛋白对TNF-α的影响，我们首先采用ELISA方法检测了大鼠血液中的TNF-α，结果发现HFS饲养的大鼠血清中TNF-α的含量较较ND组高2.4倍，但融合蛋白能逆转血清中TNF-α水平，使之接近于正常ND组水平(图21D)。有趣的是在脂肪组织局部TNF-α的含量显著高于全身。采用免疫组织化学检测附睾的脂肪组织和胰腺组织里TNF-α的表达情况，其具体步骤为：将上述组织用4％的多聚甲醛固定后行石蜡切，然后将石蜡切片脱蜡至水后与1∶200兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体(一抗)(北京中山生物技术公司)在室温孵育1h，用PBS洗涤5次，然后与生物素标记的二抗(1∶200)在室温孵育1h，再用PBS洗3次后与辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育0.5h，洗涤，然后加底物DAB显色5min，洗涤镜检。结果显示：棕色颗粒主要分布在胰腺的胰岛(图21A)和脂肪组织的脂肪细胞膜上(图21B)，其中HFS组大鼠的胰岛和脂肪细胞中TNF-α的表达量显著高于ND组；另外，HFS组的附睾脂肪组织垫的组织匀浆上清中的TNF-α也显著高于ND组(图21C)，与Fc蛋白相比，融合蛋白处理后几乎可以完全抑制胰岛和脂肪组织中TNF-α的表达。

6.6融合蛋白对IRS酪氨酸磷酸化的影响IRS-1的酪氨酸磷酸化是其激活下游信号通路的一个关键环节，而TNF-α就是通过干扰胰岛素受体的信号参与胰岛素抵的。为了研究融合蛋白增加胰岛素敏感性的机制，我们采用免疫共沉淀-Western blotting方法检测了IRS-1中酪氨酸的磷酸化水平。其简单步骤为：禁食一晚上后，腹腔注射1IU/kg猪胰岛素或等体积的生理盐水，30min后，麻醉大鼠，取其股四头肌、肝脏、附睾脂肪组织，在4℃条件下用组织匀浆缓冲液(1％Triton X-100，10mM EDTA，100mMsodium fluoride，10mM sodium vanadate，100mM sodium pyrophosphate，50mM Hepes，pH 7.4，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，0.01mg/ml leupeptin and 0.01mg/mlaprotinin)制成组织匀浆，12,000g离心15min，收集上清，测定其蛋白质含量。取1mg的抽提蛋白与1mg/ml的兔抗鼠胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz.CA)在4℃孵育过夜，然后再向此免疫复合物中加入50μl蛋白A-琼脂糖凝胶CL-4B珠子(Amersham PharmaciaBiotech)，继续在4℃孵育1h后，用RIPA缓冲液(0.15M NaCl/10mM phosphate buffer，pH 7.0，1％Nonidet P-40，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS)洗3～5次，加上上样缓冲液，煮沸后上样进行8％SDS-PAGE凝胶电泳，然后将凝胶中的蛋白质经电泳转移至PVDF膜上。将此膜用TBS(20mM Tris-Hcl，pH 8.0 0.15M Nacl)配制的5％无脂奶粉于4℃封闭过夜后，用1∶1000稀释的抗磷酸化酪氨酸激酶p-Tyr单抗(PY99)(SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz.CA)，或用1∶1000稀释的抗IRS-1的多克隆抗体于4℃与膜孵育过夜，TBST(TBS with 0.05％Tween-20)洗涤3次，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10000)(北京中山生物技术公司)孵育30min后，用增强化学发光剂现示测定蛋白质的条，并用激光密度测定仪进行蛋白质条带的定量。结果发现：在没有用胰岛素刺激时，各实验组所有组织中都检测不到IRS-1的酪氨酸的磷酸化，一旦用胰岛素刺激后30min，正常ND组的肌肉、脂肪和肝脏组织中的IRS-1的酪氨酸磷酸化水平迅速而明显升高(图22A)，而HFS组和HFS+Fc组的酪氨酸磷酸化水平显著被抑制，与ND相比，其抑制率在脂肪组织中约为80％、肌肉组织中约68％、肝脏中约为32％(图22B)。用融合蛋白阻断TNF-α和TNFR1的作用后能显著促进胰岛素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化，与ND相比，肌肉组织的磷酸化水平可提高了84.7％，在脂肪组织中提高了92.7％，但在肝脏组织的变化不明显。

