KR100694508B1 - Ｈｂｂｋ４항체를 포함하는 암 질환 치료용 약학조성물및 이를 이용한 암의 면역치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 질환의 치료에 효과적인 인간화 항체인 HBBK4에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 동물실험에서 암세포 제거 능력이 확인된 CD11c+CD8+ T 세포군을 매개로 하여 인간화 항-4-1BB 항체인 HBBK4를 포함하는 암 질환 치료용 약학조성물 및 암의 면역치료 방법을 제공한다.

암, 항체, T 세포, HBBK4

Description

ＨＢＢＫ４항체를 포함하는 암 질환 치료용 약학조성물 및 이를 이용한 암의 면역치료 방법 {A composition comprising HBBK4 antibody for the treatment of cancer and the immunotherapic method for treating cancer using thereby}

도 1은 항진성 항-4-1BB 항체 BBK4의 인간화 디자인을 나타낸 도이고,

도 2는 BBK4의 인간화 ScFv 제작을 위한 프라이머 디자인을 나타낸 도이며,

도 3은 항-E 태그 세파로즈(Sepharose)를 이용한 인간화 BBK4(HBBK4) ScFv의 순수분리를 나타낸 도이고,

도 4는 HBBK4의 유세포 분석을 나타낸 도이고,

도 5는 경쟁적 ELISA를 나타낸 도이며,

도 6은 H2L2를 이용한 웨스턴 블러팅(western blotting)을 나타낸 도로써, 레인(lane) 1은 HBBK4-75/pcDNA 트랜스펙턴트(transfectant), 레인 2는 HBBK4-75/pD18 트랜스펙턴트, 레인 3은 293 EBNA-음성대조군을 나타낸 도이고,

도 7a는 HBBK4-75G1의 염기서열을 나타낸 도이고,

도 7b는 HBBK4-75G1의 아미노산 서열을 나타낸 도이며,

도 8a는 HBBK4-75G4의 염기서열을 나타낸 도이고,

도 8b는 HBBK4-75G4의 아미노산 서열을 나타낸 도이며,

도 9a는 HBBK4-75L의 염기서열을 나타낸 도이고,

도 9b는 HBBK4-75L의 아미노산 서열을 나타낸 도이며,

도 10은 HBBK4에 의한 T세포 증식이 강화된 것을 나타낸 도이고,

도 11a는 항진성 항-4-1BB와 저해성 항-CTLA-4항체를 이용한 멜라노마(melanoma)의 복합치료에서 암조직의 크기를 나타낸 도이고,

도 11b는 항-4-1BB와 저해성 항-CTLA-4항체를 이용한 멜라노마(melanoma)의 복합치료에서 쥐의 생존율을 나타낸 도이며,

도 12a는 C57BL/6 쥐에 4× 106의 B16-F10 멜라노마 세포를 피하주사 하고, 동시에 쥐 lgG, 항-4-1BB 또는 항-CTLA-4 항체를 200㎍씩 4일 간격으로 5회 주사하였고 암세포 주사후 12일에 출수림프절을 분리하여 항-CD4-FITC + anri-CD8-PE로 염색하여 유세포를 분석한 도이고,

도 12b는 C57BL/6 쥐에 4× 106의 B16-F10 멜라노마 세포를 피하주사 하고, 동시에 쥐 lgG, 항-4-1BB 또는 항-CTLA-4 항체를 200㎍씩 4일 간격으로 5회 주사하였고 암세포 주사후 12일에 출수림프절을 분리하여 항-CD8-FITC + 항-IFN-γ-PE로 염색하여 유세포를 분석한 도이고,

도 12c는 C57BL/6 쥐에 4× 106의 B16-F10 멜라노마 세포를 피하주사 하고, 동시에 쥐 lgG, 항-4-1BB 또는 항-CTLA-4 항체를 200㎍씩 4일 간격으로 5회 주사하였고 암세포 주사후 12일에 출수림프절을 분리하여 항-CD8-FITC + 항-CD11c-PE로 염색하여 유세포를 분석한 도이며,

도 13a은 항진성 항-4-1BB 투여에 의한 CD11c+CD8+ T 세포의 암조직내 침윤을 나타 낸 도로써, 항-CD4-FITC + 항-CD8-PE로 염색한 것을 나타낸 도이고,

도 13b는 항진성 항-4-1BB 투여에 의한 CD11c+CD8+ T 세포의 암조직내 침윤을 나타낸 도로써, 항-CD8-FITC + 항-CD11c-PE로 염색한 것을 나타낸 도이며,

도 13c는 항진성 항-4-1BB 투여에 의한 CD11c+CD8+ T 세포의 암조직내 침윤을 나타낸 도로써, 항-CD3-FITC + 항-NK1.1-PE로 염색한 것을 나타낸 도이고,

도 13d는 유세포 분석을 통해 결정된 각 세포군의 비율과 각 암조직으로부터 수거된 세포의 개수로부터 CD4+/CD8+ T 세포의 숫자를 결정한 것을나타낸 도이며,

도 14은 CD11c+CD8+ T세포의 유전자 발현 분포를 나타낸 도이다.

암세포는 특정 단백질의 과대발현 및 돌연변이를 유발함으로써 암세포 특이적인 항원을 발현하며, 이로 인해 환자 자신의 면역능력에 의해 암세포가 제거된다 (Nagorsen D. et al, Clin Cancer Res. 9: pp4296-4303, 2003 ; Yee C. et al, J Exp Med. 192, pp1637-1644, 2000 ; Castelli C. et al, J Cell Physiol. 182, pp323-331, 2000). 이러한 암세포에 대한 면역반응은 정상적인 면역반응과 동일하게 수지상세포(dendritic cell)와 같은 항원제시세포(antigen-presenting cell; APC)에 의하여 제시되며 이에 적합한 T 및 B 세포의 활성화시켜 암세포를 제거하게 된다(Jay A. et al., J. Clin. Invest. 113, pp1515-1525, 2004).

암세포 역시 MHC 분자의 감소, 공동자극분자의 발현억제, TGF-β 및 IL-10과 같은 면역억제 물질의 유도, CD4+CD25+ 조절(regulatory) T 세포의 암 조직내 침윤 등의 여러 가지 기작을 통해 무반응(anergy) 또는 내성(tolerance)을 유발하며 항암면역반응으로부터 회피를 시도한다(Zhiya Yu, et al., J. Clin. Invest. 110, pp289-294, 2002).

항암 면역반응은 세포성 면역반응(cell-mediated immunity)에 의존적이며, 특히 CD8+ T 세포 (CTL)에 의하여 암이 제거되고 면역학적 기억을 유지한다 (Maeurer MJ, et al., Int Rev Immunol. 14, pp97-132, 1997)

T 세포의 활성을 유도하기 위해서는 두 종류의 신호가 필요하다(Mondino A, et al., J Leukoc Biol. 55, pp805-815, 1994). 제 1신호는 항원 특이 신호로 TCR에 의한 것이며 제 2신호는 공동자극분자 (co-stimulatory molecules)를 통하여 이루어진다. 잘 알려진 공동자극분자는 Ig 군(family)과 TNFR 군(family)으로 크게 나눌 수 있다. 이들 분자의 면역항진 및 억제 기능이 알려지면서, 이를 이용한 암치료가 다방면으로 시도되었다. 이들 중 현재 가장 강력한 항암효과를 보이는 분자들은 4-1BB (CD137), CTLA-4, CD28, LIGHT, PD-1, CD27 등이다(Ye Z, et al., Nat Med. 8, pp343-834, 2002 ; Phan GQ, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100, pp8372-8377, 2003 ; Li Q, et al., J Immunother, 25, pp304-313, 2002 ; Yu P. et al., RK, Nat Immunol. 5, pp141-149, 2004 ; Iwai Y. et al., Int Immunol. 17, pp133-144, 2005 ; . Arens R, et al., J Exp Med. 199, pp1595-1605, 2004).

4-1BB는 Th1 면역반응인 CTL 및 IFN-γ의 발현을 유도하는 것으로 잘 알려져 있으며, 이를 이용한 암 치료 효과는 여러 연구팀에서 보고한 바있다.(Shuford WW, et al., J Exp Med. 186, pp47-55, 1997).

CTLA-4는 면역반응을 제한하는 것으로 알졌으며, 활성화된 T 세포에 발현되는 CTLA-4 신호전달을 저해할 경우 T 세포 활성화를 극대화하여 암세포 증식을 억제할 수 있다(Phan GQ, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100, pp8372-8377, 2003).

