CN109745560B - 抗-tigit抗体作为制备治疗泡型包虫病药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及泡型包虫病治疗药物技术领域，是一种抗‑TIGIT抗体作为制备治疗泡型包虫病药物的应用。本发明首次公开抗‑TIGIT抗体对泡型包虫病的治疗作用，同时本发明首次公开抗‑TIGIT抗体主要依赖CD4+T细胞发挥泡型包虫病的治疗功能，且通过药效学实验数据可知，抗‑TIGIT抗体对泡型包虫病病灶生长抑制和肝脏病理性损伤缓解均具有治疗的效果，即说明抗‑TIGIT抗体对泡型包虫病能够作为新型的抗包虫病药物，从而为泡型包虫病的治疗提供新途径。

Description

抗-TIGIT抗体作为制备治疗泡型包虫病药物的应用

技术领域

本发明涉及泡型包虫病治疗药物技术领域，是一种抗-TIGIT抗体作为制备治疗泡型包虫病药物的应用。

背景技术

包虫病(Echinococcosis)，呈世界性分布，亦称为棘球蚴病，它的蚴虫寄生于人体将导致严重的人畜共患病。目前公认的有4种，即细粒棘球蚴绦虫(E.granulosus，E.g)、少节棘球蚴绦虫(E.oligarthtus,E.o)、多房棘球蚴绦虫(E.multilocularis,E.m)和福氏棘球蚴绦虫(E.vogeli,E.v)，其中，泡型包虫病(Alveolar Echinococcoisis，AE)是由多房棘球绦虫(E.multilocularis，E.m)的幼虫(六钩蚴)寄生于人体所致的一种“类肝癌样”致死性寄生虫病，几乎原发于肝脏，本病呈隐袭进行性的特点，WHO资料显示未经治疗的泡型包虫病病人10年病死率高达94％，成为西部农牧民“因病致贫，因病返贫”的重要原因。虽然近几十年手术切除术、药物治疗及其它治疗方法在不断改进和发展，但泡型包虫病的有效治疗仍然是个难题。

目前，学者认为包虫病以手术切除病灶为主，对于术后预防或者无法实施手术的AE患者临床给予口服ABZ(阿苯达唑)片剂或者脂质体，临床上使用ABZ后出现多种不良的毒、副反应，导致其使用受限。在家畜饲养管理中，手术治疗因其成本相对较高且容易复发而很难用于生产实践，因此药物治疗对于该病则显得尤为重要。同时，对于实施手术的包虫病患者，术后仍然需要持续用药2年以上，并在10年内定期进行复查防止术后复发；而对于不能实施手术的患者只能长期服用苯并咪唑类药物进行治疗。苯并咪唑类药物主要为阿苯达唑和甲苯达唑，该类药物通过对虫体β-tubulin具有高度亲和力，因此抑制寄生虫微管的聚合作用而杀死虫体，其中阿苯达唑因吸收性较好而应用更为广泛。但目前很多报道已表明，因该类药物靶点即虫体β-tubulin与宿主β-tubulin氨基酸序列同源性高达94％，导致药物不仅与虫体β-tubulin能够产生相互作用，而且导致药物与宿主β-tubulin也能够产生相互作用，而产生严重的副作用，然而更糟糕的是除这类药物外病人尚无其他选择。另一方面，人们发现通过苯并咪唑与吡喹酮的联合用药，能够提高苯并咪唑治疗包虫病的效果，但这一方法却仅适用于部分患者，虽然吡喹酮为成功治疗血吸虫病的有效药物，但近十年里临床出现了吡喹酮抗药性不断增长的现象，同时在动物研究领域，因改变苯并咪唑靶点结构而导致抗药性增加的现象也已报道。因此，对于防治包虫病而积极寻找新药物及其作用靶点和非手术治疗方法的意义重大。

目前大量的研究表明，宿主的免疫状态是影响E.m感染寄生、病灶活性及其疾病转归的重要因素。临床和流行病学调查资料分析也发现，AE病人存在较高的自愈转归现象，而能够形成活跃期病例仅占1％至2％，并且E.m可利用自身分泌性蛋白负性调控宿主免疫系统或诱导免疫偏移。由此可见，同样是E.m感染的AE病人，因产生不同的免疫应答反应，造成截然不同的临床结局。针对活跃期AE病人，研究发现肝脏局部和系统性T细胞处于一种免疫耗竭或无能的状态，造成E.m慢性寄生和侵袭性生长。据报道，利用IFN-γ、IFN-2α和IL-12等细胞因子干预，对于泡型包虫病的免疫治疗是有效的。因此，探索E.m感染所致宿主免疫耐受机制的研究，开发新的免疫干预策略和靶点，以提高包虫病药物治疗的质量，始终是研究重点方向和任务。

