KR101527300B1 - 4-1ｂｂ 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 결합 분자, 상기 결합 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포, 상기 결합 분자를 제조하는 방법, 상기 결합 분자를 함유하는 제약 조성물, 및 상기 결합 분자 또는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

4-1ＢＢ 결합 분자{4-1BB BINDING MOLECULES}
본 개시내용은 항체, 및 특히 인간 4-1BB에 결합하는 항체에 관한 것이다.
(CD137, TNFRSF9 등으로도 지칭되는) 4-1BB는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 (TNFRS) 중의 한 막횡단 단백질이다. 4-1BB에 대한 현 이해는 발현이 일반적으로 활성화 의존성이고, 활성화된 NK 및 NKT 세포, 조절 T 세포, 수지상 세포 (DC), 자극 비만 세포, 분화 골수성 세포, 단핵구, 호중구, 및 호산구를 비롯한, 광범위한 면역 세포의 서브세트에 존재한다는 것을 보여준다 (문헌 [Wang, 2009, Immunological Reviews 229: 192-215]). 4-1BB 발현은 또한 종양 맥관구조 상에서 (문헌 [Broll, 2001, Amer. J Clin. Pathol. 115(4):543-549]; [Seaman, 2007, Cancer Cell 11: 539-554]) 및 염증성 또는 아테롬성동맥경화성 내피 부위에서 (문헌 [Drenkard, 2007 FASEB J. 21:456-463]; [Olofsson, 2008, Circulation 117: 1292-1301]) 이루어지는 것으로 입증된 바 있다. 4-1BB를 자극하는 리간드, 즉, 4-1BB 리간드 (4-1BBL)는 활성화된 항원-제시 세포 (APC), 골수성 전구 세포, 및 조혈 줄기 세포 상에서 발현된다.
인간 4-1BB는 255개 아미노산 단백질이다 (수탁 번호 NM_001561; NP_001552). 완전 인간 4-1BB 아미노산 서열은 서열 번호 68에 제공되어 있다. 상기 단백질은 신호 서열 (아미노산 잔기 1-17)에 이어서, 세포외 도메인 (169개의 아미노산), 막횡단 영역 (27개의 아미노산), 및 세포내 도메인 (42개의 아미노산)을 포함한다 (문헌 [Cheuk ATC et al. 2004 Cancer Gene Therapy 11:215-226]). 수용체는 단량체 및 이량체 형태로 세포 표면에서 발현되며, 이는 신호에 대한 4-1BB 리간드와 삼량체를 형성할 가능성을 지니고 있다.
뮤린 및 인간 T 세포에 관한 많은 연구들을 통해 4-1BB가 증진된 세포 증식, 생존, 및 시토카인 생산을 촉진시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Croft, 2009, Nat Rev Immunol 9:271-285]). 일부 4-1BB 효능제 mAb는 공동자극 분자 발현을 증가시키고, 세포용해성 T 림프구 반응을 현저하게 증진시킴으로써 다양한 모델에서 항종양 효능을 일으킨다는 것이 연구를 통해 나타났다. 4-1BB 효능제 mAb의 예방학적 및 치료학적 환경에서의 효능이 입증되어 있다. 추가로, 4-1BB 단일요법 및 병용 요법 종양 모델은 내구성이 있는 항종양 보호 T 세포 기억 반응을 확립시켰다 (문헌 [Lynch, 2008, Immunol Rev. 22: 277-286]). 4-1BB 효능제는 또한 당업계에 알려진 다양한 자가면역 모델에서 자가면역 반응을 억제시키는 것으로 밝혀져 있다(문헌 [Vinay, 2006, J Mol Med 84:726-736]). 4-1BB의 이러한 이중 활성은 면역 관용을 파괴하는 면역요법 접근법과 관련될 수 있는 자가면역 부작용을 약화시키면서, 항종양 활성을 제공하는 잠재능을 제공한다.
인간 4-1BB에 결합하고, 4-1BB 매개 반응을 증가시킴으로써, 암을 비롯한 다양한 질환 및 상태 치료를 위한 잠재능을 지닌 치료제를 제공하는 항체에 대한 요구는 장기간 동안 충족되지 못하고 있다.
개요
인간 4-1BB에 결합하는 단리된 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 결합 단편, 또는 그의 유도체를 제공하는 것이 본 개시내용의 목적이다. 4-1BB에 결합하는 결합 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이 본 개시내용의 또 다른 목적이다. 또한, 본 개시내용의 결합 분자를 하나 이상 사용함으로써 4-1BB 신호전달과 관련되거나 4-1BB 신호전달에 의해 매개되는 질환 및/또는 상태를 치료하는 방법을 제공하는 것이 본 개시내용의 목적이다. 본 개시내용의 이러한 목적 및 다른 목적이 본원에 보다 상세하게 기술되어 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
한 특정 측면에서, 단리된 항체는 서열 번호 68의 아미노산 잔기 115-156을 포함하는 에피토프에서 인간 4-1BB와 결합한다. 일부 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 29의 H-CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 30의 H-CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 31의 H-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 서열 번호 34의 L-CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 35의 L-CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 36의 L-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 항체는 본 개시내용에 기술된 비아코어(BIACore) 검정으로 측정되는 바, 인간 4-1BB 세포외 도메인에 대하여 600 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 또는 1 nM 이하인 KD로 인간 4-1BB와 결합한다.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 항체는 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 15, 또는 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1; (b) 서열 번호 2, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2; 및 (c) 서열 번호 3, 서열 번호 17, 또는 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3을 포함한다.
또 다른 특정 측면에서, 단리된 항체는 (a) 서열 번호 6, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1; (b) 서열 번호 7, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2; 및 (c) 서열 번호 8, 서열 번호 22, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 포함한다.
추가 측면에서, 단리된 항체는 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 15, 또는 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1; (b) 서열 번호 2, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2; 및 (c) 서열 번호 3, 서열 번호 17, 또는 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3을 포함하고; (d) 서열 번호 6, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1; (e) 서열 번호 7, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2; 및 (f) 서열 번호 8, 서열 번호 22, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 추가로 포함한다.
일부 추가의 특정 측면에서, 단리된 항체는
(a) 서열 번호 1에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 2에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 3에 제시된 H-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분;
(b) 서열 번호 15에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 16에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 17에 제시된 H-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분; 및
(c) 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB와 특이적으로 결합하며,
(a) 서열 번호 6에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 7에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 8에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분;
(b) 서열 번호 20에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 21에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 22에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분;
(c) 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 36에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분; 및
(d) 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다.
일부 추가의 특정 측면에서, 단리된 항체는
(a) 서열 번호 1에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 2에 제시된 H-CDR2, 서열 번호 3에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 6에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 7에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 8에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분;
(b) 서열 번호 15에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 16에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 17에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 20에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 21에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 22에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분;
(c) 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 36에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분; 및
(d) 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 특정 측면에서, 단리된 항체는 서열 번호 4, 서열 번호 18, 서열 번호 32, 및 서열 번호 43에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 특정 측면에서, 단리된 항체는 서열 번호 9, 서열 번호 23, 서열 번호 37, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 56, 서열 번호 60, 또는 서열 번호 64에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 특정 측면에서, 단리된 항체는 서열 번호 4, 18, 32, 및 43 중 어느 하나에 제시된 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 9, 서열 번호 23, 서열 번호 37, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 56, 서열 번호 60, 및 서열 번호 64 중 어느 하나에 제시된 VL 도메인 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
추가의 특정 측면에서, 단리된 항체는
(a) 서열 번호 4에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 9에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(b) 서열 번호 18에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 23에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(c) 서열 번호 32에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 37 또는 서열 번호 56에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
(d) 서열 번호 43에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 60, 또는 서열 번호 64에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 특정 측면에서, 본 개시내용에 의해 제공되는 단리된 항체는 (i) 서열 번호 11, 서열 번호 25, 서열 번호 39, 서열 번호 47을 포함하는 핵산 서열, 또는 (ii) 고 엄격도 조건하에서 서열 번호 11, 서열 번호 25, 서열 번호 39, 또는 서열 번호 47의 상보성 가닥에 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 VH 쇄를 포함한다.
추가의 특정 측면에서, 단리된 항체는 (i) 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 40, 서열 번호 48, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 62, 또는 서열 번호 66을 포함하는 핵산 서열, 또는 (ii) 고 엄격도 조건하에서 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 40, 서열 번호 48, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 62, 또는 서열 번호 66의 상보성 가닥에 혼성화하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 VL 쇄를 포함한다.
추가의 특정 측면에서, MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1, 또는 MOR-7483.2로부터 선택되는 예시적인 항체와 인간 4-1BB에의 결합에 대하여 경쟁하고/거나 교차 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다.
추가의 특정 측면에서, 인간 4-1BB 상의, 본원에 개시된 임의의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB 상의, MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1, 또는 MOR-7483.2로부터 선택되는 예시적인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
추가의 특정 측면에서, 본 개시내용은 인간 VH 3-23 유전자, VH 1-69 유전자, 또는 VH 5의 생성물이거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 또 다른 특정 측면에서, 본 개시내용은 인간 VL λ3 또는 λ1-13 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 단리된 항체는
a) 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 것;
b) 인간 및 시노몰구스 4-1BB에 결합하는 것;
c) 인간 4-1BB 또는 시노몰구스 4-1BB에는 결합하지만, 래트 또는 마우스 4-1BB에는 결합하지 않는 것;
d) IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것; 및
e) 인간 항체 또는 인간화된 항체인 것
이라는 특성 또는 특징들 중 하나 이상을 가진다.
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공되는 임의의 항체의 항원 결합 부분을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 부분은 Fab 또는 scFv 단편이다.
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공되는 임의의 항체의 유도체를 제공한다.
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 VH 쇄를 코딩하며,
(i) 서열 번호 4, 서열 번호 18, 서열 번호 32, 또는 서열 번호 43에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
(ii) 서열 번호 11, 서열 번호 25, 서열 번호 39, 또는 서열 번호 47에 제시된 핵산 서열; 또는
(iii) 고 엄격도 조건하에서 서열 번호 11, 서열 번호 25, 서열 번호 39, 또는 서열 번호 47에 제시된 핵산 서열의 상보성 가닥에 혼성화하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 핵산을 제공한다.
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 VL 쇄를 코딩하며,
(i) 서열 번호 9, 서열 번호 23, 서열 번호 37, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 56, 서열 번호 60, 또는 서열 번호 64에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열;
(ii) 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 40, 서열 번호 48, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 62, 또는 서열 번호 66에 제시된 핵산 서열; 또는
(iii) 고 엄격도 조건하에서 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 40, 서열 번호 48, 서열 번호 53, 서열 번호 58, 서열 번호 62, 또는 서열 번호 66에 제시된 핵산 서열의 상보성 가닥에 혼성화하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 핵산을 제공한다.
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 임의의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 추가 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 그러한 숙주 세포는 박테리아 또는 포유동물일 수 있다.
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은 임의의 항체, 그의 항원 결합 부분, 또는 그의 유도체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 추가로 비정상적인 세포 성장 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 본 개시내용의 결합 분자 또는 본원에 기술된 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 비정상적인 세포 성장 치료를 필요로 하는 대상체에서의 비정상적인 세포 성장을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 대상체에게 유효량의, 본원에 기술된 결합 분자 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 세포 전이를 감소시키는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 비정상적인 세포 성장 치료를 필요로 하는 대상체에서의 비정상적인 세포 성장 치료용 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 임의의 결합 분자 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다. 추가 측면에서, 본 개시내용은 비정상적인 세포 성장 치료를 필요로 하는 대상체에서의 비정상적인 세포 성장 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 결합 분자 또는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 추가 측면에서, 본 개시내용은 종양 세포 전이 치료를 필요로 하는 대상체에서의 종양 세포 전이 치료에 사용하기 위한 본원에 기술된 결합 분자 또는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 추가 측면에서, 본 개시내용은 종양 세포 전이 치료를 필요로 하는 대상체에서의 종양 세포 전이 치료용 의약의 제조를 위한 본원에 기술된 임의의 결합 분자 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
도 1은 알렉사 플루오르(Alexafluor) 647에 접합된 명시된 4-1BB 항체 또는 대조군 항체와 함께 인큐베이션된, 인간 (좌측 상부), 시노몰구스 (우측 상부), 개 (좌측 하부), 및 래트 (우측 하부)로부터의 비자극 (검은색) 및 PHA 자극(옅은 회색) 1차 PBMC의 평균 형광 강도를 보여주는 4개의 칼럼 그래프이다. 패널은 PHA로 자극받은 인간 및 시노몰구스 PBMC에의 결합을 보여준다.
도 2는 여러 농도의 4-1BB 특이적 mAb 또는 이소형 대조군 mAb로 자극을 받은 4-1BB 발현 293T 세포에서의 루시퍼라제 리포터 활성을 보여주는 2개의 선 그래프이다. 좌측 패널은 시노몰구스 4-1BB를 발현하는 세포에서의 리포터 활성을 보여주는 것이다. 우측 패널은 인간 4-1BB를 발현하는 세포에서의 활성을 보여주는 것이다. 데이터는 이소형 대조군보다 큰 자극 배수로서 표시되어 있다.
도 3 (3a 및 3b)는 항-CD3 및 여러 농도의 4-1BB 항체로 인간 T 세포를 자극한 후 72시간이 경과하였을 때, 세포 배양 배지 중에 존재하는 인간 IL-2의 농도를 보여주는 선 그래프이다. 각 패널 (A 및 B)은 개별 공여체를 나타낸다.
도 4는 4-1BB mAb 또는 이소형 대조군 mAb로 처리된 마우스에서의 인간 말초 혈액 단핵 세포의 확장을 보여주는 산포도이다. 데이터는 0일째 6백만개의 인간 말초 혈액 단핵 세포를 주사맞고, 9일째 1 mg/kg 4-1BB mAb 또는 이소형 대조군 mAb를 주사맞은 개별 NSG 마우스의 말초 혈액 중 연구 24-28일째에 인간 CD45를 발현하는 세포의 비율(%)로서 표시되어 있다. 양측 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정을 사용하여 통계적 유의도를 측정하였다. * p<0.05, ** p<0.005. 비 HBPT는 인간 세포를 주사맞지 않은 동물을 나타낸다.
도 5는 시노몰구스 원숭이에서 4-1BB mAb 투여 후 여러 시점에서의 증식 CD8 중추 기억 T 세포의 변화를 보여주는 2개의 칼럼 그래프이다. 데이터는 (용량 수준-동물 번호)로 지정된 개별 동물을 나타내는 칼럼으로서 제시되어 있으며, 연구 전 개수에 대해 상대적인 Ki-67+ 세포 개수의 동물내 변화 {[(명시된 연구일의 Ki-67+ 세포 개수 - 투여 이전의 Ki-67+ 세포 개수)/투여 이전의 Ki-67+ 세포 개수]*100}로서 나타내었다. CD8 중추 기억 세포는 CD3+, CD8+, CD28+ 및 CD95+인 것으로 확인되었다.