二、TNF结合肽(环9肽)与TNFR1封闭肽(环9肽)

实施例7 TNF结合肽和TNFR1封闭肽的筛选及其特异性鉴定

7.1噬菌体肽库的筛选：参照New England Bioland Biolabs说明书，分别以0.1MNaHCO3(pH8.6)包被液稀释人重组TNF-α和人重组TNFR1I蛋白为诱饵包被30×15mm塑料培养皿，同时设空白对照，4℃过夜，0.5％BSA封闭，4℃2h，加肽库(2.0×1011个噬菌体克隆/10μl)，室温作用1h，洗去未结合的噬菌体(此噬菌体称为无关噬菌体，作为后续实验的阴性对照)，用0.2M甘氨酸-盐酸洗脱液解离已经与诱饵蛋白结合的噬菌体，侵染ER2738菌，扩增并用PEG提取噬菌体，用于下一轮筛选。共进行三轮筛选，逐轮降低诱饵蛋白的浓度及其与肽库作用时间，增加洗涤缓冲液中Tween-20浓度，以便得到亲和力高、特异性强的噬菌体克隆。经三轮筛选后随机挑选噬菌体单斑扩增，PEG/NaCl沉淀，最后用200μl TE溶解噬菌体，分别得到能与TNF-α结合的“TNF-α结合噬菌体”和能与TNFR1I结合的“TNF受体封闭噬菌体”。结果，经三轮筛选后，噬菌体的回收率均能逐步上升，说明筛选所得到的特异性噬菌体克隆有较高程度的富集，最后第三轮洗脱下的噬菌体比第一轮筛选得到的产量均高出100多倍(表略)。

7.2细胞毒抑制实验：取上述三轮筛选后随机挑选并扩增的噬菌体克隆，借助其能否抑制S-TNF-α杀伤L929细胞或/和U937细胞的“细胞毒抑制实验”进行筛选。

基本方法：取对数生长期的L929细胞或U937细胞(5×104)为靶细胞，加入96孔培养板中，同时加入噬菌体克隆，每孔终体积均为100μl，置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养16～18h后，每孔加入MTT 10ul(终浓度为0.5mg/ml)，继续培养4h后，离心1000rpm，10min，弃上清，每孔加入100μl DMSO，待甲月替完全溶解(室温放置15min)后，用酶标仪测其OD570nm值(630nm校准)。

实验分组：①TNF结合噬菌体组：TNF结合噬菌体(终浓度为106pfu/10ul)预先与TNF-α(终浓度为50U/ml)混合，37℃孵育30min后加入到靶细胞悬液中；②TNFR1封闭噬菌体组：TNFR1封闭噬菌体(终浓度为1012pfu/10ul)预先与U937细胞混合，37℃孵育30min后加入TNF-α(终浓度为50U/ml)。③联合噬菌体组：将上述两种噬菌体各减半量，分别与TNF-α和靶细胞孵育30min后再混合培养；同时，设空白组、TNF-α组(阳性对照组)及无关噬菌体组作阴性对照。

