KR20100043130A - 세포 활성 조성물 - Google Patents

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김병삼
주성아
성부희
이상철
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울산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법, 상기 활성화된 CD8 T T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 암, 세포내 기생세균 감염질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 조성물, CD8 T세포 활성용 조성물 및 CD8 T 세포 활성화 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 감염성 질환 및 암 등에 대한 면역반응에 주된 역할을 하는 CD8 T 세포에 상기 CD137 수용체 및 TLR-2를 자극할 수 있는 물질을 동시에 처리하는 경우, CD8 T 세포의 세포 수 증가와 세포 활성화가 됨이 확인되었고, 실제로 실험동물을 이용한 동물실험(in vivo analysis)에서도 상기 질병에 대한 치료 효과가 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 CD137 수용체 및 TLR-2를 동시에 자극하는 방법을 이용하는 경우, 감염성 질환 및 암에 대하여 우수한 치료효과가 있을 것을 예상되므로, 이를 토대로 감염성 질환 및 암 등에 관한 치료제 또는 치료방법의 연구가 가능할 수 있다.
CD8 T 세포, CD137, TLR2, 암, 세포내 기생성 세균 감염치료, Virus 감염치료

Description

세포 활성 조성물{COMPOSITION FOR ACTIVATION AND PROLIFERATION OF CD8 T-CELL}
본 발명은 CD8 T세포 활성용 조성물, 질병 치료 또는 예방용 조성물 및 CD8 T 세포 활성화 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암 및 감염성 질환의 치료를 위하여 최근 면역세포 등을 이용한 세포치료제에 대한 관심이 증대되고 있다. 구체적으로, 특정 개체에서 분리한 면역세포를 활성화시켜 환자에게 직접 투여하여 암 및 감염성 질환 특히, 치료가 어렵거나 기존의 치료제에 많은 부작용이 보고되어 있는 암, 리스테리아 감염증, 간염, 인플루엔자의 감염에 의한 독감이나 HIV 감염에 의한 후천성면역결핍증(AIDS) 등을 치료하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 이러한 세포치료법에서는 APC 세포나 특정 항원 등으로 활성화시킨 세포를 이용하고 있다.
상기와 같은 세포치료법이나 세포치료제의 경우 최근 연구가 진행되고 있는 분야로, 그 연구 수준이 제한적인 것이 현실이다. 상기 세포치료법이나 세포치료제의 성과는 특정 개체로부터 분리된 면역세포의 활성화 여부 및 부작용여부에 의해 영향을 받을 것으로 예상된다. 현재에는 면역세포의 활성화와 관련된 연구 특히, 질병의 치료를 가능하게 하는 면역세포의 활성화에 대한 연구가 미비한 실정이다.
상기 종래기술의 한계를 해결하기, 본 발명은 암 또는 감염성 질환의 치료를 위한 면역세포의 활성화 방법 및 이를 이용한 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 암 또는 감염성 질환의 치료제 및 상기 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법 및 상기 방법에 의해 활성화된 CD8 T 세포를 포함하는 암, 세포내 기생세균 감염질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CD8 T 세포 활성 조성물 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 암, 세포내 기생세균 감염질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암, 세포내 기생세균 감염질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 스크리닝하는 방법은 CD8 T 세포에 후보 물질을 투여하는 단계; 및 상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체를 모두 자극할 수 있는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 상기 질병의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 CD8 T 세포의 활성화를 통한 암 및 감염성 질환의 치료를 위한 연구를 거듭한 결과, CD3 또는 항원자극에 의하여 감작된 CD8 T 세포를 CD137 수용체 및 TLR 2(toll like receptor-2)를 통하여 함께 자극하는 경우, CD8 T 세포가 증가(proliferation)하고 세포 활성화(activation)된다는 것을 확인하였고, 실험동물에 상기 CD8 T 세포의 CD137 수용체 및 TLR 2를 자극할 수 있는 물질을 동시에 처리한 경우, 실험동물에서 CD8 T 세포의 증가와 암세포의 감소를 확인하였으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 있어서, T 세포는 면역 반응에 관여하는 세포로, 특정 세포 표면 마커(cell surface marker)를 발현하는 T 세포집단(population)을 의미한다. 본 발명은 T 세포 집단 중에서 CD8 표면 마커를 가지는 T 세포(CD8 T 세포)를 분리하여 이용하는 발명에 관한 것이다. CD8 항원을 가지는 CD8 T 세포에는 Tc 세포(cytotoxic T 세포)가 있다. Tc 세포는 타겟 세포를 용해할 수 있는 세포로, 바이러스 감염된 세포 및 암세포 등을 직접적으로 제거하는 역할을 한다. 또한 CD8 항원을 가지는 CD8 T 세포에는 Ts 세포(suppressor T 세포)가 있다.
본 명세서에 있어서, 개체(subject)는 T 세포를 포함하는 단핵세포를 제공하는 제공자(donor), 혈관계(vascular system) 및 조혈세포(hematopoietic cell)를 가지는 유기체가 모두 포함될 수 있으며, 바람직하게는 인간과 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 토끼, 마우스 등의 척추동물일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 세포 활성화란 T 세포가 면역반응을 담당할 수 있도록 자극을 주는 것을 의미하고, 다양한 신호에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명의 목적상 T 세포 활성화는 CD8 T 세포 활성화를 의미한다.
본 명세서에서 있어서, "예방"이란 활성화된 CD8 T 세포 투여에 의해 암 또는 감염성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 있어서, "치료"란 활성화된 CD8 T 세포 투여에 의해 암 또는 감염성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 있어서, "환자"는 활성화된 CD8 T 세포 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 암 또는 감염성 질환을 가진 인간과 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다.
본 발명은 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 개체의 생물학적 시료로부터 CD8 T 세포를 분리하는 단계; 및 상기 CD8 T 세포를 상기 CD137 수용체 자극 물질 및 상기 TLR-2 수용체 자극 물질이 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 개체의 생물학적 시료는 상기 개체의 혈액(blood), 혈장(plasma), 림프절(lymph node), 비장(spleen), 흉선(thymus) 및 골수(bone marrow)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종이상일 수 있다.
상기 개체의 생물학적 시료로부터 T 세포를 분리하는 단계를 수행하는 방 법은 특별히 제한되지 않는다. 일 예로, 세포 밀도(cell density), 세포 표면 에피토프에 대한 항체 친화도, 세포 크기(cell size), 형광 방출(fluorescent emission) 정도에 의존하여 분리할 수 있다.
구체적으로, 상기 T 세포를 분리하는 방법은 알부민(albumin), 덱스트란(dextran), 피콜(Ficoll), 메트라자미드(metrizamid), 퍼콜(Percoll) 등을 이용한 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation) 방법, 항체를 이용한 MACS(magnetic activated cell sorter) 등의 방법, 세포 크기를 이용한 centrifugal elutriation 등의 방법 및 형광물질을 이용한 FACS(Flow Cytometry Cell Sorter) 등의 방법이 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 방법 중 MACS 컬럼(column)을 사용하여 CD8 T 세포를 분리하였다.
상기 분리된 CD8 T 세포는 CD137 수용체 자극 물질 및 상기 TLR-2 수용체 자극 물질이 첨가된 배지에서 배양하는 방법으로 활성화될 수 있다. 또한, 상기 CD8 T 세포는 항원 또는 CD3 자극 물질에 의해 감작된 것일 수 있다. 또한, 상기 분리된 CD8 T 세포를 활성화하기 위하여, T 세포를 감작시킬 수 있는 감작물질, 일 예로 항원 또는 CD3 자극 물질을 더 첨가한 배지에서 배양할 수 있다. 상기 CD3 자극 물질은 T 세포의 CD3 수용체 자극물질을 의미하고, T 세포를 자극할 수 있는 항원 또는 T 세포를 감작시킬 수 있는 항원이면, 그 종류에 제한되지 아니한다. 일 예로, T 세포에 항원으로 작용할 수 있는 세균, 구체적으로 그람양성 세균, 그람음성 세균, 바이러스 또는 곰팡이 등을 열처리한 것 또는 CD3 항원일 수 있다.