도 6은 0일째 종양 세포 (PC3, 좌측 패널; LOVO, 우측 패널) 및 인간 말초 혈액 단핵 세포가 피하로 주사된 종양 성장을 보여주는 선 그래프이다. 0일째 10 mg/kg의 명시된 4-1BB mAb를 마우스에 주사하였다.
도 7의 좌측 패널은 4-1BB 넉인(knock in) 마우스를 4-1BB mAb 또는 비히클 대조군으로 처리한 후 T 세포 표면 마커 CD8+ 둘 모두에 대하여 양성이며 BrdU 뉴클레오시드 유사체를 혼입한 PBMC의 비율(%)을 나타내는 산포도이다. 우측 패널은 4-1BB 넉인 마우스 내로 피하 주사되며 명시된 농도의 4-1BB mAb로 처리된, 뮤린 흑색종 종양의 성장을 보여주는 선 그래프이다.
도 8은 관련 배선 서열(Relevant Germline Sequence)과 함께 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역(CDR은 밑줄로 표시)의 아미노산 서열 정렬을 보여주는 것이다.
A. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업계의 숙련가가 통상 이해하는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형의 용어는 복수의 의미를 포함하고, 복수형의 용어는 단수의 의미를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기법은 당업계에 주지되어 있고, 일반적으로 사용되는 것이다.
본원에서 사용되는 바, 하기 용어들은 각각 본 섹션에서 그와 관련된 의미를 가진다.
본원에서 정의된 바, "4-1BB 항체"라는 용어는 인간 4-1BB 수용체에 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
본 출원에서 "4-1BB" 및 "4-1BB 수용체"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 이는 인간 4-1BB 수용체 뿐만 아니라, 그의 변이체, 이소폼(isoform), 및 종 상동체를 포함한다. 따라서, 본원에서 정의되고 개시된 바, 결합 분자는 또한 인간 이외의 종으로부터 유래된 4-1BB에도 결합할 수 있다. 다른 경우에서, 결합 분자는 인간 4-1BB에 대하여 완전하게 특이적일 수 있고, 종 또는 다른 유형의 교차 반응성을 보이지 않을 수도 있다.
"하나("a" 및 "an")라는 관사는 관사의 문법상의 대상이 1개 또는 1개 초과(즉, 1개 이상)인 것을 의미한다. 일례로, "한 요소"라는 것은 1개 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 정의된 바, "효능제"라는 용어는 4-1BB에의 결합시 (1) 4-1BB를 자극 또는 활성화시키거나, (2) 4-1BB의 활성, 기능 또는 존재를 증진, 증가, 촉진, 유도, 또는 연장시키거나, 또는 (3) 4-1BB의 발현을 증진, 증가, 촉진, 또는 유도하는 결합 분자를 의미한다.
"아미노산"이라는 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사하게 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연적으로 발생된 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라, 추후 변형된 아미노산, 예컨대, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. "아미노산 유사체"라는 용어는, 천연적으로 발생된 아미노산과 기본 화학 구조는 동일하지만, C-말단 카르복시기, N-말단 아미노기, 또는 측쇄 작용기는 또 다른 작용기로 화학적으로 변형된 것인 화합물을 의미한다. "아미노산 모방체"라는 용어는 아미노산의 일반 화학 구조와는 다른 구조를 가지지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사하게 작용하는 화학적 화합물을 의미한다.
"항체"라는 용어는 당업계에 알려진 용어이며, 이는 2개의 동일한 중쇄 (H) 및 2개의 동일한 경쇄 (L)로 이루어진 기본 4개 폴리펩티드 쇄 구조를 가진 항원 결합 단백질 (즉, 면역글로불린)을 의미한다. 각각의 L 쇄는 하나의 이황화 공유 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소형에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로에 연결된다. 각각의 중쇄는 N-말단에 가변 영역 (본원에서는 VH로 약칭됨)을, 이어서 불변 영역을 가진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2, 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 N-말단에 가변 영역 (본원에서는 VL로 약칭됨)을, 이어서 그의 다른쪽 말단에 불변 영역을 가진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VL은 VH와 함께 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 정렬된다. VH와 VL이 쌍을 형성함으로써 이들은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. IgM 항체는 J 쇄로 불리우는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본 이종사량체 단위로 구성되며, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 반면, 분비된 IgA 항체는 중합하여 J 쇄와 함께 2-5개의 기본 4쇄 단위를 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있다.
VH 및 VL 영역은 추가로는 프레임워크 영역 (FR)이라 명명되는, 보다 더 보존성이 큰 영역이 그 사이에 산재하고 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 명명되는, 과가변 영역으로 세분될 수 있다. CDR 영역은 카바트(Kabat) 또는 코티아(Chothia) 번호 매김 체계를 사용하여 결정될 수 있는데, 이 둘 모두 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]을 참조할 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4인 순서로 배열되어 있는, 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되어 있다. 본 개시내용 전체를 통해, 중쇄의 3개의 CDR은 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3으로 지칭된다. 유사하게, 경쇄의 3개의 CDR은 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3으로 지칭된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 비롯한, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역도 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조할 수 있다.
임의의 척추동물 종으로부터 유래된 L 쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 및 람다로 명명되는, 2개의 뚜렷이 다른 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 그의 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 부류 또는 이소형으로 지정될 수 있다. 각각 α (알파), δ (델타), ε (엡실론), 감마 (γ), 및 뮤 (μ)로 지정된 중쇄를 가지는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM인 5가지의 항체 부류가 존재한다. 항체 중 IgG 부류는 각각 감마 중쇄 Y1 - Y4에 의해 4개의 서브부류 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 추가로 분류될 수 있다.
"항체 유도체" 또는 항체의 "유도체"라는 용어는 항체가 결합하는 것과 동일한 항원 (예컨대, 4-1BB)에 결합할 수 있고, 추가의 분자 엔티티(entity)에 연결된 항체의 아미노산 서열을 포함하는 분자를 의미한다. 항체 유도체에 함유되는 항체의 아미노산 서열은 항체의 전장의 중쇄, 전장의 경쇄, 전장의 중쇄의 임의의 부분 또는 부분들, 전장의 경쇄의 임의의 부분 또는 부분들, 항체의 임의의 다른 단편(들), 또는 완전한 항체일 수 있다. 추가의 분자 엔티티는 화학적 또는 생물학적 분자일 수 있다. 추가의 분자 엔티티의 예로는 화학기, 아미노산, 펩티드, 단백질 (예컨대, 효소, 항체), 및 화학적 화합물을 포함한다. 추가의 분자 엔티티는 예컨대, 검출제, 표지, 마커, 제약 작용제 또는 치료제로서의 용도와 같이, 임의의 유용성을 가질 수 있다. 항체의 아미노산 서열은 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 등에 의해 추가의 분자 엔티티에 부착되거나, 연결될 수 있다. "항체 유도체"라는 용어는 또한 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 보존적 아미노산 치환, 부가 및 삽입과 같은, 4-1BB 항체의 아미노산 서열의 변형으로부터 유도된 분자를 포함한다.
항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"이라는 용어는 항체가 결합하는 항원 (예컨대, 4-1BB)에 결합할 수 있는 능력을 보유하는, 항체의 하나 이상의 부분을 의미한다. 항체의 "항원 결합 단편"의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., Nature 341 :544-546 (1989)]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
"결합 분자"라는 용어는 (1) 항체, (2) 항체의 항원 결합 단편, 및 (3) 항체의 유도체를 포함하며, 이들은 각각 본원에서 정의되는 바와 같다.
"4-1BB와 결합하는," "4-1BB와 결합한다," "4-1BB에 결합하는," 또는 "4-1BB에 결합한다"라는 용어는 시험관내 검정에서, 예컨대, 실시예 6에서 기술된 바와 같은 비아코어 검정에서 500 nM 이하의 친화도 (KD)로 본원에서 정의되는 바와 같은 결합 분자가 인간 4-1BB에 결합하는 것을 의미한다.
"키메라 항체"라는 용어는 상이한 동물 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 항체, 예컨대, 인간 항체로부터 유래된 가변 영역 및 뮤린 면역글로불린 불변 영역을 가지는 것을 의미한다.
"결합에 대해 경쟁한다"라는 용어는 결합 표적에 대한 두 항체의 결합에서 그들의 상호작용을 의미한다. 제2 항체의 존재하에서의 제1 항체의 그의 동족 에피토프와의 결합이 제2 항체의 부재하에서의 제1 항체의 결합과 비교하였을 때 검출가능할 정도로 감소하였다면, 제1 항체가 제2 항체와 결합에 대해 경쟁하는 것이다. 제2 항체의 그의 에피토프에의 결합 또한 제1 항체의 존재하에서 검출가능할 정도로 감소하는 대안적인 경우도 있을 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 즉, 제2 항체는 제1 항체의 그의 각각의 에피토프에의 결합을 억제시키지 않으면서, 제1 항체는 제2 항체의 그의 에피토프에의 결합을 억제시킬 수 있다. 그러나, 각 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합을 검출가능할 정도로 억제시키는 경우, 동일한 정도로든, 더 큰 정도로든, 또는 더 작은 정도로든지간에, 항체는 그의 각 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차 경쟁한다"라고 말할 수 있다.
"에피토프"라는 용어는 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)가 결합하는 항원의 일부분을 의미한다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 병치된 연속하는 아미노산 또는 비연속하는 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 연속하는 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에의 노출시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매 처리시 손실된다. 에피토프는 다양한 개수의 아민노산을 독특한 공간 입체 형태로 포함할 수 있다. 에피토프의 공간 입체 형태를 측정하는 방법으로는 예를 들어, x선 결정화법 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조할 수 있다. 일단 항원상의 원하는 에피토프가 결정되고 나면, 예컨대, 본원에 기술된 기법을 사용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 또한, 항체의 생성 및 특징 규명을 통해서도 바람직한 에피토프에 대한 정보를 밝혀낼 수 있다. 이어서, 상기 정보로부터 동일 에피토프에의 결합에 대하여 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 교차 결합 연구를 수행함으로써 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 즉, 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 찾아내는 것이다. 그의 교차 경쟁에 기초하여 항체를 "비닝(binning)"하는 고성능 방법은 PCT 공보 번호 WO 03/48731에 기술되어 있다.
"배선"이라는 용어는 생식 세포를 통해 모체로부터 자손으로 전달되는, 항체 유전자 및 유전자 세그먼트의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 배선 서열은 B 세포 성숙화 과정 동안 재조합 및 과돌연변이 이벤트에 의해 변경된 성숙 B 세포에서 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 구별된다.
"당화 부위"라는 용어는 당 잔기의 부착을 위한 위치로서 진핵생물 세포에 의해 인식되는 아미노산 잔기를 의미한다. 탄수화물, 예컨대, 올리고당이 부착되는 아미노산은 전형적으로 아스파라긴 (N-연결), 세린 (O-연결), 및 트레오닌 (O-연결) 잔기이다. 특이적 부착 부위는 전형적으로 본원에서 "당화 부위 서열"이라고 지칭되는 아미노산 서열에 의해 신호전달이 이루어진다. N-연결된 당화를 위한 당화 부위 서열은 -Asn-X-Ser- 또는 -Asn-X-Thr- (여기서, X는 프롤린 외에, 임의의 종래 아미노산일 수 있다)이다. "N-연결된" 및 "O-연결된"이라는 용어는 당 분자와 아미노산 잔기 사이의 부착 부위로서 작용하는 화학기를 의미한다. N-연결된 당은 아미노기를 통해 부착되고; O-연결된 당은 히드록실기를 통해 부착된다. "글리칸 점유"라는 용어는 당화 부위에 연결된 탄수화물 모이어티의 존재를 의미한다 (즉, 글리칸 부위가 점유되어 있음을 의미). 폴리펩티드 상에 2개 이상의 잠재적인 당화 부위가 존재하는 경우, 탄수화물 모이어티에 의해 어떤 부위도 점유되지 않을 수 있거나 (0개의 글리칸 부위 점유), 한 부위 (1개의 글리칸 부위 점유) 또는 두 부위 모두 (2개의 글리칸 부위 점유)가 점유될 수 있다.
"숙주 세포"라는 용어는 관심의 대상이 되는 단백질, 단백질 단편, 또는 펩티드를 생성하도록 조작될 수 있는 세포계를 의미한다. 숙주 세포로는 제한없이, 배양된 세포, 예컨대, 설치류 (래트, 마우스, 기니아 피그, 또는 햄스터)로부터 유래된 포유동물 배양된 세포, 예컨대, CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0; 또는 인간 조직 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 및 곤충 세포, 및 트랜스제닉 동물 또는 배양된 조직 내에 포함된 세포를 포함한다. 상기 용어는 특정 대상체 세포 뿐만 아니라, 상기 세포의 자손 또한 포함한다. 돌연변이 또는 환경상의 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은 모체 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이는 여전히 "숙주 세포"라는 용어의 범주 내에 포함된다.
"인간 항체"라는 용어는 경쇄 및 중쇄의 전체 아미노산 서열이 인간 면역글로불린 유전자로부터 유래된 것인 항체를 의미한다. 인간 항체가 마우스에서, 마우스 세포에서, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산된 것이라면, 이는 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
"인간화된 항체"라는 용어는 인간 항체 서열로부터 유래된 아미노산 잔기를 함유하는 키메라 항체를 의미한다. 인간화된 항체는, 항체의 프레임워크 및 불변 영역이 인간 항체 서열로부터 유래된 아미노산 잔기를 함유하면서, 비인간 동물 항체로부터 유래된 CDR 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있다.
"예시적인 항체"라는 용어는 본 개시내용에 기술되어 있고, MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1, 및 MOR-7483.2로 지정된 항체 중 어느 하나를 의미한다. 이들 항체는 임의의 부류 (예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM)의 것일 수 있다. 따라서, 상기에서 확인된 각 항체는 VL 및 VH 영역에 대한 동일한 아미노산 서열을 가지는, 5가지 부류 모두의 항체를 포함한다. 추가로, IgG 부류의 항체는 임의의 서브부류 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)의 것일 수 있다. 따라서, IgG 서브부류 중의 상기에서 확인된 각 항체는 VL 및 VH 영역에 대한 동일한 아미노산 서열을 가지는, 4가지 서브부류 모두의 항체를 포함한다. 5가지의 부류 뿐만 아니라, 4가지의 IgG 서브부류의 인간 항체의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 일례로, 인간 IgG1 및 IgG2 불변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 69 및 71에 제공되어 있다. 예시적인 항체의 각각의 IgG2 서브부류에 대한 전장 중쇄의 아미노산 서열은 본 개시내용에 제공되어 있다.