본 실험에서는 항진성 항-4-1BB 항체와 저해성 항-CTLA-4 항체를 이용하여 암 치료 시 암세포 특이적인 CD8+ T 세포가 증가하며, 다른 종류의 공동자극분자와는 차별되게 CD11c 분자를 발현하는 CD8+ T 세포가 형성되어 암조직 내로 침윤(infiltration)된다는 것을 발견하였다. 항진성 항-4-1BB 항체를 투여하여 암세포 증식을 억제할 경우, 암 조직 내 침윤된 세포들의 대부분이 CD11c+CD8+ T 세포로 구성되어 있었으며 높은 수준으로 IFN-γ를 발현하였다. 따라서 본 실험을 통해 4-1BB에 의한 암치료 효과는 CD11c+CD8+ T 세포의 증가와 이 세포의 암 억제 능력 - CTL 기능 및 IFN-γ 발현 - 강화로 인한 것이며, CTLA-4 신호전달 억제를 통해 그 효과가 극대화되었다는 것을 확인하였다.

본 발명의 목적은 암세포 제거능을 갖는 인간화 항체 HBBK4를 포함하는 암 질환 치료용 약학조성물 및 암의 면역치료 방법을 제공하는 데에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 질환의 예방 및 치료에 효과적인 인간화 항체 HBBK4를 제공한다.

본 발명은 CD11c+CD8+ T세포의 증가를 유도하는 항-4-1BB 항체의 인간화 항체인 HBBK4를 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 질환 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 HBBK4는 조성물 총 중량에 대해 0.1~50 중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 HBBK4의 염기서열은 서열 목록:59, 서열 목록:61 또는 서열 목록:63의 서열인 암질환 치료용 약학조성물이다.

또한, 상기 HBBK4의 아미노산 서열은 서열 목록:60, 서열 목록:62 또는 서열 목록:64의 서열인 암질환 치료용 조성물이다.

이하, 본 발명의 인간화 항체인 HBBK4를 얻는 방법을 상세히 설명한다.

하이브리도마 세포주를 이용하여 항체를 제조하는 제 1단계; BBK4의 유전자 클로닝을 하는 제 2단계; BBK4의 VH와 VL의 인간화하는 제 3단계; 인간화 BBK4(HBBK) ScFv의 기능 분석을 통한 인간화 BBK4(HBBK4) 클론을 선택하는 제 4단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 과정을 통하여 인간화항체 HBBK4를 수득할 수 있다.

또한 본 발명은 인간화 항체 HBBK4를 함유하는 조성물을 인간을 포함한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 암 질환의 면역 치료 방법을 제공한다.

상기 암 질환은 폐암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근 암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종이 있으며, 본 발명의 조성물암 질환 및 전이 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 HBBK4 항체를 포함하는 약학조성물을 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 HBBK4 항체는 단독 또는 탁솔 등의 기존 항암제와 같은 타 약학적 활성 화합물과 결합 뿐만아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 HBBK4 항체를 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정 제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 HBBK4 항체의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 HBBK4 항체는 1일 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 HBBK4 항체는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 HBBK4 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 항진성 항-인간 4-1BB (BBK4) 항체의 제작

1-1. 하이브리도마 세포주 제조방법

사람의 4-1BB 분자를 코딩하는 cDNA와 글루타치온 S 트랜스퍼라제(GST) 중 글루타치온이 결합하는 부위를 코딩하는 DNA(Pharmacia LKB Biotechnology)를 결합시켜서 pGEX3 발현벡터(Pharmacia LKB Biotechnology)를 제작하였다. 이 벡터로 E.coli를 형질전환시킨 후 적절한 조건에서 배양하여 4-1BB-GST 융합단백질의 발현을 유도한 다음 글루타치온 세파로즈-4B 컬럼(Pharmacia LKB Biotechnology)를 이용하여 분리 정제하여 4-1BB-GST 융합단백질을 얻었다.

1-2. 면역

20ug의 4-1BB-GST를 0.1ml의 완전 프로인트 보조제(Freund complete adjuvant)와 섞어서 생후 4 내지 8주된 Balb/c 마우스의 복강에 주사하여 최소면역을 시켰다. 이 후 20ug의 4-1BB-GST를 0.1ml의 불완전 프로인트 보조제(Freund incomplete adjuvant)와 섞어서 3주 간격으로 2차례 복강내에 주사하여 면역화시켰다. 면역화시킨 최종일로부터 3일 후에 꼬리로부터 소량의 피를 채혈하여 효소면역 검정법에 의해 원하는 항체의 역가를 측정하였다, 면역가가 일정수준 이상이 되면 마우스로부터 비장을 적출하여 비장세포를 얻어 융합에 사용하였다.

1-3. 세포융합

면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포를 SP2/0-Ag14 골수종 세포(ATCC CRL 1581)와 1:2로 혼합하고, 50% 폴리에틸렌글리콜 4000(Gibco)을 사용하여 융합시켰다. 여기에 관한 자세 프로토콜은 잘 알려진 방법(Mishell and SHiigi, Seledted Methods in cellular Immunology. W. H. Freeman Company. 1980)에 따라 시행하였다.

하이브리도마 세포주를 선별하기 위해, 융합시킨 세포혼합물을 HAT 배지(15% 송아지 태아 혈청, 0.1mM 하이포크산틴(Hypoxanthine), 0.4uM 아미노프테린(Aminopterin), 16uM 티미딘(Thymidine)이 보강된 RPMI 1640 배지)내에 재현탁시킨 다음 3×107세포/ml의 농도로 96웰 마이크로 배양 트레이에 투입하여 5% CO2를 함유하는 37℃의 세포배양기에서 배양하였다. 골수종세포 및 융합되지 않은 비장세포는 HAT 배지에서 잘 성장할 수 없으므로, 상기 배지에서 성장하는 세포는 융합이 이루어진 세포로 생각할 수 있다. 6, 7, 8일 후에 세포배양액의 1/2을 새로운 세포배양액으로 대체시켰다. 세포 증식 여부를 역상현미경을 이용하여 관찰하여 세포가 충분히 자랐을 때 96웰 마이크로 배양트레이로부터 항체를 포함하고 있는 상층액을 취하여 ELISA법을 시행하였다.

1-4. 하이브리도마 세포주 선별

4-1BB-GST를 탄산 완충액(pH 9.6)에 희석하여 200ng/0.1ml로 한 다음 ELISA 플레이트에 코팅시켰다. 코팅이 완료된 플레이트를 인산염 완충액으로 여러 번 씻고 난 후, 1% 소혈청 알부민이 포함된 인산염 완충액을 플레이트에 가하여 1시간 방치하고 인산염 완충액으로 여러 번 씻은 다음, 상기에서 얻은 세포 상층액을 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 인산염 완충액으로 여러 번 씻고 알카라인 포스파타제가 결합된 연소 황-마우스 면역 글로불린(Southern Biotech)을 1000배 희석하여 0.1ml 첨가하였다. 1시간 방치후 인산염 완충액으로 여러 번 씻고, 기질(p-니트로페닐 인산 이나트륨염을 단산염 완충액에 녹여서 1mg/ml로 만든 용액, pH 9.6)를 0.1ml 첨가하여 실온에서 10분간 보존하였다. 이후 자동 마이크로 플레이트 기록계로 반응을 측정하였다.

이렇게 4-1BB 분자에 특이하게 작용하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 찾았으며, BBK-4로 명명하였다.

1-5. 하이브리도마 세포주를 이용한 항체의 제조

상기에서 제조한 BBK-4 세포주 1 × 10⁷개를 배양액에서 증식시킨 후 프리스테인(pristane : 2.6.10.14-테트라메틸펜타데칸. Sigma) 0.5ml로 미리 처리한 Balb/c 마우스의 복막에 주입하고 10일 후에 복수액을 수집하였다. 이 복수액을 프로테인-G 세파로즈 컬럼(Pharmacia)을 이용하여 친화 크로마토그래피를 행하여 본 발명의 모노클로날항체를 분리하였다. 이때 항체 생성율은 1mg/1ml 복수액이였다.

항체 분석키트를 사용하여 측정한 결과 본 발명의 모노클로날 항체는 IgG1인 것으로 나타났으며 카파 경사슬(kappa light chain)의 아이소타입을 갖고 있었다.

실시예 2. 항진성 항-인간 4-1BB 항체 BBK4의 유전자 클로닝

2-1. BBK-4 클론의 mRNA

BBK-4 클론의 2X108 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 그 방법은 세포 펠렛(pellet)에 삼중 정제 분리 시약(TriPure Isolation Reagent; SIGMA)을 처리하고 페놀/클로로포름 추출을 1회 실시하였다. 상층액에 이소프로파놀(isopropanol)을 처리하여 RNA를 침전시키고 75% 에탄올로 2회 세척한 후에 depc'd 워터(water)에 녹여 총 RNA를 얻었다. mRNA의 추출은 다이날비즈(Dynalbeads) mRNA 정화 키트(purification kit; DYNAL)을 사용하여 실시하였다.

