WO2015137724A1 - 자가암항원 특이적 cd8+ t 세포의 분리 및 증식방법 - Google Patents

자가암항원 특이적 cd8+ t 세포의 분리 및 증식방법 Download PDF

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김영우
김영호
박병규
박상윤
박상재
엄현석
오호식
유헌
이돈길
이승훈
이영주
이진수
최범규
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Definitions

  • the present invention relates to a method for the isolation and proliferation of autologous cancer antigen specific CD8 + T cells, and more particularly, to select and select epitopes recognized by CD8 + T cells from autologous antigens present in the blood of individual cancer patients.
  • the present invention relates to a method for isolating CD8 + T cells specific for autocancer antigens using peptides of epitopes, and a method for mass proliferation of CD8 + T cells using the same.
  • CD8 + T cells have relatively simple functions compared to other cells such as dendritic cells, CD4 + T, and NK cells, there are fewer chances of unexpected side effects in anticancer immunotherapy.
  • MHC class I / peptide multimers are used to isolate antigen-specific CD8 + T cells.However, in this method, apoptosis is high due to apoptosis after cell separation, thereby producing a sufficient amount of antigen-specific CD8 + T cells. There was a disadvantage of having to culture for a long time. Therefore, a surrogate marker capable of separating antigen-specific CD8 + T cells by replacing MHC multimers that stimulate T cell receptors (TCR) is needed. (CD137) has been studied.
  • 4-1BB is expressed in activated T cells as inducible co-stimulatory molecules, and in particular enhances the activity of CD8 + T cells, as well as anti-apoptotic molecules such as Bcl-2, Bcl-XL, Bfl-1, etc. It is well known to increase the expression of anti-apoptotic molecules, thereby inhibiting activation-induced cell death (AICD).
  • the characteristics of the 4-1BB stimulus are suitable for cancer treatment, and based on this, the effect of cancer treatment with anti-4-1BB mAb was verified using an animal model.
  • an object of the present invention is to isolate and proliferate autologous antigen-specific CD8 + T cells capable of selectively isolating and mass culturing CD8 + T cells specific for autologous antigens present in an extremely low rate in the body within 31 days. To provide.
  • the present invention comprises the steps of: a) screening auto-antigen CD8 + T cell epitopes present in the blood of cancer patients; b) culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from the blood of cancer patients in medium with peptides of said epitope and IL-2; c) inducing 4-1BB expression by adding the same peptide to the cultured cells as in step b); And d) culturing the 4-1BB expression-induced cells in a culture plate coated with an anti-4-1BB antibody, and then removing the non-attached cells of the autologous antigen-specific CD8 + T cells.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the self-cancer antigen of step a) may be selected from the group consisting of hTERT, WT1, NY-ESO1 and MAGE-A3.
  • the epitope in step b) may be a peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 15.
  • step c) the expression induction of step c) is characterized in that the culture for 12 to 36 hours.
  • the culturing of step d) may be performed for 1 to 20 minutes.
  • the present invention is cultured after suspending the isolated autoantigen specific CD8 + T cells and irradiated allogeneic PBMC with a medium containing IL-2, anti-CD3 antibody and autologous plasma. It provides a method for mass culturing auto-cancer antigen-specific CD8 + T cells, including injecting into a bag, and incubating the medium further.
  • the PBMC may be isolated from the normal donor.
  • the culture may be performed for 4 to 15 days.
  • CD8 + T cells specific for autologous cancer antigens can be isolated using peptides of autologous cancer antigen CD8 T cell epitopes present in the blood of individual cancer patients other than foreign antigens. Therefore, the use of T cells recognizing autologous antigens present in an extremely low rate in a normal person separated by the method of the present invention can effectively select and remove cancer cells derived from the cells of cancer patients themselves.
  • FIG. 1 is a view illustrating a selective isolation and mass culture process of autologous cancer antigen specific CD8 + T cells according to the present invention.
  • FIG. 2 is a process flow diagram of an epitope screening process according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of hTERT epitope screening using PBMC obtained from a healthy doner.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of WT1 epitope screening using PBMC obtained from a normal person.
  • 5 to 7 show hTERT epitope screening results using PBMCs obtained from gastric cancer, lung cancer and pancreatic cancer patients, respectively.
  • 15 is a diagram illustrating a pilot production process of a WT1 T cell therapeutic agent.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating a pilot production process of NY-ES01 T cell therapeutic agent.
  • 17 is a diagram illustrating a pilot production process of a MAGE-A3 T cell therapeutic agent.
  • cancer cells are derived from the cells constituting our body, selective removal and mass culturing of self tumor Ag-specific CD8 + T cells overexpressed in cancer cells are required to selectively remove cancer cells.
  • T cells that recognize autologous cancer antigens are not only present in very low proportions in normal individuals, but also in a state in which activity is inhibited by immune tolerance. Therefore, a standardized process for selectively separating and culturing auto-cancer antigen specific CD8 + T cells from cancer patients has not been developed yet.
  • the present inventors have selectively separated autologous antigen specific CD8 + T cells, such as hTERT, WT1, NY-ESO1, and MAGE-A3, which are present in the body at an extremely low rate by using an anti- 4-1BB antibody.
  • CD8 + T cells such as hTERT, WT1, NY-ESO1, and MAGE-A3
  • the present invention provides a method for separating autologous antigen specific CD8 + T cells.
  • the method for separating autologous cancer-specific CD8 + T cells of the present invention comprises the steps of: a) selecting autologous antigenic CD8 + T cell epitopes present in the blood of cancer patients; b) culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from the blood of cancer patients in medium with peptides of said epitope and IL-2; c) inducing 4-1BB expression by adding the same peptide to the cultured cells as in step b); And d) culturing the cells induced with 4-1BB expression in a culture plate coated with an anti-4-1BB antibody and then removing the unattached cells.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the self-cancer antigen of step a) may be any cancer antigen present in the cancer patient's own body, and an appropriate auto-cancer antigen may be selected and used according to the carcinoma.
  • an appropriate auto-cancer antigen may be selected and used according to the carcinoma.
  • hTERT GenBank: BAC11010.1
  • WT1 GenBank: AAO61088.1
  • NY-ESO1 GenBank: CAA05908.1
  • MAGE-A3 NCBI Reference Sequence: NP_005353.1
  • the hTERT is an enzyme that synthesizes telomeric DNA at the end of a chromosome, and cancer cells function excessively by activating this enzyme to avoid telomere-dependent cell death and target various solid cancers including lung cancer, gastric cancer and pancreatic cancer. It is known as an antigen (Kim NW, et al. Science . 1994; 266: 2011-2015), and WT1 is a gene associated with Wilms tumor, which encodes a zinc finger transcription factor to prevent cell proliferation, differentiation, apoptosis, and organ development. As a protein involved, it is known as a target antigen of cerebrospinal cancer, lung cancer, etc. (Call KM, et al., Cell . 1990.
