CN109419795B - 一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物 - Google Patents

Abstract

一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的绿原酸和治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物，以及药学上可接受的载体。本发明绿原酸与治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病药物的联合使用治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病可以发挥协同增效的作用，提高单用TNF‑α抑制剂的疗效，减轻类风湿性关节炎患者关节腔内的炎性浸润及关节软骨的侵蚀程度；增强urelumab抑制肿瘤发展的疗效；提高TARIL对癌细胞的抑制率；将绿原酸与肿瘤坏死因子家族相关药物制成联合用药物具有明显的协同增效的作用，疗效优良，毒性小，临床应用前景良好。

Description

一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物

技术领域

本发明涉及一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物。

背景技术

自从Aggarwal等于1984年分离并鉴定出首个肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor,TNF)后，至今这个蛋白家族已有近20名成员。TNF通过与其受体TNFR(TNFreceptor,TNFR)相互作用在自身免疫性疾病、细菌及病毒感染、肿瘤、糖尿病、骨质疏松等多种疾病的发生与发展中起关键作用。因此，近年来TNF/TNFR家族的重要成员TNFα/TNFR、Fas/FasL和

TRAIL/TRAILR成为重要的药物靶点，并开发出多个相关靶向药物，尤其是生物药物，其中有些在临床疗效和商业上获得巨大成功。

目前，治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物大多还处于临床前和临床阶段，只有少量药物已经开始上市销售。针对不同的TNF/TNFR家族成员，所开发的相关药物治疗病症也有差异，例如与TNFα抑制剂主要治疗类风湿性关节炎、节段性肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎等疾病；而

TRAIL/TRAILR相关药物主要为抗肿瘤药物。

美国食品药品管理局(FDA)已批准5种TNFα抑制剂上市，这些药在治疗炎症及自身免疫性疾病中表现出很好的效果，但其所带来的风险也逐渐引起了人们的重视。已报道的TNFα抑制剂常见的不良反应包括引起恶性肿瘤，引发细菌、病毒、真菌的感染，药物的免疫反应，皮肤过敏反应等。因此，基于TNFα抑制剂的良好疗效以及并存的安全隐患，在不加大TNFα抑制剂用量的情况下，提高其药效，对降低TNFα抑制剂的不良反应显得尤为重要。另外，临床证明TRAIL/TRAILR相关药物具有抗肿瘤的功效，但是单独使用TRAIL作为抗肿瘤药物，难以取得满意的疗效，需要与其他化疗药物联合使用。

绿原酸是一种具有强生物活性的天然物质，目前的临床试验已经证实，绿原酸是一种安全、无毒、广谱的抗肿瘤药物，可以用于包括肺癌、脑胶质瘤、肝细胞癌、淋巴细胞肿瘤等多种恶性肿瘤的治疗，同时机理研究显示，绿原酸主要通过调节机体T细胞介导的细胞免疫过程，发挥抗肿瘤作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物，以提高治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病药物单独用药的疗效。

本发明提供一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物，其特征在于：它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的绿原酸和治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物，以及药学上可接受的载体。

其中，所述治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物包括TNFα抑制剂、TNFR相关药物或TRAIL/TRAILR相关药物。

其中，所述的TNFα抑制剂包括阿达木单抗、英夫利西单抗、依那西普；

和/或，TNFR相关药物包括Urelumab；

和/或，TRAIL/TRAILR相关药物包括TRAIL。

其中，绿原酸和TNFα抑制剂或TNFR相关药物的重量比为400:1-1.5:1；

和/或，绿原酸和TRAIL/TRAILR相关药物的摩尔比为100:0.025-100:0.3。

其中，绿原酸和TNFα抑制剂或TNFR相关药物的重量比为400:1。

本发明还提供前述的联合用药物在制备治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物中的用途。

其中，所述肿瘤坏死因子家族相关疾病为类风湿性关节炎、节段性肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、癌症、实体瘤。

本发明还提供绿原酸和治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病药物在制备治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物中的用途。