2-2. BBK-4 클론의 cDNA 라이브러리 제작

cDNA 라이브러리 제작을 위해서 ZAP-cDNA 합성 키트(Synthesis Kit) 및 ZAP-cDNA 기가팩 Ⅲ 금 클로닝 키트(Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit; STRATAGENE)를 사용하였다.

2-2-1. 첫 번째 가닥 합성(First Strand Synthesis)

앞에서 추출한 mRNA를 이용하여 첫번째 가닥(strand)을 합성한다. mRNA는 5㎍사용하고 링커(linker) 프라이머, RNase H- 역전사효소(reverse transcriptase), 메틸 뉴클레오티드 혼합물(methyl nucleotide mixture), RNase 억제자(inhibitor)를 이용하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨다.

링커 프라이머는 XhoI 부분(site)을 가지며 서열은 서열 목록: 1의 서열을 갖는다.

2-2-2. 두 번째 가닥 합성(Second Strand Synthesis)

RNase H와 DNA 중합효소(polymerase) I을 이용하여 두 번째 가닥을 합성하며 16℃에서 2시간 30분 동안 반응시킨다. 반응 후에 페놀-클로로포름 추출을 실시하고 에탄올을 이용하여 농축시킨다. 70% 에탄올로 세척한 후에 침전을 물에 녹이고 울트라프리-프로바인드 필터(Ultrafree-Probind filter; SIGMA)를 사용하여 단백질을 제거한다.

2-2-3. 평편한 cDNA 말단 제조 (Blunting the cDNA Termini)

클레나우 분절(Klenow fragment)과 dNTP를 이용하여 3′, 5′ 끝을 평편한 끝으로 만든다. 울트라프리-프로바인드를 이용하여 단백질을 제거한다.

2-2-4. EcoRI 수용체 연결(Ligation EcoRI Adaptors)

rATP, T4 DNA 리가아제(ligase)를 첨가하고 4℃에서 12시간동안 반응시킨다. 효소 를 불활성화 시키기 위해서 70℃에서 30분 동안 가열한다.

2-2-5. EcoRI 끝의 키나아제화(Kinasing the EcoRI Ends)

rATP, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(polynucleotide kinase)를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 반응시킨다. 70℃에서 30분 동안 불활성화 시킨다.

2-2-6. Xho I 침지(Digestion)

Xho I을 이용하여 침지(digestion)를 실시한다. 울트라프리-프로바인드를 이용하여 단백질을 제거한다.

2-2-7. 단일-ZAP XR 벡터 안으로 cDNA 연결(Ligating cDNA into Uni-ZAP XR Vector Arms)

에티디움 브로마이드(Ethidium bromide) 플레이트 분석(assay)을 이용하여 만들어진 cDNA의 양을 결정한다. cDNA 100ng에 단일-ZAP XR 벡터(Uni-ZAP XR vector) 125㎍를 rATP와 T4 DNA 리가아제(ligase)를 이용하며 12℃에서 12 시간동안 반응시킨다.

2-2-8. 패키징(Packaging)

-80℃에 보관하던 패키징 추출물을 꺼내어 녹기 시작하면 즉시 2㎕의 연결된 DNA를 넣고 기포가 생기지 않게 조심하며 파이펫을 이용하여 섞어준다. 이것을 상온에서 2시간동안 반응시킨다. 여기에 SM 완충액(100mM NaCl, 10mM MgSO4.7H2O, 50mM Tris-HCl pH 7.5, 0.01% gelatin) 500㎕, 클로로포름 20㎕ 넣고 섞어준다. 잠시 동안 원심분리하여 상층액을 새 튜브에 옮긴다.

2-2-9. 라이브러리 적정량(Titering the 라이브러리)

숙주 세포로는 XL-1 Blue MRF'를 이용하였다. LB/테트라사이클린(50ug/ml) 플레이트에 접종하여 얻은 싱글 군집을 10mM MgSO4와 0.2% 맥아당(maltose)을 포함하는 LB 배지에 접종한다. 이것을 37℃에서 OD600이 1.0이 넘지 않게 200rpm으로 진동하면서 키운다. 이 배양을 500 X g에서 10분동안 원심분리하여 배지를 제거하고 세포 펠렛(pellet)에 10mM MgSO4를 가하여 OD600에서 0.5가 될 때까지 희석한다. 이렇게 준비된 숙주 세포는 4℃에 저장하며 48시간 동안 사용 가능하다.

숙주 세포 200㎕에 팩키지드 리액션(pakaged reaction)을 1/10로 희석한 것을 1㎕넣고, 37℃에서 15분 동안 부착시킨다. 48℃로 식힌 톱 한천(top agar)을 3㎖ 넣고 볼텍싱(vortexing) 한 후에 예열된 LB 한천 플레이트에 즉시 붓는다. 37℃에서 10시간 동안 키운 후에 플라크(plaques)를 세어 ㎖당 pfu를 계산한다. 그 결과 1.9 X 10⁵ pfu를 얻었다.

2-3. 중쇄유전자와 카파 사슬 유전자(kapa chain gene)의 스크리닝

100mm 플레이트에 각각 약 200-300개의 플라크가 형성되도록 플레이팅 (plating)하고, 이것을 나일론 막으로 이동시키고 UV 교차 연결(cross linking)한다. 이 막을 이용하여 혼성화(hybridization)를 실시한다. 이 때 무거운 사슬과 카파 사슬의 스크리닝을 위한 프로브(probe)로는 PCR로 클로닝(cloning)한 각각의 충실한 부분의의 단편을 사용하였다. 혼성화는 ECL 직접 핵산 표지 및 검출 키트을 사용하였다. 여기서 얻어진 클론은 the Exassit/SOLR을 사용한 생체 내(in vivo) 제거 시스템을 통하여 플라스미드로 전환시키고 시퀀싱(sequencing)을 이용하여 서열을 확인하였다.

실시예 3. 항진성 항-인간 4-1BB 항체 BBK-4의 VH와 VL 인간화

3-1. BBK-4의 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)의 인간 상동의 선별

인간 항체 유전자 중에서 쥐의 단백질을 코딩하고 있는 클론 BBK-4의 V 지역의 염기서열과 가장 유사한 것을 데이터 베이스 검색을 통하여 선별하고 이 염기서열을 BBK-4의 염기서열과 비교하여 결합의(combinatorial) 항체 라이브러리의 제작에 필요한 PCR 템플레이트 겸 프라이머를 제작하는데 사용하였다.

3-2. BBK-4 유전자의 인간화를 위한 설계

BBK-4의 중쇄와 경쇄의 CDR과 FR 부분의 위치를 결정하고, 인간의 아미노산 잔기로 바꿀 것인지 쥐의 잔기를 그대로 사용할 것인지를 결정하기 위해서 표 1의 법칙에 따랐다.

H 및 L 사슬의 다양한 부분 서열 중에서 항원과 직접 결합하는 부분인 CDR 부분은 쥐의 서열로 두었다. 표준(Canonical) 잔기 역시 쥐의 서열로 두고, FR 부분에 존재하는 서열이라도 H와 L 사슬의 접촉면(interface)에 존재하는 것은 쥐의 서열, 특이적 서열은 인간의 서열, 용매 노출(solvent exposed) 잔기는 쥐의 서열 그대로 두었다. 이를 토대로 BBK-4의 인간화된 뉴클레오티드 서열을 결정하였다 (도 1).

인간화 설계

쥐 잔기	설명	결정
CDR	lg Blast에 따름 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)	쥐
표준잔기	chotia 표준지시 (http://www.cryst.bbk.ac.kr/~ubcg07s/)	쥐
가운데사슬을 둘러싸는 잔기		쥐
N-글리코실레이트 부분		인간
특이 구조 잔기	CDR 잔기의 5-6Å이내에 있는 잔기	쥐
	기타 모든 잔기	인간
용매-노출 잔기	CDR, 표준, 가운데 사슬의 잔기	쥐
	기타 모든 잔기	인간

3-3. 결합(Combinatorial) 항체 라이브러리를 만들기 위한 프라이머 제작

결합 항체 라이브러리를 만들기 위한 삽입물를 준비하기 위해서 BBK-4 클론의 중쇄와 경쇄 서열과 인간 주형을 비교해서 얻은 아미노산 서열을 바탕으로 결합 프라이머를 제작하였다. 서열 목록: 2 내지 서열 목록: 18 및 표 2 에 제작된 프라이머의 서열을 나타내었다.