  • the NY-ESO1 is one of the proteins belonging to cancer testis antigen (CTA), and is well known to express various cancer cells including germ cells, sarcoma, and breast cancer, but what functions do they have in these cells? Not well known (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res . 2006; 95: 1-30).
  • CTA cancer testis antigen
  • MAGE-A3 is a protein belonging to the melanoma-associated antigen family, it is not known what function it performs in normal cells. However, MAGE-A3 is known to overexpress various cancer cells including lung cancer, sarcoma, and melanoma. It has been evaluated as a target antigen (Decoster L, et al., Ann Oncol . 2012 Jun; 23 (6): 1387-93).
  • the epitope in step b) is characterized in that the peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 15.
  • the medium of step b) is characterized in that the medium containing autologous plasma, and the culture of step b) is characterized in that it is carried out for 12 to 16 days.
  • step c) the expression induction of step c) is characterized in that the culture for 12 to 36 hours, the culture of step d) is characterized in that it is carried out for 1 to 20 minutes.
  • the present invention was suspended in a medium containing IL-2, anti-CD3 antibody and autologous plasma of autologous antigen-specific CD8 + T cells and irradiated allogeneic PBMCs isolated by the above-described separation method It is then injected into the culture bag, and provides a method for mass culture of autologous antigen-specific CD8 + T cells comprising the additional culture of the medium.
  • the PBMC is characterized in that it is separated from the normal donor, the culture is characterized in that it is performed for 4 to 15 days.
  • the medium may be additionally injected on the 4th, 7th, 9th, 11th and 14th days of culture while the culture is performed.
  • the present invention selectively propagates and isolates autologous cancer antigen specific CD8 T cells using peptides.
  • Epitopes of autologous cancer antigens recognized by CD8 T cells are different depending on HLA-A type and condition of each patient. Therefore, epitope screening is used to detect autologous antigen CD8 T cell epitope present in the blood of individual cancer patients. Three to four kinds of peptides for the production of T cell therapeutics were selected.
  • autologous antigen-specific CD8 T cells are present in 0.1% or less in blood, they are specific for peptides derived from autologous antigens by incubating for 14 days with 3-4 kinds of peptides for production and IL-2 in PBMCs isolated from blood. Induces proliferation of CD8 T cells. All cells are harvested on day 14 of culture and reactivated with the same peptides for 24 hours to induce peptide-specific CD8 T cells to simultaneously express 4-1BB.
  • the cells reactivated with peptides are cultured on an anti-4-1BB antibody-coated culture plate and incubated for 10 minutes to attach 4-1BB-expressing CD8 T cells, and all unsolicited cells are washed out. Thereafter, the medium containing IL-2 is added to incubate for two days so that the isolated T cells fall into the culture plate with proliferation.
  • CD8 T cells 5 ⁇ 10 5 cells isolated in a 1L culture bag, irradiated allogeneic PBMCs 1 ⁇ 10 8 cells, 1000U / ml IL-2, 40ng anti-CD3 mAb Medium is added daily to mass cultivate the cells at a level of ⁇ 10 9 cells / L and propagate to levels that can be administered to cancer patients.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • CTL medium RPMI1640 medium + 4 mM
  • Incubation in a CO 2 incubator was performed by analyzing algorithms and adding peptides of each epitope selected to each tube at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • 1 ml of CTL medium containing 50 U / ml IL-2 was added to each tube.
  • CTL medium containing 50 U / ml IL-2 was added.
  • the cells were washed three times by adding RPMI1640 medium to each tube and centrifuging at 1400 rpm for 5 minutes.
  • FIG. 2 is a process flow diagram of an epitope screening process according to the present invention.
  • Anti-CD8-PE-Cy5, anti-4-1BB-PE used in the experiment was purchased from eBioscience (San Diego, Calif.).
  • RPMI1640, L-glutamine, HEPES, 2-mercaptoethanol were purchased from Invitrogen, San Diego, Calif.
  • hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1) are used for anticancer immunotherapy in various ways. Representative auto-cancer antigens are being selected for carcinomas applicable to these four cancer antigens are summarized in Table 1 below.
  • CD8 T cell epitopes The amino acid sequences of selected autologous antigens were analyzed by algorithms to determine the amino acid sequences presumed to be CD8 T cell epitopes (CTLPred: http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/, NetCTL: http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/, SYFPEITHI: http://www.syfpeithi.de/) to chemically synthesize peptides on selected epitopes (Peptron Inc; www.peptron.com) Used for epitope screening.
  • CD8 T cell epitopes selected from each autologous antigen are shown in Tables 2 to 5 below.
  • FIG. Epitope screening as described above was performed.
  • hTERT epitope screening was mainly for gastric, lung and pancreatic cancer
  • WT1 epitope screening was for cerebrospinal and lung cancer
  • NY-ESO1 epitope screening for ovarian and sarcoma
  • MAGE-A3 epitope screening for sarcoma and lung cancer was performed.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of hTERT epitope screening using PBMC obtained from a healthy doner.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of WT1 epitope screening using PBMC obtained from a normal person.
  • CD8 T cell epitopes of hTERT and WT1 failed to induce T cell responses from PBMCs isolated from normal human blood. Therefore, it was confirmed that the selected epitopes of the present invention were not recognized by T cells of normal persons.
  • 5 to 7 show hTERT epitope screening results using PBMCs obtained from gastric cancer, lung cancer and pancreatic cancer patients, respectively.
  • Table 7 shows the results of analyzing hTERT epitope screening using PBMC obtained from gastric cancer patients.
  • Table 8 below shows the results of hTERT epitope screening using PBMC obtained from lung cancer patients.
  • Table 9 shows the results of analyzing hTERT epitope screening using PBMC obtained from pancreatic cancer patients.
  • Table 10 shows the results of analyzing WT1 epitope screening using PBMC obtained from patients with brain tumors.
  • Table 11 shows the results of analyzing WT1 epitope screening using PBMC obtained from lung cancer patients.
  • Table 12 shows the analysis of NY-ESO1 epitope screening using PBMC obtained from ovarian cancer patients.
  • Table 13 shows the results of analyzing WT1 epitope screening using PBMC obtained from sarcoma patients.
  • Table 14 below shows the results of MAGE-A3 epitope screening using PBMC obtained from sarcoma patients.
  • Table 15 below shows the results of MAGE-A3 epitope screening using PBMC obtained from lung cancer patients.