"단리된 항체" 또는 "단리된 결합 분자"라는 용어는 본원에 정의되는 바와 같이, (1) 그의 천연 상태에서 그를 동반하는 천연적으로 회합된 성분과 함께 회합되어 있지 않거나; (2) 같은 종으로부터의 다른 단백질이 없거나; (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나; 또는 (4) 천연 상태에서는 발생하지 않는 것인 항체 또는 결합 분자를 의미한다. 단리된 항체의 예로는 4-1BB를 사용하여 친화성 정제된 4-1BB 항체, 시험관내에서 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 생성된 4-1BB 항체, 및 트랜스제닉 동물로부터 유래된 4-1BB 항체를 포함한다.
"단리된 핵산"이라는 용어는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된, 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 핵산 분자, 또는 그의 조합을 의미한다. 예를 들어, 게놈 DNA와 관련하여, "단리된"이라는 용어는 게놈 DNA가 천연적으로 회합하고 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게, "단리된" 핵산에는 천연적으로 핵산 측면에 위치하는 서열 (즉, 관심의 대상이 되는 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)이 존재하지 않는다.
"ka"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도 상수를 의미하는 반면, "kd"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 의미한다.
"KD"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다. 이는 kd 대 ka의 비 (즉, kd/ka)로부터 수득되고, 몰 농도 (M)로 표현된다. KD는 항체의 그의 결합 파트너에 대한 친화성의 척도로서 사용된다. KD가 작을수록, 항체가 더욱 밀착하여 결합하거나, 항체와 항원 사이의 친화도가 더 크다. 예를 들어, 해리 상수가 나노몰 (nM)인 항체는 해리 상수가 마이크로몰 (μM)인 항체보다 더 밀착하여 특정 항원에 결합하다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립되어 있는 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 항체의 KD를 측정하는 한 방법은 표면 플라스몬 공명을 사용하여, 전형적으로는 바이오센서 시스템, 예컨대, 비아코어® 시스템을 사용함으로써 진행된다. 비아코어™ 시스템을 사용하는 검정 방법 (비아코어 검정)은 본 개시내용의 실시예 섹션에 기술되어 있다.
"포유동물"이라는 용어는 포유동물 부류의 임의의 동물 종을 의미한다. 포유동물의 예로는 인간; 실험실용 동물, 예컨대, 래트, 마우스, 시미안 및 기니아 피그; 가축, 예컨대, 고양이, 개, 토끼, 소, 양, 염소, 말, 및 돼지; 및 우리에 갇힌 야생 동물, 예컨대, 사자, 호랑이, 코끼리 등을 포함한다.
"모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종성인 항체 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하고, 집단에 포함된 개별 항체가 동일한 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대한 것이다. 추가로, 상이한 결정기 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 그의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의한 오염 없이 합성될 수 있다는 점에서 이롭다. "모노클로날"이라는 수식어는 임의의 특정 방법에 의해 항체가 생산되어야 하는 것으로 해석되서는 안된다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵생물 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조). 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
포유동물에서의 특정 질환 상태와 관련하여 "예방하다" 또는 "예방하는"이라는 용어는 질환의 발병을 방지 또는 지연시키거나, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 소견을 방지하는 것을 의미한다.
"재조합 항체"라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체, 예컨대, 또 다른 종의 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 동물로부터 단리된 항체, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 두 폴리펩티드 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 사이에 동일한 아미노산의 비율(%)을 나타낸다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 동일성은 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대, Bestfit, FASTA, 또는 BLAST를 사용하여 측정될 수 있다 (예컨대, 문헌 [Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)]; [Pearson, Methods Mol . Biol . 132:185-219 (2000)]; [Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990)]; [Altschul et al., Nucelic Acids Res . 25:3389-3402 (1997)]을 참조할 수 있다). Bestfit 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 참조 아미노산 서열과 예를 들어 95% 동일하는지 여부를 측정할 때, 파라미터는 동일성(%)이 참조 아미노산 서열 전장에 대하여 계산되도록, 및 참조 서열 중의 아미노산 잔기의 총 개수의 최대 5%까지의 상동성으로 갭이 허용되도록 설정한다. 폴리펩티드 사이의 동일성(%)을 측정하는 상기 언급된 방법은 본원에 개시된 모든 단백질, 그의 단편, 또는 변이체에 적용될 수 있다.
본원에서 정의되는 바와 같은 결합 분자 (예컨대, 항체)와 그의 결합 파트너 (예컨대, 항원)의 상호작용과 관련하여 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적으로 ~에 결합하다"라는 용어는 주어진 조건 세트하에서 동물 종으로부터의 관심의 대상이 되는 항원과 다른 동물 종으로부터의 항원 오르토로그를 구별할 수 있는 결합 분자의 능력을 의미한다. 시험관내 검정으로 측정된 바, 4-1BB 결합 분자가 래트 또는 마우스의 4-1BB에 결합할 때의 EC50의 50% 미만인 EC50으로 인간 4-1BB에 결합한다면, 4-1BB 결합 분자는 인간 4-1BB에 특이적으로 결합한다고 말할 수 있다. 항체의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 방법의 예로는 PHA 자극 1차 세포를 사용하는 FACS, 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-테스트 및 펩티드 스캔을 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같은 결합 분자 (예컨대, 항체)와 그의 결합 파트너 (예컨대, 항원)의 상호작용과 관련하여 "선택적으로 결합하다" 또는 "선택적으로 ~에 결합하다"라는 용어는, 주어진 조건 세트하에서 동물 종으로부터의 관심의 대상이 되는 항원 (예컨대, 인간 4-1BB)과 같은 동물 종으로부터의 다른 항원 (예컨대, 인간 CD40)을 구별할 수 있는 결합 분자의 능력을 의미한다. 시험관내 검정으로 측정된 바, 4-1BB 결합 분자가 인간 CD40 또는 인간 CD134에 결합할 때의 EC50의 10% 미만인 EC50으로 인간 4-1BB에 결합한다면, 4-1BB 결합 분자는 인간 4-1BB에 선택적으로 결합한다고 말할 수 있다.
포유동물에서 특정 질환 상태와 관련하여 "치료하다," "치료하는," 또는 "치료"라는 용어는 질환 상태를 앓는 포유동물에서 바람직한 또는 유익한 효과를 일으키는 것을 의미한다. 바람직한 또는 유익한 효과로는 질환의 하나 이상의 증상 (즉, 종양 성장 및/또는 전이, 또는 면역 세포의 개수 및/또는 활성에 의해 매개되는 다른 효과 등)의 빈도 또는 중증도 감소, 또는 질환, 상태, 또는 장애의 추가 발생 정지 또는 억제를 포함할 수 있다. 포유동물에서 암 치료와 관련된 바람직한 또는 유익한 효과로는 암 세포의 추가 성장 또는 확산 억제, 암 세포 사멸, 암 재발 억제, 암과 관련된 통증 감소, 또는 포유동물의 생존 개선을 포함할 수 있다. 그러한 효과는 주관적이거나 객관적일 수 있다. 예를 들어, 포유동물이 인간인 경우, 인간은 개선된 활력 또는 생명력, 또는 요법에 대한 개선 또는 반응의 주관적인 증상으로서 통증 감소에 주목할 수 있다. 별법으로, 임상의는 신체 검사, 실험실 파라미터, 종양 마커 또는 방사선 촬영술의 발견에 기초하여 종양 크기 또는 종양 부하량의 감소를 관찰할 수 있다. 임상의가 치료에 대한 반응으로서 관찰할 수 있는 일부 실험실 징후로는 검사, 예컨대, 백혈구 계수, 적혈구 계수, 혈소판 계수, 적혈구 침강 속도, 및 다양한 효소 수준의 정규화를 포함한다. 추가로, 임상의는 검출가능한 종양 마커의 감소를 관찰할 수 있다. 별법으로, 예컨대, 초음파도, 핵 자기 공명 검사 및 양전자 방출 검사와 같은 다른 검사를 사용하여 객관적인 개선을 평가할 수 있다.
"벡터"라는 용어는 외래 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 외래 핵산 분자는 재조합 기법, 예컨대, 라이게이션 또는 재조합에 의해 벡터 핵산 분자에 연결된다. 이를 통해 외래 핵산 분자를 숙주 세포 또는 유기체에서 증식시키거나, 선별하거나, 추가로 조작하거나, 또는 발현시킬 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 바이러스, 또는 비리온일 수 있다. 숙주 세포 내로의 도입시 한 유형의 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다 (예컨대, 비-에피솜 포유동물 벡터), 또 다른 유형의 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제될 수 있다 (예컨대, 박테리아 복제 기점을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 작동가능하게 연결된 발현가능한 외래 핵산의 발현을 지시할 수 있는 또 다른 특정 유형의 벡터를 통상 "발현 벡터"로 지칭한다. 발현 벡터는 일반적으로 발현가능한 외래 핵산의 발현을 구동시키는 제어 서열을 갖는다. "전사 벡터"로 알려져 있는, 좀 더 단순한 벡터는 번역은 할 수 없고, 오직 전사만을 할 수 있다: 이는 표적 세포에서 복제될 수는 있지만, 발현은 되지 못한다. "벡터"라는 용어는 그의 기능과는 상관없이 모든 유형의 벡터를 포함한다. 그에 작동가능하게 연결된 발현가능한 핵산의 발현을 지시할 수 있는 벡터가 통상 "발현 벡터"로 지칭된다.
본 개시내용의 방법 및 기법은 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 당업계에 주지되어 있는 방법에 따라, 및 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반 참조 문헌 및 보다 구체적인 참조 문헌에서 기술된 바와 같이 수행된다. 그러한 참조 문헌으로는 예컨대, 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning , A Laboratory Approach , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)], [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, NY (2002)], 및 [Harlow and Lane Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)]을 포함한다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조사의 설명서에 따라, 당업계에서 통상적으로 수행되는 바와 같이, 또는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 화학 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법, 및 상기 화학에서의 실험실 방법 및 기법은 당업계에 주지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제제, 제제화, 및 전달, 및 환자 치료를 위해 표준 기법이 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 20종의 종래 아미노산 및 그의 약어는 종래 사용법을 따른다. 문헌 [Immunology -A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))]을 참조할 수 있다.
B. 인간 4-1BB에 결합하는 결합 분자
본 개시내용은 4-1BB 항체, 4-1BB 항체의 항원 결합 단편, 및 4-1BB 항체의 유도체를 비롯한, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 결합 분자를 제공한다.
B-1. 4-1BB 항체
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열 번호 68의 아미노산 잔기 115-156 내의 에피토프에서 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 서열 번호 29의 H-CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 30의 H-CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 31의 H-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 단리된 항체는 서열 번호 34의 L-CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 35의 L-CDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 36의 L-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 본원 상기에 기술된 항체는 본원 하기에 기술되는 생물학적 특성 중 하나 이상을 가진다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 15, 또는 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1; (b) 서열 번호 2, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2; 및 (c) 서열 번호 3, 서열 번호 17, 또는 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3을 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 6, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1; (b) 서열 번호 7, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2; 및 (c) 서열 번호 8, 서열 번호 22, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 15, 또는 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1; (b) 서열 번호 2, 서열 번호 16, 또는 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2; 및 (c) 서열 번호 3, 서열 번호 17, 또는 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3을 포함하고; (d) 서열 번호 6, 서열 번호 20, 또는 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1; (e) 서열 번호 7, 서열 번호 21, 또는 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2; 및 (f) 서열 번호 8, 서열 번호 22, 서열 번호 36, 또는 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 추가로 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은
(a) 서열 번호 1에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 2에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 3에 제시된 H-CDR3을 포함하는 항체;
(b) 서열 번호 15에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 16에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 17에 제시된 H-CDR3을 포함하는 항체; 및
(c) 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3을 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은
(a) 서열 번호 6에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 7에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 8에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체;
(b) 서열 번호 20에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 21에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 22에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체;
(c) 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 36에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체; 및
(d) 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은
(a) 서열 번호 1에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 2에 제시된 H-CDR2, 서열 번호 3에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 6에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 7에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 8에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체;
(b) 서열 번호 15에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 16에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 17에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 20에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 21에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 22에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체;
(c) 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 36에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체; 및
(d) 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 서열 번호 4, 서열 번호 18, 서열 번호 32, 또는 서열 번호 43에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 서열 번호 9, 서열 번호 23, 서열 번호 37, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 56, 서열 번호 60, 또는 서열 번호 64에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 (1) 서열 번호 4, 서열 번호 18, 서열 번호 32, 또는 서열 번호 43에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열, 및 (2) 서열 번호 9, 서열 번호 23, 서열 번호 37, 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 56, 서열 번호 60, 또는 서열 번호 64에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은
(a) 서열 번호 4에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 9에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(b) 서열 번호 18에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 23에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체;
(c) 서열 번호 32에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 37 또는 서열56에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
(d) 서열 번호 43에 제시된 VH 쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 45, 서열 번호 51, 서열 번호 60, 또는 서열 번호 64에 제시된 VL 쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간 4-1BB에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 에피토프 결합과 관련하여 기술된 항체, 및 CDR 또는 가변 영역의 특이적 아미노산 서열과 관련하여 기술된 항체를 비롯한, 본원 상기 기술된 항체는 (a) 500 nM 이하인 KD로 인간 4-1BB에 결합하는 것; (b) 인간 4-1BB에 대해 효능제 활성을 가지는 것; (c) 최대 1,000 nM까지의 농도에서 인간 CD40 수용체에 결합하지 못하는 것; (d) 최대 1,000 nM까지의 농도에서 인간 CD134 수용체에 결합하지 못하는 것; (e) 최대 100 nM까지의 농도에서 래트, 또는 마우스 4-1BB에 결합하지 못하는 것; (h) 종양 세포 성장을 억제시킬 수 있는 것; 및 (i) 암에 대해 치료 효능을 가지는 것이라는 기능적 특성들 중 하나 이상을 가진다. 일부 추가 실시양태에서, 항체는 본 개시내용에 기술된 비아코어 검정으로 측정되는 바, 인간 4-1BB 세포외 도메인에 대하여 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 또는 1 nM 이하인 KD로 인간 4-1BB에 특이적으로 결합한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 항체는 본 개시내용에 기술된 비아코어 검정으로 측정되는 바, 인간 4-1BB 세포외 도메인에 대하여 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 또는 1 nM 이하인 KD로 인간 4-1BB에 특이적으로 결합하는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 일부 추가 실시양태에서, 항체는 인간 4-1BB에 특이적으로 및 선택적으로 결합하는 인간 항체이다.