本发明还提供绿原酸在制备提高单用TNF-α抑制剂、urelumab或TARIL的疗效作用的药物中的用途。

其中，所述药物是提高TNF-α抑制剂在减轻类风湿性关节炎患者关节腔内的炎性浸润及关节软骨的侵蚀程度的疗效的药物；

和/或，所述药物是增强urelumab抑制肿瘤发展的疗效的药物；

和/或，所述药物是提高TARIL对癌细胞的抑制率的药物。

本发明提供的Urelumab为一种靶向TNFR家族成员CD137的用于治疗癌症和实体瘤的全人源IgG4单克隆抗体，目前正处于临床试验阶段，由四川大学国家生物技术重点实验室提供。

本发明绿原酸与治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病药物的联合使用治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病可以发挥协同增效的作用，提高单用TNF-α抑制剂的疗效，减轻类风湿性关节炎患者关节腔内的炎性浸润及关节软骨的侵蚀程度；增强urelumab抑制肿瘤发展的疗效；提高TARIL对癌细胞的抑制率；将绿原酸与肿瘤坏死因子家族相关药物制成联合用药物具有明显的协同增效的作用，疗效优良，毒性小，临床应用前景良好。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1为绿原酸联合肿瘤坏死因子抑制剂药物，不同给药组小鼠关节腔局部炎性细胞浸润评分。

图2为绿原酸联合肿瘤坏死因子抑制剂药物，不同给药组小鼠关节软骨侵蚀度评分。

图3为绿原酸联合TRAIL，不同给药组对MCF-7干细胞的抑制率结果(％)。

具体实施方式

实施例1绿原酸联合TNF-α抑制剂对人滑膜细胞增殖的抑制作用研究

1、材料

药品：阿达木单抗(修美乐)；依那西普(恩利)；英夫利西单抗(类克)；绿原酸原料药(四川九章生物科技有限公司，纯度99.3％)

组织/细胞：滑膜组织，来自四川大学华西医院骨科骨折患者，进行分离培养后得到成纤维样滑膜细胞，备用。

2、实验方法

2.1单药及联合用药MTT实验

组织块移植法培养滑膜细胞，使用0.25％的胰酶进行消化，连续传代2-3次后，用DMEM完全培养基制备成细胞悬液，使细胞浓度为5×10⁵个/mL，并将其接种至96孔板中，每孔100μL，继续常规培养24h。待细胞完全贴壁后取出培养板，弃去培养基后，分成1)绿原酸单药组；2)阿达木单抗单药组；3)依那西普单药组；4)英夫利昔单抗单药组；5)绿原酸联合阿达木单抗组；6)绿原酸联合依那西普单抗组；7)绿原酸联合英夫利昔单抗组；8)阴性对照组(只有细胞，不加药物)；9)空白对照组(没有细胞)；并在对应组中加入不同的实验药物，具体的实验分组和药物浓度如表1所示，每组3个复孔。继续培养48h后，每孔加入MTT，结束后弃去上清，加入DMSO充分震荡均匀后，与酶标仪490nm处测定吸光值(A)。

表1实验药物的浓度和组合表

2.2药物联合作用的评价

(1)抑制率＝1-(实验组A-空白对照组A)/(阴性对照组A-空白对照组A)×100％

(2)类风湿性关节炎，是一种累及多关节的自身免疫系统疾病，滑膜细胞在多种炎性因子的刺激下，类肿瘤样的过度增殖是该病的重要过程之一，故抑制成纤维样滑膜细胞的增殖是该病的主要治疗策略之一，也是考察相关治疗药物的重要体外指标。

3、实验结果

酶标仪检测每组细胞的增值情况后，通过计算不同药物及药物组合对滑膜细胞增值的抑制情况，结果显示，绿原酸联合药物组(绿原酸联合阿达木、绿原酸联合依那西普和绿原酸联合英夫利昔)对成纤维样滑膜细胞增值的抑制率分别较对应的单用药物组，均有了显著的提高。结果表明，具有显著性差异(p＜0.05)，实验结果如表2所示：