	서 열
HBBK4-1U	5'-actgcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcagcagtctggggctgaagtaRWaaagcctggggc -3'
HBBK4-1D	5'-agtagctgctgaaggtgtagccagaagccttgcaggaaaScttcactgaagccccaggctttWYtacttc -3'
HBBK4-2U	5'-tacaccttcagcagctactggatgcactgggtgaRgcaggcacctggacaaggccttgagtggattggag -3'
HBBK4-2D	5'-tgctcttgaacttctcattgtagttagtatgaccgttgccaggattaatctctccaatccactcaaggcc -3'
HBBK4-3U	5'-aatgagaagttcaagagcaRggYaactMtgactSKggacacctctacaagcacagYatacatgSaactca -3'
HBBK4-3D	5'-taaaagatcttgcacagtaatagaccgcggWgtcctcagaccgcaggctgctgagttScatgtatRctgt -3'
HBBK4-4U	5'-tactgtgcaagatcttttactacggcacgggcgtttgcttactggggccaagggaccctcgtgaccgtct -3'
HBBK4-4D	5'-ctgagccgccgccgcctgagccgccgccgcctgagccgccgccgcctgaggagacggtcacgagggtccc -3'
HBBK4-5U	5'-tcaggcggcggcggctcagacRttgtgatgactcagtctccagccttcttatctgtgactccaggagaga -3'
HBBK4-5D	5'-agtgtaagtagtcgctaatagtctggctggccctgcaagtaaKagtcactttctctcctggagtcacaga -3'
HBBK4-6U	5'-attagcgactacttacactggtatcaacaaaaacccgatcaaKctcccaaacttctcatcaaatatgctt -3'
HBBK4-6D	5'-tccctgatccactgccactgaacctggagggaaYcccagagatggattgggaagcatatttgatgagaag -3'
HBBK4-7U	5'-agtggcagtggatcagggactgatttcactYttaStatctcgtcgStcgaggcagaagatgYtgSgRYgt -3'
HBBK4-7D	5'-tagttccttgaccgaaagttgggggaaagctgtgaccatcttgacagtaatacRYcScaRcatcttctgc -3'
HBBK4-8D	5'- gagtcattctcgacttgcggccgctttgatctcgagtttagttccttgaccgaaagt -3'
HBBK4 Sfil-U	5'- actgcggcccagccggccat -3'
HBBK4 Notl-D	5' - ttagttccttgaccgaaagt -3'

표 2와 같이 제작된 프라이머를 주형 겸 프라이머로 사용하여 다음과 같은 순서로 ScFv 부분의 PCR을 수행하였다(도 2). PCR 반응은 전(pre)-변성(denaturation) 94℃, 5분, 94℃, 30초, 59℃, 1 분, 72℃, 30 초, 후(post)-신장(elongation) 72℃, 7 분으로 35 회(cycles) 실시하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 QIAGEN 겔 추출 키트로 분리 하였다.

3-4. 결합 ScFv에 억제 효소 부분(restriction enzyme site)의 첨가

억제 효소 부분(restriction enzyme site)을 표 3 및 서열 목록: 19 내지 서열 목록: 20에 나타내었다.

	억제 효소 부분(restriction enzyme site)
HBBK4 SfiI-U	5'- actgcggcccagccggccat -3'
HBBK4 NotI-D	5' - ttagttccttgaccgaaagt -3'

PCR된 ScFv에 HBBK4 SfiI-U, Hu 4B4 NotI-D를 이용해서 5′-, 3′- 에 효소부분을 첨가하기 위해 PCR로 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 QIAGEN 겔 추출 키트로 분리하였다.

3-5. 삽입물의 억제 침지(digestion)와 정제(purification)

Sfi I 침지(digestion) 반응;

정제 ScFv 산물(1ug)............................X ul

10X 완충액(RoChe)............................8.5 ul

Sfi I(10U/ul, RoChe)...........................2 ul

T.D.W. ........................................X ul

총 부피.......................................85 ul

위의 구성요소를 잘 섞어서 85ul의 미네랄 오일을 첨가하여, 50℃에서 4시간 동안 반응시킨다.

Not I 침지(digestion) 반응;

3M NaCl......................................3.6 ul

10X 완충액(Roche)............................1.5 ul

Not I(10U/ul, Roche).......................... 4 ul

T.D.W. ........................................X ul

총 부피 ......................................15 ul

위의 구성요소를 잘 섞어서 37℃에서 4시간동안 반응시킨다. 페놀/클로로포름 추출을 실시하고, 회전-컬럼 정제(Spin-column purification)로 분리시켰다.

3-6. ScFv의 정량과 pCANTAB 5 E 벡터에 결합(ligation)

0.75cm 두께의 1%의 아가로즈 겔(agarose gel)에 12.5ng과 25ng의 ScFv 마커(marker)를 분리된 ScFv와 같이 전기영동하여 비교함으로써 정량하였다.

이렇게 준비한 삽입물을 결합(ligation)에 이용하였으며, 결합 혼합(ligation mixture)은 다음과 같다.

BBK-4 ScFv 유전자 단편(150ng)..................X ul

10X OPA 완충액.................................5 ul

pCANTAB 5 E(50ng/ul)...........................5 ul

10mM ATP ......................................5 ul

T4 DNA 리가아제ligase(4U/ul)...................2 ul

T.D.W. .......................................50 ul

총 부피.......................................50 ul

위의 혼합을 16℃에서 1 시간 동안 반응시키고, 70℃에서 10 분 동안 리가아제를 열 불활성화 시킨 후, 얼음에서 5 분 동안 식힌다.

3-7. 형질전환(Transformation)과 라이브러리 사이즈의 확인

적당한 TG1 세포 1 ml에 결합 반응(ligation reaction)을 첨가하고, 얼음에서 45 분 동안 둔다. 이 혼합을 42℃에서 2 분 동안 배양시키고, 얼음에서 냉각시킨다. 이 중 100 ul에 900 ul의 LBG를 첨가하여, 250rpm으로 혼탁배양한다. 이렇게 형질전환된 세포를 여러 비율로 희석하여 SOBAG 플레이트에 플레이팅(plating)하여 cfu를 확인한 결과 6 X 10⁶ cfu의 라이브러리를 얻었다.

3-8. BBK-4 재조합 파아지 항체 라이브러리로의 전환

위에서 얻은 세균 라이브러리의 900 ul에 9.1 ml의 2X YT-G 배지를 첨가하고, 250 rpm으로 37℃에서 1 시간 동안 혼탁배양한다. 세포를 침전시키기 위해서 1000 xg에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한다. 침전된 세포에 10 ml 2 X YT-AK 배지를 첨가하고, 250 rpm으로 37℃ 에서 o/n 혼탁배양 시킨다. 다시 세포를 침전시키기 위해서 1000 xg에서 20 분 동안 원심분리하고 상층액을 0.45um 여과지를 통과시킨 후, 멸균된 50 ml 원뿔형 튜브에 옮겨 4℃에서 패닝(panning)시킬 때까지 보관한다.

3-9. 재조합 파아지의 PEG 침전(precipitation)

BBK-4 재조합 파아지 항체 라이브러리에 2 ml의 PEG/NaCl를 가하고 잘 섞은 후 얼음에서 60 분 동안 배양한다. 침전시키기 위해서 4℃, 10000 xg에서 20 분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다. 침전물에 16 ml의 2 X YT 배지를 첨가하여 잘 섞어 0.45 um 여과지를 통과시킨 후 패닝(panning)을 실시한다.

3-10. 항원-양성 재조합 파아지 항체의 선택을 위한 패닝(panning)

0.05 M 탄산염 완충액(pH9.6)에 4-1BB를 10 ug/ml이 되게 희석한 후 상온에서 1-2 시간 동안 25 플라스크에 코팅한다. PBS로 플라스크를 3회 세척한 후, 차당(blocking) 완충액을 플라스크에 가득 채워 상온에서 한 시간 동안 보관한 후, PBS로 3회 세척한다. PEG를 이용하여 침전시킨 재조합 파아지 16 ml을 0.01 % 나트륨 아지드화물(sodium azide)을 포함하는 차단(blocking) 완충액 14 ml로 희석하고 상온에서 15분간 반응시킨다. 희석한 재조합 파아지 20 ml을 준비된 플라스크에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 50 ml의 PBS로 20 번 플라스크를 세척하고, 50 ml의 0.1 % PBS-T로 20 번 세척한다.

10ml의 성장-단계 TG1 세포 10 ml을 플라스크에 넣고, 37℃에서 한 시간 동안 배양한다. 이 배양액 중 100 ul를 2X YT 배지로 1:10, 1:100, 1:1000으로 희석하여, SOBAG 플레이트에 100 ul씩 플레이팅(plating)한다. 이 플레이트를 30℃에서 o/n 배양시킨다. 각 플레이트의 cfu를 계산하여 라이브러리 사이즈를 추정한 결과 9 X 10⁴ cfu를 얻었다.