다른 실시양태에서, 본원 상기 기술된 항체는 특정 배선 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 배선 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 예컨대, 항체는 인간 VH 1-69 유전자, VH 3-23 유전자, 또는 VH 5 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예시적인 항체로는 MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483.1, 및 MOR-7483.2를 포함하는데, 이들은 각각 인간 배선 VH5 유전자로부터 유래된 아미노산을 함유하는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본원 상기 기술된 항체는 인간 VL λ3 유전자로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원 상기 기술된 항체는 인간 VH 1-69 유전자, VH 3-23 유전자 또는 VH 5 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 인간 VL λ3 유전자의 생성물이거나 그로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하며, 여기서, 항체 또는 그의 일부는 인간 4-1BB에 특이적으로 결합한다. 예시적인 항체로는 MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483.1, 및 MOR-7483.2를 포함하는데, 이들은 각각 인간 배선 VH5 유전자 및 VL λ3 유전자로부터 유래된 아미노산을 각각 함유하는 것이다.
본원에서 사용되는 바, 인간 항체는 항체의 가변 영역이 인간 배선 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득된 것인 경우, 특정 배선 서열"로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심의 대상이 되는 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지 상에 나타난 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심의 대상이 되는 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 면역글로불린 서열"로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 서열이 인간 항체의 서열과 가장 가까운 (즉, 동일성(%)이 가장 큰) 인간 배선 면역글로불린 서열을 선택함으로써 그와 같은 방식으로 확인할 수 있다. 특정 인간 배선 면역글로불린 서열"로부터 유래된" 인간 항체는 예를 들어, 천연적으로 발생된 체세포 돌연변이 또는 의도적인 부위 지정 돌연변이 도입에 기인하여, 배선 서열과 비교하였을 때, 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로 인간 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산과 아미노산 서열 동일성이 90% 이상이고, 다른 종의 배선 면역글로불린 아미노산 서열(예컨대, 뮤린 배선 서열)과 비교하였을 때, 인간 항체를 인간이라고 나타내는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산과 아미노산 서열 동일성이 95% 이상, 또는 심지어는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 Ig 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 아미노산 서열이 동일하다. 전형적으로, 특정 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 보일 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하의, 또는 심지어는 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 보일 수 있다. 예시적인 항체 및 관련 배선의 가변 영역의 아미노산 서열 정렬이 도 6에 제시되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 예시적인 항체, 예컨대, MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1, 또는 MOR-7483.2와 인간 4-1BB에의 결합에 대하여 경쟁 또는 교차 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 4-1BB 상의, 본 개시내용의 임의의 예시적인 항체와 동일한 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁 또는 교차 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다. 또 다른 항체와의 결합에 대하여 경쟁 또는 교차 경쟁할 수 있는 항체의 능력은 당업계에 공지되어 있는 표준 결합 검정, 예컨대, 비아코어 분석법, ELISA 검정, 또는 유세포 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 포화 조건하에 본 개시내용의 예시적인 항체가 인간 4-1BB에 결합할 수 있도록 한 후, 시험 항체의 4-1BB에 결합할 수 있는 능력을 측정할 수 있다. 시험 항체가 예시적인 항체와 동시에 4-1BB에 결합할 수 있다면, 이때 시험 항체는 예시적인 항체와는 다른 에피토프에 결합하는 것이다. 그러나, 시험 항체가 동시에 4-1BB에 결합하지 못한다면, 이때 시험 항체는 동일한 에피토프, 중복 에피토프, 또는 예시적인 항체가 결합하는 에피토프와 매우 인접한 위치에 있는 에피토프에 결합하는 것이다. 상기 실험은 다양한 방법, 예컨대, ELISA, RIA, FACS, 또는 표면 플라스몬 공명을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 기술된 4-1BB 항체는 임의의 부류, 예컨대, IgG, IgM, IgE, IgA, 또는 IgD일 수 있다. 4-1BB 항체는 IgG 부류, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브부류인 것이 바람직하고, IgG2 서브부류인 것인 더 바람직하다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 4-1BB 항체를 한 부류 또는 서브부류로부터 또 다른 부류 또는 서브부류로 전환시킬 수 있다. 항체를 원하는 부류 또는 서브부류로 제조하는 예시적인 방법은 4-1BB 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산, 및 4-1BB 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산을 단리시키는 단계, VH 영역을 코딩하는 서열을 단리시키는 단계, VH 서열을 원하는 부류 또는 서브부류의 중쇄 불변 영역을 코딩하는 서열에 라이게이션시키는 단계, 세포에서 경쇄 유전자 및 중쇄 구축물을 발현시키는 단계, 및 4-1BB 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 개시내용에 의해 제공되는 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있지만, 모노클로날인 것이 바람직하다.
본 개시내용에 의해 제공되는 특정 단리된 항체의 예로는 하기 예시적인 항체: MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483, MOR-7483.1, 및 MOR-7483.2를 포함한다. IgG2 서브부류에 대한 중쇄 가변 영역, 전장의 중쇄, 및 상기 항체의 경쇄 가변 영역, 및 전장의 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 본 개시내용에 제공되어 있다; 이들 서열에 대한 서열 번호 인덱스는 하기 표 1에 제공되어 있다. 상기 예시적인 항체의 CDR의 아미노산 서열은 하기 표 2에 제시되어 있다.
Figure 112013055555339-pat00001
Figure 112013055555339-pat00002
본 개시내용의 항체는 종래 모노클로날 항체 방법, 예컨대, 표준 체세포 세포 혼성화 기법 (예컨대, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975] 참조), B 림프구의 바이러스 또는 발암성 형질전환, 또는 본원 하기에 상세 기술하는 재조합 항체 기술을 비롯한, 당업계에 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 생산은 매우 주지되어 있는 방법이다. 하이브리도마 제조에 일반적인 동물계는 뮤린계이다. 융합을 위한, 면역화 프로토콜 및 면역화된 비장 세포를 단리시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예컨대, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법 또한 공지되어 있다. 본 개시내용에 의해 제공되는 인간 4-1BB 항체를 제조하는 데 사용될 수 있는 주지의 한 방법은 제노마우스(XenoMouse)™ 동물계를 사용하는 것을 포함한다. 제노마우스™ 마우스는, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 큰 단편을 포함하며 마우스 항체 생산이 결핍된, 조작된 마우스 계통이다. 예컨대, 문헌 [Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994)] 및 WO2003/040170을 참조할 수 있다. 동물을 4-1BB 항원으로 면역화시킨다. 4-1BB 항원은 단리 및/또는 정제된 4-1BB인데, 4-1BB인 것이 바람직하다. 이는 4-1BB의 단편, 예컨대, 4-1BB의 세포외 도메인, 특히 서열 번호 68의 아미노산 잔기 115-156을 포함하는 4-1BB 세포외 도메인 단편일 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 동물을 면역화시킬 수 있다. 예컨대, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990]을 참조할 수 있다. 비인간 동물, 예컨대, 마우스, 래트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말을 면역화시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예컨대, 문헌 [Harlow and Lane, 상기 문헌 동일], 및 미국 특허 번호 제5,994,619호를 참조할 수 있다. 면역 반응을 자극시키기 위해 애주번트와 함께 4-1BB 항원을 투여할 수 있다. 예시적인 애주번트로는 완전 또는 불완전 프로인트 애주번트, RIBI (무라밀 디펩티드) 또는 ISCOM (면역자극 복합체)를 포함한다. 4-1BB 항원으로 동물을 면역화시킨 후, 면역화된 동물로부터 단리된 세포로부터, 항체를 생산하는 불멸화된 세포주를 제조한다. 면역화시킨 후, 동물을 희생시키고, 림프절 및/또는 비장 B 세포를 불멸화시킨다. 세포를 불멸화시키는 방법은 세포에 발암 유전자를 전달하는 방법, 세포를 발암성 바이러스로 감염시키고 불멸화된 세포를 선별하는 조건 하에서 이들을 배양하는 방법, 세포를 암유발성 화합물 또는 돌연변이화 화합물에 적용시키는 방법, 세포를 불멸화된 세포, 예컨대, 골수종 세포와 융합시키는 방법 및 종양 억제인자 유전자를 불활성화시키는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 문헌 [Harlow and Lane, 상기 문헌 동일]을 참조할 수 있다. 골수종 세포와의 융합법을 사용할 경우, 골수종 세포가 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는 것 (비분비성 세포주인 것)이 바람직하다. 4-1BB, 그의 일부, 또는 4-1BB를 발현하는 세포를 사용하여 불멸화된 세포를 스크리닝한다. 4-1BB 항체를 생산하는 세포, 예컨대, 하이브리도마를 선별하고, 클로닝하고, 강건한 성장, 고도의 항체 생산 및 하기에 추가로 논의되는 것과 같은 바람직한 항체 특징들을 비롯한 원하는 특징에 대하여 추가로 스크리닝한다. 하이브리도마는 동계 동물, 면역계가 결여되어 있는 동물, 예를 들어, 누드 마우스의 생체내에서, 또는 시험관내 세포 배양물에서 확장될 수 있다. 하이브리도마를 선별, 클로닝 및 확장시키는 방법은 당업계의 숙련가에게 주지되어 있다.
본 개시내용의 항체는 또한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리시키는 상기 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있으며, 그 예로는 실시예 1에 추가로 기술되어 있는 HuCAL® 라이브러리즈(HuCAL® Libraries)가 있다. 예를 들어, 문헌 [Achim Knappik, et al: Fully Synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) Based on Modular Consensus Frameworks and CDRs Randomized with Trinucleotides. J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86]도 참조할 수 있다.
B-2. 항원 결합 단편
일부 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공되는 임의의 4-1BB 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.
항원 결합 단편은 항체의 임의의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 (1) 4-1BB 항체의 경쇄; (2) 4-1BB 항체의 중쇄; (3) 4-1BB 항체의 경쇄로부터의 가변 영역; (4) 4-1BB 항체의 중쇄로부터의 가변 영역; (5) 4-1BB 항체의 하나 이상의 CDR (2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR); 또는 (6) 4-1BB 항체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1, 또는 MOR-7483.2로부터 선택되는 항체의 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 다른 특정 실시양태에서, 4-1BB 항체의 항원 결합 단편은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 항체의 VH 영역에 연결된 항체의 VL 영역을 포함하는 폴리펩티드인 단일 쇄 항체 (scFv)를 포함한다 (문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]).
일부 특정 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab-6032, Fab-7361, Fab-7480, 및 Fab-7483으로 이루어진 군으로부터 선택되는 Fab 단편이다.
B-3. 항체 유도체
일부 추가 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공되는 임의의 4-1BB 항체의 유도체를 제공한다.
한 측면에서, 항체 유도체는 본 개시내용의 예시적인 항체 ("모체 항체")의 아미노산 서열의 변형으로부터 유도되며, 이때 모체 항체 아미노산 서열의 전반적인 분자 구조는 보존된다. 모체 항체 쇄의 임의의 영역, 예컨대, 프레임워크 영역, CDR 영역, 또는 불변 영역의 아미노산 서열이 변형될 수 있다. 변형 유형으로는 모체 항체의 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 유도체는 서열 번호 4, 18, 32, 또는 43 중 어느 것에 제시된 아미노산 서열과 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일한 VH 영역을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 항체 유도체는 서열 번호 9, 23, 37, 45, 51, 56, 60, 또는 64 중 어느 것에 제시된 아미노산 서열과 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98%% 이상, 또는 99% 이상 동일한 VL 영역을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 유도체는 서열 번호 4, 18, 32, 43, 9, 23, 37, 45, 51, 56, 60, 또는 64 중 어느 것에 제시된 아미노산 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환, 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다.
아미노산 치환은 보존적 치환 및 비-보존적 치환 둘 모두를 포함한다. "보존적 아미노산 치환"이라는 용어는 한 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미하는 것으로서, 여기서, 상기 두 아미노산은 특정의 물리-화학적 특성, 예컨대, 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 포함된 잔기의 양친매성 성질이 유사한 것이다. 예를 들어, 전형적으로는 각각의 하기 군 내에서 치환이 이루어질 수 있다: (a) 비극성 (소수성) 아미노산, 예컨대, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌; (b) 극성 중성 아미노산, 예컨대, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민; (c) 양으로 하전된 (염기성) 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 리신, 및 히스티딘; 및 (d) 음으로 하전된 (산성) 아미노산, 예컨대, 아스파르트산 및 글루탐산.
CDR, 프레임워크 영역, 또는 불변 영역을 비롯한, 항체의 아미노산 서열 중 임의 위치에서 변형이 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은, 본 개시내용의 예시적인 항체의 VH 및 VL CDR 서열은 포함하지만, 예시적인 항체의 프레임워크 서열과는 상이한 프레임워크 서열을 함유하는 것인 항체 유도체를 제공한다. 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 그러한 프레임워크 서열은 공개 DNA 데이터베이스, 또는 공개된 참고 문헌으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 진뱅크 데이터베이스에서, 또는 "V베이스(VBase)" 인간 배선 서열 데이터베이스에서에서 살펴볼 수 있다 (문헌 [Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]; [Tomlinson, I. M., et al., J. Mol . Biol . 227:776-798 (1992)]; 및 [Cox, J. P. L. et al., Eur . J. Immunol . 24:827-836 (1994)]). 항체 유도체를 구축할 때 사용될 수 있는 프레임워크 서열은 본 개시내용의 예시적인 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열과 구조상 유사한, 예컨대, 본 개시내용의 예시적인 항체에 의해 사용되는 VH 3-23 프레임워크 서열 및/또는 VL λ3 또는 λ1-13 프레임워크 서열과 유사한 프레임워크 서열을 포함한다. 예를 들어, 예시적인 항체의 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3 서열, 및 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3 서열을, 프레임워크 서열이 유래된 배선 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 가진 프레임워크 영역 상으로 이식시킬 수 있거나, 또는 상기 CDR 서열을 배선 서열과 비교하였을 때 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상으로 이식시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 유도체는 본 개시내용의 예시적인 항체의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 일례로, 하나 이상의 예시적인 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 비인간 동물, 예컨대, 마우스 또는 래트로부터 유래된 항체로부터의 CDR과 함께 조합시킨다. 또 다른 일례에서, 키메라 항체의 CDR 모두는 하나 이상의 예시적인 항체로부터 유래된 것이다. 일부 특정 실시양태에서, 키메라 항체는 예시적인 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함한다. 당업계에 공지된 종래 방법을 사용하여 키메라 항체를 생성할 수 있다.