表2不同给药组对成纤维样滑膜细胞增殖的影响(n＝3，

)

与阿达木组相比，**p＜0.01；与依托西普组相比，##p＜0.01；与英夫利昔组相比，△△p＜0.01。

实验结果说明，绿原酸联合TNF-α抑制剂(阿达木单抗、依那西普和英夫利昔)较单药组相比，能够更显著的提高对该类细胞的抑制作用，证明联合用药具有增效协同作用。

实施例2绿原酸联合肿瘤坏死因子抑制剂药物治疗关节炎小鼠的体内药效评价

1、材料

药品：阿达木单抗(修美乐)；绿原酸原料药(四川九章生物科技有限公司，纯度99.3％)

动物：DBA/1小鼠

2、实验方法

2.1类风湿性关节炎小鼠模型的建立

(1)胶原-佐剂混合乳剂的配制

①将牛II型胶原溶于0.1M冰醋酸溶液中，浓度为2mg/mL，4℃放置12h；

②分别取1mL的II型胶原和1mL的佐剂混合；

③用注射器将上述混合剂来回推拉，使II型胶原和佐剂充分的混匀，呈乳白色，此过程须在冰浴上进行。

(2)小鼠模型的建立

将小鼠固定于自制的固定装置中，用75％乙醇消毒背部皮肤，每只小鼠背部皮下注射200μL胶原-完全弗氏佐剂混合乳剂。3周后，将不完全弗氏佐剂与牛II型胶原一算溶液等量混合并乳化，于每只小鼠尾根部进行皮下注射，总共100μL，进行加强免疫，即得类风湿性关节炎小鼠。对照组小鼠则按上述方法，于同样的时间，注射等量的生理盐水。

2.2动物分组和治疗

取上述建好的模型小鼠24只，随机分为4组，分别命名为①模型对照组；②绿原酸单药组；③阿达木单药组；④绿原酸联合阿达木治疗组，共4组，于造模成功第二天开始，其中：①模型对照组连续4周等量注射生理盐水；②绿原酸单药组，连续4周进行腹腔给药；③阿达木单药组，每2周皮下注射一次，共注射2次；④绿原酸联合阿达木治疗组，绿原酸连续注射4周，而阿达木每2周皮下注射一次，共2次，具体分组和给药方案如表3所示。

表3不同给药组小鼠的给药方案

2.3组织学评估

待实验结束后(第4周)，按以下方法对各用药小鼠的组织学进行评估。

①苏木精-伊红染色观察关节腔内炎性细胞浸润度,评分标准如表4所示：

表4关节腔炎性细胞浸润度评分标准

②甲苯胺蓝染色观察关节软骨侵蚀度,评分标准为如表5所示：

表5关节软骨侵蚀度评分标准

3、实验结果

(1)关节腔局部炎性细胞浸润的研究结果显示，绿原酸联合阿达木治疗组，相较于其它组能更显著的减轻关节腔局部炎性细胞浸润，与单用阿达木组数据相比，具有显著性差异(p＜0.05)，具体实验结果如图1所示。

(2)关节软骨破坏和骨侵蚀的实验结果显示，绿原酸联合阿达木组能够显著的缓解模型小鼠关节骨侵蚀的程度，达到良好的治疗效果，与阿达木单用药组相比，联合用药组的研究数据具有显著性差异(p＜0.05)，具体实验结果如图2所示。

实验结果表明：绿原酸联合阿达木组较其它各组可以更为显著的减轻模型小鼠关节腔内的炎性浸润，可以减少对关节软骨的侵蚀程度，具有良好的协同增效作用。

实施例3绿原酸联合urelumab对小鼠头颈部鳞癌治疗作用的评价

1、材料

药品：4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)；绿原酸原料药(99.2％纯度，四川九章生物科技有限公司)，urelumab(由四川大学国家生物技术重点实验室提供)