상기 활성화단계는 시험관내(in vitro) 방법으로 활성화할 수 있다.
상기 분리된 CD8 T 세포를 활성화하는 단계는 상기 수용체 자극 물질 또는 상기 수용체 자극 물질과 항원 또는 CD3 자극 물질이 첨가된 것을 제외하고는, 통상의 배양방법으로 수행할 수 있다.
상기 시험관내 방법에 사용되는 배양배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적인 영양소를 함유한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하거나 혈청을 포함할 수 있다. 상기 배지는 일 예로, DMEM 또는 RPMI 같은 배지를 사용할 수 있다.
본 발명자는 상기 감작된CD8 T 세포를 상기 CD137 수용체 및 상기 TLR-2 수용체를 이용하여 자극하는 경우, 상기 CD8 T 세포가 다른 수용체에 의한 자극이나 상기 D137 수용체 및 상기 TLR-2 수용체를 각각 자극한 경우에 비하여 현저하게 활성화되고 세포분열(cell division)되어 세포가 증식되는 것을 확인하였다. 즉, 상기 D137 수용체 및 상기 TLR-2 수용체는 상기 CD8 T 세포의 자극에 상승적으로(synergistically) 작용함이 확인되었다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 D137 수용체 및 상기 TLR-2 수용체의 자극은 감작된 CD8 T 세포를 활성화시켜 CD8 T 세포를 증식시킴으로써, 감염성 질환을 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 실제로 신장암 세포의 수가 감소됨이 확인되어, 상기 D137 수용체 및 상기 TLR-2 수용체의 자극은 CD8 T 세포의 활성화를 통한 감염성 질환 또는 암의 치료 또는 예방에 효과적임이 증명되었다.
상기 CD137 수용체 자극 물질은 CD137 수용체를 통하여 CD8 T 세포를 자극하는 물질을 의미하고, 일 예로 항 CD137 수용체 단클론 항체, 항 CD137 수용체 리 간드 및 항 CD137 수용체 리간드 융합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항 CD137 수용체 단클론 항체 또는 항 CD137 수용체 리간드는 다양한 개체 유래의 야생형이거나 야생형의 생물학적 활성을 유지하는 이의 단편, 또는 변이체일 수 있다. 일 예로, anti-4-1BB mAb(항 4-1BB 단클론 항체), 상기 4-1BB ligand의 세포외 부위에 면역글로블린의 Fc 부위를 융합시킨 융합단백질인 4-1BBLFc 또는 SA-4-1BB(Ex Vivo Expansion of CD4+CD25+FoxP3+ T Regulatory Cells Based on Synergy between IL-2 and 4-1BB Signaling, The Journal of Immunology, 179: 7295-7304(2007))일 수 있다.
또한, 상기 TLR-2 수용체 자극 물질은 TLR-2 수용체를 통하여 CD8 T 세포를 자극하는 물질을 의미하고, 일 예로 열처리된 균주, Pam(lipopeptidePam3CysSK4), lipoteichoic acid, peptidogycan, atypical LPS, OspA, Porin, LcrV, Lipomannan, GPI anchor, Lysophosphatidylserine, Lipophosphoglycan(LPG), Glycophosphatidylinositol(GPI), Zymosan,Hemagglutinni, 세균, MALP-2, MALP-404 및 MALT-2로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 세균은 그람 양성 세균(Gram-positive bacteria), 그람 음성 세균(Gram-negative bacteria) 또는 바이러스로, 상기 세균은 열처리에 의해 사멸화된 것일 수 있다. 상기 세균은 일 예로 Mycoplasma 속 균주, Chlamydophila pneumoniae, Borrelia burgdorferi, Haemophilus influenzae, Propionibacterium acnes, Yersinia 속 균주, Mycobacterium 속 균주, Trypanosoma cruzi, Schistosoma mansoni, Leishmania major, Plasmodium falciparum, Saccharomyces cerevisiae, Malassezia 속 균주, Aspergillus fumigatus, Herpes simplex virus, Varicella zoster virus, Cytomegalovirus(CMV) 또는 Measles virus일 수 있다. 또한, 상기 열처리된 균주는 상기 CD8 T 세포의 TLR-2 수용체 자극의 원인이 되는 감염성 질환의 원인 균주, 일 예로 기생세균, 바이러스 또는 곰팡이일 수 있고, 상기 열처리는 상기 균주 중 해당 균주를 사멸시키기 위하여 열을 가하는 것을 의미한다. 상기 Pam(lipopeptidePam3CysSK4) 또는 MALT-2는 다양한 개체 유래의 야생형이거나 야생형의 생물학적 활성을 유지하는 이의 단편, 또는 변이체일 수 있다.
상기 배지에는 상기 수용체 자극 물질에 추가로 CD8 T 세포를 활성화시키기 위한 추가 성분이 포함될 수 있다. 상기 CD8 T 세포를 활성화시키기 위한 추가 성분은 상기 CD8 T 세포의 항원으로 작용할 수 있는 물질이면 그 종류가 제한되지 아니하며, 일 예로 CD3일 수 있다.
상기 D137 수용체 자극 물질 및 상기 TLR-2 수용체 자극 물질은 CD8 T 세포를 활성화시키는 유효량 내에서, 이를 세포 배양액에 첨가하는 방법, 시기, 첨가 횟수 등에 특별히 제한되지 않는다. 분리한 CD8 T 세포를 배지에서 배양함과 동시에 첨가할 수도 있고, 세포 배양 후 일정 시간적 간격을 두고 첨가할 수도 있다. 또한, 유효량 내에서 단일 투여할 수도 있고 몇 차례에 걸쳐 다중 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 자극 물질 각각의 첨가되는 시기도 조절될 수 있다.
상기 배양시기는 요구되는 CD8 T 세포의 활성화 정도, 세포 상태 및 사용 목적에 따라서 다양하게 조절될 수 있으며, 일 예로 상기 자극물질을 첨가 후 배지 에서 12시간 내지 240 시간 또는 1일 내지 4일 배양할 수 있다.
본 발명의 활성화 방법은 독성이 거의 없고, 세포 치료의 효율성을 결정적으로 영향을 미치는 CD8 T 세포의 활성을 유도하는 간단하면서도 효과적인 방법이다. 상기 본 발명의 방법으로 활성화된 CD8 T 세포는 다양한 용도의 암, 세포내 기생세균 감염질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환을 포함하는 감염질환 및 면역질환 치료를 위한 생물학적 제제로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 활성화된 CD8 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 암, 세포내 기생세균 감염 질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 일 예로, 상기 질병은 바람직하게는 암 또는 리스테리아 감염증일 수 있다.
상기 암은 개체의 필요에 따라 규칙적이고 절제 있는 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 필요한 상태를 무시하고 무제한의 증식을 하는 미분화 세포 덩어리 즉, 악성 신생물을 의미하고, 암종과 육종 두가지로 구분될 수 있다.　 상기 미분화 세포는 종괴 또는 종양을 형성할 수 있다. 상기 암의 종류는 한정되지 아니하고, 일 에로 신장암, 대장암, 위암, 피부암, 유방암, 폐암 또는 간암일 수 있다.