또 다른 유형의 변형은 VH 및/또는 VL 쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내에서 아미노산 잔기를 돌연변이화시키는 것이다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들) 및 항체 결합에 대한 효과, 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 도입하기 수행될 수 있고, 당업계에 공지된 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가될 수 있다. 전형적으로, 보존적 치환이 도입된다. 돌연변이는 아미노산 부가 및/또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로는 CDR 영역내 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다. 일부 실시양태에서, 항체 유도체는 H-CDR 및/또는 경쇄 CDR에 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 치환은 항체 중 하나 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대, 제한없이, 알라닌 또는 세린으로 교체하는 것이다. 시스테인은 정규 또는 비-정규 시스테인일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 유도체는 예시적인 항체의 아미노산 서열과 비교하여 H-CDR 영역 중에 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 가진다.
변형은 또한 VH 및/또는 VL 영역 내의 프레임워크 잔기에서도 이루어질 수 있다. 전형적으로는, 상기 프레임워크 변이체는 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 제조되는 것이다. 한 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀 돌연변이화"시키는 것이다. 이미 체세포 돌연변이화된 항체는 그 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 항체 프레임워크 서열을 그 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 상기 잔기를 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 입체배치로 복귀시키기 위해, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀 돌연변이화"시킬 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 항체 중 수개는 실시예 6에 추가로 기술되어 있는 바와 같이, 특정 배선 서열로 "복귀 돌연변이화"된 것이다.
추가로, 변형은 또한 예시적인 항체의 Fc 영역 내에서, 전형적으로는 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포 세포독성을 변경시키기 위해 이루어질 수 있다. 일례로, 힌지 영역 중의 시스테인 잔기의 개수를 변경시키기 위해, 예컨대, 증가 또는 감소시키기 위해 CH1의 힌지 영역을 변형시킨다. 이러한 접근법은 추가로 미국 특허 번호 제5,677,425호에 기술되어 있다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 촉진시키기 위해, 또는 항체의 안전성을 증가 또는 감소시키기 위해 CH1의 힌지 영역 중 시스테인 잔기의 개수를 변경시킨다. 또 다른 경우, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이화시킨다.
추가로, 본 개시내용의 항체는 그의 잠재적인 당화 부위 또는 패턴을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 예시적인 항체 MOR-7480 및 MOR-7483 둘 모두, 및 그의 임의의 배선 변이체, 및 MOR-7480 및 MOR-7483의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체는 중쇄 가변 도메인 중 59번 아스파라긴에 잠재적인 N-연결된 당화 부위 (NYS)를 포함한다. 상기 항체의 IgG 버전은 추가로 중쇄 Fc 도메인 중 제2 N-연결된 당화 부위를 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 항체의 IgG2 버전의 경우, Fc N-연결된 당화 부위 (NST)는 중쇄 CH2 도메인 중 292번 아스파라긴에 존재한다. 따라서, 각 중쇄는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체가 0개의 글리칸 점유 (즉, 4개의 잠재적인 당화 부위 중 어느 곳에서도 당화는 없음)에서부터 4개의 글리칸 점유 (즉, 각 쇄 중의 Fab 및 Fc 둘 모두에서 당화가 일어남)에 이르는 범위로 임의의 조합을 포함할 수 있도록 0개, 1개 (Fab 또는 Fc 중 어느 것에) 또는 2개의 글리칸 점유를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 가변 영역 중의 당화 패턴을 변경시키기 위해 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 중에 1 이상의 돌연변이를 함유하는 본 개시내용의 4-1BB 항체의 유도체를 제공한다. 그러한 항체 유도체는 항원에의 결합에 대해 증가된 친화도 및/또는 변형된 특이성을 가질 수 있다. 돌연변이는 V 영역 중에 신규한 당화 부위를 부가할 수 있거나, 하나 이상의 V 영역 당화 부위(들)의 위치를 변경시킬 수 있거나, 또는 기존 V 영역 당화 부위를 제거할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 한 중쇄 가변 영역 중의 잠재적인 N-연결된 당화 부위가 제거된, 중쇄 가변 영역 중 59번 아스파라긴에 잠재적인 N-연결된 당화 부위를 가지는 4-1BB 항체의 유도체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 양 중쇄 가변 영역 모두 중의 잠재적인 N-연결된 당화 부위가 제거된, 중쇄 가변 영역 중 59번 아스파라긴에 잠재적인 N-연결된 당화 부위를 가지는 4-1BB 항체의 유도체를 제공한다. 항체의 당화 패턴을 변경시키는 방법은 예컨대, 미국 특허 번호 제6,933,368호 (이의 개시내용은 본원에서 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 것과 같이, 당업계에 공지되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 추가의 분자 엔티티에 연결된, 본원에 기술된 바와 같은 4-1BB 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 유도체를 제공한다. 추가의 분자 엔티티의 예로는 제약 작용제, 펩티드 또는 단백질, 검출제 또는 검출용 표지, 및 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 유도체는 제약 작용제에 연결된, 본 개시내용의 항체를 포함한다. 제약 작용제의 예로는 세포독성제 또는 다른 암 치료제, 및 방사성 동위원소를 포함한다. 세포독성제의 구체적인 예로는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 티트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제로는 또한 예를 들어, 항대사산물 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예컨대, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신)) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)) 및 항유사분열제 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. 진단학적으로 또는 치료학적으로 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예로는 아이오딘131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항체를 제약 작용제에 연결시키는 방법은 예컨대, 다양한 링커 기술을 사용하는 것과 같이, 당업계에 공지되어 있다. 링커 유형의 예로는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드 함유 링커를 포함한다. 링커 및 치료제를 항체에 연결시키는 방법에 관한 추가의 논의를 위해, 문헌 [Saito et al., Adv . Drug Deliv . Rev. 55:199-215 (2003)]; [Trail, et al., Cancer Immunol . Immunother . 52:328-337 (2003)]; [Payne, Cancer Cell 3:207-212 (2003)]; [Allen, Nat . Rev . Cancer 2:750-763 (2002)]; [Pastan, I. and Kreitman, Curr . Opin . Investig . Drugs 3:1089-1091 (2002)]; [Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv . Drug Deliv . Rev . 53:247-264]도 참조할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 유도체는 4-1BB 항체의 다량체 형태, 예컨대, 항체 이량체, 삼량체, 또는 단량체 항체의 고차 다량체인 4-1BB 항체 다량체이다. 항체 다량체 내의 개별 단량체는 동일하거나 상이할 수 있다. 추가로, 다량체 내의 개별 항체는 동일하거나 상이한 결합 특이성을 가질 수 있다. 항체의 다량체화는 항체의 천연 응집을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 제제 (예컨대, 정제된 IgG1 분자) 중 일부 비율(%)은 항체 동종이량체, 및 다른 고차 항체 다량체를 함유하는 단백질 응집물을 자발적으로 형성한다. 별법으로, 항체 동종이량체는 당업계에 공지된 화학적 연결 기법을 통해, 예컨대, 가교제 사용을 통해 형성될 수 있다. 적합한 가교제로는 적절한 스페이서에 의해 이격화되어 있는, 상이한 2개의 반응기를 가진 이종이작용성 가교제 (예컨대, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르, 숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 및 N-숙신이미딜 S-아세틸티오-아세테이트) 또는 동종이작용성 가교제 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트)을 포함한다. 그러한 링커는 예를 들어, 피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chemical Company: 미국 일리노이주 록퍼드)로부터 상업적으로 입수가능하다. 또한, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법을 통해 항체를 다량체화시킬 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공되는 다른 항체 유도체의 예로는 단일 쇄 항체, 디아바디, 도메인 항체, 나노바디, 및 유니바디를 포함한다. "단일-쇄 항체" (scFv)는, VL 도메인 및 VH 도메인이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 것인, VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된 것이다. 단일 쇄 항체는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). "디아바디"는 2개의 쇄로 구성된 것으로서, 각각의 쇄는 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된 동일 폴리펩티드 쇄 상의 경쇄 가변 영역에 연결된 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, 동일 쇄 상의 두 영역은 서로 쌍을 형성하는 것이 아니라, 다른 쇄 상의 상보적인 도메인과 쌍을 형성함으로써 이중특이적 분자를 형성한다. 디아바디를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448] 및 [Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 도메인 항체 (dAb)는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역에 상응하는, 항체의 작은 기능성 결합 단위이다. 도메인 항체는 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포계에서 잘 발현된다. 도메인 항체 및 그의 제조 방법에 관한 추가의 상세한 설명은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제6,291,158호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,172,197호; 제6,696,245호; 유럽 특허 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609 참조). 나노바디는 항체의 중쇄로부터 유래된 것이다. 나노바디는 전형적으로는 단일의 가변 도메인과 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 포함하며, 원래의 항체의 항원 결합능을 보유한다. 나노바디는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 제6,765,087호, 미국 특허 번호 제6,838,254호, WO06/079372 참조). 유니바디는 IgG4 항체의 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄로 구성된 것이다. 유니바디는 IgG4 항체의 힌지 영역의 제거에 의해 제조될 수 있다. 유니바디 및 그의 제조 방법에 관한 추가의 상세한 설명은 WO2007/059782에서 살펴볼 수 있다.
C. 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 4-1BB 항체를 제조하는 재조합 방법
본 개시내용의 또 다른 측면은 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 항체의 임의의 일부분, 예컨대, CDR, 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함하는 서열, 중쇄의 가변 영역, 경쇄의 가변 영역일 수 있거나, 또는 전장의 중쇄 또는 전장의 경쇄일 수 있다. 본 개시내용의 핵산은 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 전형적으로 핵산은 cDNA 분자이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (1) 예시적인 항체의 H-CDR3 또는 L-CRD3의 아미노산 서열; (2) 예시적인 항체의 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역; 또는 (3) 예시적인 항체의 전장의 중쇄 또는 전장의 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 구성되는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1-10, 15-24, 29-38, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 55-57, 60, 61, 64, 및 65 중 어느 하나에 제시되어 있는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 11-14, 25-28, 39-42, 47-50, 53, 54, 58, 59, 62, 63, 66, 및 67로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 그로 구성된다.
본 개시내용의 핵산은 임의의 적합한 분자 생물학 기법을 사용하여 수득할 수 있다. 하이브리도마에 의해 발현된 항체인 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA를 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기법에 의해 수득할 수 있다. (예컨대, 파지 디스플레이 기법을 사용하여) 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득된 항체인 경우, 항체를 코딩하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를, 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장의 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예컨대, 문헌 [Kabat el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, IgG1 또는 IgG4 불변 영역이 가장 바람직하다. IgG1 불변 영역 서열은 예컨대, Gm(1), Gm(2), Gm(3), 및 Gm(17)과 같이 상이한 개체들 간에 존재하는 것으로 알려져 있는 다양한 대립유전자 또는 알로타입 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 알로타입은 IgG1 불변 영역에서의 천연적으로 발생된 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-코딩 DNA는 오직 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를, 경쇄 불변 영역인 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장의 경쇄 유전자 (뿐만 아니라, Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예컨대, 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 상기 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예컨대, 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시켜, VH 및 VL 서열이 연속하는 단일-쇄 단백질로서 발현되도록 할 수 있는데, 여기서, VL 및 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결되어 있다 (예컨대, 문헌 [Bird et al., Science 242:423-426 (1988)]; [Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:5879-5883 (1988)]; 및 [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)] 참조).
본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공되는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 핵산 분자는 경쇄 또는 중쇄의 일부분 (예컨대, CDR 또는 가변 영역), 전장의 경쇄 또는 중쇄, 중쇄 또는 경쇄의 일부분 또는 전장을 포함하는 폴리펩티드, 또는 항체 유도체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 발현에 유용한 발현 벡터이다.
본 개시내용의 결합 분자를 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄의 일부분 또는 전장을 코딩하는 DNA를, 상기 DNA 분자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 이와 관련하여, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 DNA 분자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 할 수 있도록 항체 유전자가 벡터로 라이게이션되어 있다는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이 되도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 더욱 전형적으로는, 두 유전자 모두 동일 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 항체 유전자는 임의의 적합한 방법 (예컨대, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않을 경우 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, VH 세그먼트가 벡터내 CH 세그먼트(들)에 작동가능하게 연결되고, VK 세그먼트가 벡터내 CL 세그먼트에 작동가능하게 연결되도록, 이미 원하는 이소형 및 서브부류의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터 내로 본원에 기술된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 삽입함으로써 임의의 항체 이소형 및 서브부류의 전장의 항체 유전자를 생성하는 데 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄의 분비를 촉진시키는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는, 신호 펩티드가 프레임내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드, 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에, 본 개시내용의 발현 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. "조절 서열"이라는 용어는 프로모터, 인핸서, 및 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 다른 발현 제어 요소 (예컨대, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 한다. 그러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))]에 기술되어 있다. 조절 서열 선택을 비롯한, 발현 벡터 디자인은 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열의 예로는 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대, 시토메갈로바이러스 (CMV), 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 별법으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 추가로, 상이한 공급원들로부터의 서열들, 예컨대, SV40 초기 프로모터로부터의 서열 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 1형의 긴 말단 반복부를 함유하는 SR 프로모터 시스템으로 조절성 요소가 구성된다 (문헌 [Takebe, Y. et al. (1988) Mol . Cell . Biol. 8:466-472]).
항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에도, 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예컨대, 복제 기점) 및 선별가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예컨대, 미국 특허 번호 제4,399,216호, 제4,634,665호, 및 제5,179,017호 (이들 모두 악셀(Axel) 등) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에 약물, 예컨대, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선별가능한 마커 유전자로는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위한 것) 및 neo 유전자 (G418 선별용)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 임의의 적합한 기법에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 "형질감염"이라는 용어는 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내로 도입하는 데 통상적으로 사용되는 매우 광범위한 기법, 예컨대, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 한다. 비록 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 개시내용의 항체를 발현시키는 것이 가능하기는 하지만, 진핵생물 세포, 전형적으로는 포유동물 숙주 세포에서의 항체의 발현이 가장 전형적이다.
본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공되는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 숙주 세포는 사실상 발현 벡터가 이용가능한 임의의 세포일 수 있다. 이는 예를 들어, 고등 진핵생물 숙주 세포, 예컨대, 포유동물 세포, 하등 진핵생물 숙주 세포, 예컨대, 효모 세포일 수 있고, 원핵생물 세포, 예컨대, 박테리아 세포일 수 있다. 재조합 핵산 구축물의 숙주 세포 내로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE, 덱스트란 매개 형질감염, 전기천공, 또는 파지 감염에 의해 이루어질 수 있다.
형질전환을 위해 적합한 원핵생물 숙주로는 E. 콜라이(E. coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 스트렙토미세스(Streptomyces) 속, 및 스타필로로쿠스(Staphylococcus) 속에 포함되는 다양한 종을 포함한다.