  • Selected peptides include hTERT peptides: CLKELVARV (SEQ ID NO: 1), PLFLELL (SEQ ID NO: 2), AAVTPAA (SEQ ID NO: 3); WT1 peptides: SLGEQQVSV (SEQ ID NO: 4), RMFPNAPVL (SEQ ID NO: 5), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 6), VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 7); NY-ESO1 peptide: SISSCLQQL (SEQ ID NO: 8), RLLEFYLAM (SEQ ID NO: 9), GVLLKEFTV (SEQ ID NO: 10), ILTIRLTAA (SEQ ID NO: 11); And MAGE-A3 peptide: LLIIVLAII (SEQ ID NO: 12), KIWEELSVL (SEQ ID NO: 13), LVFGIELMEV (SEQ ID NO: 14), SLPTTMNYPL (SEQ ID NO: 15).
  • Epitope screening selects 3-4 epitope peptides for each autologous antigen suitable for T cell therapeutic preparation, and then uses these peptides for hTERT, WT1, NY-ESO1, and MAGE-A3 specific T cells. Trial production of therapeutics was performed. Production of T cell therapy consists of three stages of primary proliferation, isolation, and mass culture of autologous anticancer T cells.
  • 50 ml blood was isolated from cancer patients whose epitope screening confirmed the presence of at least one epitope with score 3 or greater.
  • PBMC Separation from Patient's Blood 7 ml of blood was slowly flowed into a 15 ml cornical tube filled with 7 ml Ficoll-hypaque and overlayed on top of the Ficoll solution. The tube was centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes, and only white cell layers located between Ficoll and plasma were collected and washed and used as PBMC.
  • the isolated PBMC is suspended in CTL medium (RPMI1640 medium + 4 mM L-glutamine + 12.5 mM HEPES + 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol + 3% autoplasma) at 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and in the present invention through epitope screening Selected 3-4 peptides were added at a concentration of 1 ⁇ g / ml each. These cell suspensions were dispensed in 1 ml aliquots into 14 ml round tubes and incubated in a CO 2 incubator.
  • CTL medium RPMI1640 medium + 4 mM L-glutamine + 12.5 mM HEPES + 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol + 3% autoplasma
  • the washed cells were suspended in CTL medium at a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml, and then cultured by adding each of the same 3-4 peptides at a concentration of 5 ⁇ g / ml.
  • PBMCs were collected and washed twice with RPMI1640 medium, then suspended in CTL medium at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / ml and 50 U / ml IL-2 was added. .
  • PBMCs Isolate PBMCs from normal donors, suspend them at 1 ⁇ 10 8 cells / ml, irradiate at 3000 rad to induce cell death, and provide costimulation for inducing proliferation of T cells. Can be used as a culture additive.
  • FIG. 14 shows three types of hTERT peptides [CLKELVARV (SEQ ID NO: 1), PLFLELL (SEQ ID NO: 2), AAVTPAA (SEQ ID NO: 3)] by separating PBMC from 50 cc blood of gastric cancer patients with HLA-A * 24 allele. Each was added at a concentration of 1 ⁇ g / ml, followed by culture according to the procedure described in “(1) Proliferation of (1) Autologous Cancer Antigen-Specific CD8 T Cells” of Example 3. On the 14th day of culture, all cells were harvested and T cells proliferated in response to hTERT peptide were isolated / proliferated according to “(2) Screening of autologous cancer antigen specific CD8 T cells”.
  • the isolated T cells were cultured at a level that can be administered to cancer patients through the “(3) mass culture of autocancerous antigen specific CD8 T cells” process, and the final cultured cells had a specific TCRVb type with low aging and function. Flow cytometry was determined to be T cells.
  • 15 is a diagram illustrating a pilot production process of a WT1 T cell therapeutic agent.
  • FIG. 15 shows four types of WT1 peptide [SLGEQQVSV (SEQ ID NO: 4), RMFPNAPVL (SEQ ID NO: 5), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 6) by separating PBMC from 50 cc blood of malignant glioma patients with HLA-A * 02 allele. , VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 7)] was added at a concentration of 1 ⁇ g / ml, and then cultured according to the procedure described in “(1) Proliferation of (1) Autologous Antigen Specific CD8 T Cells”.
  • T cells proliferated in response to WT1 peptide were isolated / proliferated according to “(2) Screening of autologous antigen-specific CD8 T cells”.
  • the isolated T cells were cultured at a level that can be administered to cancer patients through the “(3) mass culture of autocancerous antigen specific CD8 T cells” process, and the final cultured cells had a specific TCRVb type with low aging and function. Flow cytometry was determined to be T cells.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating a pilot production process of NY-ES01 T cell therapeutic agent.
  • FIG. 16 shows four types of NY-ESO1 peptide [SISSCLQQL (SEQ ID NO: 8), RLLEFYLAM (SEQ ID NO: 9), GVLLKEFTV (SEQ ID NO: 10), isolated from 50 cc blood of ovarian cancer patients with HLA-A * 02 allele. ), ILTIRLTAA (SEQ ID NO: 11)] were each added at a concentration of 1 ⁇ g / ml, and then cultured according to the procedure described in “(1) Proliferation of (1) Autologous Antigen Specific CD8 T Cells”.
  • T cells proliferated in response to NY-ESO-1 peptide were isolated / proliferated according to “(2) Selection of autologous cancer antigen specific CD8 T cells”.
  • the isolated T cells were cultured at a level that can be administered to cancer patients through the “(3) mass culture of autocancerous antigen specific CD8 T cells” process, and the final cultured cells had a specific TCRVb type with low aging and function. Flow cytometry was determined to be T cells.
  • 17 is a diagram illustrating a pilot production process of a MAGE-A3 T cell therapeutic agent.
  • FIG. 17 shows four types of MAGE-A3 peptide [LLIIVLAII (SEQ ID NO: 12), KIWEELSVL (SEQ ID NO: 13), LVFGIELMEV (SEQ ID NO: 14), isolated from PBMC from 50cc blood of a sarcoma patient with HLA-A * 02 allele.
  • SLPTTMNYPL SEQ ID NO: 15
  • T cells proliferated in response to MAGE-A3 peptide were isolated / proliferated according to “(2) Screening of autologous cancer antigen specific CD8 T cells”.
  • the isolated T cells were cultured at a level that can be administered to cancer patients through the “(3) mass culture of autocancerous antigen specific CD8 T cells” process, and the final cultured cells had a specific TCRVb type with low aging and function. Flow cytometry was determined to be T cells.

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Abstract

본 발명은 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식방법에 관한 것으로, 상세하게는 암 환자 개개인의 혈액 내에 존재하는 자가암항원으로부터 CD8+ T 세포에 의해 인식되는 에피토프를 선별하고 선별된 에피토프의 펩티드를 이용하여 자가암항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 분리하는 방법, 및 이를 이용한 CD8+ T 세포의 대량증식방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 외래항원이 아닌 암 환자의 개개인의 혈액에 존재하는 자가암항원 CD8 T 세포 에피토프의 펩티드를 이용하여 자가암항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 분리할 수 있다. 따라서 자가암항원을 인식하는 T 세포를 이용하면 암 환자 자신의 세포로부터 유래된 암세포를 효과적으로 선택하여 제거할 수 있으므로, 암 질환의 치료 및 개선에 부작용 없이 응용될 수 있다.