상기 세포내 기생세균 감염 질환은 세포내 기생세균(intracellular bacteria)의 감염에 의한 질환으로, 일 예로 리스테리아(Listeria) 감염증, 클라미디아 병(Chlamydia disease)과 같은 클라미디아 감염에 의한 질병, 결핵 등과 같은 항산균(mycobacteria)에 의한 항산균병(mycobacteria disease), 부르셀라(brucella) 감염에 의한 부르셀라 감염증, 리케치아(richettsia) 감염에 의한 리케치아증, 살모넬라 감염에 의한 질병일 수 있다. 상기 리스테리아병은 리스테리아 모노키토게네스(Listeris monocytogenes)에 의하여 일어나는 전염병으로 선회병이라고도 하고, 뇌염형 등과 같은 증세를 수반한다.
상기 바이러스 감염질환은 바이러스의 감염에 의한 질환으로, 구체적으로 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)의 감염에 의한 질환, 홍역, 뇌염, HSV(Herpes simplex vius) 감염에 의한 질환, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염에 의한 질환, 간염 바이러스 감염에 의한 질환 및 HIV-1를 포함한 HIV 감염에 의한 후천선면역결핍증(AIDS) 등이 있으나, 특별히 제한되지 않는다.
상기 인플루엔자 바이러스는 오쏘미소비리데(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 바이러스로, 인플루엔자바이러스 A(Influenzavirus A), 인플루엔자바이러스 B(Influenzavirus B), 인플루엔자바이러스 C(Influenzavirus C), 쏘고토바이러스(Thogotovirus) 및 이자바이러스(Isavirus) 등이 있다.
상기 곰팡이 감염질환은 곰팡이의 감염에 의한 질환으로, 대표적으로 칸디다(Candida) 균의 감염에 의한 것으로 일 예로 칸디다 증, 칸디다설염, 칸디다 패혈증 또는 칸디다질염 등이 있다. 상기 칸디다 증은 모닐리아증이라고도 하며, 점막 칸디다증, 피부 칸디다증, 소화관 칸디다증, 및 전신성 칸디다증이 있다.
상기 조성물은 기존의 항암활성, 항균활성 또는 항-바이러스 활성을 가지 는 물질과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 CD8 T 세포를 투여함으로써, 암 세포 또는 세포내 기생세균, 바이러스 또는 곰팡이에 감염된 세포를 효과적으로 제거함으로써 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방 효과를 가지게 된다.
상기 CD8 T 세포 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.
상기 조성물의 유효성분인 상기 활성화된 CD8 T 세포는 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 질병의 중증도, 연령, 성별, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 CD8 T 세포의 CD137 수용체 자극 물질 및 CD8 T 세포의 TLR-2 수용체 자극 물질을 포함하는 CD8 T 세포 활성 조성물에 관한 것일 수 있다. 상기 CD8 T 세포 활성 조성물은 CD8 T 세포를 감작할 수 있는 항원 물질 또는 CD3 를 추가로 포함할 수 있다.
상기 CD8 T 세포 활성 조성물은 CD8 T 세포가 생육하는 환경이면, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 (조건) 안(in vivo)에 제한되지 않고 첨가될 수 있다. 따라서, 시험관 내 조건의 경우, 배지에 첨가되어 CD8 T 세포를 활성화시킬 수 있고, 생체에 투여되는 경우에는 의약 조성물 또는 약품과 같은 형태로 제재화되어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 CD8 T 세포 활성 조성물을 유효성분으로 포함하는 암, 세포내 기생세균 감염질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 질병은 암 또는 리스테리아 감염증일 수 있다.
상기 치료 또는 예방용 조성물은 상기 CD8 T 세포 활성 조성물을 유효성분으로 포함하고, 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 치료 또는 예방용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상 의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 상기 CD8 T 세포 활성 조성물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
본 발명의 상기 CD8 T 세포 활성 조성물을 유효성분으로 포함하는 치료 또는 예방용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형물로 사용될 수 있다.
상기 치료 또는 예방용 조성물은 상기 CD8 T 세포 활성 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 포함할 수 있으며, 일 예로 전체 조성물 총 중량에 대하여 CD8 T 세포 활성 조성물을 0.001 중량% 내지 49.9 중량% 또는 0.1 중량% 내지 49 중량% 또는 1중량% 내지 10 중량% 포함할 수 있다.
또한, 상기 치료 또는 예방용 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있다.
구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 CD8 T 세포 활성 조성물에 부형제가 추가될 수 있다. 또한, 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 단순희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등의 부형제가 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 치료용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체 적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 전제, 침제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등일 수 있다. 더 나아가 본 발명의 치료용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 또한, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량과 투여횟수는 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 암, 세포내 기생세균 감염증, 바이러스 감염증 및 곰팡이 감염증으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
상기 스크리닝하는 방법은 CD8 T 세포에 후보 물질을 투여하는 단계; 및 상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체를 모두 자극할 수 있는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 CD8 T 세포를 시험관 내(in vitro) 환경에서 배양하고 있는 경우, 상기 후보 물질은 배지에 첨가하는 방법으로 투여할 수 있고, 상기 CD8 T 세포가 개체의 생체로부터 분리되지 아니한 경우에는, 상기 개체에 상기 후보물질을 주입하 는 방법으로 투여할 수 있다. 상기 개체의 생체 투여되는 경우에는 의약 조성물 또는 약품과 같은 형태로 제재화되어 투여될 수 있다. 상기 개체란 상기 스크리닝을 위하여 사용되는 실험동물을 의미한다.
상기 후보물질이란 상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체를 모두 자극하여, 상기 CD8 T 세포를 활성화함으로써, 암, 세포내 기생세균 감염증, 바이러스 감염증 및 곰팡이 감염증으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병에 대한 치료효과 또는 예방효과가 있는 것으로 예상되어, 치료 효과를 측정하기 위한 실험대상으로 사용될 수 있는 모든 물질을 의미하며, 실험동물에 적용할 수 있고 치료 효과를 측정할 수 있으면 천연물질 또는 그로부터 얻어진 것이든, 인공적으로 합성된 것이든 제한되지 않고, 그 종류도 제한되지 않는다.
한편, 상기 실험동물에 투여하는 경우, 경구로 섭취시키거나 주사 등의 방법을 이용하거나 외용하는 등의 모든 방법을 의미하며, 상기 방법은 제형이나 제재의 종류에 의해서 제한되지 아니한다.
상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체를 모두 자극할 수 있는지 여부를 확인하는 단계는 상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체의 발현량이 증가되었는지 여부, TLR-2 수용체의 발현량이 증가되었는지 여부 및 CD8 T 세포의 수가 증가하였는지 여부를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체를 모두 자극할 수 있는지 여부를 확인하는 단계는 상기 후보물질을 투여한 후에, 12 시간 내지 240시간, 바람직하게는 1일 내지 4일이 경과한 후에, 각 증가여부를 확인하는 방법으로 수행 할 수 있다. 상기 증가여부의 확인은 후보물질을 투여하지 아니한 CD8 T 세포 또는 CD137 수용체 자극물질이나 TLR-2 수용체 자극물질 중 어느 하나만을 투여한 CD8 T 세포를 동일한 실험조건에서 배양한 경우, 측정되는 CD8 T 세포의 수와 비교하는 방법으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 CD8 T 세포의 DNA 합성을 방사성 동위원소로 표지된 물질, 일 예로 [3H]thymidine을 사용하여 측정하는 방법으로 수행하거나 세포를 CFSE로 labelling한 후, FACS(유세포분석기)를 이용하여 형광감소 정도를 측정하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 FACS를 이용하는 경우, CFSE-labeled population의 형광감소의 의미는 cell division이 일어났음을 의미하는 것이다.