细胞死亡率＝(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％

细胞毒抑制率＝[1-噬菌体/TNF组细胞杀伤率/TNF组细胞杀伤率]×100％

结果：以TNF-α为靶蛋白，从第三轮筛选的洗脱物中随机挑选并扩增39个克隆，以小鼠成纤维细胞株L929为TNF-α的靶细胞，并设无关噬菌体克隆为阴性对照，根据噬菌体是否能抑制TNF-α细胞毒效应(即细胞毒抑制实验)，粗步筛选到5个具有拮抗TNF-α作用的噬菌体克隆(其编号为5、6、7、32及38)，并称之为“TNF结合噬菌体”；用细胞毒效应筛选TNFR1封闭噬菌体：以TNFR1为靶蛋白，从第三轮筛选的洗脱物中随机挑选并扩增37个噬菌体克隆，分别观察它们对TNF-α细胞毒效应的影响。结果显示有2个克隆不仅对靶细胞无细胞毒作用，而且能明显抑制TNF-α诱导的细胞毒效应，即为“TNFR1封闭噬菌体”，其编号为X2、X4(图23)。然后，以同样的方法选择人单核细胞株U937作为TNF-α的靶细胞，进一步观察上述各TNF结合噬菌体和各TNFR1封闭噬菌体对不同浓度TNF-α介导的细胞毒效应的影响。结果显示，滴度为106pfu/μl的TNF结合噬菌体和滴度为1012pfu/1μl的TNFR1封闭噬菌体几乎可完全阻断50U/ml的TNF-α(杀伤率约为20％)对U937的胞毒效应；当TNF-α浓度增加到100U/ml(杀伤率约为30％)时，各个噬菌体克隆的细胞毒抑制率虽然较前者显著下降(P＜0.01)，但仍然有50％左右的抑制率；当TNF-α浓度增加到200U/ml(杀伤率约55％)时，各个噬菌体克隆的细胞毒抑制率进一步显著下降(P＜0.01)，只有6、7、32、38及X4号还有10％左右的抑制率。提示TNF结合噬菌体和TNFR1封闭噬菌体的竞争性抑制效果随着TNF-α浓度的增高而减弱(图24)为了进一步观察TNF结合噬菌体和TNFR1封闭噬菌体是否具有协同作用，将其滴度减半，观察两种噬菌体联用对100U/ml的TNF-α(杀伤率约为30％)的影响。结果显示：X4与32号、X4号与38号联用的细胞毒抑制效应均较其单独作用的效果好，但其中X4与38号联用的抑制率达85.3％，显著高于各自单独的抑制作用(P＜0.01)，也显著高于X4与32号噬菌体联用的抑制率(P＜0.01)。提示TNF结合噬菌体(38号)和TNFR1封闭噬菌体(X4号)联用具有协同抑制作用。

7.3ELISA鉴定噬菌体克隆的特异性。分别取含50μg/ml人重组TNF-α蛋白和TNFR11蛋白的包被液包板，0.5％BSA封闭，分别加入上述TNF结合噬菌体和TNF受体封闭噬菌体(4倍倍比稀释噬菌体1012～2×105)，室温孵育2h；加入HRP标记的抗-M13抗体(1∶5000)室温孵育1h后用底物四甲基联苯胺(TMB)显色，在波长405-415nm下读取OD值。用无关噬菌体做阴性对照。结果：5个TNF结合噬菌体克隆和2个TNFR1封闭噬菌体克隆分别能与hrTNF重组蛋白和hrTNFR1重组蛋白特异性结合而显色，而无关噬菌体克隆(阴性对照)与空白对照则不显色，提示TNF结合噬菌体和TNFR1封闭噬菌体分别具有结合TNF-α和TNFR1的特异性(图25)

7.4RT-PCR检测TNFR1封闭噬菌体对TNF-α诱导U937细胞IL-1βmRNA水平的影响，具体方法同实施例2.2。结果显示：X2、X4本身不能促进IL-1βmRNA转录，但能抑制TNF-α诱导IL-1βmRNA的转录，其中X4的抑制率达50％。提示TNFR1封闭噬菌体与U937细胞膜表面的TNFR1结合后，本身无受体激活作用，但能有效阻止TNF-α与TNFR1结合，从而阻断其生物学效应。因此，TNFR1封闭噬菌体展示的环肽可能为较理想的TNFR1拮抗剂。(图26)

7.5DNA序列分析和多肽合成：根据上述实验结果，挑取TNF结合噬菌体克隆5、6、7、32、38号和TNFR1封闭噬菌体克隆X2、X4号及无关噬菌体克隆进行DNA测序。结果显示5个TNF结合噬菌体展示肽和2个TNFR1封闭噬菌体展示肽的氨基酸序列与天然的TNF-α和TNFR1的氨基酸序列均无同源性。选择对TNF-α生物学功能具有较强抑制效应的32、38和X4号噬菌体克隆，根据其展示肽的序列合成环肽