3-11. 스크리닝을 위한 단일 클론 선택

패닝(Panning) 후에 얻어진 800개의 군집을 각각 200ul의 2X YT-AG 배지가 든 96 웰 플레이트에 접종하여 250 rpm으로 37℃에서 o/n 혼탁 배양하였다. M13KO7, 2.5 x 1010 pfu가 포함된 2X YT-AG 배지를 50 ml 준비하여 새 96 웰 플레이트에 200 ul 씩 각각 분주한다. 이 플레이트에 o/n 배양액을 40 ul 씩 접종한다. 접종한 플레이트를 150 rpm으로 37℃에서 두 시간 동안 혼탁배양한다. 이 플레이트를 1500 xg에서 상온에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 200 ul의 2X YT-AK 배지를 각 웰에 첨가한다. 250 rpm으로 37℃에서 혼탁배양한 후, 상온 1500 xg에서 20분 동안 원심분리한다. 이 상층액으로 ELISA를 실시하여 스크리닝한다.

3-12. ELISA를 통한 스크리닝

0.05 M 탄산염 완충액(pH9.6)에 4-1 BB를 2 ug/ml이 되게 희석한 후 상온에서 1-2 시간 동안 ELISA 플레이트에 100ul 씩 코팅한다. PBS로 플레이트를 3회 세척한다.

차단(Blocking) 완충액 200 ul 씩 각 웰에 넣고 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후, 0.01 % PBS-T 완충액으로 플레이트를 3회 세척한다. 준비된 플레이트에 위에서 얻어진 재조합 파아지 항체 상층액 100 ul를 첨가하고, 여기에 차단(blocking) 완충액을 동량 섞어서 상온에서 30분 동안 반응시킨다. 희석된 재조합 파아지 항체 상층액 200 ul를 항원이 코팅된 웰에 넣고, 상온에서 한 시간 동안 반응시킨다. 반응 후, 0.01 % PBS-T로 플레이트를 5회 세척하며, 차단(blocking) 완충액에 HRP/항-M13 단일클론 접합(conjugate)을 1:5000으로 희석하여 각 웰에 200 ul 씩 첨가하고, 상온에서 한 시간 동안 반응시킨다. 0.01% PBS-T로 플레이트를 6회 세척한 후, 1X ABTS 용액을 각 웰당 200ul 씩 첨가하고, 20분간 상온에서 반응시킨다. 405 nm에서 흡광도를 측정하여 0.5이상의 흡광도를 가지는 클론을 양성 클론으로 정하였다.

스크리닝 결과 162개의 양성 클론을 얻었으며, 시퀀싱(sequencing)하여 각 클론의 염기 서열을 확인하였다. 분석된 염기서열 중 중복된 것을 확인하여, 54개의 서로 다른 염기서열을 가진 그룹으로 나누었다.

실시예 4. 인간화 BBK4 (HBBK) ScFv의 기능분석을 통한 HBBK4 클론의 선택

4-1. HBBK4 ScFv의 순수분리

각 ScFv를 항-E 태그 세파로즈 컬럼(Taq Sepharose column)을 이용하여 순수 분리하였다. 분리 결과는 아래 도 3과 같다.

4-2. HBBK4 ScFv를 이용한 유세포 분석(flow cytometry)

ELISA 스크리닝을 통해 결정된 HBBK4 ScFv 클론들을 순수분리한 후, 인간 4-1BB를 발현하는 주르캣(Jurkat) 8-1 세포에 처리하여 유세포 분석하여 HBBK4의 인간 4-1BB 결합 정도를 확인하였다. 2 x 105의 주르캣(Jurkat) 8-1에 2 ug의 HBBK4를 넣어 30분간 4℃에서 보관한 후, 0.1% BSA가 포함된 PBS로 두 번 세척한다. 2차 항체로 항-인간 IgG-FITC를 처리하여 HBBK4를 검출하였다. 염색한 세포는 유세포 분석기 (FACScan; BD Bioscience)를 이용하여 분석하였다. 도 4는 HBBK4 클론중 쥐 BBK4와 유사한 정도로 인간 4-1BB를 인식하는 것들을 보여주고 있다.

4-3. 경쟁(Compititive) ELISA

다음은 각 클론이 원래의 쥐 BBK4와 같은 에피토프(epitope)를 가지는지에 대한 실험이다. 경쟁(Competitive) ELISA는 Ag으로 4-1BB-GST를 사용하였으며 여기에 인간화전의 쥐 BBK4 항체 농도가 증가됨에 따라 HBBK4 ScFv의 결합 감소 정도를 % 억제(inhibition) 값으로 나타내었다. (수학식 1)

% 억제(inhibition) = 100 x (경쟁자 없는 OD405 - 경쟁자 있는 OD405 )/경쟁자 없는 OD405

도 5 결과는 쥐 BBK4의 농도가 증가함에 따라 % 억제가 증가하며, 따라서 HBBK4 ScFv가 원래의 항체와 동일한 에피토프(epitope)를 가지고 있다는 것을 증명한다. 따라서 HBBK4 ScFv가 쥐 BBK4와 같은 생물학적 효과(biological effect)를 가질 것이라는 것을 강력히 암시한다.

4-4. 인간화된 ScFv의 불변영역(constant region) 연결

HBBK4 ScFv는 VH, 링커(linker), VL이 연결되어 있는 형태이다. 이것을 원래 항체의 형태인 H2L2형태로 만들기 위해서, BBK4의 VH에 선도 서열(leader sequence)을 연결시키고 여기에 각각 인간 IgG1의 불변영역 또는 인간 IgG4의 불변영역을 연결 시켰다. 카파 사슬(kappa chain)에는 선도 서열(leader sequence)과 인간 카파 사슬 서열(human kappa chain sequence)이 연결되었다. 각 단편의 연결은 PCR을 통해서 수행하였다.

4-5. H2L2를 이용한 ELISA

불변영역(Constant region)까지 완전히 인간화된 유전자를 진핵생물 발현 벡터인 pcDNA에 서브클로닝(subcloning)하여 293EBNA 세포에 도입 (transfection)하고 그 세포의 배양액으로 ELISA 및 웨스턴 블러팅(western blotting)을 수행하였다.

ELISA를 위한 항원으로는 4-1BB-GST를 사용하였으며, 각 50개의 트랜스펙턴트(transfectant)의 배양액을 사용하였다. 50개 중에서 가장 높은 발현률을 보인 것은 75 클론이며 표4의 ELISA 결과에서 살펴보면 음성 대조군보다 약15배 높은 값을 보이고 있다.

시 료	흡 수
293 EBNA 배양액에 도입된 HBBK4-75/pcDNA	1.935
293 EBNA 배양액	0.126

선택된 75 클론에서 생성된 항체를 이용하여 웨스턴 블러팅(western blotting)을 실시하였으며, 인간화가 완료된 항체 HBBK4-75 클론이 인간 4-1BB에 잘 결합하는 것을 확인하였다 (도 6).

실험예 1. 항진성 항-쥐 4-1BB 항체를 이용한 동물실험

1-1. 항체

항진성 항-쥐 4-1BB와 저해성 항-CTLA-4 항체는 단백질 G-컬럼 (protein G-column)에 의해 복수(Ascites, 생쥐의 복강 활액)로부터 정제하였다. 대조군으로 사용된 쥐(rat) IgG 는 Sigma 사로부터 구입하였으며, 그 외의 유세포 분석용 항체인 항-CD8-PE (53-6.7), 항-CD4-FITC (GK1.5), 항-CD8-FITC (53-6.7), 항-IFN-γ-PE (XMG1.2), 항-CD11c-PE (HL3), 항-NK1.1-PE (PK136)는 BD PharMingen 사로부터 구입하였다.

1-2. 암모델 및 항체투여

B16-F10 멜라노마(melanoma) 암세포는 Hart에 의해 최초 보고된 것으로 B16 멜라노마의 변이체이며, 낮은 항원성을 가지고 있다. 본 실험을 위해서 C57BL/6 생쥐에 4 × 105 B16-F10 멜라노마 세포를 등쪽 피하에 주사하여 암조직을 형성하였다. 항진성 항-4-1BB (3H3 클론)와 저해성 항-CTLA-4 항체 (4F10)는 암세포 주사와 함께 각각 200㎍을 4일 간격으로 5회 복강 투여하였다. 암조직의 크기는 4일 간격으로 측정하였고(수학식 2), 쥐의 생존율을 확인하기 위해 매일 관찰되었다.