近年来，免疫检查点分子PD-1和CTLA-4已经应用于肿瘤免疫、感染性疾病和抑制排斥等领域的实验研究和临床病人治疗。针对肿瘤的研究，其构成高度抑制性的微环境，在微环境中浸润的T细胞和NK细胞被耗尽，并且被例如PD-1和CTLA-4的检查点分子沉默，从而逃避免疫应答。针对寄生虫研究，通过PD-1、CTLA-4或LAG-3抗体单独或联合治疗，能够有效恢复T细胞免疫应答能力，增强对虫体清除效果。其他检查点分子也已被报道，如TIM-1和TIGIT等。TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白)分子是2009年新发现表达在T细胞和NK细胞表面的抑制性受体，是免疫球蛋白超家族成员，以高亲和力结合配体PVR(CD155)，并通过胞内基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)传递抑制信号，从而抑制T细胞或NK细胞的效应功能，目前已成为抗肿瘤效应方面研究的关注热点之一。对此，TIGIT抗体和抑制剂一类的药物在恶性肿瘤的治疗中已经获得较多的研究，并进入临床I期或II期试验。同时，随着肿瘤研究领域中一些免疫检查点分子的深入研究，如PD-1、CTLA-4和TIGIT，其相关靶向抗体及药物相关的细胞生物学和药物动力学研究数据，都将有效地促进抗寄生虫药物的发展，并能减少研究成本和时间。

综上所述，AE病人肝脏局部免疫抑制微环境形成，特别是大量募集驯化的免疫抑制性或耗竭性T细胞是泡球蚴感染慢性化的重要原因。结合我们研究发现，TIGIT分子参与诱导临床AE病人肝脏局部和系统性T细胞功能降低，从而导致E.m的慢性寄生。

发明内容

本发明提供了一种抗-TIGIT抗体作为制备治疗泡型包虫病药物的应用，克服了上述现有技术不足，其首次提出抗-TIGIT抗体对泡型包虫病的治疗作用；本发明还首次公开抗-TIGIT抗体主要依赖CD4⁺T细胞治疗泡型包虫病。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种抗-TIGIT抗体作为制备治疗泡型包虫病药物的应用。

本发明首次公开抗-TIGIT抗体对泡型包虫病的治疗作用，同时本发明首次公开抗-TIGIT抗体主要依赖CD4⁺T细胞发挥泡型包虫病的治疗功能，且通过药效学实验数据可知，抗-TIGIT抗体对泡型包虫病病灶生长抑制和肝脏病理性损伤缓解均具有治疗的效果，即说明抗-TIGIT抗体对泡型包虫病能够作为新型的抗包虫病药物，从而为泡型包虫病的治疗提供新途径。

附图说明

图1-1为泡型包虫病小鼠模型肝脏募集CD4⁺T细胞表面TIGIT表达变化。

图1-2为泡型包虫病小鼠模型肝脏募集CD8⁺T细胞表面TIGIT表达变化。

图2-1为泡型包虫病小鼠模型肝脏募集TIGIT阳性群CD4⁺T细胞与阴性群CD4⁺T细胞分泌细胞因子变化。

图2-2为泡型包虫病小鼠模型肝脏募集TIGIT阳性群CD8⁺T细胞与阴性群CD8⁺T细胞分泌细胞因子变化。

图3-1为抗-TIGIT抗体治疗泡型包虫病小鼠模型操作图示。

图3-2为抗-TIGIT抗体对泡型包虫病小鼠模型治疗效果评价。

图4-1为抗-TIGIT抗体治疗对泡型包虫病小鼠模型T细胞向肝脏募集的影响。

图4-2为抗-TIGIT抗体治疗对泡型包虫病小鼠模型肝脏募集T细胞分泌细胞因子的影响。

图5-1为抗-TIGIT抗体治疗联合CD4或CD8T细胞清除治疗泡型包虫病小鼠模型操作图示。

图5-2为抗-TIGIT抗体治疗联合CD4或CD8T细胞清除对泡型包虫病小鼠模型治疗效果影响。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数。

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：该抗-TIGIT抗体作为制备治疗泡型包虫病药物的应用。

下面为抗-TIGIT抗体作用于泡型包虫病的药效学实验：

1泡型包虫病感染小鼠模型建立，及其肝脏募集T细胞表面TIGIT表达和功能分析

1.1泡型包虫病感染小鼠模型建立

取腹腔感染泡球蚴6个月以上的种鼠一只，采用颈椎脱臼法处死后，将其完全浸入75％乙醇中体表灭菌1分钟。分离腹腔感染E.m病灶组织，取出已灭菌的100目的钢制细胞筛网，置于无菌的含PBS溶液的平皿中，将剪碎的泡球蚴组织置于钢网上，用5毫升(mL)注射器的黑色橡胶头在钢网上充分碾磨，加PBS溶液至钢网上，不断搅动碾磨碎的泡球蚴组织，过滤收集E.m原头蚴虫体。