实施例8 TNF结合肽和TNFR1封闭肽的生物学特性及功能检测

以下TNF结合肽(TBP)与TNFR1封闭肽(TRBP)均由西安美联合成并环化(即环9肽)。

8.1GFP-TNF融合蛋白竞争结合实验检测TBP和TRBP的特异性取无菌盖玻片置于6孔细胞培养板中，加入1×106/ml对数生长期的L929细胞，置37℃，5％CO2细胞培养箱中培养过夜，制作细胞爬片，用1％多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗细胞；同时加入GFP-TNF融合蛋白(3μg/ml)和TBP或TRBP(3μg/ml)，置4℃过夜；用PBS冲洗玻片，在荧光显微镜下观察并拍照。另外，取1×106/ml对数生长期的U937细胞用1％多聚甲醛固定后，加入GFP-TNF蛋白和合成环肽(3μg/ml)，置4℃过夜上流式细胞仪检测荧光。结果显示：合成多肽能抑制GFP-TNF融合蛋白与细胞膜上TNFR1结合。其中，TBP(Pep.38)与TRBP(pep.X4)联用的抑制效果最好，能使U937细胞结合GFP-TNF荧光蛋白的阳性细胞率降低50％，也能显著减少L929细胞膜上的荧光强度(图27)。提示人工合成的TBP和TRBP仍具有结合TNF-α和TNFR1的特异性。

8.2非变性聚丙烯凝胶电泳检测TBP与TRBP二者的互补结合性质谱分析的结果显示TBP(pep.38)与TRBP(pep.X4)的分子量分别为1102.21和1203.96。理论上，如果二者能互补结合，其分子量应为2300以上，在20％的非变性聚丙烯凝胶中其蛋白条带应在二者单独电泳的条带之后。非变性聚丙烯凝胶电泳与变性的聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)的过程完全相同，所不同的是上样缓冲液中不加巯基乙醇、其他工作液中均不加十二烷基磺酸钠(SDS)。本实验使用的是20％分离胶和3.75％浓缩胶。取细胞培养液RPMI1640溶解TBP(pep.38)与TRBP(pep.X4)(2mg/ml)，将pep.38和pep.X4等体积混合后，置37℃温箱中孵育30～45min后取出，加入等体积的2×上样缓冲液，混匀，取15ul上样电泳，同时设pep.38和pep.X4对照。电泳完毕后取出凝胶用考马斯亮蓝染色4h，再用脱色液脱色2h，脱色过程中随时观察蛋白条带颜色深浅的变化，并拍照。结果显示：无论pep.38和pep.X4单独电泳还是二者混合孵育后电泳，三者条带均在同一直线上，并无任何滞后条带出现，提示二者混合不会发生互补结合。(图28)

8.3TBP与TRBP对TNF-α胞毒效应的抑制作用为了检测人工合成环肽是否象噬菌体展示环肽一样有效，故观察TBP和TRBP能否抑制TNF-α对U937细胞的胞毒效应。方法同实施例7.2。实验分组：①TBP组：各种浓度的TBP预先与TNF-α(终浓度为50U/ml)混合，37℃孵育30min后加入到靶细胞悬液中；②TRBP组：各种浓度的TRBP预先与U937细胞混合，37℃孵育30min后加入TNF-α(终浓度为50U/ml)。③联合多肽组：将上述两种多肽各减半量，分别与TNF-α和靶细胞孵育30min后再混合培养；同时，设空白组、TNF-α组(阳性对照组)及无关多肽组作阴性对照。结果显示：为了检测人工合成环肽是否象噬菌体展示环肽一样有效，故观察TBP和TRBP能否抑制TNF-α对U937细胞的胞毒效应(图3)。结果显示TBP与TRBP对TNF-α的细胞毒效应均有抑制作用，且随着剂量的增加而增强，当剂量增加到10μg/ml时，抑制效果最好。此外，将TBP与TRBP联用(即pep.38+X4)，其各个剂量的细胞毒抑制率均显著高于各自单独作用的抑制率(P＜0.01)。(图29)

