CN116768982A - 一种多肽及其在制备防治肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

一种多肽及其在制备防治肿瘤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向打断肿瘤微环境中乳酸和GLUT10结合的多肽在制备防治肿瘤的药物中的应用。所述多肽的氨基酸序列如将序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽和/或所述多肽配合药物辅料形成的给药剂型。本发明的多肽及多肽衍生物能够特异性地与GLUT10结合，从而阻断肿瘤微环境中乳酸与GLUT10蛋白的相互作用，恢复肿瘤微环境中CD8+T细胞的糖摄取能力和杀伤功能，因此将其应用于提高免疫治疗来防治肿瘤的药物制备中。所制备的药物在治疗肿瘤疾病中，具有疗效显著，毒副作用少，使用安全的优点。

Description

一种多肽及其在制备防治肿瘤的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽及其在制备防治肿瘤的药物中的应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过激活体内免疫细胞和增强机体抗肿瘤免疫应答来抑制肿瘤生长，清除肿瘤细胞。CD8+T细胞是机体免疫系统发挥肿瘤杀伤功能的主要免疫细胞，CD8+T细胞通过识别肿瘤细胞表面的MHCⅠ和抗原复合物被激活，进而发挥肿瘤杀伤功能。
在肿瘤微环境中，肿瘤细胞的生长和增殖依赖其高强度代谢以满足其生物合成的需要，高强度的有氧糖酵解是肿瘤细胞代谢的一大重要特征，肿瘤细胞高强度的糖酵解会大量消耗微环境中的葡萄糖并产生大量乳酸排至肿瘤微环境中，导致肿瘤微环境低糖高酸的特性。一方面，在肿瘤微环境中，由于葡萄糖的匮乏，导致T细胞无法充分摄取葡萄糖，最终累及T细胞活化。另一方面，肿瘤微环境中积累的大量乳酸可直接对CD8+T细胞的增殖和效应功能产生影响。除此之外，肿瘤微环境中的调节性T细胞(Treg)细胞可利用乳酸作为能源物质，并使Treg表面PD-1表达升高，阻断PD-1单克隆抗体对CD8+T的作用。我们前期研究结果发现，肿瘤微环境中，CD8+T细胞主要通过GLUT10转运体转运葡萄糖，而乳酸通过抑制GLUT10转运葡萄糖的功能来抑制CD8+T细胞杀伤肿瘤的功能。因此，开发靶向结合GLUT10与乳酸相互作用的化合物或多肽类药物，一方面能够提高CD8+T细胞杀伤肿瘤功能，另一方面靶向性强、毒副作用小，具有较好的抑制肿瘤发生和发展的成药前景。
迄今为止，肿瘤免疫治疗如靶向PD-1/PD-L1的单克隆抗体在肿瘤的治疗取得了巨大的成功，但是非抗体的抑制剂如小分子、多肽或DNA适配体等较少进入临床研究。由于单克隆抗体药物的药物生产升本高、免疫原性副作用大等限制其在肿瘤免疫治疗中的作用，因此开发多肽类药物有较大的发展空间，为肿瘤免疫治疗提供新的机遇。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对目前缺乏有效抑制乳酸功能和活性的抑制剂，提供打断GLUT10与乳酸结合的多肽PG10，用于制备、预防和或控制肿瘤的药物中的用途。
本发明所述的多肽PG10，氨基酸序列如SEQ ID No.1或如下所示：
His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Leu-Ser-Glu-Ile-Tyr-Pro-Val-Glu-Ile-Arg-Gly-Arg。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供含有多肽PG10来治疗、预防和/或控制肿瘤的药物中的应用。
本发明的发明人经过深入的研究和反复的试验发现，获得了能够结合GLUT10，打断GLUT10与乳酸结合的多肽PG10(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.1)，多肽PG10具有较好的稳定性和生物学活性。
本发明还提供一种药物组合物，由多肽PG10及其药学上可接受的载体或赋形剂组成。
本发明所述的药物组合物，多肽PG10的重量比为0.01～99.99％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.01～99.99％。