Description

자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식방법
본 발명은 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식방법에 관한 것으로, 상세하게는 암 환자 개개인의 혈액 내에 존재하는 자가암항원으로부터 CD8+ T 세포에 의해 인식되는 에피토프를 선별하고 선별된 에피토프의 펩티드를 이용하여 자가암항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 분리하는 방법, 및 이를 이용한 CD8+ T 세포의 대량증식방법에 관한 것이다.
CD8+ T 세포는 수지상세포, CD4+ T, NK 세포와 같은 다른 세포들에 비해 비교적 단순한 기능을 가지고 있기 때문에, 항암 면역치료시 기대하지 않았던 부작용이 나타날 가능성이 적다. 일반적으로 MHC class I/peptide multimer를 이용하여 항원 특이적인 CD8+ T 세포를 분리하지만, 이 방법의 경우 세포 분리 후 세포자살에 의한 사멸율이 높아 충분한 양의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 생산하기 위해 장기간 배양을 해야 하는 단점이 있었다. 따라서 TCR(T cell receptor)을 자극하는 MHC multimer를 대체하여 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리할 수 있는 서로게이트 마커(surrogate marker)가 필요하고, 이에 본 발명자는 오랫동안 면역조절 단백질인 4-1BB (CD137)과 관련된 연구를 진행해왔다.
4-1BB는 유도성 공동자극 분자로 활성화된 T 세포에서 발현되며, 특히 CD8+ T 세포의 활성을 증진시킬 뿐 아니라, Bcl-2, Bcl-XL, Bfl-1 등과 같은 항-세포사멸 분자(anti-apoptotic molecules)의 발현을 증가시켜, 활성 후 세포사멸(AICD; activation-induced cell death)을 억제하는 기능을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 4-1BB 자극의 특성들은 암 치료에 적합한 특성들이며, 이를 기반으로 항-4-1BB mAb를 이용한 암 치료 효과에 대해 동물모델을 이용하여 검증하였다. 이에 본 발명자는 이전 연구에서 항원 특이적으로 활성화된 CD8+ T 세포의 4-1BB의 발현을 이용하여 항-4-1BB 항체를 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식 방법을 확립하였으나 (대한민국 등록특허 제10-0882445호), 항체의 경우 in vitro 및 in vivo 반감기가 길고, Fc 수용체를 통한 신호전달 결과와 항체가 인식하는 표적 단백질을 통한 신호전달의 효과가 통합되어 전체 결과가 나타나게 된다. 또한 동일한 항원에 대해 다양한 항체가 존재하는 경우가 많으며, 이들이 서로 조금씩 다른 효과가 나타나게 된다. 이러한 한계점을 극복하기 위하여 오중합체인 COMP-4-1BBL 단백질을 이용하여 성공적으로 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리 및 증식하는 방법을 개발한 바 있다 (대한민국 등록특허 제10-1103603호).
이 두 가지 특허는 외래항원인 바이러스항원 (EBV/LMP2A, CMV/pp65) 특이적 CD8 T 세포를 분리/대량 배양하는 기술로, 체내 이들 세포의 비율이 높아 비교적 쉽게 구현이 가능하다. 그러나 대부분의 암세포는 우리 몸을 구성하는 세포로부터 형성되므로, 우리 몸을 구성하는 단백질이지만, 정상세포에서는 낮은 비율로 존재하며 암세포에서는 과발현되어 있는 자가암항원(self tumor Ag)을 인식하는 CD8 T 세포의 선택적 분리 및 대량배양이 필요하다.
따라서 본 발명의 목적은 체내에 극히 낮은 비율로 존재하는 자가암항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 31일내 선택적으로 분리하고 대량 배양할 수 있는, 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 암 환자 혈액내에 존재하는 자가암항원 CD8+ T 세포 에피토프를 선별하는 단계; b) 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 상기 에피토프의 펩티드 및 IL-2와 함께 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 배양된 세포를 b) 단계와 동일한 펩티드를 첨가하여 4-1BB 발현을 유도하는 단계; 및 d) 4-1BB 발현이 유도된 세포를 항-4-1BB 항체가 코팅된 배양 플레이트에서 배양한 후 부착하지 않은 세포를 제거하는 단계하기 단계를 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리방법을 제공한다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 a) 단계의 자가암항원은 hTERT, WT1, NY-ESO1 및 MAGE-A3로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 b) 단계에서 에피토프는 서열번호 1 내지 15로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드일 수 있다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 c) 단계의 발현 유도는 12 내지 36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분리방법에 있어서, 상기 d) 단계의 배양은 1 내지 20분간 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 분리된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포와 방사선 조사된 동종이계(allogeneic) PBMC를 IL-2, 항-CD3 항체 및 자가혈장이 포함된 배지로 현탁한 후 배양용 백에 주입하고, 상기 배지를 추가로 주입하여 배양하는 것을 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 대량배양방법을 제공한다.
본 발명의 대량배양방법에 있어서, 상기 PBMC는 정상 공여자로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 대량배양방법에 있어서, 상기 배양은 4 내지 15일간 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 외래항원이 아닌 암 환자의 개개인의 혈액에 존재하는 자가암항원 CD8 T 세포 에피토프의 펩티드를 이용하여 자가암항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 분리할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법으로 분리된, 정상인에서 극히 낮은 비율로 존재하는 자가암항원을 인식하는 T 세포를 이용하면 암 환자 자신의 세포로부터 유래된 암세포를 효과적으로 선택하여 제거할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 선택적 분리 및 대량배양 과정을 설명하는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 에피토프 스크리닝 과정의 공정 흐름도를 나타낸 도면이다.
도 3은 정상인(healthy doner)으로부터 얻은 PBMC을 이용한 hTERT 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 정상인으로부터 얻은 PBMC를 이용한 WT1 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 내지 7은 각각 위암(gastric cancer), 폐암(lung cancer) 및 췌장암(pancreatic cancer) 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 hTERT 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 8 및 9는 각각 뇌종양(glioblastoma) 및 폐암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 WT1 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 10 및 11은 각각 난소암(ovarian cancer) 및 육종(sarcoma) 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 NY-ESO1 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 12 및 13은 각각 육종 및 폐암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 MAGE-A3 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 14는 hTERT T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
도 15는 WT1 T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
도 16은 NY-ES01 T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
도 17은 MAGE-A3 T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
암세포는 우리 몸을 구성하는 세포로부터 유래되므로 암세포를 선택적으로 제거하기 위해서는 암세포에서 과발현되는 자가암항원(self tumor Ag) 특이적 CD8+ T 세포의 선택적 분리 및 대량배양이 필요하다. 그러나 자가암항원을 인식하는 T 세포는 정상인의 경우 비율이 극히 낮게 존재할 뿐 아니라, 면역관용(immune tolerance)에 의해 활성이 억제된 상태로 존재한다. 따라서 암환자의 혈액으로부터 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 선택적으로 분리하여 대량배양 하는 규격화된 공정은 아직 개발되지 못하고 있다. 이에 본 발명자들은 항4-1BB 항체를 이용하여 체내에 극히 낮은 비율로 존재하는 hTERT, WT1, NY-ESO1, 및 MAGE-A3과 같은 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포를 31일내 선택적으로 분리 및 대량배양 할 수 있는 규격화된 공정기술을 개발하였다.