본 개시내용의 결합 분자를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포로는 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예컨대, 문헌 [Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol . 159:601-621 (1982)]에 기술되어 이는 바와 같이, DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-4220 (1980)]에 기술되어 있는 dhfr- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 Sp2 세포를 포함한다. 특히 NS0 골수종 또는 CHO 세포와 함께 사용하기 위한, 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS (글루타민 신테타제) 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙주 세포에서 항체가 발현될 수 있도록 하거나 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체가 분비될 수 있도록 하는 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생산한다. 임의의 적합한 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다.
D. 조성물
다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공된 결합 분자를 함유하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 조성물은 결합 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다. 조성물은 당업계에 공지된 종래 방법에 의해 제조될 수 있다.
"제약 조성물" 및 "제약 제제"라는 용어는 결합 분자의 효과적인 전달을 위한 투여 형태를 제조하는 데 필요한 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제, 또는 담체와 함께, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 결합 분자, 임의의 항체, 임의의 그의 항원 결합 부분, 또는 그의 유도체를 포함하는 조성물을 의미한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공되는 항체, 또는 그의 항원 결합 부분, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 서열 번호 30에 제시되어 있는 CDR 아미노산 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함하고, 상기 조성물은 조성물 중에 존재하는 항체, 또는 그의 항원 결합 부분의 총량과 비교하였을 때, 상기 아미노산 서열의 아스파라긴에서 당화된 상기 항체, 또는 항원 결합 부분을 약 11%, 10%, 8%, 5%, 3%, 또는 2% 이하로 포함하는 것인 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 상기 조성물 중에 존재하는 항체, 또는 그의 항원 결합 부분의 총량과 비교하였을 때, 서열 번호 30의 상기 아미노산 서열의 아스파라긴에서 당화된 상기 항체, 또는 항원 결합 부분을 적어도 약 2% 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "부형제"라는 용어는 활성 제약 성분을 제약 제제로 제제화시키는 데 사용되는 물질을 의미하며; 바람직한 실시양태에서, 부형제는 활성 제약 성분의 주된 치료학적 효과를 저하시키거나 간섭하지 않는다. 바람직하게, 부형제는 치료학상 불활성이다. "부형제"라는 용어는 담체, 희석제, 비히클, 가용화제, 안정화제, 벌크화제, 산성 또는 염기성 pH 조정제 및 결합제를 포함한다. 부형제는 또한 제조 공정의 간접적인 또는 의도되지 않은 결과로서 제약 제제 중에 존재하는 물질일 수도 있다. 바람직하게, 부형제는 인간 및 동물에게 투여하는 데 안전한 것으로 승인받는 받거나 간주되는 것, 즉, GRAS 물질 (일반적으로 안전하다고 간주됨)이다. GRAS 물질은 미국 식품의약국(Food and Drug administration)에 의해 미국연방규정집(Code of Federal Regulations: CFR) 21 CFR 182 및 21 CFR 184 (이는 본원에서 참고로 포함된다)에 열거되어 있다.
"제약상 허용되는 담체"라는 용어는 결합 분자의 전달을 위한 제제화에서 사용하기에 적합한 임의의 불활성 물질을 의미한다. 담체는 점착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 충전제 또는 희석제, 보존제 (예컨대, 항산화제, 항박테리아제, 또는 항진균제), 감미제, 흡수 지연제, 습윤제, 유화제, 완충제 등일 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 덱스트로스, 식물성 오일 (예컨대, 올리브 오일), 염수, 완충제, 완충처리된 염수, 및 등장제, 예컨대, 당, 폴리알콜, 소르비톨, 및 염화나트륨을 포함한다.
"완충화제"라는 용어는 제약 제제의 pH를 안정화시키는 제약상 허용되는 부형제를 의미한다. 적합한 완충제가 당업계에 주지되어 있고, 이는 문헌상에서 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 히스티딘 완충제, 글리신 완충제, 트리스 또는 아세테이트 완충제, 및/또는 그의 각각의 유리 산 또는 염기 뿐만 아니라, 그의 다양한 염 및/또는 산 및 염기의 혼합물이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충제는 완충화제로서 히스티딘 완충제, 즉, 히스티딘, 일반적으로, L-히스티딘을 포함하는 완충제이다. 특정 완충제는 L-히스티딘, L-히스티딘 모노히드로클로라이드, 또는 L-히스티딘 및 L- 히스티딘 모노히드로클로라이드의 혼합물을 포함하는, L-히스티딘/HCl 완충제이다. L-히스티딘 완충제는 일반적으로 약 0.05 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 1 mg/ml의 농도로 사용된다. L-히스티딘 모노히드로클로라이드 완충제는 일반적으로 약 0.1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml, 또는 약 2 mg/ml 내지 약 4 mg/ml의 농도로 사용된다.
사용되는 완충제와는 상관없이, pH는 당업계에 공지된 산 또는 염기로, 예컨대, 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 시트르산, 수산화나트륨 및 수산화칼륨을 이용하여 약 4.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.0 내지 약 6.0인 범위의 값으로 조정될 수 있다.
한 측면에서 본 발명은 0.1 내지 1 mg/ml의 L-히스티딘; 1 내지 5 mg/ml의 L-히스티딘 모노히드로클로라이드; 50 내지 100 mg/ml의 트레할로스 탈수화물; 0.01 내지 0.1 mg/mL의 EDTA 이나트륨 이수화물; 및 0.05 내지 1 mg/mL의 폴리소르베이트 80을 포함하며, pH 범위가 4.0 내지 7.0인 제약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 결합 분자의 농도는 약 10 내지 약 22 mg/ml 범위이다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 완충화제는 히스티딘 완충제, 예를 들어, L-히스티딘/HCl 완충제, 또는 아세테이트 완충제 또는 아세트산나트륨 완충제이다. 특정 실시양태에서, 완충화제는 L-히스티딘/HCl이다.
특정 실시양태에서, 완충제의 농도는 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 또는 1 mM 내지 약 25 mM이다.
본 발명의 조성물의 pH는 하기 범위: 3 내지 10, 또는 4 내지 9로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 완충화제는 pH 5.0 내지 6.0 또는 5.5±0.3을 제공한다. 폴리펩티드 또는 조성물의 다른 성분들의 가용성 또는 안정성을 개선시키기 위해서는 상기 범위 안으로 또는 밖으로의 통상적인 pH 조정이 필요할 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 폴리소르베이트, 예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리소르베이트 80 농도는 0.01 내지 10 mg/ml, 0.5 내지 5 mg/ml 또는 0.1 내지 0.5 mg/ml이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 1 이상의 안정화제는 염, 예를 들어, 염화나트륨, 당류, 트레할로스 이수화물 또는 수크로스, 및 아미노산, 예컨대, 아르기닌 히드로클로라이드의 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 1 이상의 안정화제의 농도의 10 내지 200 mg/ml, 20 내지 150 mg/ml, 또는 50 내지 100 mg/ml이다.
본원에서 사용되는 바, "킬레이팅제"라는 용어는 일반적으로 금속 이온에의 1 이상의 결합 (예컨대, 공유, 이온 등)을 형성할 수 있는 부형제를 의미한다. 킬레이팅제는 전형적으로, 불안정성을 촉진시킬 수 있는 종과 복합체를 형성하는 안정화제로서, 선택된 액체 조성물 중에서 사용될 수 있는 다좌 리간드이다. 대개, 킬레이팅제로서 작용할 수 있는 화합물은 전자가 풍부한 작용기를 가질 것이다. 적합한 전자 풍부 작용기로는 카르복실산기, 히드록시기, 및 아미노기를 포함한다. 아미노폴리카르복실산, 히드록시폴리카르복실산, 히드록시아미노카르복실산 등에서 상기 기의 배열을 통해 모이어티는 금속에 결합할 수 있는 능력을 가지게 된다.
그러나, 본 발명은 주로 금속 이온과 결합을 형성할 수 있는 킬레이팅제의 능력에 의해 항체 안정성을 증진시키는 킬레이팅제로 제한하고자 하는 것은 아니다. 그러므로, 본 발명은 킬레이팅제가 본 발명의 조성물을 안정화시키는 특정 기전으로만 제한하고자 하는 것은 아니며, 본원에서 킬레이팅제로 지칭되는 부형제는 주로 금속 이온과 결합을 형성할 수 있는 킬레이팅제의 능력과 전혀 관련이 없는 기전을 통해 특성을 증진시키면서 그의 항체 안정성을 달성할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 킬레이팅제로는 아미노폴리카르복실산, 히드록시아미노카르복실산, N-치환된 글리신, 2-(2-아미노-2-옥소에틸) 아미노에탄 술폰산 (BES), 데페록사민 (DEF), 시트르산, 니아신아미드, 및 데스옥시콜레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 아미노폴리카르복실산의 예로는 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 5 (DTPA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), N-2-아세트아미도-2-이미노디아세트산 (ADA), 비스(아미노에틸)글리콜에테르, N,N,N',N'-테트라아세트산-(EGTA), 트랜스-디아미노시클로헥산 테트라아세트산 (DCTA), 글루탐산, 및 아스파르트산을 포함한다. 적합한 히드록시아미노카르복실산의 예로는 N-히드록시에틸이미노디아세트산 (HIMDA), N,N-비스-히드록시에틸글리신 (비신) 및 N-(트리스히드록시메틸메틸) 10 글리신 (트리신)을 포함한다. 적합한 N-치환된 글리신의 예로는 글리실글리신이 있다. 적합한 데스옥시콜레이트의 예로는 데스옥시콜산나트륨이 있다.
본 발명에 사용되는 킬레이팅제는 가능할 경우, (예컨대, 본원에서 "EDTA" 또는 "에데테이트"로 상호교환적으로 지칭되는) 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태로서 또는 상응하는 염 형태로서 (예컨대, 상응하는 산 부가염 또는 염기 부가염 형태로서, 예컨대, 에데트산이나트륨으로서) 존재할 수 있다. 적합한 산 부가염으로는 예컨대, 알칼리 금속 염 (예컨대, 나트륨 또는 칼륨 염), 알칼리 토금속 염 (예컨대, 칼슘), 및 다른 약한 결합의 금속 이온을 사용하여 제조될 수 있는 염을 포함한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 염의 성질 및 중화시키고자 하는 전하의 개수는 존재하는 카르복실기의 개수 및 안정화 킬레이팅제가 공급되는 pH에 따라 달라질 것이다. 이 또한 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 킬레이팅제는 다양한 강도로 특정 표적 이온에 결합한다. 추가 설명으로, EDTA의 적합한 염으로는 에데트산이칼륨, 에데트산이나트륨, 에데트산칼슘이나트륨, 에데트산나트륨, 에데트산삼나트륨, 및 에데트산칼륨을 포함하고; 데페록사민 (DEF)의 적합한 염으로는 데페록사민 메실레이트 (DFM)가 있다.
본 발명에서 사용되는 킬레이팅제는 화합물 또는 상응하는 염의 무수, 용매화된 또는 수화된 형태로 존재할 수 있다. 킬레이팅제가 용매화된, 또는 수화된 형태로 존재하는 경우, 이는 다양한 용해화 또는 수화 상태 (예컨대, 무수, 수화된, 이수화된 및 삼수화된 형태 포함)로 존재할 수 있다. 추가 설명으로, EDTA의 적합한 수화물은 EDTA 이나트륨 이수화물이다. 한 실시양태에서, 이나트륨 EDTA 이수화물의 농도는 0.001 내지 5 mg/ml, 0.01 내지 2 mg/ml, 및 0.02 내지 0.5 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 킬레이팅제는 본원에 기술된 조성물 중 항체의 응집을 감소시키거나 방지할 수 있다. 그러한 킬레이팅제는 킬레이팅제의 보호없이 제제화된 항체의 분해를 감소시키거나 방지할 수 있다.
제약 조성물은 일반적으로는 특정의 의도된 투여 경로에 맞게 적합화될 수 있다. 경구, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는, 화합물을 투여하는 다중 기법이 당업계에 존재한다. 조성물은 임의의 적합한 형태로, 예컨대, 액체, 반고체, 및 고체 투여 형태일 수 있다. 액체 투여 형태의 예로는 액제 (예컨대, 주사용 및 주입용 액제), 마이크로에멀젼, 리포솜, 분산액제, 또는 현탁액제를 포함한다. 고체 투여 형태의 예로는 정제, 환제, 캡슐제, 마이크로캡슐제 및 분제를 포함한다. 결합 분자를 전달하는 데 적합한 조성물의 특정 형태는 멸균 액체, 예컨대, 주사용 또는 주입용 액제, 현탁액제 또는 분산액제이다. 멸균 액제는 적절한 담체 중에 항체를 필요한 양으로 혼입시킨 후, 멸균 정밀 여과하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는, 기본 분산 매질 및 다른 담체를 함유하는 멸균 비히클 내로 항체를 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 액제 제조용의 멸균 분제인 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동 건조 (동결건조)하여 그의 앞서 멸균 여과된 액제로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 원하는 성분의 분제를 수득하는 것을 포함한다. 조성물의 다양한 투여 형태는 당업계에 공지된 종래 기법에 의해 제조될 수 있다.
본 조성물에 포함된 결합 분자의 상대적인 양은 다수의 인자, 예컨대, 사용되는 특이적 결합 분자 및 담체, 투여 형태, 및 원하는 방출 및 약력학적 특징에 따라 달라질 것이다. 한 실시양태에서, 조성물은 결합 분자를 1 내지 100 mg/ml, 5 내지 50 mg/ml, 또는 10 내지 22 mg/ml인 농도로 포함한다. 단일 투여 형태 중 결합 분자의 양은 일반적으로는 치료학적 효과를 발휘하는 양이 되겠지만, 그보다 적은 양으로 존재할 수도 있다. 일반적으로, 상기 양은 투여 형태 총 중량에 대해 약 0.01% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 1% 내지 약 30%인 범위가 될 것이다.
결합 분자 이외에도, 조성물 중에 하나 이상의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 추가의 치료제의 예로는 본원 하기에 기술한다. 조성물 중에 포함시키고자 하는 추가의 치료제의 적합한 양은 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있고, 이는 다수의 인자, 예컨대, 사용되는 특정 작용제 및 담체, 투여 형태, 및 원하는 방출 및 약력학적 특징에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태 중 포함되는 추가의 치료제의 양은 일반적으로는 치료학적 효과를 발휘하는 작용제의 양이 되겠지만, 그보다 적은 양으로도 존재할 수 있다.