本发明所述的药物组合物，还含有其他具有抗肿瘤活性或免疫检查点抑制剂一起作为活性成分。
本发明所述的药物组合物，该药物组合物可以制备成任何可药用的剂型。
本发明所述的药物组合物，该药物组合物为注射给药或口服给药。
本发明所述的药物组合物，注射给药较佳的包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
本发明中，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，较佳地选自壳聚糖及其衍生物、卡波姆和脂质体中的一种或多种。所述的药物组合物为本领域常规所述的各种剂型，优选凝胶剂、乳剂、膜剂、微球和纳米球中的一种或多种。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳的为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳的包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳的为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的另一个目的在于提供多肽PG10在制备靶向治疗、预防和/或控制与GLUT10相关的肿瘤药物中的应用。
本发明所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肠癌、肝癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌。
本发明所述多肽PG10在制备靶向治疗、预防和/或控制与GLUT10相关的肿瘤药物中的应用。
本发明中，所述的肿瘤可为本领域常规的肿瘤。较佳地为肠癌、肝癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等。其中，所述的肝癌可为本领域常规的肝癌，优选原发性肝癌或继发性肝癌；所述的肺癌可为本领域常规的肺癌，优选小细胞肺癌或非小细胞肺癌；所述乳腺癌可为本领域常规的乳腺癌，优选非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌；所述的肠癌可为本领域常规的肠癌，优选结肠癌或直肠癌。所述黑色素瘤为本领域常规的黑色素瘤；
所述的防治可为本领域常规概念，即包括预防和/或治疗。所述预防可为本领域常规的预防，较佳地指存在可能的肿瘤因素时，使用后防止或降低肿瘤的产生。所述治疗可为本领域常规的治疗，较佳地指减轻肿瘤的程度，或者治愈肿瘤使之正常化，或者减缓肿瘤的进程。
所述的活性成分是指具有预防或治疗肿瘤功能的化合物。在所述药物组合物中，所述的靶向促进打断GLUT10与乳酸结合的多肽可以单独作为活性成分或和其他具有抗肿瘤活性的化合物或者免疫检查点抑制剂PD-1等一起作为活性成分。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽能够靶向结合GLUT10，抑制GLUT10与乳酸的结合，恢复CD8+T细胞的杀伤功能，从而应用于抗肿瘤的药物的制备中。所述的多肽及其衍生物在治疗肿瘤疾病中，尤其是在针对肝癌、结肠癌和黑色素瘤的体内和体外实验、以及乳腺癌的体外实验中，均表现出了能够显著抑制肿瘤生长的能力，疗效显著，且所述的多肽及其衍生物具有毒副作用少，使用安全的优点。
附图说明
图1.多肽PG10对乳酸和GLUT10结合能力的影响。
图2.多肽PG10对CD8+T细胞糖摄取能力的影响。图(A)不同浓度PG10对人的CD8+T细胞糖摄取能力的影响。图(B)不同浓度PG10对小鼠CD8+T细胞糖摄取能力的影响。
图3.共培养体系中给予不同浓度多肽PG10对肿瘤细胞的凋亡和CD8+T细胞功能的影响。图(A)不同浓度多肽PG10对共培养体系中肿瘤细胞凋亡能力的影响。图(B)不同浓度多肽PG10对共培养体系中CD8+T细胞糖摄取能力和杀伤功能的影响。
图4.多肽PG10对黑色素瘤细胞B16生长的影响。图(A)流程图评价PG10在黑色素瘤皮下瘤模型上的治疗效果。图(B)黑色素瘤皮下瘤模型，给予PBS对照或PG10多肽，肿瘤生长曲线。图(C)给予PBS对照或PG10多肽对CD8+T细胞糖摄取能力的影响。图(D)给予PBS对照或PG10多肽对CD8+T细胞杀伤能力的影响。图(E)给予PBS对照或PG10多肽对CD8+T细胞增殖活性的影响。