따라서 본 발명은 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리방법은, a) 암 환자 혈액내에 존재하는 자가암항원 CD8+ T 세포 에피토프를 선별하는 단계; b) 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 상기 에피토프의 펩티드 및 IL-2와 함께 배지에서 배양하는 단계; c) 상기 배양된 세포를 b) 단계와 동일한 펩티드를 첨가하여 4-1BB 발현을 유도하는 단계; 및 d) 4-1BB 발현이 유도된 세포를 항-4-1BB 항체가 코팅된 배양 플레이트에서 배양한 후 부착하지 않은 세포를 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명의 분리방법에서, 상기 a) 단계의 자가암항원은 암 환자 자신의 체내에 존재하는 어떠한 암 항원일 수 있으며, 암종에 따라 적합한 자가암항원을 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 항암면역치료에 이용되고 있는 대표적인 자가암항원으로서 hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1) 등을 사용할 수 있다. 상기 hTERT는 염색체 말단에서 텔로미어 DNA(telomeric DNA)를 합성하는 효소로서 암 세포는 이 효소를 과도하게 활성화시켜 텔로미어 의존적 세포 사멸을 회피할 수 있도록 기능하고 폐암, 위암, 췌장암을 포함하는 다양한 고형암의 타겟 항원으로 알려져 있고 (Kim NW, et al. Science. 1994;266:2011-2015), 상기 WT1은 Wilms tumor와 관련된 유전자로서 zinc finger 전사인자를 암호화하여 세포의 증식과 분화, 자멸사, 기관의 발생에 관여를 하는 단백질로서 뇌척수암, 폐암 등의 타겟 항원으로 알려져 있다 (Call KM, et al., Cell. 1990. 60:509-520; Nakahara Y, et al., Brain Tumor Pathol. 2004. 21:113-6). 또한 상기 NY-ESO1은 cancer testis antigen (CTA)에 속하는 단백질 중 하나로 주로 생식세포 (germ cell)와 육종(sarcoma), 유방암을 포함한 다양한 암세포에 발현하는 것으로 잘 알려져 있지만, 이들 세포에서 어떤 기능을 하는지에 대해서는 잘 알려져 있지 않다 (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res. 2006;95:1-30). 상기 MAGE-A3은 melanoma-associated antigen family에 속하는 단백질로 정상세포에서 어떤 기능을 수행하는지에 대해서는 알려진 것이 없지만, 폐암, 육종 및 흑색종을 포함한 다양한 암세포에 과발현하는 것으로 알려져 있어 암의 면역치료에 적합한 표적 항원으로 평가되고 있다 (Decoster L, et al., Ann Oncol. 2012 Jun;23(6):1387-93).
본 발명의 분리방법에서, 상기 b) 단계에서 에피토프는 서열번호 1 내지 15로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분리방법에서, 상기 b) 단계의 배지는 자가혈장이 포함된 배지인 것을 특징으로 하며, 또한 상기 b) 단계의 배양은 12 내지 16일 동안 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분리방법에서, 상기 c) 단계의 발현 유도는 12 내지 36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하며, 상기 d) 단계의 배양은 1 내지 20분간 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상술한 분리방법으로 분리된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포와 방사선 조사된 동종이계(allogeneic) PBMC를 IL-2, 항-CD3 항체 및 자가혈장이 포함된 배지로 현탁한 후 배양용 백에 주입하고, 상기 배지를 추가로 주입하여 배양하는 것을 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 대량배양방법을 제공한다.
본 발명의 대량배양방법에서, 상기 PBMC는 정상 공여자로부터 분리된 것을 특징으로 하며, 상기 배양은 4 내지 15일간 수행되는 것을 특징으로 한다. 특히 상기 배양을 수행하는 동안 배양 4일, 7일, 9일, 11일 및 14일째에 배지를 추가 주입할 수 있다.
이하, 본 발명의 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식방법을 단계별로 설명한다.
(1) Epitope screening (사전선별검사)
본 발명은 펩티드를 이용하여 자가유래 암항원 특이적 CD8 T 세포를 선택적으로 증식 및 분리한다. CD8 T 세포에 의해 인식되는 자가암항원의 에피토프(epitope)들은 환자 개개인의 HLA-A type 및 상태에 따라 서로 다르므로 epitope screening을 통해 암환자 개개인의 혈액내에 존재하는 자가암항원 CD8 T cell epitope을 선별하여 T 세포치료제 제조용 펩티드 3-4종류를 선별한다.
(2) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식
자가암항원 특이적 CD8 T 세포는 혈액내 0.1% 이하로 존재하므로, 혈액으로부터 분리된 PBMC에 제조용 펩티드 3-4종 및 IL-2를 첨가하여 14일간 배양함으로써 자가암항원으로부터 유래된 펩티드에 특이적인 CD8 T 세포의 증식을 유도한다. 배양 14일째 모든 세포를 수거하여 동일한 펩티드들로 24시간 재활성화함으로써 펩티드-특이적 CD8 T 세포들이 동시에 4-1BB를 발현하도록 유도한다.
(3) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 선택적 분리
항4-1BB 항체가 코팅된 배양 플레이트에 펩티드로 재활성화시킨 세포를 분주하여 10분간 배양함으로써 4-1BB를 발현하는 CD8 T 세포들이 부착되도록 하며, 부탁되지 않은 세포들은 모두 세척하여 제거한다. 이후 IL-2가 포함된 배지를 첨가하여 이틀간 배양함으로써 분리된 T 세포들이 증식과 함께 배양 플레이트로 떨어지도록 한다.