动物：Balb/c小鼠(20-25g)60只

2、实验方法

2.1头颈部鳞癌的小鼠模型的建立和实验分组

将4NQO用蒸馏水配制为浓度为0.05％的备用液，于4℃避光保存，用时以普通自来水配制成0.005％的浓度至于避光处，让小鼠自由饮用，每周更换饮水2次。于第16周开始，将小鼠随机分为4组，每组15只小鼠，分别为①模型对照组；②绿原酸单药组；③urelumab组；④绿原酸联合urelumab治疗组；其中，绿原酸单药组小鼠，于第16周开始，每周连续腹腔注射绿原酸5天，休息2天，一共用药至第36周；urelumab单药组，于第16周开始，每4周静脉注射一次urelumab，一共注射5次，一共用药至第36周；联合用药组，每4周静脉注射一次urelumab，共5次，每周腹腔注射绿原酸5天休息2天，一共持续至第36周。具体分组和给药方案如表6所示。

表6不同给药组小鼠的给药方案

2.2实验观察

在实验过程中每天观察各组动物活动状况，每周汇总一次饮水量、饮食量及体重。于实验结束后(第36周)，称取所有小鼠的体重，并处死全部小鼠，观察并记录舌及口腔其它部位粘膜变化，并行HE染色组织病理学检查，评价不同给药组小鼠舌背粘膜增生异常的情况。

3、实验结果

3.1对不同组小鼠平均每天每只饮水量、实验结束时的体重和敏感性结果如表7所示：

表7不同给药组小鼠平均每天每只饮水量、实验结束体重、敏感性(n＝3，

)

由表7可以看出，通过对不同给药组小鼠的饮水量、体重以及敏感性的观察，表明绿原酸联合urelumab能有效抑制小鼠的饮水量、体重及刺激反应的敏感性下降。

3.2不同给药组小鼠的舌背粘膜病检测结果

实验结果如表8：

表8每种细胞96孔板中设置的不同药物的浓度及组合

由表8可以看出：实验结束后对不同给药组小鼠的舌背粘膜病进行检测后，结果显示绿原酸联合urelumab相比与模型对照组和urelumab单药组，可以显著的改善小鼠舌背粘膜病变情况，其中重度异常增生和浸润癌的比例较单用urelumab组显著下降，且发生病变的小鼠总数也由单用urelumab时的10只(66.7％)下降到4只(26.7％)。

实验结果表明：绿原酸与urelumab联合用药能有效维持机体正常机能，抑制肿瘤的发展，具有协同增效的作用。

实施例4绿原酸联合TRAIL对乳腺癌干细胞的抑制作用研究

1、材料

药品：TRAIL(上海恪敏)；绿原酸原料药(99.2％纯度，四川九章生物科技有限公司)

细胞株：MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)

2、实验方法

2.1 MCF-7肿瘤干细胞的分选和获得

将MCF-7细胞用1640完全培养基正常培养，待细胞数达1×10⁸个/ml时，用胰酶将细胞消化，充分吹打成细胞悬液，分选前将细胞标记CD44-APC，CD24-PE，ESA-FITC抗体，使用流式细胞仪分选出CD44+/CD24/low/ESA+的细胞,分选至培养瓶或96孔板中。采用无血清的干细胞专用培养液，防止乳腺癌干细胞的分化。

2.2 MTT实验考察不同给药组对乳腺癌干细胞增殖的抑制作用

向96孔板中加入干细胞专用培养基稀释的不同浓度的不同药物并按照表9中的不同浓度交叉组合，同时设置相应的对照组(不加药物)。每组均设置3个复孔，培养48h后每孔加入MTT溶液20μL，继续孵育4h，吸弃上清，每孔加150μLDMSO后置水平摇床上低速振荡10min，充分溶解结晶，490nm波长处测量各孔吸光值(A)。分别计算各加药组的抑制率。