图5.多肽PG10对肝癌PDX小鼠生长的影响。图(A)流程图表示肝癌PDX模型上评价多肽PG10的治疗效果。图(B)肝癌PDX的生长。图(C)多肽PG10对CD8+T细胞糖摄取能力和杀伤功能的影响。
图6.PG10和PD-1抗体联用对黑色素瘤细胞生长的影响。图(A)流程图表示小鼠黑色素瘤模型上评价多肽和PD-1抗体联用的治疗效果。图(B)给予PG10和PD-1抗体对黑色素瘤生长的影响。图(C)给予PG10和PD-1抗体对于CD8+T细胞糖摄取能力、杀伤能力和增殖活性的影响。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
若无特别说明，实施例中所述的PBS溶液，指浓度为0.1M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳的为15～30℃。实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05认为有显著性差异，p<0.01认为有极其显著性差异。
实施例1多肽的合成
多肽PG10的氨基酸序列参见序列表中SEQ ID No.1。多肽PG10由安徽国平药业有限公司合成并纯化。
SEQ ID No.1:
His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Leu-Ser-Glu-Ile-Tyr-Pro-Val-Glu-Ile-Arg-Gly-Arg；
实施例2免疫共沉淀验证多肽PG10可以打断乳酸和GLUT10的结合。
免疫共沉淀试剂如下：
裂解液A液：0.6057g Tris碱，1.7532g NaCl，0.1017g MgCl2·6H2O，0.0742gEDTA，10mL甘油，10mL 10％ NP40，加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7.6，定容至191mL，充分混匀，0.45μm滤膜过滤，4℃储存。
裂解液B液：200μL 2Mβ-磷酸甘油，4mL 2.5M NaF，2mL 100mM NaVO3，2mL 100mMPMSF，200μL 1M DTT，1mg/mL的Leu、Pep、Apr各200μL，总体积共9mL。母液于-20℃储存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀。
Biotin(生物素)磁珠购自博尔迈公司。
具体操作步骤如下：
(1)将HEK293细胞(中国医学科学院基础医学研究所)铺10mm2大皿，12小时后转染GLUT10的质粒，培养24小时后收集细胞。
(2)以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约4-10mg，将各组蛋白调整至相同浓度。每组蛋白各取200μg留作Input。
(3)剩余蛋白(5mg左右/组)加入3mM生物素标记的乳酸，同时加入30μL Biotin磁珠充分重悬，4℃缓慢旋转摇动，结合4小时后，加入不同浓度的PG10多肽(0μM、1μM和5μM)，4℃缓慢旋转摇动过夜。将样品放到磁力架上，静置1-2min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到磁珠。加入0.5mL免疫共沉淀洗液，混匀，放到磁力架上，静置1-2min，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次静置3min。小心吸除上清，加入30μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
结果如图1所示，PG10可以阻断乳酸和GLUT10蛋白的结合，表现为随着PG10浓度的升高，免疫印迹杂交检测到GLUT10的表达逐渐降低。
实施例3流式细胞术检测多肽对CD8+T细胞糖摄取能力
流式细胞术检测多肽对CD8+T细胞糖摄取能力。具体操作步骤如下：
1.使用小鼠CD8+T细胞分离试剂盒从小鼠脾脏分离单个CD8+T细胞或使用CD8+T细胞分离试剂盒从人的外周血分离单个CD8+T细胞，用1640培养基(购自美国Invitrogen公司)调整细胞浓度，制成100万个/mL的细胞悬液。
2.将1mL步骤1所制得的细胞悬液加入12孔板进行培养，并给予1μg/ml anti-CD3和1μg/ml anti-CD28抗体刺激，加入15mM乳酸和不同浓度的多肽PG10。