(4) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 대량배양
1L 배양용 백(culture bag)에 분리된 CD8 T 세포 5×105 세포, 방사선 조사된(irradiated allogeneic) PBMCs 1×108 세포, 1000U/ml IL-2, 40ng 항-CD3 mAb를 혼합하여 14일간 정기적으로 배지를 첨가하여 ~109 세포/L 수준으로 세포를 대량 배양하여, 암환자에게 투여 가능한 수준으로 증식시킨다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예. 에피토프 스크리닝 공정
알고리즘을 통해 자가암항원의 CD8 T 세포 에피토프(epitope)들을 선별하였다. 암 환자의 혈액 내 존재하는 T 세포들이 어떤 CD8 T 세포의 에피토프에 반응하는지 확인하기 위해, 암 환자의 혈액으로부터 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하여 세척한 후, CTL 배지(RPMI1640 배지 + 4 mM L-글루타민 + 12.5 mM HEPES + 50 μM 2-메르캅토에탄올 + 3% 자가혈장)에 1×106 세포/ml로 현탁하고, 14 ml 튜브(round tube)에 1 ml씩 분주하였다. 알고리즘을 통해 분석하여 선별된 각 에피토프의 펩티드들(peptides)을 각 튜브에 1 μg/ml 농도로 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 배양을 시작하였다. 배양 이틀째, 50 U/ml IL-2가 포함된 CTL 배지를 각 튜브에 1 ml씩 첨가하였다. 배양 7, 9, 11, 및 13일째 1 ml 배지를 제거한 후, 50 U/ml IL-2가 포함된 CTL 배지를 첨가하였다. 배양 14일째, 각 튜브에 RPMI1640 배지를 첨가하여 1400 rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 3회 세척하였다. 세척된 세포에 1 ml CTL 배지를 현탁한 후, 동일한 펩티드를 5 μg/ml 농도로 첨가하여 배양하였다. 24시간 후, 각 튜브의 세포를 수거하여 항-CD8-PE-Cy5 및 항-4-1BB-PE 항체로 염색하여 유세포 분석하였으며, 4-1BB를 발현하는 CD8 T 세포의 비율을 분석함으로써, 어떤 펩티드에 반응하여 CD8 T 세포가 활성화 되었는지를 분석하였다. 도 2는 본 발명에 따른 에피토프 스크리닝 과정의 공정 흐름도를 나타낸 도면이다.
실험에 사용된 항-CD8-PE-Cy5, 항-4-1BB-PE는 e바이오사이언스(eBioscience, San Diego, CA)에서 구매하였다. RPMI1640, L-글루타민, HEPES, 2-메르캅토에탄올은 인비트로겐 사(Invitrogen, San Diego, CA)로부터 구매하였다.
실시예 1. 자가암항원 선별 및 CD8 T 세포 에피토프 선별
각 암종별로 어떤 암항원이 암의 면역치료에 적합한지에 대해 평가한 논문들(Scanlan MJ, et al., Immunol Rev. 2002 Oct. 188:22-32; Ramakrishnan S, et al., Cancer research. 1998. 58:622-625; Nakahara Y, et al., Brain Tumor Pathol. 2004. 21(3):113-6)을 기반으로 한국인 호발암 및 난치성암(위암, 폐암, 췌장암 등)의 면역치료에 적합한 자가암항원을 선별하였다. hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1)은 다양한 방식으로 항암면역치료에 이용되고 있는 대표적인 자가암항원으로 이들 네 가지 암 항원의 적용이 가능한 암종들을 선별하여 하기 표 1에 정리하였다.
표 1
Figure PCTKR2015002356-appb-T000001
선별된 자가암항원의 아미노산 서열을 알고리즘을 통해 분석하여 CD8 T 세포 에피토프로 추정되는 아미노산 서열을 결정하였으며 (CTLPred: http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/, NetCTL: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/, SYFPEITHI: http://www.syfpeithi.de/), 선별된 에피토프를 대상으로 펩티드를 화학합성 (Peptron Inc; www.peptron.com)하여 에피토프 스크리닝(epitope screening)에 사용하였다. 각 자가암항원으로부터 선별된 CD8 T 세포 에피토프는 하기 표 2 내지 표 5와 같다.
표 2
Figure PCTKR2015002356-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2015002356-appb-T000003
표 4
Figure PCTKR2015002356-appb-T000004
표 5
Figure PCTKR2015002356-appb-T000005
실시예 2. 임상 암 환자를 대상으로 한 에피토프 스크리닝
실시예 1에서 선별된 hTERT, WT1, NY-ESO1, MAGE-A3 자가암항원의 CD8 T 세포 에피토프들이 실제 임상 암 환자의 혈액에 존재하는 CD8 T 세포 증식을 유도할 수 있는지 검증하기 위해, 도 2에 모식된 에피토프 스크리닝을 수행하였다. hTERT 에피토프 스크리닝은 위암, 폐암, 췌장암을 주 대상으로 수행하였으며, WT1 에피토프 스크리닝은 뇌척수암 및 폐암, NY-ESO1 에피토프 스크리닝은 난소암 및 육종, 그리고 MAGE-A3 에피토프 스크리닝은 육종 및 폐암을 주 대상으로 수행하였다.
도 3은 정상인(healthy doner)으로부터 얻은 PBMC을 이용한 hTERT 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 정상인으로부터 얻은 PBMC를 이용한 WT1 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 3과 4에서 볼 수 있듯이, hTERT 및 WT1의 CD8 T 세포 에피토프들은 정상인의 혈액으로부터 분리된 PBMC로부터 T 세포 반응을 유도하지 못하였다. 따라서 본 발명의 선별된 에피토프들은 정상인의 T 세포가 인식하지 못하는 것으로 확인되었다.
도 5 내지 7은 각각 위암(gastric cancer), 폐암(lung cancer) 및 췌장암(pancreatic cancer) 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 hTERT 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 8 및 9는 각각 뇌종양(glioblastoma) 및 폐암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 WT1 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 10 및 11은 각각 난소암(ovarian cancer) 및 육종(sarcoma) 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 NY-ESO1 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 12 및 13은 각각 육종 및 폐암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 MAGE-A3 에피토프 스크리닝 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 내지 13에서 볼 수 있듯이, 임상 암 환자의 혈액으로 분리한 PBMC를 대상으로 에피토프 스크리닝을 수행하여 hTERT, WT1, NY-ESO1, 및 MAGE-A3에 대한 CD8 T 세포 반응성을 조사한 결과, 정상인과는 달리 선택된 자가암항원들에 대한 T 세포 반응이 높게 나타나는 것으로 확인되었다. 따라서 위암, 폐암, 췌장암, 육종, 난소암 등을 대상으로 각각의 자가암항원에 대한 반응성을 에피토프 스크리닝을 반복적으로 수행하여 확인하였다.
또한, 상기 에피토프 스크리닝 결과를 객관적으로 분석하기 위해, 스코어링 시스템(scoring system)을 하기 표 6과 같이 만들었다.
표 6
Figure PCTKR2015002356-appb-T000006
상기 표 6의 기준에 따라 에피토프 스크리닝 결과를 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 7 내지 15에 나타내었다.