8.4NBT还原法检测TBP与TRBP对外周血单核细胞的影响：方法同实施例2.1。TNF-α由活化的单核/巨噬细胞产生，又能参与巨噬细胞的激活，促进单核/巨噬细胞对IFN-γ的敏感性，增强其呼吸爆发，促进其吞噬功能，诱导炎性细胞因子如IL-1、IL-8等产生。故本发明首先观察TBP和TRBP在体外对TNF-α诱导人外周血单核细胞活化的影响。结果发现：同时给予外源性IFN-γ和TNF-α(各5ng/ml，5U/ml)较之二者单独作用更能明显激活单核细胞，表现为呼吸爆发功能显著增强。TBP和TRBP联用能有效抑制TNF-α和IFN-γ诱导的单核细胞呼吸爆发强度，使反应体系中NBT还原能力减弱，OD值显著降低(其抑制率为56.25％)(图30)。

8.5RT-PCR检测TBP和TRBP对TNF-α诱导U937细胞IL-1βmRNA水平的影响，具体方法同实施例2。RT-PCR产物条带扫描显示其对IL-1β和IL-8mRNA转录抑制率为55.10％和52.53％。这些结果表明TBP和TRBP可通过竞争性抑制TNF-α与TNFR1的结合，降低单核细胞对IFN-γ的敏感性，从而抑制单核细胞的活化(图31)。

实施例9 TBP和TRBP对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用

9.1大鼠溃疡性结肠炎模型制备、动物分组及取材取wistar大鼠，术前禁食24h，自由饮水，乙醚轻微麻醉后，用硬膜外麻醉导管经肛门轻缓地插入8cm，深达结肠，然后注射TNBS(50mg/kg体重)乙醇溶液(5％TNBS溶液与等体积无水乙醇混合)。本实验36只大鼠随机分为6组，各实验组TNBS乙醇溶液灌肠后12h内经灌胃给药，1ml/只/天，连续6天。具体分组：①正常对照组，仅生理盐水处理；②模型组(非用药组)组；③无关多肽组，取无关环肽(2.5mg/kg/次)对照处理；④联合多肽治疗组，取等量混合的TNF结合环肽和TNFR1封闭环肽(总剂量2.5mg/kg/次)治疗；⑤抗TNF抗体治疗组：取抗TNF多克隆抗体(10mg/kg/次)治疗；⑥5-氨基水杨酸治疗组：TNBS取Pentasa(100mg/kg/次)治疗。实验前后称量大鼠体重，处理6天后，摘眼球取血，随后解剖，取肛门至盲肠肠管(约8-10cm)，沿肠系膜纵轴剪开，用冷生理盐水冲洗干净后进行肉眼大体形态学评分，然后，一部分结肠标本放入10％的甲醛溶液中固定24h进行常规石蜡组织切片、HE染色、显微镜下进行组织学观察评分；另一部分标本置-80℃冻存，用以检测生化指标及促炎细胞因子表达。结果，SD雄性大鼠经肛门灌肠给药12h后，大鼠出现腹泻、呐差、饮水量增加、毛发粗造等症状，一周后大鼠体重明显下降，大体解剖可见距肛门8～10cm处结肠粘膜充血水肿、溃疡形成，粘膜增厚、肠腔狭窄，结肠组织与周围组织粘连。病理组织学检查发现，大多数大鼠的结肠组织病变累及肠壁全层，以黏膜和黏膜下层为重，淋巴管、血管扩张，肠壁水肿，并见大量的中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润，有两处或多处黏膜上皮坏死脱落，形成溃疡，有的溃疡深达黏膜肌层(如图32)。此结果与文献报导的一致，说明大鼠溃疡性结肠炎模型制备成功。

9.2联合多肽对溃疡性结肠炎大鼠体重、结肠组织病理损伤的影响

结肠组织损伤大体形态评分标准为：无溃疡，无炎症计0分；无溃疡，局部水肿计1分；有溃疡，无水肿计2分；仅一处有溃疡与炎症计3分；两处或更多地方有溃疡与炎症计4分；溃疡大于2cm计5分。结肠组织切片的病理损伤评分标准为：无淋巴细胞浸润，计0分；低水平的淋巴细胞浸润计1分；中等水平的淋巴细胞浸润计2分；高密度血管，肠壁增厚计3分；全层淋巴细胞浸润，杯状细胞消失，肠壁增厚计4分。