3.24小时后，收集细胞，弃上清，用葡萄糖摄取测定工作液重悬(100微升/100万细胞；工作液配制：2NBDG：缓冲液＝1:300；Cell MeterTM 2-NBDG Glucose Uptake Assay Kit23500)，37度，5％CO2孵箱避光孵育15分钟后，加1毫升缓冲液，1500rpm，5分钟离心洗掉未被摄取染料，后用200微升缓冲液重悬。
4.运用流式细胞计数仪，激发波长为465nm，发射波长为520nm，测定细胞内荧光的强弱，计算含荧光细胞占总细胞的百分比。结果如表3所示，含荧光细胞占总细胞百分比越高，说明CD8+T细胞的糖摄取能力越强。
图2说明，给予不同浓度多肽PG10处理后，含荧光的细胞比例明显多于对照组，因此多PG10能够解除乳酸对CD8+T细胞糖摄取功能的抑制，提高CD8+T细胞的糖摄取能力。
实施例4流式细胞术检测多肽对CD8+T细胞肿瘤杀伤能力的影响
流式细胞术检测多肽对CD8+T细胞肿瘤杀伤能力的影响。具体操作步骤如下：
1.使用人CD8+T细胞分离试剂盒分离人的外周血分离单个CD8+T细胞，用1640培养基(购自美国Invitrogen公司)调整细胞浓度，制成100万个/mL的细胞悬液。
2.将1mL步骤1所制得的细胞悬液加入12孔板进行培养，并给予1μg/ml anti-CD3和1μg/ml anti-CD28抗体刺激，刺激48小时。
3.将100万个CD8+T细胞与50万个人的肝癌细胞HepG2进行共培养，共培养12小时后，通过流式检测肿瘤细胞的凋亡，CD8+T的杀伤活性。
图3说明，给予不同浓度多肽PG10处理后，CD8+T细胞的糖摄取能力逐渐增加，肿瘤细胞的凋亡比例明显增多，杀伤性CD8+T细胞的比例明显增多，表明多肽PG10能够增强CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。
实施例5肿瘤皮下生长实验研究多肽PG10对黑色素瘤细胞B16生长的影响。
操作步骤如下：
1.实验耗材及试剂：灭菌1.5mL EP管、15mL离心管、枪头、滤网(100目)、脱脂棉球、镊子数把、酒精棉球、无菌1mL注射器、500mL烧杯(灭菌，用前照紫外)、PBS(过滤)、胰酶，以及血清。
2.实验动物及分组：6-8周龄雄性C57小鼠20只(购自北京维通利华实验动物有限公司)，随机分为2组：PG10组及PBS对照组，每组10只。
3.细胞制备：将贴壁培养的肿瘤细胞用胰酶消化，到达胰酶消化时间后(此时细胞状态应为单细胞且刚好贴壁不掉)，吸掉胰酶。用含有1％血清的PBS按2mL/皿终止，将细胞吹下，移至15mL离心管中，1200转离心5min。弃上清，PBS重悬，过100目滤网一次；细胞计数，调整细胞终浓度至2.5×107/mL。该肿瘤细胞为对数生长期的黑色素瘤细胞B16直接收集至15mL离心管，1200转离心5min。弃上清，PBS重悬，过100目滤网一次；细胞计数，调整细胞终浓度至1×106/mL。
4.肿瘤细胞接种：接种2×105个肿瘤细胞(细胞悬液200μL)于C57小鼠左上腹部近腋下皮下。
5.肿瘤生长观察：皮下注射肿瘤细胞后两周用多肽进行治疗(5mg/kg体重，每周两次)，游标卡尺纪录肿瘤大小。肿瘤体积＝(长×宽×宽)/2；
实验结果以mean±SEM表示，并采用t test检验对照组与PG10组间的差异。
接种肿瘤18天后，各组小鼠肿瘤生长曲线如图4B所示，肿瘤体积越大表明肿瘤生长越快，CD8+T细胞的糖摄取能力，杀伤功能及增殖活性明显增加。因此多肽PG10能够明显抑制肿瘤细胞在小鼠体内生长，提高CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
实施例6肝癌PDX模型研究多肽PG10对肝癌细胞生长的影响。
操作步骤如下：
1.实验耗材及试剂：灭菌1.5mL EP管、15mL离心管、枪头、手术切刀、脱脂棉球、镊子数把、剪刀数把、酒精棉球、无菌1mL注射器、500mL烧杯(灭菌，用前照紫外)、PBS(过滤)、胰酶，以及血清。
2.实验动物及分组：6-8周龄免疫缺陷小鼠NSG 20只(购自北京百奥赛图生物技术有限公司)，随机分为2组：PG10组及PBS对照组，每组10只。
3.构建免疫健全小鼠：正常人外周血细胞，经过Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心，取中间白膜层淋巴细胞，计数，将细胞密度调整为1*108/ml，每只小鼠通过尾静脉接种2*107的淋巴细胞(细胞悬液200ul)，接种14天左右，通过流式检测小鼠外周血中人CD45阳性细胞的比例(大于1％)即认为重建成功。