암 조직의 크기=(가로 × 세로 × 높이) × (π/6)

1-3. 암조직내 침윤 면역세포의 분리

항진성 항-4-1BB, 저해성 항-CTLA-4, 또는 쥐(rat) IgG를 투여한 쥐로부터 암세포 주사후 18일째에 암조직을 분리하였다. 분리된 암조직을 HBSS와 섞어 단세포 부유상태(single suspension)으로 만든 후, 63% / 36% 퍼콜 농도구배(percoll gradient)의 상층에 올려 500g에서 45분간 원심분리하였다. 원심분리 후 63%와 36% 퍼콜(percoll) 사이에 형성된 흰색의 면역세포를 수거하여 RPMI1640으로 두 번 세척하여 실험에 사용하였다.

1-4. 유세포 분석을 위한 세포 염색

출수림프절 또는 암조직으로부터 분리한 면역세포에 1ug 2.4G2 Fc 차단제(blocker)를 첨가한후 10분간 4℃ 보관하였다. 준비된 세포를 항-CD4-FITC + 항- CD8-PE, 항-CD8-FITC + 항-CD11c-PE로 30분간 염색한 후 0.1% BSA가 포함된 PBS로 두 번 세척하여 FACScan (BD Bioscience)로 분석하였다. 세포질내 IFN-γ 염색을 위해 항-CD8-FITC로 30분간 표면 염색 후, 500ul 사이토픽스/펌 (Cytofix/Perm; BD PharMingen)으로 상온에서 20분간 배양하여 세포를 고정하였으며, 사포닌(saponin)이 포함된 펌워시 완충액(PermWash buffer; BD PharMingen)로 세척하였다. 펌워시 완충액에 혼탁된 세포에 항-IFN-γ-PE를 첨가하여 30분간 염색한 후 FACScan (BD Bioscience)로 분석하였다.

1-5. 암조직내 침윤된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개수

상기 기술된 바와 같이 암조직 내 침윤된 면역세포를 퍼콜(percoll)을 이용하여 분리한 후 헤마시토미터(hemacytometer) 를 이용하여 그 숫자를 계산하였다. 동시에 유세포 분석을 통해 결정된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율을 암조직내 침윤된 숫자와 곱하여 암조직내 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개수를 계산하였다(수학식 3)

암조직내 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개수 = (암조직내 침윤된 전체 면역세포의 개수 × CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 비율 (%)) / 100

1-6. CD8c+CD11c+ T 세포의 분리

항진성 항-4-1BB 또는 쥐(rat) IgG를 투여한 관절염 쥐로부터 출수림프절을 수거하여, 쥐 IgG 투여 쥐로 부터는 CD8+ T 세포를, 항-4-1BB 항체 투여 쥐로부터는 CD11c+CD8+ T 세포를 분리하였다. 세포는 MACS 마그네틱 분리 시스템을 사용하여 분리하였다. 먼저 준비된 세포에서 마이크로비드(microbead)가 결함된 적절한 항체를 처리하여 CD4+, F4/80+, CD40+, B220+, DX5+ 세포 집단을 제거하였다. 그 후에 CD8 항체를 처리하여 CD8+ T 세포를 분리하였으며, CD11c+CD8+ T 세포는 분리된 CD8+ T 세포에 CD11c-마이크로비드 처리 후, LS 분리 컬럼(Miltenyi Biotec)을 사용하여 CD8+CD11c+와 CD8+CD11c- 세포만을 분리하였다. 각각의 분리된 세포는 96~98%의 고순도를 보여주었다.

1-7. 마이크로어레이(Microarray) 및 RT-PCR

콜라젠 유도성 관절염 모델의 출수림프절로부터 준비된 세포로부터 RNeasy 키트(kit) (Quiagen)을 이용하여 RNA를 추출하였으며, 분리된 RNA는 Affimatrix사의 Genechip을 이용하여 유전자 발현 비교를 하였다.

B16-F10 암모델의 출수림프절로부터 각 세포군을 재분리하였으며, RNA 추출 및 cDNA를 합성하였다. DNA 어레이(array) 결과를 토대로 표 5 및 서열 목록: 21 내지 서열 목록: 58에 명시된 유전자 특이 프라이머를 이용하여 각 유전자의 발현 수준을 비교하였다. 추출한 RNA는 체외 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 합성하였으며, PCR은 0.5ul의 cDNA를 사용하여 각각 0.5 uM 프라이머 농도로 실시하였다.

RT-PCR에 사용된 프라이머의 염기서열

명 칭	정 위 (Orientation)	프 라 이 머	명 칭	정 위 (Orientation)	프 라 이 머
AnnexinA4	Sense	aatcaaccagacataccagc	Tim-3	Sense	atccagcagataccagctaa
	Anti-sense	tcttcaaagcttccagatgt		Anti-sense	tccattgttattatggaggg
Klrg1	Sense	ctttgcaatggtggcttt	IL-4 ig 1	Sense	gtatcttcactttccgggat
	Anti-sense	ctccagccatcaatgttc		Anti-sense	gaggtagaagaagccctcc
CD68 Ag	Sense	gcatatctgttttgaatccc	pleckstrin	Sense	actgaatctggagaaggaca
	Anti-sense	ccttagagagagcaggtcaa		Anti-sense	ttcagtaaacatccctgctt
THRI13	Sense	gtgatgaccaccgtactctt	TIP2	Sense	aaagcaaagcaaatgaagag
	Anti-sense	gcattgactactcggatagc		Anti-sense	tcagtggaggaatggtaatc
NKG2	Sense	cgattcacccttaacacatt	LAG3	Sense	gtctccatcacgtacaacct
	Anti-sense	gctggaattttgagacaaac		Anti-sense	cacaaatctttcctttccag
TGF-β1	Sense	ttgacgtcactggagttgta	Klrg2-A1	Sense	tcctccagagaaactcattg
	Anti-sense	aatagttggtatccagggct		Anti-sense	tacagtttttggaaatgcag
PRP1	Sense	cagcattaccacaagaatga	CD27	Sense	gctgaatctcacagttcctc
	Anti-sense	cccacattccagaagattta		Anti-sense	ccagtgtcacctggatatg
IL-1R II	Sense	cgatgcaggctattacagat	Perforin	Sense	gtcacgtcgaagtacttg
	Anti-sense	atcaaaaatcagcgacactt		Anti-sense	atggctgatagcctgtct
Granzyme B	Sense	cccaggcgcaatgctaat	IFN-γ	Sense	aacgctacacactgcatc
	Anti-sense	ccaggataagaaactcga		Anti-sense	gccgtggcagtaacagcc
GAPDH	Sense	gaacgggaagcttgtcat
	Anti-sense	ctaagcagttggtggtgc

실험예 2. 항진성 항-인간 4-1BB 항체 (BBK4)의 인간화

항진성 항-4-1BB 항체를 이용한 암치료 방법을 사람에게 적용하기 위해서는, 항체 자체의 부작용을 최소화한 인간화(humanization)된 항체를 필요로 한다. 항진성 항-인간 4-1BB 항체인 쥐 BBK4 클론의 중쇄/ 경쇄 아미노산 서열과 가장 유사한 사람의 항체를 검색하여 비교한 후 인간화 작업을 수행하였다. 최종적으로 스크리닝을 통해 선택된 인간화된 항진성 항-인간 4-1BB 항체 - HBBK4 - 는 두가지 형태의 충실한 부분(constant region)-인간 IgG1 또는 IgG4 - 과 융합되었으며, 각각 HBBK4-75G1, HBBK4-75G4로 명명되었다. 최종 제작된 HBBK4 항체의 염기서열 및 아미노산 서열을 도 7a 내지 도 9b 및 서열 목록: 59 내지 서열 목록: 64에 나타내었다.

최종 제작된 HBBK4 항체의 특성을 확인하기 위해 사람의 말초혈액으로부터 분리한 T 세포를 분리하였다. 분리된 세포에 항-CD3 mAb (OKT3)를 처리하여 T 세포의 활성을 유도하였으며, 동시에 인간화된 항-4-1BB 항체 (HBBK4-75)를 농도별로 처리하여 세포의 증식정도를 측정하였다. OKT3에 의해 활성화된 T 세포는 HBBK4-75의 처리 농도에 비례하여 T 세포의 활성이 증가하였으나, HBBK4-75 또는 항-CD28 항체만을 처리할 경우 T 세포의 활성은 일어나지 않았다 (도 7).

따라서 스크리닝을 통해 최종 제작된 인간화 항-인간 4-1BB 항체인 HBBK4-75는 사람의 4-1BB 분자를 인식할 뿐만 아니라, 항진성 항체로서 공동자극을 할 수 있다는 것을 확인하였다.