本发明的结果显示：联合多肽对溃疡性结肠炎大鼠体重、结肠组织病理损伤的影响各实验组大鼠实验前后称量体重，结果(表3)显示正常对照组实验后较实验前显著增加(p＜0.01)；模型组体重实验后较实验前显著下降，但多肽治疗组和抗体治疗、5-氨基水杨酸组一样，其体重虽然较正常组实验后低(p＜0.01)，但是显著高于模型组实验后的体重(p＜0.01)。由于TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型的主要症状是腹泻，脱水，导致大鼠体重下降，因此，此结果表明联合多肽能改善溃疡性结肠炎症状。各组大鼠实验前后的体重变化情况见表4，它显示正常对照组大鼠的体重较实验前显著增长(P＜0.05)，模型组和无关肽对照组实验后的体重均有所下降，而联合多肽治疗组与抗体治疗组、水杨酸组的结果一致，未见下降，其体重显著高于模型组及无关肽对照组(P＜0.05)。由于此模型为急性结肠炎，其主要症状为严重的腹泻，多肽治疗组实验后的体重较模型组和无关肽组的高，提示其腹泻症状较轻，炎症损伤较轻。大体解剖结果显示大鼠大体解剖结果模型组和无关肽组的大鼠结肠表现为粘膜充血水肿、溃疡形成、粘膜增厚、肠腔狭窄、可见近端肠腔扩张。联合给予TNF结合肽和TNFR1封闭肽与用抗TNF抗体及5-氨基水杨酸一样能明显改善大鼠结肠炎症状，使结肠黏膜水肿和溃疡明显减轻。病理学检查的结果(见图33)显示大鼠结肠组织病理学检查发现：模型组和无关肽组大鼠的结肠组织病变累及肠壁全层，淋巴管、血管扩张，肠壁水肿，大量中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润，局部黏膜上皮坏死脱落，形成溃疡，而联合应用TNF结合肽和TNFR1封闭肽与用抗TNF抗体及5-氨基水杨酸一样能显著减轻大鼠结肠组织病理损伤，溃疡较轻，炎性细胞浸润较少。根据文献报道的溃疡性结肠炎病理损伤程度评分标准进行大体标本形态学评分及组织学评分，结果(见表3)上述三个治疗组的大体标本形态学评分及组织学评分均显著低于无关肽组和溃疡性结肠炎对照组(P＜0.05)，而三个治疗组之间无显著性差异(P＞0.01)。

表2.各种治疗对溃疡性结肠炎大鼠体重变化的影响(X±SD)

^aP＜0.01，VS正常对照组；^bP＜0.01，VS模型组

表3.各组大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分(X±SD)

^bP＜0.05 VS模型组及无关肽对照组

表4.各种治疗对溃疡性结肠炎大鼠血清中NO活性及活性氧的影响

^aP＜0.05 VS生理盐水；^bP＜0.01 VS模型组和无关肽组；^cP＜0.01 VS生理盐水

表5.各种治疗对结肠炎大鼠结肠组织中MPO活性、NO含量及活性氧的影响

^aP＜0.05 VS生理盐水；^bP＜0.01 VS模型组和无关肽组；^cP＜0.01 VS生理盐水

9.3联合多肽对结肠炎大鼠血清及结肠组织中NO、活性氧和MPO的影响为了进一步研究联合多肽减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病例损伤的机制，本发明检测了各组大鼠血清和结肠组织NO含量、活性氧和结肠组织中MPO活性(检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)。表4和表5显示溃疡性结肠炎大鼠血清和结肠组织NO含量和结肠组织中MPO活性均明显升高，多肽治疗组与抗体治疗组、水杨酸治疗组一样，可有效抑制溃疡性结肠炎大鼠产生NO，因为其血清和结肠组织中NO的含量虽然仍高于正常对照组但较模型组和无关肽显著下降(P＜0.01)；此外，三种治疗也可明显抑制溃疡性结肠炎结肠组织中MPO的活性(P＜0.01)，但对活性氧的产生却无明显影响(P＞0.05)。