4.肝癌PDX接种：将建立好的PDX肿瘤组织块，用基质胶354248和PBS比例1:1重悬，接种(细胞悬液200μL)于建立好的免疫健全小鼠左上腹部近腋下皮下。
5.肿瘤生长观察：皮下注射肿瘤细胞后两周用多肽进行治疗(5mg/kg体重，每周两次)，游标卡尺纪录肿瘤大小。肿瘤体积＝(长×宽×宽)/2；
实验结果以mean±SEM表示，并采用t test检验对照组与PG10组间的差异。
接种肿瘤18天后，各组小鼠肿瘤生长曲线如图5B所示，肿瘤体积越大表明肿瘤生长越快，CD8+T细胞的糖摄取能力，杀伤功能及增殖活性明显增加。因此多肽PG10能够明显抑制肿瘤细胞在小鼠体内生长，提高CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
实施7黑色素瘤小鼠模型上评价PG10与免疫检查点抑制剂PD-1联用的效果。
操作步骤如下：
1.实验耗材及试剂：灭菌1.5mL EP管、15mL离心管、枪头、滤网(100目)、脱脂棉球、镊子数把、酒精棉球、无菌1mL注射器、500mL烧杯(灭菌，用前照紫外)、PBS(过滤)、胰酶，以及血清。
2.实验动物及分组：6-8周龄雄性C57小鼠40只(购自北京维通利华实验动物有限公司)，随机分为4组：IgG1组、PG10+IgG1组、anti-PD1组及PG10+anti-PD1组，每组10只。
3.B16肿瘤细胞的制备，方法同实施3
4.肿瘤细胞接种：接种2×105个肿瘤细胞(细胞悬液200μL)于C57小鼠左上腹部近腋下皮下。
5.肿瘤生长观察：皮下注射肿瘤细胞后两周用多肽进行治疗(5mg/kg体重，每周两次)，游标卡尺纪录肿瘤大小。肿瘤体积＝(长×宽×宽)/2；
实验结果以mean±SEM表示，并采用t test检验对照组与PG10组间的差异。
接种肿瘤18天后，各组小鼠肿瘤生长曲线如图4B所示，肿瘤体积越大表明肿瘤生长越快，CD8+T细胞的糖摄取能力，杀伤功能及增殖活性明显增加。因此多肽PG10和PD-1抗体联用能够明显抑制肿瘤细胞在小鼠体内生长，提高CD8+T细胞对肿瘤的杀伤。

Claims (10)

1.一种可特异性结合的多肽PG10，其特征在于，氨基酸序列如下：
PG10:His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Leu-Ser-Glu-Ile-Tyr-Pro-Val-Glu-Ile-Arg-Gly-Arg。
2.一种药物组合物，其特征在于，由权利要求1所述的多肽PG10及其药学上可接受的载体或赋形剂组成。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，药物组合物中，多肽PG10的重量比为0.1～99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1～99.9％。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还含有其他具有抗肿瘤活性或免疫检查点抑制剂一起作为活性成分。
5.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物可以制备成任何可药用的剂型。
6.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物为注射给药或口服给药。
7.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，注射给药较佳的包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
8.权利要求1所述多肽PG10在制备靶向治疗、预防和/或控制与GLUT10相关的肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肠癌、肝癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌。
10.含有权利要求1所述多肽PG10在制备靶向治疗、预防和/或控制与GLUT10相关的肿瘤药物中的应用。
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