하기 표 7은 위암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 hTERT 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
[규칙 제91조에 의한 정정 04.05.2015]　
표 7
Figure WO-DOC-TABLE-7
하기 표 8은 폐암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 hTERT 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 8
Figure PCTKR2015002356-appb-T000008
하기 표 9는 췌장암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 hTERT 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 9
Figure PCTKR2015002356-appb-T000009
하기 표 10은 뇌종양 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 WT1 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 10
Figure PCTKR2015002356-appb-T000010
하기 표 11은 폐암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 WT1 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 11
Figure PCTKR2015002356-appb-T000011
하기 표 12는 난소암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 NY-ESO1 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 12
Figure PCTKR2015002356-appb-T000012
하기 표 13은 육종 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 WT1 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 13
Figure PCTKR2015002356-appb-T000013
하기 표 14는 육종 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 MAGE-A3 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 14
Figure PCTKR2015002356-appb-T000014
하기 표 15는 폐암 환자로부터 얻은 PBMC을 이용한 MAGE-A3 에피토프 스크리닝을 분석한 결과이다.
표 15
Figure PCTKR2015002356-appb-T000015
상기 표 7 내지 13에서와 같이, 스코어 3 이상으로 CD8 T 세포가 펩티드 자극에 의해 4-1BB를 발현할 경우, 항4-1BB 항체를 이용하여 효과적으로 이들 세포를 분리할 수 있다. 각 암종에서 스코어 3 이상으로 자가암항원에 T 세포가 반응하는 비율 40-50% 수준이었으므로, 선별된 자가암항원의 에피토프들을 이용하여 T 세포치료제를 제조하는 것이 가능할 것으로 판단하였다. 선별된 펩티드들은, hTERT 펩티드: CLKELVARV (서열번호 1), PLFLELL (서열번호 2), AAVTPAA (서열번호 3); WT1 펩티드: SLGEQQVSV (서열번호 4), RMFPNAPVL (서열번호 5), CMTWNQMNL (서열번호 6), VLDFAPPGA (서열번호 7); NY-ESO1 펩티드: SISSCLQQL (서열번호 8), RLLEFYLAM (서열번호 9), GVLLKEFTV (서열번호 10), ILTIRLTAA (서열번호 11); 그리고 MAGE-A3 펩티드: LLIIVLAII (서열번호 12), KIWEELSVL (서열번호 13), LVFGIELMEV (서열번호 14), SLPTTMNYPL (서열번호 15)이다.
실시예 3. 자가암항원 특이적 T 세포치료제의 시험제조
에피토프 스크리닝을 통해 T 세포치료제 제조에 적합한 각 자가암항원에 대한 3-4종의 에피토프의 펩티드를 선별한 후, 이들 펩티드를 이용하여 hTERT, WT1, NY-ESO1, 및 MAGE-A3 특이적 T 세포치료제의 시험생산을 수행하였다. T 세포치료제의 생산은 자가유래 항암 T 세포의 1차 증식, 분리, 대량배양 세 단계로 구성되어 있다.
(1) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식
에피토프 스크리닝을 통해 스코어 3 이상의 에피토프가 하나 이상 존재하는 것을 확인한 암 환자로부터 50 ml 혈액을 분리하였다.
1) 환자의 혈액으로부터 PBMC 분리: 7 ml 피콜-하이파크(Ficoll-hypaque)가 채워진 15 ml 튜브(cornical tube)에 7 ml 혈액을 천천히 흘려보내 피콜 용액 상층에 오버레이(overlay)하였다. 튜브를 상온 2000 rpm에서 20분간 원심분리 하였으며, 피콜과 혈장 사이에 위치한 흰색의 세포층만을 수거하여 세척한 후 PBMC로 사용하였다.
2) 분리된 PBMC를 CTL 배지(RPMI1640 medium + 4mM L-glutamine + 12.5 mM HEPES + 50 μM 2-mercaptoethanol + 3% autoplasma)에 1×106 세포/ml로 현탁하고, 에피토프 스크리닝을 통해 본 발명에서 선별된 3-4종의 펩티드들이 각각 1 μg/ml 농도가 되도록 첨가하였다. 이들 세포 현탁액을 14 ml 튜브(round tube)에 1 ml씩 분주하여 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
3) 배양 이틀째 50 U/ml IL-2(Proleukin, Novatis)가 포함된 CTL 배지를 각 튜브에 1 ml씩 첨가하였다.
4) 배양 7, 9, 11, 및 13일째 1 ml 상층배지를 제거한 후, 50 U/ml IL-2가 포함된 CTL 배지를 첨가하였다.
5) 배양 14일째 각 튜브의 세포를 50 ml 코티컬 튜브(cornical tube)에 수거한 후, RPMI1640 배지를 첨가하여 1400rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 세척하였다. 이 과정을 두 번 더 반복하였다.
6) 세척된 세포를 2×106 세포/ml의 농도로 CTL 배지로 현탁한 후, 동일한 펩티드 3-4종 각각을 5 μg/ml 농도로 첨가하여 배양하였다.
(2) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 선별
1) 배양 24시간째, 하루 동안 재활성화시킨 PBMC를 수거하여 RPMI1640 배지로 두 번 세척한 후, 5×106 세포/ml의 농도로 CTL 배지를 현탁하고 50 U/ml IL-2를 첨가하였다.
2) 항4-1BB 항체를 50 μg/ml의 농도로 하루 동안 코팅한 6웰 또는 12웰 플레이트(culture plate)에, 이들 세포를 1 ml 씩 첨가하여 10분간 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
3) 배양 10분 후, 플레이트에 부착되지 않은 세포를 모두 세척하여 제거한 후, 1000 U/ml IL-2가 포함된 CTL 배지 2-4 ml을 각 웰에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 이틀간 배양하였다.
(3) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 대량배양
1) 항4-1BB 항체로 분리하여 이틀간 배양한 세포를 모두 수거하여 RPMI1640 배지로 두 번 세척하여 계수하였다.
2) 정상 공여자로부터 PBMC를 분리하여 1×108 세포/ml로 현탁한 후, 3000 rad로 방사선 조사하여 세포의 사멸을 유도한 후, T 세포의 증식 유도에 필요한 공동자극(costimulation)을 제공할 수 있는 배양 첨가물로 사용하였다.
3) 50 ml 코니컬 튜브에 분리된 CD8 T 세포 5×105 세포와 irradiated allogeneic PBMCs 1×108 세포를 첨가한 후, 1,000 U/ml IL-2, 40 ng/ml 항-CD3 mAb(BD Bioscience) 및 3% 자가혈장(autoplasma)이 포함된 ALyS505N 배지(CELL SCIENCE & TECHNOLOGY INST., INC. (CSTI))를 50 ml까지 첨가하였다.
4) 50 ml 세포현탁액을 1L 배양용 백(culture bag)에 주입한 후, CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
5) 배양 4일째, 1,000 U/ml IL-2, 3% 자가혈장이 포함된 ALyS505N 배지 50 ml을 1L 배양용 백에 추가 주입하였다.