실험예 3. 항진성 항-4-1BB와 저해성 항-CTLA-4 항체를 이용한 암 복합치료

임상실험에서 항진성 HBBK4의 치료효과를 예상하기 위해, HBBK4와 동일한 특성을 나타내는 쥐의 항진성 항-4-1BB 항체를 사용하여 동물실험을 수행하였다. 동물실험은 B16-F10 멜라노마(melanoma) 암모델을 사용하였으며, 항진성 항-4-1BB 항체와 함께 치료효과를 극대화시키기 위해 T 세포의 반응을 최대화하여 암치료 효과가 나타나는 것으로 알려진 저해성 항-CTLA-4 항체를 함께 사용하였다.

항진성 항-4-1BB 및 저해성 항-CTLA-4 항체 각각의 암치료 효과 및 복합효과를 실험하기 위해, 6주령의 C57BL/6 생쥐에 4 × 105 B16-F10 멜라노마 세포를 등쪽으로 피하주사 하였다. 암세포 주사와 동시에 각각의 항체를 200㎍ 피하주사 하였으며, 4일 간격으로 5회 주사하였다. 대조군으로는 쥐(rat) IgG 항체를 투여하였다. 항진성 항-4-1BB 항체를 투여한 쥐는 대조군인 쥐 IgG를 투여한 쥐에 비해 암조직의 크기가 상대적으로 작았지만 큰 차이를 나타내지는 않았으며, 저해성 항-CTLA-4 항체를 투여한 경우에는 대조군과 동일하게 암세포가 증식하였다. 그러나 두 가지 항체를 동시에 투여한 경우 20일까지 느린 암세포 성장을 보였으며, 그 후에는 서서히 감소하였다 (도 11a). 암세포 주사 후 35일까지의 생존율은 항진성 항-4-1BB 항체를 투여한 쥐의 80%, 저해성 항-CTLA-4 항체를 투여한 쥐의 40%, 두 가지 항체를 투여한 쥐는 100% 생존하였으며, 대조군은 30일 이내에 100% 치사율을 나타내었다 (도 11b).

실험예 4. 4-1BB 자극에 의한 CD8+ T 세포의 증가와 CD11c+CD8+ T 세포의 형성

항진성 항-4-1BB와 저해성 항-CTLA-4 항체의 복합 치료효과를 분석하기 위해 각 그룹의 쥐로부터 출수림프절 (draining lymph node)인 서혜의(inguinal) LN를 수거하여 각 세포군의 비율을 조사하였다. 항진성 항-4-1BB 항체 투여시 암세포 제거에 필수적인 CD8+ T 세포의 비율이 2배로 증가하였으며, CD8+ T 세포의 IFN-γ 발현은 5배 이상 증가하였다 (도 12a, 12b). 저해성 항-CTLA-4 항체를 투여한 경우에는 CD8+ T 세포 및 IFN-γ 발현이 대조군과 큰 차이를 보이지 않았지만, CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두 대조군에 비해 증가된 성향을 나타내었다 (도 12a, 12b). 암치료 효과를 나타내었던 복합투여군의 경우, CD8+ T 세포의 증가는 항-4-1BB 투여군과 유사하였지만 IFN-γ의 발현은 더욱 증가하여 전체 CD8+ T 세포중 약 30%가 IFN-γ를 발현하였다 (도 12a, 12b).

항진성 항-4-1BB 항체를 자가면역질환인 콜라젠 유도성 관절염 (collagen-induced arthritis; CIA)이 발병된 쥐에 투여시 질병의 억제 및 치료가 가능하며, 이러한 치료효과가 CD11c+CD8+ T 세포에 의해 매개된다는 것을 보고하였다 (Seo SK, et al., Nat Med. 10, pp1088-1094, 2004). 따라서 항진성 항-4-1BB 항체를 이용한 암치료 과정에도 동일한 세포군이 형성되는지를 확인하기 위해 출수림프절로부터 분리한 세포를 항-CD11c 및 항-CD8 항체로 염색하여 CD11c+CD8+ T 세포의 존재를 확인하였다. 암모델에서도 항-4-1BB 항체 투여시 동일한 세포군이 형성되며 36%의 CD8+ T 세포가 CD11c+CD8+ T 세포였다. 복합투여시 동일 세포군의 비율은 더욱 증가하여 50%의 CD8+ T 세포가 CD11c를 발현하였다 (도 12c).

이 결과들은 항진성 항-4-1BB 항체 투여시 CD8+ T 세포와 IFN-γ의 발현이 증가하며, 항-CTLA-4 항체는 이러한 효과를 더욱 극대화한다는 것을 보여준다. 또한 항-4-1BB 항체를 이용한 암치료 과정에 CD11c+CD8+ T 세포가 관여할 것이라는 것을 시사한다.

실험예 5. 항진성 항-4-1BB 항체에 의한 암조직내 CD11c+CD8+ T 세포의 침윤

항진성 항-4-1BB 항체 투여에 의한 CD8+T 세포 및 IFN-γ 증가와 CD11c+CD8+ T 세포의 형성이 암세포 증식 억제에 직접적으로 관여했는지를 알아보기 위해 암조직으로부터 면역세포를 분리하여 각 세포군의 비율 및 특징을 분석하였다. B16-F10 멜라노마 세포를 피하주사 하였으며 동시에 각각의 항체 - 쥐 IgG, 항-4-1BB, 항-CTLA-4, 또는 항-4-1BB + 항-CTLA-4 - 를 200㎍씩 4일간격으로 투여하였다. 암세포 주사 후 18일째에 분리된 암조직을 36% / 63% 퍼콜(percoll)을 사용하여 원심분리함으로서 면역세포를 분리하였다. 분리된 세포 중 CD4+ / CD8+ T 세포의 비율 조사하였을때, 대조군인 쥐 IgG를 투여한 쥐는 5% 미만의 CD4+ / CD8+ T 세포가 존재하였다. 그러나 항-4-1BB를 투여한 쥐는 CD8+ T 62%, CD4+ T 13%로 CD8+ T 세포가 높은 수준으로 침윤되어 있었다. 저해성 항-CTLA-4 항체를 투여한 경우 대조군과 유사한 수준이었으며, 복합투여한 경우 항-4-1BB 항체 투여군과 유사한 수준을 나타냈다 (도 13a). 출수림프절에 발견된 CD11c+CD8+ T 세포는 암조직내에도 발견되었으며, 암조직내로 침윤된 CD8+ T 세포의 90% 이상이 CD11c+CD8+ T 세포인 것으로 확인되었다 (도 13b). NK 세포 역시 암세포 제거에 직접적으로 관여한다. 항진성 항-4-1BB 항체에 의한 암억제 과정에 이 세포군의 관여 여부를 조사하기 위해 암조직내 NK 세포의 비율을 조사하였지만, 어떤 실험군에서도 NK 세포의 증가를 확인하지 못하였다 (도 13c).

항진성 항-4-1BB 투여시 암조직내로 침윤되는 세포의 수가 약 두배 증가하였으며, 복합투여를 한 경우 약 2.5배 증가하였다 (도 13d). 유세포분석 결과로부터 암조직내 CD4+ / CD8+ T 세포의 숫자를 계산할 경우, CD8+ T 세포는 항-4-1BB 투여군은 약 10배, 복합투여의 경우에는 약 15배 증가하였다. CD4+ T 세포의 경우 항-4-1BB 투여군은 약간의 증가를 보였으며, 복합투여의 경우에는 4배 이상 증가하였다 (도 13d).

이러한 결과들은 항진성 항-4-1BB 항체 투여에 의해 CD11c+CD8+ T 세포 분화 및 증식이 이루어졌으며, 이 세포군이 암조직내로 침윤함으로서 암세포 증식을 억제한다는 것을 시사한다. 또한 항-CTLA-4 항체는 항-4-1BB 항체의 항암효과를 극대화하였으며, NK 세포는 이러한 과정에 직접적으로 관여하지 않았음을 보여준다.

실험예 6. CD11c+CD8+ T 세포의 유전자 발현분포

항진성 항-4-1BB 항체에 의해 형성된 CD11c+CD8+ T 세포의 특징을 분석하며, 어떤 유전자의 발현에 의해 암세포 증식이 가능한 것인가를 알아보기 위해, CD11c+CD8+ T 세포와 쥐 IgG 투여 쥐의 CD8+ T 세포를 분리하여 유전자 발현의 차이를 비교를 시도하였다. 항진성 항-4-1BB 투여에 의해 자가면역질환의 억제가 가능하며, 이러한 치료효과는 CD11c+CD8+ T 세포를 매개로 가능하다는 것을 보고하였다. 따라서 자가면역질환인 콜라젠 유도성 관절염 (CIA) 모델로부터 분리한 세포 - 항-4-1BB 항체 투여 쥐의 CD11c+CD8+ T 세포와 쥐 IgG 투여 쥐의 CD8+ T 세포 - 를 이용하여 DNA 어레이(array)를 수행하였으며, 그 결과를 토대로 암모델에서 형성되는 CD11c+CD8+ T 세포의 유전자 발현을 RT-PCR로 확인하였다.