先调整E.m原头蚴浓度，使总体系为200-300微升(μL)。选取6周-8周龄C57/6N小鼠，经肝门静脉进针穿刺，用干棉签按压穿刺点约2分钟(min)，直至止血。将术后的小鼠置于30℃加热台，直至苏醒，放回鼠笼正常饲养。

1.2泡型包虫病小鼠模型肝脏募集T细胞TIGIT表达分析

造模成功后于2周、12周和24周收集小鼠肝脏，取出小鼠的肝脏，用含0.2％BSA的PBS进行研磨，经钢丝网过滤后1500rpm离心5min，取沉淀。用6ml 40％Percoll(GEHealthcare公司)溶液重悬肝脏沉淀，通过密度梯度离心20min，收集下层细胞沉淀，通过血细胞计数器在显微镜下进行细胞计数。取1×10⁶个分离的肝脏单个核细胞，用纯化CD16/32抗体(Biolegend公司)进行封闭，然后标记抗NK1.1、CD3、CD4、CD8α、TIGIT(Biolegend公司)的荧光抗体。

结果见图1-1，E.m代表感染组，Con代表假手术组组，CD4⁺TIGIT⁺T细胞比例显示，(1)在感染2周，感染组CD4⁺TIGIT⁺T细胞的比例与假手术组无显著差异(P>0.05)。(2)在感染12周，感染组CD4⁺TIGIT⁺T细胞的比例显著高于假手术组(P<0.01)。(3)在感染24周，感染组CD4⁺TIGIT⁺T细胞的比例显著高于假手术组(P<0.001)，并且24周感染组CD4⁺TIGIT⁺T细胞的比例显著高于2周和12周(P<0.001)。

结果见图1-2，CD8⁺TIGIT⁺T细胞比例显示，(1)在感染2周和12周，CD8⁺TIGIT⁺T细胞的比例无统计学差异(P>0.05)。(2)在感染24周，感染组CD8⁺TIGIT⁺T细胞的比例显著高于假手术组(P<0.05)，并且24周感染组CD8⁺TIGIT⁺T细胞的比例显著高于2和12周(P<0.001)。该结果表明在感染中期，高剂量泡球蚴感染小鼠模型肝脏区域CD4⁺T细胞表面TIGIT分子表达上调，至感染晚期，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面TIGIT分子均表达上调。

1.3泡型包虫病小鼠模型肝脏募集T淋巴细胞的功能检测

流式细胞术检测24周泡球蚴感染小鼠模型肝脏募集T淋巴细胞分泌细胞因子Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α的情况。

结果见图2-1，CD4⁺T细胞中TIGIT阳性群细胞分泌细胞因子Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α比例显著低于TIGIT阴性群(P<0.01或P<0.001)。

结果见图2-2，CD8⁺T细胞中TIGIT阳性群细胞分泌效应分子Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α比例显著低于TIGIT阴性群(P<0.05或P<0.001)。该结果表明E.m感染晚期诱导肝脏募集T淋巴细胞表面TIGIT分子的高表达，导致分泌细胞因子能力降低。

2抗-TIGIT抗体治疗能够抑制泡型包虫病小鼠模型病灶生长，延缓肝脏病理性损伤

建立泡型包虫病小鼠模型，于感染12周后腹腔注射抗-TIGIT抗体(BioXcell,1G9，BE0274)，每只小鼠100微克(μg)/每次，每周3次注射，共维持至24周，同时设置对照组IgG1(BioXcell,MOCP-21)，具体操作见图3-1。

实验结果见图3-2，抗-TIGIT治疗12周后，与对照组(IgG)比较，小鼠模型肝脏病灶重量和病灶数量显著降低(P<0.05)；病理学观察发现抗-TIGIT(anti-TIGIT)治疗后，肝脏E.m病灶缺少具有增殖性多突出分支结构；并且抗-TIGIT治疗后外周中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平显著低于对照组。该研究结果表明抗-TIGIT抗体通过腹腔方式治疗能够抑制泡型包虫病小鼠模型病灶生长，延缓肝脏病理性损伤。