일 예로, 상기 스크리닝 방법은 암 세포주를 처리한 실험동물에 후보 물질을 투여하는 단계; 상기 실험동물로부터 CD8 T 세포를 분리하고, 상기 분리된 CD8 T 세포의 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체의 발현량이 증가하였는지 여부를 확인하는 단계; 상기 실험동물의 CD8 T 세포의 수가 증가하였는지 여부를 확인하는 단계; 및 상기 실험동물의 암 세포 수가 감소하였는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 CD8 T 세포에 상기 CD137 수용체 및 TLR-2를 자극할 수 있는 물질을 함께 처리하여, 상기 CD137 수용체 및 TLR-2를 동시에 자극하는 경우, CD8 T 세포가 활성화됨으로써, CD8 T 세포와 관련된 다양한 질병을 치료 또는 예방할 수 있으며, 특히 암세포주를 이용한 실험에서 탁월한 암세포 감소효과를 확인하여, 상기 세포활성화 방법 및 상기 치료 또는 예방용 조성물과 상기 스크리닝 방법을 이용하는 경우, 기존에 그 효과가 미비하고 다양한 부작용이 문제되었던 암 또는 감염성 질병의 치료제를 대체할 수 있는 치료제 또는 치료방법의 개발할 수 있을 것으로 예상되어 상기 질병과 관련된 다양한 산업에 응용될 수 있으므로, 그 산업적 효과가 매우 크다 할 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 시료 및 실험동물
실시예 1-1. 실험동물의 구입 및 사육
C57BL6 마우스는 Jackson Laboratories(USA)로부터 구입하였고, Balb/c 마우스는 Orient company에서 구입하였으며, 상기 마우스는 각각 암컷을 구입하여 울산대학교 면역제어연구센터의 사육실 SPF(specific pathogen-free)에서 온도 22°C, 습도 50% 및 12시간 밝음/12시간 어둠의 명암주기 조건을 유지하면서 사육하였고, 물과 먹이는 자유로이 공급하였다.
또한, CD137 KO(4-1BB KO), MyD88 KO, IFN-gamma KO, IFN-gammaR KO, nude 마우스는 울산대학교 면역제어연구센터의 사육실(SPF condition)에서 번식시키고, 유지하여 사용하였다.
상기 모든 마우스는 7 내지 8주령을 사용하였다.
실시예 1-2. 항체
Anti-4-1BB mAb는 3E1 clone으로 Robert S. Mittler 박사(Emory Vaccine Center, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, USA)로 부터 분양 받아 사용하였다. 그 hibridoma(3E1)를 nude mouse에 주사하여 얻은 복수를 protein G column(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 정제하여 PBS에 투석 후 마우스에 주사용으로 사용하였다.
또한, Anti-4-1BB mAb-FITC는 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 conjugation하여 사용하였다.
또한, Anti-CD8-microbead(Miltenyi Biotec), Anti-TLR2-PE(6C2; eBioscience), Anti-145.2C11 mAb(anti-CD3, BD PharMingen; San Diego, CA), MALP-2(Alexis Corporation), Anti-CD8-PE(BD PharMingen; San Diego, CA)를 구입하여 사용하였고, Pam(Pam3CysSK4)는 INVIVOGEN에서 구입하여 사용하였다.
실시예 2: 실험방법
실시예 2-1. 세포정제(Cell Purification)
Spleen과 LN으로로부터 CD8 T 세포의 분리는 magnetic bead (Anti-CD8-microbead ;Miltenyi Biotec)를 이용하여 분리하였다. 분리된 CD8 T 세포는 anti- CD8-PE(BD PharMingen; San Diego, CA)로 염색하여 순도(purity)를 확인하였으며, 실험에 사용된 CD8 T 세포는 96%이상의 순도(purity)를 확인하였다.
실시예 2-2. 세포배양(Cell Culture)
상기 실시예 2-1에서 정제된 CD8 T 세포를 round-bottom 96well microplate 4x105/well 넣고, 0.05ug/ml의 anti-CD3(BD PharMingen; San Diego, CA)와 함께 5ug/ml의 anti-4-1BB mAb(3E1) 및/또는 2ug/ml의 Pam(INVIVOGEN)을 첨가하고 37℃로 유지된 CO2 배양기에서, 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 medium로 배양하였다.
실시예 2-3. CFSE 염색
상기 CD8 T 세포의 염색은 상기 CD8 T 세포를 분리하는 방법은 하기와 같다. 우선, 상기 CD8 T 세포를 분리하고, 2.5uM CFSE (Molecular Probes, PoortGebouw, The Netherlands)로 37°C에서 20분간 반응시킨 후, PBS로 두 번 washing하였다. round-bottom 96well microplate(NUNC)에 4x105/well 넣고, 0.05ug/ml의 anti-CD3(BD PharMingen; San Diego, CA)와 그리고 5ug/ml anti-4-1BB mAb(3E1) 및/또는 2ug/ml Pam(INVIVOGEN)을 첨가하고 37℃로 유지된 CO2 배양기에서, 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 medium로 배양하였다. 72시간 배양 후 FACS(유세 포분석기)로 분석한다.
실시예 2-4. Cell proliferation assay
상기 CD8 T 세포를 분리하여 anti-CD3(0.05ug/ml), anti-4-1BB(5ug/ml), Pam(2ug/ml) 또는 MALT-2(1ug/ml)를 처리하고, 54시간째 [3H]thymidine을 0.5uCi/well로 처리하였다. 72시간이 경과한 후, 세포를 회수하여 beta-counter(Wallac; 1450 microbeta)를 통해 방사능 수치를 측정하여, 세포 증식 정도를 확인하였다.
실시예 2-5. ELISA for cytokine
상기 분리한CD8 T 세포는 round-bottom 96well(NUNC) plate에 4x105/well 넣고, 0.05ug/ml의 anti-CD3(BD PharMingen; San Diego, CA), 5ug/ml의 anti-4-1BB mAb(3E1) 및 Pam(2ug/ml)을 첨가하고 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 medium에서 24시간 배양하였다. 이후 배양 상층액을 회수하여 cytokine을 IL-2와 IFN-gamma ELISA kits(Endogen)를 사용하여 측정하였다.
실시예 2-6. FACS 분석
FACS(Flow cytometry cell sorter)란 유액상태의 입자나 세포가 일정 감지 지역을 통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여, 한 세포가 갖는 여러 특징을 동시에 측정하고 특정한 부분을 선택하여 분석하고 분리할 수 있는 장비이다. 또한, 형광염색소(Fluorescent dye)와 단클론 항체(Monoclonal antibodies)를 사용하여 세포의 표면 및 내부가 갖는 면역상태를 파악하고 세포 혹은 핵 내부의 DNA 양 분석을 통해 종양의 성격을 파악할 수 있는 있는 장비이다. 본 발명에서는 FACS를 이용하여, immumophenotyping, proliferation assay, cell cycle을 분석하였다.
우선, 세포는 먼저 FSC(Forward Scatter) /SSC(Side Scatter)로 분석하여 세포크기 및 granules분포에 따라 Lympocytes의 위치를 확인후 gate 1으로 표시하고, 이후 gate1 내에서 x축을 FL-1 channel (보통 FITC), Y축을 FL-2 channel (보통 PE)로 잡고, 필요한 monoclonal Ab를 사용하여, 세포의 phenotype 을 확인하였다. 본 발명에 사용된 세포는 mouse의 면역세포 중 CD8 T 세포만을 MACS column(magnetic separation system)을 사용하여 순수분리 후, CD8 T 세포의 purity를 확인하고 그 이후의 실험에 사용하였다.