E. 결합 분자 및 제약 조성물의 용도
본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자 및 제약 조성물은 치료, 진단, 또는 다른 목적, 예컨대, 면역 반응을 증진시키거나, 암을 치료하거나, 다른 암 요법의 효능을 증진시키거나, 백신 효능을 증진시키거나, 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용하다. 따라서, 다른 측면에서, 본 개시내용은 결합 분자 또는 제약 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 포유동물에게 치료 유효량의, 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 결합 분자는 4-1BB 효능제 또는 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 4-1BB 효능제이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
일부 실시양태에서, 장애는 암이다. 악성이든 양성이든 간에, 및 원발성이든 속발성이든 간에, 4-1BB가 연루된 다양한 암은 본 개시내용에 의해 제공되는 방법으로 치료 또는 예방될 수 있다. 그러한 암의 예로는 폐암, 예컨대, 기관지원성 암종 (예컨대, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 대세포 암종, 및 샘암종), 폐포 세포 암종, 기관지 샘종, 연골종 과오종 (비암성), 및 육종 (암성); 심장암, 예컨대, 점액종, 섬유종, 및 횡문근종; 골암, 예컨대, 골연골종, 연골종, 연골아세포종, 연골 점액양 섬유종, 유골 골종, 거대 세포 종양, 연골육종, 다발 골수종, 골육종, 섬유육종, 악성 섬유 조직구종, 유잉 종양 (유잉 육종), 및 그물 세포 육종; 뇌암, 예컨대, 신경아교종 (예컨대, 다형성 아교모세포종), 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 수모세포종, 척삭종, 신경집종, 뇌실막세포종, 수막종, 뇌하수체 샘종, 송과체종, 골종, 혈관아세포종, 두개인두종, 척삭종, 종자세포종, 기형종, 유피낭종, 및 맥관종; 소화계 암, 예컨대, 평활근종, 표피모양 암종, 샘암종, 평활근육종, 위 샘암종, 장 지방종, 장 신경섬유종, 장 섬유종, 대장 폴립, 및 결장직장암; 간암, 예컨대, 간세포 샘종, 혈관종, 간세포 암종, 섬유층판 암종, 담관암종, 간아세포종, 및 맥관육종; 신장암, 예컨대, 신장 샘암종, 신장 세포 암종, 콩팥세포 암종, 및 신우의 이행 세포 암종; 방광암; 혈액암, 예컨대, 급성 림프구 (림프아구성) 백혈병, 급성 골수성 (골수세포, 골수성, 골수아구, 골수단핵구) 백혈병, 만성 림프구 백혈병 (예컨대, 세자리 증후군(Sezary syndrome) 및 모세포 백혈병), 만성 골수세포 (골수성, 골수원성, 과립구) 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, B 세포 림프종, 균상 식육종, 및 골수증식 장애 (골수증식 장애, 예컨대, 진성 적혈구증가증, 골수섬유증, 고혈소판증, 및 만성 골수세포 백혈병 포함); 피부암, 예컨대, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 카포시 육종, 및 파제트 질환; 두부경부암; 눈 관련 암, 예컨대, 망막아세포종 및 안구내 악성흑색종; 남성 생식계 암, 예컨대, 양성 전립샘 비대, 전립샘암, 및 고환암 (예컨대, 정상피종, 기형종, 배아 암종, 및 융모막암종); 유방암; 여성 생식계 암, 예컨대, 자궁암 (자궁내막 암종), 자궁경부암 (자궁경부 암종), 난소암 (난소 암종), 외음부 암종, 질 암종, 난관암, 및 포상기태; 갑상샘암 (유두상, 소포, 역형성, 또는 수질암 포함); 크롬친화세포종 (부신); 부갑상샘의 비암성 성장; 췌장암; 및 혈액암, 예컨대, 백혈병, 골수종, 비-호지킨 림프종, 및 호지킨 림프종을 포함한다.
일부 다른 실시양태에서, 장애는 자가면역 질환이다. 결합 분자로 치료될 수 있는 자가면역 질환의 예로는 자가면역 뇌척수염, 홍반 루푸스, 및 류마티스 관절염을 포함한다. 결합 분자는 또한 염증 (예컨대, 알레르기성 천식) 및 만성 이식편 대 숙주 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에게 치료 유효량의, 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 4-1BB 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 포유동물은 인간이다. 추가 실시양태에서, 결합 분자는 4-1BB 효능제 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. "면역 반응을 증진시키는"이라는 용어 또는 그이 문법상 변이는 포유동물의 면역계의 임의의 반응을 자극, 선동, 증가, 개선 또는 증강시키는 것을 의미한다. 면역 반응은 세포 반응 (즉, 세포 매개성, 예컨대, 세포독성 T 림프구 매개성), 또는 체액성 반응 (즉, 항체 매개성 반응)일 수 있고, 1차 또는 2차 면역 반응일 수 있다. 면역 반응 증진의 예로는 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성 증가 및 세포용해성 T 세포 생성을 포함한다. 면역 반응 증진은 세포독성 T 림프구 검정, 시토카인 방출 (예를 들어, IL-2 생산), 종양 퇴행, 종양을 보유하는 동물의 생존, 항체 생산, 면역 세포 증식, 세포 표면 마커의 발현, 및 세포 독성을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지되어 있는 다수의 시험관내 또는 생체내 측정법을 사용하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 본 개시내용의 방법은 비처리 포유동물 또는 청구되는 방법을 사용하여 처리된 것이 아닌 포유동물에 의한 면역 반응과 비교하였을 때, 포유동물에 의한 면역 반응을 증진시킨다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 미생물 병원체 (예컨대, 바이러스)에 대한 인간의 면역 반응을 증진시키는 데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 결합 분자는 백신에 대한 인간의 면역 반응을 증진시키는 데 사용된다. 결합 분자는 4-1BB 효능제 또는 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 4-1BB 효능제이다. 한 실시양태에서, 본 방법은 세포 면역 반응, 특히 세포독성 T 세포 반응을 증진시킨다. 또 다른 실시양태에서, 세포 면역 반응은 T 헬퍼 세포 반응이다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응은 시토카인 생산, 특히 IL-2 생산이다. 결합 분자는 미생물 병원체 (예컨대, 바이러스)에 대한 또는 백신에 대한 인간의 면역 반응을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 결합 분자는 4-1BB 효능제 또는 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 분자는 4-1BB 효능제이다.
치료 방법을 실시할 때, 결합 분자는 단일요법으로서 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 치료제 또는 요법과 함께 병용하여 투여될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 별개, 순차적, 또는 동시 투여용의, 하나 이상의 추가의 치료제 또는 요법제와 함께 병용하여 결합 분자를 포함하는, 병용 요법을 제공한다. "추가 요법"이라는 용어는 치료제로서 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 사용하지 않는 요법을 의미한다. "추가의 치료제"라는 용어는 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자 이외의 임의의 치료제를 의미한다. 한 특정 측면에서, 본 개시내용은 포유동물에게 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 병용하여, 치료 유효량의, 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는 병용 요법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
매우 다양한 암 치료제가 본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자와 함께 병용하여 사용될 수 있다. 당업계의 숙련가는 본 개시내용에 의해 제공되는 방법 및 결합 분자와 함께 병용하여 사용될 수 있고, 본원에 기술된 상기와 같은 형태의 요법으로 제한되지 않는 다른 암 요법의 존재 및 개발을 이해할 것이다. 암 치료용 병용 요법에서 사용될 수 있는 추가의 치료제에 관한 카테고리의 예로는 (1) 화학요법제, (2) 면역치료제, 및 (3) 호르몬 치료제를 포함한다.
"화학요법제"라는 용어는 암 세포를 사멸시킬 수 있거나, 암 세포의 성장, 분열, 수복, 및/또는 기능을 방해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 의미한다. 화학요법제의 예로는 WO 2006/088639, WO 2006/129163, 및 US 20060153808 (상기 특허의 개시내용은 본원에서 참고로 포함된다)에 개시된 것을 포함한다. 특정 화학요법제의 예로는 (1) 알킬화제, 예컨대, 클로람부실(류케란(LEUKERAN)), 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)), 이포스파미드 (이펙스(IFEX)), 메클로레타민 히드로클로라이드 (무스타겐(MUSTARGEN)), 티오테파 (티오플렉스(THIOPLEX)), 스트렙토조토신 (자노사르(ZANOSAR)), 카르무스틴 (BICNU, 글리아델 와퍼(GLIADEL WAFER)), 로무스틴 (시누(CEENU)), 및 다카르바진 (DTIC-DOME); (2) 세포독성 항생제를 비롯한, 알칼로이드 또는 식물 빈카 알칼로이드, 예컨대, 독소루비신 (아드리아마이신(ADRIAMYCIN)), 에피루비신 (엘렌스(ELLENCE), 파모루부신(PHARMORUBICIN)), 다우노루비신 (세루비딘(CERUBIDINE), 다우녹솜(DAUNOXOME)), 네모루비신, 이다루비신 (이다마이신 PFS(IDAMYCIN PFS), 자베도스(ZAVEDOS)), 미톡산트론 (DHAD, 노반트론(NOVANTRONE)), 닥티노마이신 (액티노마이신 D, 코스메겐(COSMEGEN)), 플리카마이신 (미트라신(MITHRACIN)), 미토마이신 (무타마이신(MUTAMYCIN)), 및 블레오마이신 (블레녹산(BLENOXANE)), 비노렐빈 타르트레이트 (노벨빈(NAVELBINE)), 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)), 및 빈데신 (엘디신(ELDISINE)); (3) 항대사물질, 예컨대, 카페시타빈 (젤로다(XELODA)), 시타라빈 (시토사르-U(CYTOSAR-U)), 플루다라빈 (플루다라(FLUDARA)), 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)), 히드록시우레아 (히드라(HYDRA)), 메토트렉세이트 (폴렉스(FOLEX), 멕세이트(MEXATE), 트렉살(TREXALL)), 넬라라빈 (아라논(ARRANON)), 트리메트렉세이트 (뉴트렉신(NEUTREXIN)), 및 페메트렉세드 (알림타(ALIMTA)); (4) 피리미딘 길항제, 예컨대, 5-플루오로우라실 (5-FU); 카페시타빈 (젤로다), 랄티트렉세드 (토무덱스(TOMUDEX)), 테가푸르-우라실 (우프토랄(UFTORAL)), 및 겜시타빈 (겜자르); (5) 탁산, 예컨대, 도세탁셀 (탁소테르(TAXOTERE)), 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)); (6) 백금 약물, 예컨대, 시스플라틴 (플라티놀(PLATINOL)) 및 카르보플라틴 (파라플라틴(PARAPLATIN)), 및 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN)); (7) 토포이소머라제 억제제, 예컨대, 이리노테칸 (캄프토사르(CAMPTOSAR)), 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN)), 에토포시드 (에토포포스(ETOPOPHOS), 베페시드(VEPESID), 토포사르(TOPOSAR)), 및 테니포시드 (부몬(VUMON)); (8) 에피포도필로톡신 (포도필로톡신 유도체), 예컨대, 에토포시드 (에토포포스, 베페시드, 토포사르); (9) 엽산 유도체, 예컨대, 류코보린 (웰코보린(WELLCOVORIN)); (10) 니트로소우레아, 예컨대, 카르무스틴 (BiCNU), 로무스틴 (CeeNU); (11) 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 (IGFR), 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR), 및 혈소판-유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)를 비롯한, 수용체 티로신 키나제의 억제제, 예컨대, 게피티닙 (이레사(IRESSA)), 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)), 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)), 이마티닙 메실레이트 (글리벡(GLEEVEC)), 게네피티닙, 라파티닙, 소라페닙, 탈리도미드, 수니티닙 (수텐트(SUTENT)), 악시티닙, 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN), 맙테라(MABTHERA)), 트라스투주맙 (허셉틴(HERCEPTIN)), 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)), 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)), 및 라니비주맙 (루센티스(LUCENTIS)), lym-1 (온콜림(ONCOLYM)), WO2002/053596에 개시된 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)에 대한 항체; (12) 혈관신생 억제제, 예컨대, 베바시주맙 (아바스틴), 수라민 (게르마닌(GERMANIN)), 안지오스타틴, SU5416, 탈리도미드, 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제 (예컨대, 바티마스타트 및 마리마스타트), 및 WO2002055106에 개시되어 있는 것; 및 (13) 프로테아좀 억제제, 예컨대, 보르테조밉 (벨케이드)을 포함한다.
"면역치료제"라는 용어는 포유동물의 면역 반응을 증진시킬 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 의미한다. 면역치료제의 예로는 바실루스 칼메트 구에린(bacillus Calmette-Guerin:BCG); 시토카인, 예컨대, 인터페론; 백신, 예컨대, MyVax 개인 맞춤식 면역요법, 오니박스-P(Onyvax-P), 온코파지(Oncophage), GRNVAC1, Favld, 프로벤지(Provenge), GVAX, 로박신 C(Lovaxin C), 바이오백스ID(BiovaxID), GMXX, 및 NeuVax; 및 항체, 예컨대, 알렘투주맙 (캄파트(CAMPATH)), 베바시주맙 (아바스틴), 세툭시맙 (에르비툭스), 겜투주맙 오조가미신 (밀로타그(MYLOTARG)), 이브리투모맙 튜세탄 (제발린(ZEVALIN)), 파니투무맙(panitumumab) (벡티빅스(VECTIBIX)), 리툭시맙 (리툭산, 맙테라), 트라스투주맙 (허셉틴), 토시투모맙 (벡사(BEXXAR)), 이필리무맙 (예보이(YERVOY)), 트레멜리무맙, CAT-3888, OX40 수용체에 대한 효능제 항체 (예컨대, WO2009/079335에 개시되어 있는 것), CD40 수용체에 대한 효능제 항체 (예컨대, WO2003/040170에 개시되어 있는 것), 및 TLR-9 효능제 (예컨대, WO2003/015711, WO2004/016805, 및 WO2009/022215에 개시되어 있는 것)를 포함한다.
"호르몬 치료제"라는 용어는 호르몬 생산을 억제 또는 제거하거나, 호르몬이 암성 세포의 성징 및/또는 생존에 미치는 효과를 억제 또는 상쇄시키는 화학적 또는 생물학적 물질을 의미한다. 본원의 방법에 적한한 상기와 같은 작용제의 예로는 US20070117809에 개시되어 있는 것을 포함한다. 특정 호르몬 치료제의 예로는 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)), 토레미펜(파레스톤(Fareston)), 풀베스트란트 (파스로덱스(FASLODEX)), 아나스트로졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)), 엑스메스탄 (아로마신(AROMASIN)), 레트로졸 (페마라(FEMARA)), 메게스트롤 아세테이트 (메게이스(MEGACE)), 고세렐린 (졸라덱스(ZOLADEX)), 및 류프롤리드 (루프론(LUPRON))를 포함한다. 본 개시내용의 결합 분자는 또한 비-약물 호르몬 요법, 예컨대, (1) 호르몬 생산에 참여하는 기관 또는 샘, 예컨대, 난소, 고환, 부신, 및 뇌하수체 전부 또는 일부를 절제하는 수술 방법, 및 (2) 표적화된 호르몬의 생산을 억제 또는 제거하기에 충분한 양으로 환자의 기관 또는 샘에 방사선 조사하는 방사선 치료법과 병용하여 사용될 수 있다.