3抗TIGIT抗体治疗能够恢复泡型包虫病T淋巴细胞的效应功能，及其对E.m的杀伤能力

3.1促进肝脏效应性CD4⁺T细胞的募集，提高CD4⁺Teff/Treg的比例

建立泡型包虫病小鼠模型，按照操作图3-1进行抗-TIGIT抗体治疗，同时设置对照组。治疗至24周时间点采集小鼠肝脏，按照1.2步骤方法分离肝脏单个核细胞。取1×10⁶个分离的肝脏单个核细胞，用纯化CD16/32抗体(Biolegend公司)进行封闭，然后标记抗NK1.1、CD3、CD4、CD8α、CD25(Biolegend公司)的荧光抗体；接着利用FOXP3标记试剂盒进行破膜处理，进行FOXP3染色，流式细胞仪上机检测。

实验结果见图4-1，抗-TIGIT治疗12周后，与对照组比较，小鼠模型肝脏募集CD4⁺T淋巴细胞显著增多(P<0.05)；并且提高了CD4⁺Teff/Treg的比例。该研究结果表明抗-TIGIT抗体通过腹腔方式治疗能够促进效应性CD4⁺T细胞向肝脏的募集，从而发挥杀伤性能力。

3.2增强肝脏T细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α

同3.1步骤，取1×10⁶个分离的肝脏单个核细胞，放置1.5ml离心管中，在200μL包括10％胎牛血清的培养液RPMI1640(Clonetech)于37℃细胞培养箱培养4小时(hours)，同时添加Cocktail刺激剂(500倍稀释，ebioscience)。收集并PBS洗涤细胞，用纯化CD16/32抗体(Biolegend公司)进行封闭，然后标记抗NK1.1、CD3、CD4、CD8α(Biolegend公司)的荧光抗体；接着利用固定破膜试剂盒(Biolegend)处理，进行胞内细胞因子Granzyme B、CD107a、IL-2、IFN-γ和TNF-α染色标记，流式细胞仪上机检测。

实验结果见图4-2，抗-TIGIT治疗12周后，与对照组(IgG)比较，小鼠模型肝脏T细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α增强(P<0.05)。该研究结果表明抗-TIGIT抗体通过腹腔方式治疗能够增强肝脏T细胞分泌细胞因子能力。

4抗-TIGIT抗体主要依赖CD4⁺T细胞发挥泡型包虫病的治疗功能

建立泡型包虫病小鼠模型，于感染12周后腹腔注射抗-TIGIT抗体(BioXcell,1G9，BE0274)联合抗-CD4(BioXcell,GK1.5，BE0003-1)或抗-CD8α抗体(BioXcell,2.43，BE0061)，每只小鼠100μg抗-TIGIT抗体/每次，每周3次注射；每只小鼠200μg抗-CD4抗体/每次，每周2次注射；每只小鼠150μg抗-CD8α抗体/每次，两周3次注射；分别维持至24周，具体操作见图5-1。

实验结果见图5-2，抗-TIGIT抗体联合抗-CD4治疗12周后，与对照组比较，小鼠模型肝脏病灶重量和面积显著增加(P<0.05)，而联合抗-CD8α治疗小鼠模型肝脏病灶重量和面积无显著变化，但外周中ALT的水平显著增高。该研究结果表明抗-TIGIT抗体主要依赖CD4⁺T细胞发挥泡型包虫病的治疗功能。

上述利用泡型包虫病小鼠模型，通过流式细胞术、伊红染色和生化检测等实验手段，评价抗-TIGIT抗体的治疗效果。结果显示：E.m在感染12周和24周，肝脏募集T细胞高表达TIGIT分子，导致T细胞分泌细胞因子(包括granzyme B,CD107a,IFN-γ,TNF-α)能力下降；利用抗-TIGIT抗体从12周开始进行泡型包虫病小鼠模型干预治疗，与对照组(IgG)相比，有效抑制病灶生长，缓解肝脏病理性损伤，促进肝脏效应性CD4+T细胞的募集，提高CD4+Teff/Treg的比例，以及增强细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α(包括但不限于)分泌。即说明抗-TIGIT抗体对泡型包虫病具有治疗效果。

抗-TIGIT抗体要依赖CD4⁺T细胞发挥泡型包虫病的治疗功能。

抗-TIGIT抗体通过抑制TIGIT-CD155的免疫抑制性信号调控T淋巴细胞效应功能，从而恢复T细胞的对泡球蚴的杀伤能力。

综上所述，本发明首次公开抗-TIGIT抗体对泡型包虫病的治疗作用，同时本发明首次公开抗-TIGIT抗体主要依赖CD4⁺T细胞发挥泡型包虫病的治疗功能，且通过药效学实验数据可知，抗-TIGIT抗体对泡型包虫病病灶生长抑制和肝脏病理性损伤缓解均具有治疗的效果，即说明抗-TIGIT抗体对泡型包虫病能够作为新型的抗包虫病药物，从而为泡型包虫病的治疗提供新途径。

以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

Claims (1)

1.一种抗-TIGIT抗体在制备治疗泡型包虫病药物中的应用。

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