6) 배양 7일째, 1,000 U/ml IL-2, 3% 자가혈장이 포함된 ALyS505N 배지 100 ml을 1L 배양용 백에 추가 주입하였다.
7) 배양 9일째, 1,000 U/ml IL-2, 3% 자가혈장이 포함된 ALyS505N 배지 300 ml을 1L 배양용 백에 추가 주입하였다.
8) 배양 11일째, 1,000 U/ml IL-2, 3% 자가혈장이 포함된 ALyS505N 배지 500 ml을 1L 배양용 백에 추가 주입하였다.
9) 배양 14일째, 1L 배양용 백의 모든 세포를 수거하여 주사용 생리식염수로 세 번 세척하며, 5% 알부민이 포함된 주사용 생리식염수에 세포를 현탁하여 완제품 T 세포치료제를 충전하였다.
상기와 같이, 임상 암 환자로부터 본 발명의 에피토프 스크리닝을 통해 T 세포 반응을 유도할 수 있는 스코어 3 이상의 펩티드 3-4종을 선별한 후, 50 cc 혈액을 이용하여 hTERT, WT, NY-ESO1, MAGE-A3 T 세포치료제의 시험생산을 수행하였으며, 그 결과를 도 6 내지 9에 정리하였다.
도 14는 hTERT T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
도 14는 HLA-A*24 allele를 가진 위암환자의 50 cc 혈액으로부터 PBMC를 분리하여 세 종류의 hTERT peptide [CLKELVARV (서열번호 1), PLFLELL (서열번호 2), AAVTPAA (서열번호 3)]를 각각 1 μg/ml 농도로 첨가한 후, 상기 실시예 3의 “(1) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식”에 기술된 과정에 따라 배양하였다. 배양 14일째 모든 세포를 수거하여 “(2) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 선별” 과정에 따라 hTERT peptide에 반응하여 증식한 T 세포를 분리/증식하였다. 분리된 T 세포는 “(3) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 대량배양” 과정을 통해 암환자에게 투여 가능한 수준으로 대량배양하였으며, 최종 배양된 세포는 낮은 노화도와 작용기능 가지고 있는 특정 TCRVb type의 T 세포인 것으로 유세포 분석되었다.
도 15는 WT1 T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
도 15는 HLA-A*02 allele를 가진 악성신경교종환자의 50 cc 혈액으로부터 PBMC를 분리하여 네 종류의 WT1 peptide [SLGEQQVSV (서열번호 4), RMFPNAPVL (서열번호 5), CMTWNQMNL (서열번호 6), VLDFAPPGA (서열번호 7)]를 각각 1 μg/ml 농도로 첨가한 후, 상기 실시예3의 “(1) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식”에 기술된 과정에 따라 배양하였다. 배양 14일째 모든 세포를 수거하여 “(2) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 선별” 과정에 따라 WT1 peptide에 반응하여 증식한 T 세포를 분리/증식하였다. 분리된 T 세포는 “(3) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 대량배양” 과정을 통해 암환자에게 투여 가능한 수준으로 대량배양하였으며, 최종 배양된 세포는 낮은 노화도와 작용기능 가지고 있는 특정 TCRVb type의 T 세포인 것으로 유세포 분석되었다.
도 16은 NY-ES01 T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
도 16은 HLA-A*02 allele를 가진 난소암환자의 50 cc 혈액으로부터 PBMC를 분리하여 네 종류의 NY-ESO1 peptide [SISSCLQQL (서열번호 8), RLLEFYLAM (서열번호 9), GVLLKEFTV (서열번호 10), ILTIRLTAA (서열번호 11)]를 각각 1μg/ml 농도로 첨가한 후, 상기 실시예 3의 “(1) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식”에 기술된 과정에 따라 배양하였다. 배양 14일째 모든 세포를 수거하여 “(2) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 선별” 과정에 따라 NY-ESO-1 peptide에 반응하여 증식한 T 세포를 분리/증식하였다. 분리된 T 세포는 “(3) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 대량배양” 과정을 통해 암환자에게 투여 가능한 수준으로 대량배양하였으며, 최종 배양된 세포는 낮은 노화도와 작용기능 가지고 있는 특정 TCRVb type의 T 세포인 것으로 유세포 분석되었다.
도 17은 MAGE-A3 T 세포 치료제의 파일럿 생산 과정을 설명하는 도면이다.
도 17은 HLA-A*02 allele를 가진 육종환자의 50cc 혈액으로부터 PBMC를 분리하여 네 종류의 MAGE-A3 peptide [LLIIVLAII (서열번호 12), KIWEELSVL (서열번호 13), LVFGIELMEV (서열번호 14), SLPTTMNYPL (서열번호 15)]를 각각 1 μg/ml 농도로 첨가한 후, 상기 실시예 3의 “(1) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 증식”에 기술된 과정에 따라 배양하였다. 배양 14일째 모든 세포를 수거하여 “(2) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 선별” 과정에 따라 MAGE-A3 peptide에 반응하여 증식한 T 세포를 분리/증식하였다. 분리된 T 세포는 “(3) 자가암항원 특이적 CD8 T 세포의 대량배양” 과정을 통해 암환자에게 투여 가능한 수준으로 대량배양하였으며, 최종 배양된 세포는 낮은 노화도와 작용기능 가지고 있는 특정 TCRVb type의 T 세포인 것으로 유세포 분석되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 하기 단계들을 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리방법:
    a) 암 환자 혈액내에 존재하는 자가암항원 CD8+ T 세포 에피토프를 선별하는 단계;
    b) 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 상기 에피토프의 펩티드 및 IL-2와 함께 배지에서 배양하는 단계;
    c) 상기 배양된 세포를 b) 단계와 동일한 펩티드를 첨가하여 4-1BB 발현을 유도하는 단계; 및
    d) 4-1BB 발현이 유도된 세포를 항-4-1BB 항체가 코팅된 배양 플레이트에서 배양한 후 부착하지 않은 세포를 제거하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 자가암항원은 hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), 및 MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1)로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 b) 단계에서 에피토프는 서열번호 1 내지 15로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 배지는 자가혈장이 포함된 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 배양은 12 내지 16일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 c) 단계의 발현 유도는 12 내지 36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 d) 단계의 배양은 1 내지 20분간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 따른 방법으로 분리된 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포와 방사선 조사된 동종이계(allogeneic) PBMC를 IL-2, 항-CD3 항체 및 자가혈장이 포함된 배지로 현탁한 후 배양용 백에 주입하고, 상기 배지를 추가로 주입하여 배양하는 것을 포함하는 자가암항원 특이적 CD8+ T 세포의 대량배양방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 PBMC는 정상 공여자로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 배양은 4 내지 15일간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 배양은 배양 4일, 7일, 9일, 11일 및 14일째에 배지를 추가 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
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