상기 FACS분석을 위해 CD8 세포는 먼저 Fc receptor-blocking mAb 2.4G2로 4℃에서 20분간 반응시켰다. 이후 Anti-TLR2-PE(6C2; eBioscience) mAb 또는 Anti-4-1BB-FITC mAb로 4℃에서 30분간 반응시키고, 0.2% BSA가 첨가된 PBS로 두 번 washing하였다.
상기 시료는 Becton Dickinson FACScan flow cytometer와 CELL-Quest software(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다.
실시예 2-7. Cell cycle analysis
CD8세포를 분리하여, round-bottom 96well(NUNC) plate에 1x106/well 넣고, 0.5ug/ml의 anti-CD3(BD PharMingen; San Diego, CA), 5ug/ml의 anti-4-1BB mAb(3E1), 그리고 Pam(2ug/ml)을 첨가하고 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 medium에서 24시간 배양하였다. 72시간 후 세포를 회수하여 PBS로 washing하고, 70% 에탄올을 넣어 pipetting후 30분 동안 4℃에서 반응시켰다. PBS로 washing후 원심분리하여 상층액을 제거한 후 50ug/ml의 Propidium iodide (Sigma-Aldrich), 0.1mg/ml의 RNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 넣고 실온에서 25분 반응 시킨 후 FACS로 분석하였다.
실시예 2-8. 세균(bacteria) 실험
L. monocytogenes는 Korean Type Culture Collection (ATCC 19111)으로 부터 구입하였다. 상기 Bacteria는 brain heart infusion broth(Difco Laboratories, Detroit MI)에서 37℃ 18시간 배양 후 aliquots하여 -80℃에서 보관하였다. CFU는 serial dilutions 를 통해 plate에서 계수하였고, 이때 희석액으로는 0.1% BSA가 함유된 PBS를 사용하였다.
실시예 2-9. HKLM(Heat killed Listeria monocytogenes) 제조
-80℃에서 보관 중이던 상기 L. monocytogenes를 PBS로 washing후, 80°C 로 30분 중탕하여 HKLM을 제조하였다.
실시예 2-10. S. LTA( Staphylococcus aureus lipoteichoic acid) 및 L. LTA( Lactobacillus lipoteichoic acid ) 제조
상기 시료는 서울대학교 치과대학 한승현 교수님으로부터 제공받았다.
실시예 2-11. Foot pad injection
L. monocytogenes를 준비하고, 80°C 로 30분 중탕하여 HKLM을 만든 다음, 50ul를 발바닥에 주사(Foot pad injection)하여 각 제시한 농도의 CFU/mouse가 되도록 한다.
실시예 2-12. Tumor cells and animal experiments
Renca cells은 Korean Cell Line Bank로부터 구입하여 RPMI 1640 medium에 10% FBS를 첨가하여 배양하였다. 동물 실험을 위해 2 내지 3번 passage를 거친 후 log phage에 있는 세포를 PBS로 washing후 주사하였다. 7주령의 암컷 Balb/c 생쥐 오른쪽 등 피부의 털을 제거하고 피하에 RENCA cell을 9.2x 105/mouse로 주사하였다. RENCA 세포를 주사한 3일과 7일째에 꼬리 정맥으로 200ul의 HKLM(5x107CFU/mouse)을 주사하였다. Anti-4-1BB mAb는 복강으로 7, 10, 17째(RENCA 세포를 주사한 날을 Day 0)에 100ug/mouse로 주사하였다(1mg/ml을 100ul 주사). Day 0부터 2 내지 3일 간격으로 tumor 크기를 측정하였다. 종양의 크기는 "측정된 값 가로x세로x높이x0.52333"의 식으로계산하였다.
실시예 3: CD8 T 세포의 CD137 수용체와 TLR-2 수용체의 상승효과(Synergy effect) 확인
실시예 3-1. CD137 자극에 의한 TLR-2 발현량 증가의 확인
실시예 1의 C57BL6 마우스로부터 비장(spleen)과 림프절(lymphnode)을 분리하고, MACS(magnetic separatin system) column(Miltenyi Biotec)을 이용하여 CD8 T 세포만을 분리하였다. 상기 분리된 CD8 T 세포에 0.05μg/ml의 항 CD3 단클론 항체(anti-CD3 mAb) 또는 0.05μg/ml의 항 CD3 단클론 항체(anti-CD3 mAb) 및 5μg/ml의 항 CD137 단클론 항체(anti-CD3 mAb)로 자극하고, 37℃의 온도조건을 유지하며, CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 동안 배양 후, 상기 세포를 회수하고 항 TLR2-PE(anti-TLR2-PE)를 이용하여 염색한 후, 유세포분석기(FACS)를 이용하여 TLR2의 발현여부를 측정하였다.
상기 FACS를 이용한 측정은 보다 상세하게는, 먼저 FSC(Forward Scatter)/SSC(Side Scatter)로 분석하여, 세포크기 및 granules 분포에 따라 림프구(Lymphocyte) 즉, CD8 T 세포의 위치를 확인한 후, gate 1으로 표시하고, 이후 gate 1내에서 TLR2-PE를 histogram으로 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에서 오른쪽으로 그래프가 이동한 것은 TLR-2 positive %를 의미하 고, 대조군으로는 control isotype mAb로 염색하여 비교한 결과를 나타내었다.
상기 도 1에 나타낸 바와 같이, CD8 T 세포에 T 세포 공동자극원(CD3)으로 자극하는 경우, TLR-2의 발현이 증가되고, T 세포 공동자극원과 CD137을 공동으로 자극하는 경우, TLR-2의 발현이 현저하게 증가되는 것이 확인되어, T 세포가 자극 된 환경에서 CD8 T 세포에 CD137을 처리하는 경우 TLR-2의 발현량을 현저하게 증가시키는 것으로 확인되었다.
실시예 3-2. TLR-2 자극에 의한 CD137 발현량 증가의 확인
실시예 3-1과 같이, 실시예 1의 C57BL6 마우스로부터 비장(spleen)과 림프절(lymphnode)을 분리하고, MACS(magnetic separatin system) column(Miltenyi Biotec)을 이용하여 CD8 T 세포만을 분리하였다. 상기 분리된 CD8 T 세포를 96 well plate에 4x105/well씩 분주하고, 0.05μg/ml의 항 CD3 단클론 항체(anti-CD3 mAb) 또는 0.05μg/ml의 항 CD3 단클론 항체(anti-CD3 mAb) 및 TLR-2의 리간드(ligand)인 Pam 2μg/ml로 자극하고, 37℃의 온도조건을 유지하며, CO2 배양기에서 24시간, 48시간 및 72시간 배양하였다. 각각 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양 후, 상기 세포를 회수하고 항 CD137 단클론 항체(3E1)-FITC(anti-CD3 mAb(3E1)-FITC)를 이용하여 염색한 후, 유세포분석기(FACS)를 이용하여 CD137(4-1BB)의 발현여부를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, CD8 T 세포에 T 세포 공동자극원(CD3)으로 자극하는 경우에 비하여, T 세포 공동자극원과 TLR-2의 리간드로 함께으로 자극하는 경우, CD 137의 발현이 현저하게 증가되었으며, 그 발현량의 유지 정도에서도 48시간에 24시간 경과한 시점의 50% 정도로 급감한 것에 비하여, T 세포 공동자극원과 TLR-2의 리간드로 함께으로 자극한 경우에는 48시간이 경과한 경우에도 24시간 경과한 시점의 발현량과 거의 유사한 수준을 유지하는 것으로 확인되었다.