콜라젠을 투여하여 관절염을 유도와 동시에 항-4-1BB 또는 쥐 IgG를 200㎍씩 이틀간격으로 5회 주사하였으며, 최종 항체 투여일로부터 4일째에 각 쥐의 출수림프절 - 서혜(inguinal) & 장골(iliac)의 LN -을 수거하여 항-4-1BB 항체 투여 쥐의 CD11c+CD8+ T 세포와 쥐 IgG 투여 쥐의 CD8+ T 세포를 분리하였다. 분리된 세포로부터 RNA를 추출하였으며 Affimatrix 마이크로어레이(microarray) 시스템을 이용하여 두 세포간의 유전자 발현차를 분석하였다. 4-1BB 자극에 의해 형성된 CD11c+CD8+ T 세포는 약 220여개의 유전자에서 높은 발현을 나타내었으며, T 세포의 작용기능(effector function) / 세포자연사(apoptosis) / 항-세포자연사(anti-apoptosis) / 세포의 부착 및 이동(cell adhesion and migration)과 관련된 유전자로서 CD11c+CD8+ T 세포에서 증가된 것을 표 6에 나타내었다.

마이크로어레이(Microarray)를 이용한 CD11c

유 전 자	접힘	유 전 자	접힘
T 세포 작용 기능 (effector functions)		hyaluronan receptor RHAMMV5	1.34
annexin A4	3.2	lymphocyte-activation gene 3	1.25
interleukin-four induced gene 1	2.87	B lymphocyte induced maturation protein	1.25
Scyb9	2.78	Mac-2 antigen	1.2
small inducible cytokine A3	2.66	lectin, galactose binding, soluble 1	1.19
Klrg1	2.47	CD9 antigen	1.16
interleukin 10 receptor, alpha	2.45	RHAMM	1.15
T cell immunoglobulin mucin-3	2.38	CD38 antigen	1.13
peptidoglycan recognition protein	2.32	B-cell CLLlymphoma 7C	1.05
interferon g	2.3
CD68 antigen	2.3	세포자연사 (Apoptosis)
natural killer cell protein group 2-A1	2.27	Fas antigen ligand	3.03
pleckstrin	2.12	calsenilin	2.76
annexin A2	2.07	granzyme K	2.58
MHC class II antigen IE alpha (H2-Ea)	2.05	granzyme B	2.2
CD27L	2	Caspase 3	1.93
natural killer cell protein group 2-A2	1.95	hemopoietic-specific early-response protein	1.84
MHC class II H2-IA-beta chain	1.94	programmed cell death 1	1.53
NKG2	1.92	caspase 1	1.42
Ctla2a	1.88
Ctla2b	1.87	항-세포자연사 (Anti-apoptosis)
MHC class II H2-IA-beta chain	1.84	serine protease inhibitor 12	2.07
4-1BB	1.77	serine protease inhibitor 6	1.92
pleckstrin 1 small isoform	1.76	baculoviral IAP repeat-containing 5	1.66
transmembrane 7 superfamily member 1	1.72	cystatin C	1.62
neurocalcin delta	1.68
metallopeptidase	1.67	세포 접착 및 이주 (Cell adhesion and migration)
lymphotactin	1.6	CD11c	2.67
thyroid hormone receptor interactor 13	1.55	MCP-1	2.49
C1qc	1.49	chemokine (C-C) receptor 2	2.38
interleukin 1 receptor, type II	1.44	C-C chemokine receptor 5	2.07
CD74	1.4	MIP-1 alpha receptor	2.03
CD38 antigen	1.38	catenin alpha 1	1.23
serinethreonine kinase 5	1.37	chemokine-like factor super family 7	1.09
Brca1	1.35	CD166	1.07

콜라젠 유도성 관절염 발병과 동시에 쥐 IgG 또는 항-4-1BB 항체를 200㎍씩 5회 복강주사하였다 콜라젠 면역 후 12일에 각 쥐로부터 출수 림프절을 수거하여, 쥐 IgG 투여 쥐로부터는 CD8+ T 세포를, 항-4-1BB 항체 투여 쥐로부터는 CD11c+CD8+ T 세포를 분리하였다. 분리된 세포로부터 추출된 RNA와 Affimatrix 시스템을 이용하여 두 세포간의 유전자 발현 차이를 조사하였다. CD11c+CD8+ T 세포에서 상대적으로 높게 발현되는 유전자 중 T 세포의 작용기능, 세포자연사, 항-세포자연사, 세포의 부착과 이동에 관련된 유전자만을 표6에 나타내었다.

B16-F10 멜라노마 암세포 주사와 동시에 항-4-1BB 또는 쥐 IgG를 200㎍씩 이틀간격으로 5회 주사하였으며, 최종 항체 투여일로부터 4일째에 각 쥐의 출수림프절(inguinal LN)를 수거하여 CD11c+CD8+ T 세포와 CD8+ T 세포를 분리하였다. 분리된 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 표 6에서 증가된 유전자의 발현 정도를 확인하였다. Tim3, IL-4 ig1, IL-1R II, THRI13, LAG3, 플렉스트린(pleckstrin), TIP2, Klrg2-A1, PRP1, 안넥신(Annexin) A4, TGF-β, Klrg1, CD68 Ag, NKG2, IFN-γ, 퍼포린(perforin), 그란자임(granzyme) B의 발현을 RT-PCR로 확인하였으며, PRP1과 퍼포린을 제외한 대부분의 유전자 발현이 증가되었음을 발견하였다(도 14). 이 결과는 자가면역질환 모델에서 4-1BB 자극에 의해 형성된 CD11c+CD8+ T 세포와 암 모델에서 형성된 세포간에 큰 차이가 없다는 것을 보여준다. 암 모델에서 분리된 CD11c+CD8+ T 세포는 암세포 제거에 필요한 유전자인 IFN-γ와 그란자임 B의 발현수준이 높게 나타나, 이 세포군이 암세포 제거에 효율적일 것이라는 것을 보여주었다. 동시에 T 세포의 증식보다는 CTL 작용기능(effector function)이 강화된 분화상태를 나타내는 Klrg1이 CD11c+CD8+ T 세포에서 높게 발현되었으며, 그 외에도 T 세포의 항-세포자연사(anti-apoptosis)와 관련된 유전자인 안넥신 A4, T 세포의 공동자극분자인 CD27 및 THRI13, T 세포의 기능조절 관련 유전자인 팀(Tim)-3 및 LAG-3의 발현 증가를 확인하였다. 이러한 결과들은 CD11c+CD8+ T 세포가 단순히 CTL 기능이 높은 세포가 아니라, 면역반응을 조절할 수 있는 세포일 가능성이 높다는 것을 시사한다.

하기에 본 발명의 조성물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

HBBK4 항체...........................................100 ㎎

소디움 메타비설파이트................................3.0 ㎎

메틸파라벤...........................................0.8 ㎎

프로필파라벤.........................................0.1 ㎎

주사용 멸균증류수...................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 환제의 제조

HBBK4 항체...........................................120㎎

옥수수 전분..........................................100㎎

멸균증류수...........................................적량

상기의 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법으로 0.3cm 지름으로 제환하여 환제를 제조한다.

제제예 3. 정제의 제조

HBBK4 항체...........................................200 ㎎

유당.................................................100 ㎎

전분.................................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘....................................적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 4. 캡슐제의 제조

HBBK4 항체...........................................100 ㎎

유당..................................................50 ㎎

전분..................................................50 ㎎

탈크...................................................2 ㎎

스테아린산마그네슘.....................................적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

HBBK4 항체...........................................1000 ㎎

설탕....................................................20 g

이성화당................................................20 g

레몬향 .................................................적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

상기와 같이, 본 발명의 HBBK4는 CD11c+CD8+ T세포의 증가와 CTL 기능 및 IFN-γ발현으로 인한 암세포 제거능을 가지고 있으므로 암 질환 치료제 및 암의 면역치료 방법을 제공할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. CD11c+CD8+ T세포의 증가를 유도하는 항-4-1BB 항체의 인간화 항체이며, 서열목록: 59, 61 또는 63의 염기서열 및 서열목록: 60, 62 또는 64의 아미노산 서열을 갖는 HBBK4를 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 피부암 치료용 약학조성물.
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