9.4联合多肽对结肠炎大鼠腹腔Mφ中TNF-α、IL-1β及IL-8的影响

借助RT-PCR技术检测联合多肽对溃疡性结肠炎大鼠腹腔Mφ中mRNA转录水平的影响，方法同实施例？。结果见图34。IL-1β约为600bp，IL-8约250bp，内参照β-actin约400bp。生理盐水对照组大鼠腹腔巨噬细胞呈现微弱的IL-1β及IL-8 RT-PCR产物条带(泳道1)，溃疡性结肠炎组的IL-1β及IL-8条带明显增粗和增亮(泳道2)，多肽治疗组(泳道4)、抗体治疗组(泳道5)和水杨酸组(泳道6)一样可显著抑制溃疡性结肠炎大鼠腹腔巨噬细胞IL-1β及IL-8mRNA的水平，因为三种治疗组的细胞因子RT-PCR产物条带灰度扫描值都明显减弱，与模型组和无关肽组比较具有显著差异(P＜0.01)。

借助免疫组化方法检测各组大鼠结肠组织中TNF-α蛋白质表达水平。取石蜡切片(4um)常规脱蜡、水化，置0.05M柠檬酸缓冲液中进行微波抗原修复，凉至室温；3％H₂O₂孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性，滴加10％正常血清封闭非特异性抗原；倾去血清，滴加1∶100稀释的TNF-α抗体；4℃放置过夜，PBS冲洗3×5min，滴加生物素化二抗；37℃孵育10min，PBS冲洗3×5min；滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，37℃孵育15min；DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。采用图象分析系统计数阳性细胞，并进行灰度扫描，每张切片随机选取5个高倍视野(400倍)计数200个细胞。结果(图35)显示：生理盐水组大鼠结肠组织基本无TNF-α表达，而模型组及无关肽组可见结肠组织有明显褐色着色，TNF-α主要表达于炎症部位浸润的巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞的胞浆和胞膜上。图象分析结果(表6)表明，模型组大鼠结肠组织TNF-α表达的阳性密度和阳性细胞率比对照组明显增加，多肽治疗组与抗体治疗组和水杨酸组一样可使溃疡性结肠炎结肠组织TNF-α表达明显下降(P＜0.01)。提示合成多肽不但能拮抗TNF-α的致炎作用，还能抑制TNF-α本身的表达。

表6.各种治疗对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中TNF-α蛋白表达的影响

^aP＜0.05 VS生理盐水；^bP＜0.01 VS模型组。

<110> 华中科技大学

<120> 肿瘤坏死因子TNF-受体封闭肽及其在治疗TNF相关疾病中的应用

<130>  1

<160>  11   

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  12

<212>  PRT

<213> 人工序列

<400>  1

Asp His Arg Pro Leu Trp Gly Glu Ser Met Val Trp

1               5                   10         

 

<210>  2

<211>  9

<212>  PRT

<213> 人工序列

<400>  2

Cys Lys His Gln Trp His Lys His Cys

1               5                  

 

<210>  3

<211>  9

<212>  PRT

<213> 人工序列

<400>  3

Cys Lys His Ala Leu His Arg His Cys

1               5                  

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  4

gataacctgc tggtgtgtga                                                 20

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  5

cttgtgaggt gctgatgtac                                                 20

 

<210>  6

<211>  29

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  6

gcggatcatg gtcagatcat cttctcgaa                                       29

 

<210>  7

<211>  30

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  7

cccaagcttc agggcaatga tcccaaagta                                      30

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  8

aacggctccg gcatgtgcaa                                                 20

 

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  9

cttctgaccc atgcccacca                                                 20

 

<210>  10

<211>  21

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  10

atttctgcag ctctgtgtga a                                               21

 

<210>  11

<211>  21

<212>  DNA

<213> 人工序列

<400>  11

tgaattctca gccctcttca a                                               21

 

 

 

Claims (5)

1.一种TNF结合肽（环9肽），其氨基酸序列为Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-lys-His-Cys。

2.一种编码权利要求1所述的TNF结合肽（环9肽）的核酸分子，包含其简并的核酸序列。

3.一种TNFR1封闭肽（环9肽），其氨基酸序列为Cys-lys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys。

4.一种编码权利要求3所述的TNFR1封闭肽（环9肽）的核酸分子，包含其简并的核酸序列。

5.权利要求1所述的TNF结合肽或/和权利要求3所述的TNFR1封闭肽在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

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