실시예 3-3. CD137 및 TLR-2의 동시자극에 의한 상승효과(synergy effect) 확인
실시예 3-1 및 3-2와 같이, 실시예 1의 C57BL6 마우스로부터 비장(spleen)과 림프절(lymphnode)을 분리하고, MACS(magnetic separatin system) column(Miltenyi Biotec)을 이용하여 CD8 T 세포만을 분리하였다. 상기 분리된 CD8 T 세포를 CFSE로 표지(labelling)한 후, T 세포 공동자극원인 CD3에 대한 anti-CD3 mAb, anti-CD 137 mAb, TLR-2의 리간드인 Pam 또는 MALT-2를 처리하여 자극하고, 37℃의 온도조건을 유지하며, CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. 세포 회수 18시간 전에 [3H]thymidine을 처리하고, 72시간 배양 후, 상기 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포에 beta-counting을 통해 방사능 수치를 얻어, 세포 증가(cell proliferation)을 확인하였다. 또한, 상기 분리된 CD8 T 세포에 anti-CD 137 mAb 및 TLR-2의 리간드를 이용하여 CD 137와 TLR-2를 자극하고 37℃의 온도조건을 유지하며, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 배양 상층액을 회수하여 실시예 2의 ELISA를 통해 IL-2 및 IFN-γ를 측정하였으며, 상기 측정결과를 각 도 3 및 도 4에 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하는 경우, CFSE-표식(CFSE-labelde)된 세포수의 형광이 감소되어, 세포 분열(cell division)이 증가되는 것이 확인되었다. 즉, CD8 T 세포에 CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하면, 세포증식 즉, 세포수의 증가가 일어나는 것으로 확인되었다. 특히, 자극이 없는 대조군이나 CD 137만을 자극한 경우에 비하여, CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하는 경우 현저하게 상승된 세포증식이 있는 것이 확인되었다.
또한, 상기 도 4a에 나타낸 바와 같이, CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하는 경우, 세포 증식이 증가되는 것으로 나타나, 상기 도 3에 의한 결과가 거듭 확인되었다. 즉, CD8 T 세포에 CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하면, 자극이 없는 대조군이나 CD 137만을 자극한 경우에 비하여, 현저하게 상승된 세포증식이 있는 것이 확인되었다.
또한, 상기 도 4b에 나타낸 바와 같이, CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하는 경우, CD8 T 세포가 활성화되어, Th1 세포(T helper cell type 1)의 사이토카인(cytokine), 구체적으로 IL-2 및 IFN-g의 분비가 현저하게 증가되는 것으로 나타나, CD 137와 TLR-2의 동시 자극은 CD 8 T 세포의 세포증식 뿐만 아니라 세포 활성화 효과도 현저하게 뛰어난 것으로 확인되었다.
실시예 3-4. TLR-2의 동시자극원으로서 CD137의 상승효과(synergy effect) 확인
실시예 3-1 및 3-2와 같이, 실시예 1의 C57BL6 마우스로부터 비장(spleen) 과 림프절(lymphnode)을 분리하고, MACS(magnetic separatin system) column(Miltenyi Biotec)을 이용하여 CD8 T 세포만을 분리하였다. 상기 분리된 CD8 T 세포를 CFSE로 표지(labelling)한 후, 자극원(agonistic mAb), 구체적으로 T 세포 공동자극원인 CD3에 대한 anti-CD3 mAb(0.05μg/ml), anti-CD 137 mAb(5μg/ml), TLR-2의 리간드인 Pam(2μg/ml) 또는 anti-CD28 mAb(5μg/ml), anti-OX40 mAb(5μg/ml) 및 anti-CD40 mAb(5μg/ml)를 처리하여 자극하고, 37℃의 온도조건을 유지하며, CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. 세포 회수 18시간 전에 [3H]thymidine을 처리하고, 72시간 배양 후, 상기 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포에 beta-counting을 통해 방사능 수치를 얻어, 세포 증가(cell proliferation)을 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하는 경우, 세포증식 즉, 세포수의 증가가 일어나는 것으로 확인되었다. 한편, CD 137 이외의 다른 T 세포 공동자극분자들과 TLR-2를 동시에 자극하는 경우, 일부에서 세포증식 효과가 있기는 하였으나, 상승효과는 확인되지 아니하였다.
실시예 3-5. CD137 및 TLR-2의 동시자극에 의한 상승효과의 메카니즘 확인
실시예 1에서 배양한 다양한 KO 마우스(knockout mouse), 구체적으로 CD137 KO(4-1BB KO) 마우스, MyD88 KO 마우스, IFN-gamma KO 마우스, IFN-gammaR KO 마우스로부터, 실시예 3-1과 같이 실시예 1의 C57BL6 마우스로부터 비 장(spleen)과 림프절(lymphnode)을 분리하고, MACS(magnetic separatin system) column(Miltenyi Biotec)을 이용하여 CD8 T 세포만을 분리하였다. 상기 분리된 CD8 T 세포를 CFSE로 표지(labelling)한 후, 자극원(agonistic mAb), 구체적으로 T 세포 공동자극원인 CD3에 대한 anti-CD3 mAb(0.05μg/ml), anti-CD 137 mAb(5μg/ml), TLR-2의 리간드인 Pam(2μg/ml) 또는 anti-CD28 mAb(5μg/ml), anti-OX40 mAb(5μg/ml) 및 anti-CD40 mAb(5μg/ml)를 처리하여 자극하고, 37℃의 온도조건을 유지하며, CO2 배양기에서 72시간동안 배양하였다. 세포 회수 18시간 전에 [3H]thymidine을 처리하고, 72시간 배양 후, 상기 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포에 beta-counting을 통해 방사능 수치를 얻어, 세포 증가(cell proliferation)을 확인하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, CD 137와 TLR-2를 동시에 자극하는 경우, 세포증식 즉, 세포수의 증가가 일어나는 것으로 확인되었다. 상기, CD 137와 TLR-2를 동시에 자극한 경우, 세포 자극의 상승효과는 CD 137와 TLR-2의 신호전달에 의존적이나, 일반적으로 CD8 T 세포반응을 매개하는 IFN-γ에 의한 신호전달과는 무관한 것으로 확인되었다.
실시예 3-6. CD137 및 TLR-2의 동시자극에 의한 상승효과의 확인
실시예 1에서 배양한 마우스의 발바닥에 2x104 CFU의 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 주사하고, 항 CD137 단클론 항체(anti-4-1-BB mAb(3E1)를 복강주사하였다. 복강 주사 후, 5일 또는 7일 째에 상기와 같은 방법으로 비장을 분리하고, 분리한 비장을 갈아서 적혈구를 제거한 후, 전체 면역세포수를 측정하였다. 그 후, 항 CD8 단클론 항체(anti-CD8 mAb)를 이용하여 염색한 후, 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석하였다. CD8 T 세포의 수는 비장에 존재하는 전체 면역세포 수에 상기 유세포분석기를 이용하여 분석된 CD8 T 세포의 %를 곱하여 계산하여 CD8 T 세포 수의 증가여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 5일 또는 7일이 경과한 시점에서 CD 4 T 세포와 달리 CD8 T 세포는 T 세포 자극원 즉, TLR-2에 대한 리간드와 CD 137에 대한 자극원(ligand)를 함께 자극하는 경우 CD8 T 세포의 수가 현저하게 증가하는 것으로 확인되어, 그 상승효과를 확인할 수 있었다.