表9每种细胞96孔板中设置的不同药物的浓度及组合

2.3药物联合作用的评价

(1)根据上述实验结果计算不同药物对不同细胞的抑制率，抑制率计算公式如下：抑制率＝1-(实验组A-空白对照组A)/(阴性对照组A-空白对照组A)×100％；

(2)以同一药物不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图，可得到剂量效应曲线；

(3)根据药物浓度及对应的肿瘤细胞抑制率，采用Logit法IC50计算软件计算半数抑制浓度(IC50值)；

(4)联合用药以公式Q＝E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)计算有无协同作用。其中E(a+b)为两药合用的抑制率，即实测合并效应，Ea和Eb为两药单用时的抑制率，分母(Ea+Eb-Ea×Eb)为期望合并效应，Q为两者比值。Q值在0.85～1.15时，两药合并效应为相加(+)，Q值在1.15～20时为协同(++)，Q值＞20为明显协同(+++)，Q值在0.05～0.85时为拮抗，Q值＜0.05为明显拮抗；

3、实验结果

3.1联合用药对MCF-7干细胞的抑制作用

计算不同浓度药物组合对MCF-7干细胞的抑制作用，结果如图3所示，绿原酸联合TRAIL对MCF-7干细胞的抑制作用，普通高于单药组(绿原酸单药或TRAIL单药)。对上述实验结果按照联合用药指数法进行分析后，算得联合用药的联合用药的Q值，绿原酸联合TARIL具有协同作用，在不同的药物浓度组合下，这种协同作用的强度有所不同。结果如表10所示：

表10不同浓度的绿原酸与TRAIL联合作用于MCF-7干细胞的联合指数

实验结果表明：绿原酸联合TARIL对MCF-7干细胞具有显著的抑制作用，从而达到协同增效的作用。

综上，本发明绿原酸与治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病药物的联合使用治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病可以发挥协同增效的作用，提高单用TNF-α抑制剂的疗效，减轻类风湿性关节炎患者关节腔内的炎性浸润及关节软骨的侵蚀程度；增强urelumab抑制肿瘤发展的疗效；提高TARIL对癌细胞的抑制率；将绿原酸与肿瘤坏死因子家族相关药物制成联合用药物具有明显的协同增效的作用，疗效优良，毒性小，临床应用前景良好。

Claims (6)

1.一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物，其特征在于：它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的绿原酸和治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物，以及药学上可接受的载体；所述治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物选自TNF-α抑制剂、TNFR相关药物或TRAIL/TRAILR相关药物；所述的TNF-α抑制剂选自阿达木单抗、英夫利西单抗、依那西普；TNFR相关药物为Urelumab；TRAIL/TRAILR相关药物为TRAIL；其中绿原酸和TNF-α抑制剂或TNFR相关药物的重量比为400:1-1.5:1，绿原酸和TRAIL/TRAILR相关药物的摩尔比为100:0.025-100:0.3。

2.根据权利要求1所述的联合用药物，其特征在于：绿原酸和TNFα抑制剂或TNFR相关药物的重量比为400:1。

3.权利要求1或2所述的联合用药物在制备治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物中的用途，所述肿瘤坏死因子家族相关疾病为类风湿性关节炎、节段性肠炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、癌症。

4.权利要求1或2所述的联合用药物在制备治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的药物中的用途，所述肿瘤坏死因子家族相关疾病为实体瘤。

5.绿原酸在制备提高TNF-α抑制剂、Urelumab或TRAIL的疗效作用的药物中的用途，所述的TNF-α抑制剂选自阿达木单抗、英夫利西单抗、依那西普；其中绿原酸和TNF-α抑制剂或Urelumab的重量比为400:1-1.5:1，绿原酸和TRAIL的摩尔比为100:0.025-100:0.3。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述药物是提高TNF-α抑制剂在减轻类风湿性关节炎患者关节腔内的炎性浸润及关节软骨的侵蚀程度的疗效的药物；

或，所述药物是增强urelumab抑制肿瘤发展的疗效的药物；

或，所述药物是提高TRAIL对癌细胞的抑制率的药物。

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