실시예 3-7. CD137 및 TLR-2의 동시자극에 의한 비장에서의 세포수 증가여부의 확인
실시예 1에서 배양한 마우스의 발바닥에 2x104 CFU의 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 주사하고, 항 CD137 단클론 항체(anti-4-1-BB mAb(3E1)를 복강주사하였다. 복강 주사 후, 5일 또는 7일 째에 상기와 같은 방법으로 비장을 분리하고, 분리한 비장을 갈아서 적혈구를 제거한 후, 전체 면역세포수를 측정하였다. 그 후, 항 CD8 단클론 항체-FITC(anti-CD8 mAb-FITC)를 이용하 여 염색한 후, 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석하였다. CD8 T 세포의 수는 비장에 존재하는 전체 면역세포 수에 상기 유세포분석기를 이용하여 분석된 CD8 T 세포의 %를 곱하여 계산하여 CD8 T 세포 수의 증가여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 또한, 상기 분리된 신장을 촬영하고, 상기 신장의 무게를 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 5일 또는 7일이 경과한 시점에서 CD 4 T 세포와 달리 CD8 T 세포는 T 세포 자극원 즉, TLR-2에 대한 리간드와 CD 137에 대한 자극원(ligand)를 함께 자극하는 경우 CD8 T 세포의 수가 현저하게 증가하는 것으로 확인되어, 그 상승효과를 확인할 수 있었다.
상기 도 8a에 나타낸 바와 같이, 5일이 경과한 시점에서, 리스테리아 모노사이토게네스만을 주사한 비장의 무게는 240 mg이었고, 항 CD137 단클론 항체만을 주사한 비장의 무게는 80 mg이며, 리스테리아 모노사이토게네스와 항 CD137 단클론 항체를 함께 투여한 비장의 무게는 360 mg이었다. 또한, 상기 도 8b에 나타낸 바와 같이, 7일이 경과한 시점에서, 리스테리아 모노사이토게네스만을 주사한 비장의 무게는 290 mg이었고, 항 CD137 단클론 항체만을 주사한 비장의 무게는 100 mg이며, 리스테리아 모노사이토게네스와 항 CD137 단클론 항체를 함께 투여한 비장의 무게는 380 mg이었다. 상기 결과로부터, CD8 T 세포는 TLR-2와 CD 137를 함께 자극하는 경우, 비장의 크기가 하는 것으로 확인되어, 상기에서 확인된 면역세포, 즉CD8 T 세포의 수가 현저하게 증가된다는 것이 거듭 확인되었다.
실시예 3-8. CD137 및 TLR-2의 동시자극에 의한 림프절에서의 세포수 증가여부의 확인
상기 실시예 3-7의 리스테리아 모노사이토게네스(2.5×108 CFU/ml)를 80℃로 30분간 중탕하여 사멸시킴으로써 시료(HKLM, Heat-killed Listeria monocytogenes)를 제조하였다. 상기 실시예 1에서 배양한 마우스의 발바닥에 각 농도별로 상기 시료 HKLM을 주사하고, 항 CD137 단클론 항체(anti-4-1-BB mAb(3E1) 100μg를 복강주사하였다. 복강 주사 후, 5일 또는 7일 째에 상기와 같은 방법으로 오금 림프절(popliteal lymph node)을 분리하고, 분리한 비장을 갈아서 적혈구를 제거한 후, 전체 면역세포수를 측정하였다. 그 후, 항 CD8 단클론 항체-FITC(anti-CD8 mAb-FITC)를 이용하여 염색한 후, 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석하였다. CD8 T 세포의 수는 오금 림프절에 존재하는 전체 면역세포 수에 상기 유세포분석기를 이용하여 분석된 CD8 T 세포의 %를 곱하여 계산하여 CD8 T 세포 수의 증가여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 5일이 경과한 시점에서는 약간의 차이가 있었으나, 7일이 경과한 시점에서 CD8 T 세포는 T 세포 자극원 즉, TLR-2에 대한 리간드와 CD 137에 대한 자극원(ligand)를 함께 자극하는 경우 CD8 T 세포의 수가 현저하게 증가하는 것으로 확인되어, 그 상승효과를 확인할 수 있었다.
실시예 3-9. 자극원 및 수용체유무에 따른 세포수 증가여부의 확인
상기 실시예 1의 마우스와 CD137 knock-out mouse에 실시예 3-8의 스테필로코커스 아우레우스 지질타이코산(S.LTA, Staphylococcus aureus lipoteichoic aicd)와 락토바실러스 지질타이코산(L.LTA, Lactobacillus lipoteichoic aicd)를 처리한 후, 상기와 같은 방법으로 CD8 T 세포 수의 증가여부를 확인하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
상기 도 10a 내지 10c에 나타낸 바와 같이, CD8 T 세포는 TLR-2와 CD 137을 동시에 자극하는 경우, CD8 T 세포의 세포수도 증가하고, 사이토카인(cytokine)인 IFNg의 분비량도 증가되는 것으로 확인되었다. 한편, 도 10d 및 도 10e에 나타낸 바와 같이, CD137 knock-out mouse를 이용하여 측정한 실험에서는 이러한 상승효과가 나타나지 아니하여, 이러한 상승효과는 CD137에 의한 것임이 확이되었다. 또한, 장내 정상균총인 락토바실러스를 이용하여 자극한 경우에는 상승효과가 나타나지 아니하였으나, 위해 병원성균주인 스테필로코커스 아우레우스를 이용하여 자극한 경우에 상승효과가 나타나, 상기 상승효과에는 TLR-2도 중요한 영향을 미치는 것이 확인되었다.
실시예 3-10. CD137 및 TLR-2의 동시자극에 의한 림프절에서의 세포수 증가여부의 확인
상기와 같이, 실험동물로부터 CD8 T 세포를 분리하고, CD3에 대한 anti-CD3 mAb, anti-CD 137 mAb(3E1) 및 TLR-2의 리간드인 Pam(2μg/ml)을 처리하여 자 극하고, 37℃의 온도조건을 유지하며, CO2 배양기에서 72시간동안 배양하였다. 상기 세포를 회수하여, 70% 에탄올로 처리한 후, PI staining을 수행하고, 유세포분석기를 이용하여 세포주기(cell cycle)을 분석하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
상기 도 11에 나타낸 바와 같이, 분리된 CD 8 T세포에 TLR-2에 대한 자극원과 CD 137에 대한 자극원을 함께 자극하는 경우, CD8 T 세포는 세포주기 중 S기와 G2M기가 증가함이 나타나, 세포증식효과가 있음이 확인되었다. 반면, 단순히 T세포를 자극하거나, TLR-2에 대한 자극원으로 자극하는 경우는 TLR-2에 대한 자극원과 CD 137에 대한 자극원을 함께 자극하는 경우에 비하여 세포주기를 기초로 판단할 때, 세포증식효과가 높지 않음이 확인되었다.
실시예 3-11. CD137 및 TLR-2의 동시자극에 의한 암치료 효과의 확인
상기 실시예 1의 실험동물에 쥐의 신장암 세포주인 RENCA(9.2×105 / mouse) 세포를 Balb/c 마우스의 피하에 주사하여 종양을 유발시키고, 상기 실시예3-9의 HKLM 200μl(5×107particle/ mouse)를 종양유발일로부터 3일 또는 7일 경과한 시점에 정맥으로 주사하였다. 또한, anti-CD 137 mAb(3E1, 100μg/mouse)를 7일, 10일 및 17일이 경과한 시점에 복강주사하였다. 상기 종양 유발일로부터, 2 내지 3일 간격으로 종양의 크기를 측정하였다. 상기 종양의 크기는 측정한 크기의 가로×세로×높이×0.52333의 값으로 측정하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었 다.
상기 도 12a에 나타낸 바와 같이, RENCA만 주사한 경우, 7마리 중 한 마리는 자연 치유되었으나, 나머지 6마리는 모두 종양이 자라나, 14%의 치유율을 보였고, 상기 도 12b에 나타낸 바와 같이, RENCA만 주사 후, HKLM을 추가로 주사한 경우, 10마리중 5마리가 치유되어, 50%의 치유율을 나타내었다. TLR-2에 대한 자극원과 CD 137에 대한 자극원을 함께 자극한 경우인, RENCA만 주사 후, HKLM와 anti-CD 137 mAb를 함께 주사한 경우, 10마리중 8마리가 치유되어, 80%의 치유율을 나타냄으로써, 현저하게 상승된 암치료효과가 있는 것으로 확인되었다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, TLR-2 수용체가 발현되는 것을 확인한 그래프로, 보다 구체적으로는 CD8 T 세포에 T 세포 공동자극원(CD3) 또는 T 세포 공동자극원과 CD137을 공동으로 자극한 경우, TLR-2의 발현량 증가를 확인한 그래프에 관한 것이다. 상기 도 1에서 대조군은 control isotype mAb로 염색한 결과이고, 상기 그래프에서 오른쪽으로 그래프가 이동한 것은 TLR-2의 발현량이 증가한 것을 의미하는 것으로, %는 TLR-2의 발현량 증가를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD137 수용체가 발현되는 것을 확인한 그래프로, 보다 구체적으로는 CD8 T 세포에 T 세포 공동자극원(CD3) 또는 T 세포 공동자극원과 TLR-2 리간드(Pam)로 공동으로 자극한 경우, CD137의 발현량 증가를 확인한 그래프에 관한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD8 T 세포의 세포 분열 즉, 세포 증식의 정도가 증가하는 것을 확인한 그래프에 관한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD 8 T 세포 증식 및 세포 활성화가 현저하게 상승된다는 것을 나타낸 그래프에 관한 것으로, 상기 도 4a는 CD8 T 세포에 CD 137 및/또는 TLR-2를 자극한 경우, 세포 수의 증가여부를 나타낸 그래프이고, 상기 도 4b는 CD8 T 세포에 CD 137 및/또는 TLR-2를 자극한 경우, IL-2 및 IFN-g의 분비의 증가여부를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 T 세포 자극 물질, 구체적으로 CD137 수용체와 이를 제외한 T 세포 공동자극 분자를 이용하여 자극하는 경우, 세포증식에 있어서 상승효과가 있는지 여부를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD8 T 세포의 세포수가 증가하는 것과 관련된 신호전달경로(signaling 또는 mechanism)을 확인하기 위하여, 다양한 수용체가 결핍된 knock-out mouse를 실험동물로 실험한 결과를 나타낸 그래프에 관한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD4 T 세포와 달리 CD8 T 세포의 세포수증가와 관련하여 상승효과가 있다는 것을 확인하기 위하여, 실험동물에 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)와 항 CD137 단클론 항체를 주사하고, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 수를 확인한 그래프에 관한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD8 T 세포가 증가한다는 것을 확인하기 위하여 신장의 크기를 비교한 사진이다. 상기 도 8a의 사진은 복강 주사 후, 5일이 경과된 시점에서 실험을 수행한 실험동물의 비장이고, 상기 도 8b의 사진은 복 강 주사 후, 7일이 경과된 시점에서 실험을 수행한 실험동물의 비장이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD8 T 세포가 증가한다는 것을 확인하기 위하여 리스테리아 모노사이토게네스를 사멸시킨 시료와 항 CD137 단클론 항체를 이용하여 림프절의 면역세포 수의 증가여부를 나타낸 그래프에 관한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, 위해 병원성균총인 스테필로코커스 아우레우스의 지질타이코산와 정상균총인 락토바실러스의 지질타이코산을 처리한 후, CD8 T 세포의 증가여부 및 사이토카인 발현량의 증가여부를 확인한 그래프에 관한 것이다. 상기 도 10a 및 10b는 각 균총에 따른 세포수의 증가를 나타낸 그래프이고, 상기 10c는 사이토카인의 증가여부를 확인한 그래프이며, 도 10d 및 도 10e는 CD137 knock-out mouse를 이용하여 측정한 실험결과에 관한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및 CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우, CD8 T 세포가 증가한다는 것을 확인하기 위하여 자극원의 종류를 달리하여, 세포주기(cell cycle)을 분석한 그래프에 관한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, TLR-2 수용체 자극 물질 및CD137 수용체 자극 물질을 이용하여 자극하는 경우 암세포의 크기가 줄어드는 것을 확인한 그래프에 관한 것이다

Claims (15)

  1. 개체의 생물학적 시료로부터 CD8 T 세포를 분리하는 단계; 및 상기 CD8 T 세포를 CD137 수용체 자극 물질 및 TLR-2 수용체 자극 물질이 첨가된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CD137 수용체 자극 물질은 항 CD137 수용체 단클론 항체, 항 CD137 수용체 리간드 및 항 CD137 수용체 리간드 융합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TLR-2 수용체 자극 물질은 열처리된 균주, Pam(lipoprptidePam3CysSK4) 및 MALT-2로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 생물학적 시료가 혈액, 혈장, 림프절, 비장, 흉선 또는 골수인 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배지는 상기 CD8 T 세포 항원 또는 CD3 자극 물질을 추가로 포함하는 것인 CD8 T 세포를 활성화시키는 방법.
  6. 제1항의 방법으로 활성화된 CD8 T 세포를 포함하고, 다른 어떠한 항원도 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 암, 세포내 기생세균 감염 질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 질병은 암 또는 리스테리아 감염증인 질병의 치료 또는 예방용 조성물.
  8. CD8 T 세포의 CD137 수용체 자극 물질 및 CD8 T 세포의 TLR-2 수용체 자극 물질을 포함하는 CD8 T 세포 활성 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 CD137 수용체 자극 물질은 항 CD137 수용체 단클론 항체, 항 CD137 수용체 리간드 및 항 CD137 수용체 리간드 융합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 CD8 T 세포 활성 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 TLR-2 수용체 자극 물질은 Pam(lipopeptidePam3CysSK4), lipoteichoic acid, peptidogycan, atypical LPS, OspA, Porin, LcrV, Lipomannan, GPI anchor, Lysophosphatidylserine, Lipophosphoglycan(LPG), Glycophosphatidylinositol(GPI), Zymosan,Hemagglutinni, 열처리된 그람 양성 세균(Gram-positive bacteria), 열처리된 그람 음성 세균(Gram-negative bacteria) 또는 열처리된 바이러스, MALP-2, MALP-404 및 MALT-2로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 CD8 T 세포 활성 조성물.
  11. 제8항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 암, 세포내 기생세균 감염질환, 바이러스 감염질환 및 곰팡이 감염질환으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 질병은 암 또는 리스테리아 감염증인 질병의 치료 또는 예방용 조성물.
  13. CD8 T 세포에 후보 물질을 투여하는 단계; 및
    상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체를 모두 자극할 수 있는지 여부를 확인하는 단계
    를 포함하는
    암, 세포내 기생세균 감염증, 바이러스 감염증 및 곰팡이 감염증으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체를 모두 자극할 수 있는지 여부를 확인하는 단계는 상기 CD8 T 세포에 CD137 수용체의 발현량이 증가되었는지 여부, TLR-2 수용체의 발현량이 증가되었는지 여부 및 CD8 T 세포의 수가 증가하였는지 여부를 확인하는 방법으로 수행하는 것인 암, 세포내 기생세균 감염증, 바이러스 감염증 및 곰팡이 감염증으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 질병의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법.
  15. 암 세포주를 처리한 실험동물에 후보 물질을 투여하는 단계;
    상기 실험동물로부터 CD8 T 세포를 분리하고, 상기 분리된 CD8 T 세포의 CD137 수용체 및 TLR-2 수용체의 발현량이 증가하였는지 여부를 확인하는 단계;
    상기 실험동물의 CD8 T 세포의 수가 증가하였는지 여부를 확인하는 단계; 및
    상기 실험동물의 암 세포 수가 감소하였는지 여부를 확인하는 단계
    를 포함하는
    암의 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법.
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