암 치료를 위한 병용 요법은 또한 종양 절제술과 함께 결합 분자를 병용하는 것을 포함한다. 결합 분자는 수술 이전, 그동안, 또는 그 이후에 포유동물에게 투여될 수 있다.
암 치료를 위한 병용 요법은 또한 방사선 요법, 예컨대, 이온화 (전자기) 방사선요법 (예컨대, X-선 또는 감마선) 및 입자 빔 방사선 요법 (예컨대, 선형 고에너지 방사선)과 함께 결합 분자를 병용하는 것을 포함한다. 방사선원은 포유동물에 대해 외부 또는 내부일 수 있다. 결합 분자는 방사선 요법 이전, 그동안, 또는 그 이후에 포유동물에게 투여될 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공되는 결합 분자 및 조성물은 임의의 적합한 장관 투여 경로, 또는 비경구 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. "장관 투여 경로"라는 용어는 위장관의 임의의 부위를 통한 투여를 의미한다. 장관 경로의 예로는 경구, 점막, 협측 및 직장 경로, 또는 위내 경로를 포함한다. 투여의 "비경구 경로"란 장관 경로 이외의 투여 경로를 의미한다. 비경구 투여 경로의 예로는 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내, 종양내, 방광내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 경기관, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내, 피하, 또는 국소 투여를 포함한다. 본 개시내용의 항체 및 조성물은 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예컨대, 경구 섭취, 비위관, 위루관, 주사, 주입, 이식형 주입 펌프, 및 삼투압 펌프에 의해 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로 및 방법은 다수의 인자, 예컨대, 사용되는 특이적 항체, 원하는 흡수 속도, 사용되는 특이적 제제 또는 투여 형태, 치료되는 장애의 유형 또는 중증도, 특정 작용 부위, 및 환자의 상태에 따라 달라질 수 있고, 이는 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
결합 분자의 "치료 유효량"이라는 용어는 의도된 치료학적 목적을 위해 효과적인 양을 의미한다. 예를 들어, 면역 반응을 증진시키는 것과 관련하여, "치료 유효량"은 포유동물의 면역계의 임의의 반응을 자극, 선동, 증가, 개선, 또는 증강시키는 데 효과적인 임의의 양이다. 질환을 치료하는 것과 관련하여, "치료 유효량"이란 치료되는 포유동물에서 임의의 바람직한 또는 유익한 효과를 일으키는 데 충분한 임의의 양이다. 구체적으로, 암 치료에서, 바람직한 또는 유익한 효과의 예로는 암 세포의 추가 성장 또는 확산 억제, 암 세포 사멸, 암의 재발 억제, 암과 관련된 통증 감소, 또는 포유동물의 생존 개선을 포함한다. 4-1BB 항체의 치료 유효량의 범위는 일반적으로 포유동물의 체중 1 kg당 약 0.001 내지 약 500 mg이고, 더욱 일반적으로는 약 0.01 내지 약 100 mg이다. 예를 들어, 상기 양은 포유동물의 체중 1 kg당 약 0.3 mg, 1 mg, 3 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg 또는 100 mg일 수 있다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 항체의 치료 유효량의 범위는 포유동물의 체중 1 kg당 약 0.01-30 mg이다. 일부 다른 실시양태에서, 4-1BB 항체의 치료 유효량의 범위는 포유동물의 체중 1 kg당 약 0.05-15 mg이다. 투여되는 투여량의 정확한 수준은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 이는 다수의 인자, 예컨대, 치료되는 장애의 유형, 및 중증도, 사용되는 특정 결합 분자, 투여 경로, 투여 시간, 치료 지속 기간, 사용되는 특정의 추가 요법, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력, 및 의료계에 주지되어 있는 유사 인자에 따라 달라질 것이다.
결합 분자 또는 조성물은 보통 다회에 걸쳐 투여된다. 예를 들어, 매주, 매월, 매 3개월 마다, 또는 매년인 간격을 두고 단일 투여될 수 있다. 예시적인 치료 요법은 매주 1회, 매 2주마다 1회, 매 3주마다 1회, 매 4주마다 1회, 매월 1회, 매 3개월마다 1회, 또는 매 3개월마다 1회 내지 매 6개월마다 1회로 투여하는 것을 포함한다. 4-1BB 항체에 대한 전형적인 투여 요법은 하기 투여 스케줄: (i) 6회의 투여를 위해 매 4주마다, 이어서, 매 3개월마다; (ii) 매 3주마다; (iii) 체중 1 kg당 3 mg으로 1회, 이어서, 체중 1 kg당 1 mg으로 매 3주마다인 스케줄 중 하나를 사용하여 정맥내 투여를 통해 체중 1 kg당 1 mg 또는 3 mg 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되는데, 이 실시예는 추가로 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다. 본 개시내용을 전체에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고 문헌, 특허, 및 공개된 특허 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 명백하게 포함된다.
실시예
실시예 1: 4-1BB에 결합하는 FAB 단편 생성
본 발명에 의해 제공되는 특정 항체는 원래 인간 4-1BB에 결합하는 Fab로부터 생성된 것이다. 4-1BB FC, 및 인간 4-1BB를 발현하는 세포에 대하여 교대로 패닝한 후, MorphoSys HuCAL 골드(MorphoSys HuCAL GOLD)® 파지미드 라이브러리인 파지 디스플레이 라이브러리로부터 Fab를 선택하였다. 이러한 Fab는 "Fab-6032," "Fab-7361," "Fab-7480," 및 "Fab-7483"으로 지정된 것을 포함하였다. 본 출원에 개시된 4-1BB 항체 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, 및 MOR-7483은 각각 "Fab-6032," "Fab-7361," "Fab-7480," 및 "Fab-7483"으로부터 생성하였다. 주어진 Fab의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 그의 명칭이 Fab 명칭과 같은 수치 번호를 공유하는 것인 예시적인 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 동일한 것이었다. 예를 들어, Fab-7480 및 항체 MOR-7480은 각각 그의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역에 대해 동일한 아미노산 서열을 가졌다.
파지미드 라이브러리는 HuCAL® 컨셉 (문헌 [Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296(1):57-86])에 기초한 것이고, 이는 파지 표면 상에 Fab를 디스플레이하는 CysDisplay™ 기술을 사용하는 것이었다 (뢰닝(Loehning), WO 01/05950). HuCAL 골드®는, 각각이 7개의 VL 마스터 유전자 모두와 함께 조합된 하나의 VH (VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6) 마스터 유전자를 포함하는 6개의 단일 서브라이브러리를 사용하여 선별을 수행하는 옵션 또는 조합된 파지 풀을 사용하여 선별을 수행하는 옵션을 제공한다. 히퍼파지(Hyperphage) (M13KO7ΔpIII, 프로겐(Progen: 독일 하이델베르크)으로부터 입수)에 의해 1회차 패닝을 위한 파지를 제조하였다. HuCAL 골드®는 문헌 [Christine Rothe, et. al, J. Mol. Biol. (2008) 376, 1182-1200]에 상세하게 기술되어 있다.
재조합 인간 4-1BB-Fc (R&D 시스템즈(R&D Systems: 미국 미네소타주 미니애폴리스), 카탈로그 번호 838-4B)를 사용하여 고체상 패닝을 수행하였다.
실시예 2. FAB의 특징 규명
플래그(Flag)/His-태그를 가진 Fab를 포함하는 1가 Fab-포맷을 사용하여 하기 기술되는 검정으로 실시예 1에 기술된 4개의 Fab에 대한 특징 규명을 결정하였다.
2A. 용액 평형 적정 ( SET ) 방법으로 측정된 친화도
메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery: "MSD")로부터의 기기 장치를 사용하여 SET 방법을 이용함으로써 4개의 Fab에 대한 친화도 (KD로 표시)를 측정하였다. 항체 단백질의 단량체 분획을 사용하였다 (Fab의 경우, 수퍼덱스75(Superdex75) ((아마샴 파마시아(Amersham Pharmacia))로, 또는 IgG의 경우, 토소 G3000SWXL(Tosoh G3000SWXL) (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))로 각각 분석용 SEC에 의해 분석된 바, 단량체 함량은 90% 이상).
용액의 친화도 측정은 기본적으로 문헌 [Friguet et al. 1985]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. SET 방법의 감도 및 정확도를 개선시키기 위하여, 전통 ELISA로부터 ECL 기반 기술 (문헌 [Haenel et al. 2005])로 옮겼다.
1 mg/ml 염소-항-인간 (Fab)2 단편 특이적 항체 (디아노바(Dianova))를 MSD 술포-TAG™ NHS-에스테르 (메조 스케일 디스커버리: 미국 메릴랜드주 게이더스버그)로 제조사의 설명서에 따라 표지하였다.
폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 및 검정 완충제로서 0.5% BSA 및 0.02% 트윈 20을 포함하는 PBS (pH 7.4) 중에서 실험을 수행하였다. 예상 KD보다 적어도 10배 높은 농도로 출발하여, 비표지된 인간 4-1BB를 2n 시리즈로 희석시켰다. 항원을 포함하지 않는 웰을 사용하여 B최대 값을 측정하고; 검정 완충제를 포함하는 웰을 사용하여 배경값을 측정하였다. 예컨대, 30 pM Fab (60 ㎕ 최종 부피 중의 최종 농도)를 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 적용된 Fab 농도는 예상 KD와 유사하거나, 그 미만이었다.
표준 MSD 플레이트를 PBS 중 0.05 ㎍/ml 인간 4-1BB로 코팅하고 (30 ㎕/웰), 밤새도록 인큐베이션시키고, 1시간 동안 PBS 중 3% BSA로 차단하였다. 플레이트를 검정 완충제로 세척한 후, 평형화된 샘플을 상기 플레이트로 옮기고 (30 ㎕/웰), 20분 동안 인큐베이션시켰다. 세척한 후, 30 ㎕/웰의 MSD 술포-태그 표지된 검출 항체 (염소 항-인간 (Fab)2)를 1:1,500의 최종 희석률로 MSD 플레이트에 첨가하고, 에펜도르프(Eppendorf) 진탕기 (700 rpm) 상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.
플레이트를 세척하고, 계면활성제와 함께 30 ㎕/웰의 MSD 리드 버퍼 T(MSD Read Buffer T)를 첨가한 후, 섹터 이미저 6000(Sector Imager 6000) (메조 스케일 디스커버리: 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 전기화학 발광 신호를 검출하였다.
맞춤형 피팅 모델을 적용하는 XL피트(XLfit) (IDBS) 소프트웨어를 이용하여 데이터를 평가하였다. Fab 분자의 KD 측정을 위해, 하기 피트 모델을 사용하여 (문헌 [Haenel et al., 2005]), 문헌 [Abraham et al. (1996, J. Molec. Recog. 9(5-6):456-461)]에 따라 변형시켰다:
Figure 112013055555339-pat00003
[Fab]t: 적용된 Fab의 총 농도
x: 적용된 가용성 항원의 총 농도 (결합 부위)
B최대: 항원을 포함하지 않는 Fab의 최대 신호
KD: 친화도
결과는 하기 표 3에 제시되어 있다.
2B. 직접적으로 코팅된 항원에 대한 비아코어 K D 측정
KD 측정을 위해, 피분석물로서 단량체 Fab 분획을 사용하였다 (수퍼덱스75 (아마샴 파마시아)로 분석용 SEC에 의해 분석된 바, 단량체 함량은 90% 이상). 비아코어 3000 장치(비아코어: 스웨덴)를 사용하여 고정화된 항원에의 결합을 분석하였다.
비아코어 3000 장치 (비아코어: 스웨덴 웁살라)를 사용하여 공유적으로 고정화된 항원 CD137/인간 4-1BB에 결합하는 각 Fab의 일련의 희석액을 이용함으로써 반응 속도 상수 k온 및 k오프를 측정하였다. 항원의 공유 고정화를 위해, 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학법을 사용하였다. 약 16 내지 500 nM 범위의 Fab 농도를 사용하여 20 ㎕/분의 유속으로 HBS-EP (10 mM HEPES (pH 7.4); 150 mM NaCl; 3 mM EDTA; 트윈 20 0.005%) 중에서 동역학적 성질을 측정하였다. 각 농도에 대한 주입 시간은 1분이었고, 이어서, 3분 이상의 해리 단계로 이어졌다. 재생을 위해, 글리신/HCl (pH 2) 5 ㎕의 1회 이상 주입을 사용하였다.
전체 IgG 분자의 KD를 예측하기 위해, 농도 범위가 16 내지 500 nM인 2n 일련의 희석액을 사용하여 저밀도의 공유적으로 고정화된 인간 4-1BB (대략 130 RU)를 포함하는 F1 센서 칩 상에 IgG를 샘플로서 주입하였다. 상응하는 KD 값을 등급화하기 위해 정성적으로 비교되는 2가 피트 모델을 사용하여 센서그램을 평가하였다.
BIA 평가 소프트웨어 3.1 (비아코어)을 사용하여 모든 센서그램을 피팅하였다. 결과는 표 3에 제시되어 있다.
2C. ELISA 검정에서의 Fab 의 결합
직접적으로 코팅된 인간 4-1BB/Fc 상에서 표준 ELISA 기법을 사용하여 4개의 Fab의 결합을 측정하였다. 결과는 표 3에 제시되어 있다.
2D. FACS 검정에서의 Fab 의 결합
안정적으로 형질감염되고 인간 4-1BB를 발현하는 HEK293 세포 뿐만 아니라, 300.19 (뮤린 B-세포주) 음성 대조군 세포 상에서 표준 FACS 검정 기법을 사용하여 4개의 Fab의 결합을 측정하였다. 결과는 표 3에 제시되어 있다.
Figure 112013055555339-pat00004
실시예 3: IgG의 특징 규명
본 실시예에 기술되는 바와 같이 추가로 특징 규명하기 위해, Fab-6032, Fab-7361, Fab-7480, 및 Fab-7483을 비롯한, 본원에 기술된 바와 같이 실시된 패닝으로부터 수득된 수개의 Fab를 IgG1 및 IgG4 포맷의 전장의 항체로의 전환에 대하여 선별하였다. 본 실시예에서 확인된 4개의 예시적인 항체, 즉, MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, 및 MOR-7483은 각각 Fab-6032, Fab-7361, Fab-7480, 및 Fab-7483으로부터 전환되었다. IgG 포맷의 항체를 발현시키고, 정제한 후, ELISA, FACS, 및 루시퍼라제 리포터 유전자 검정으로 특징을 규명하였다.
3A. IgG 로의 전환
전장의 IgG 발현을 위해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 인간 IgG1 및 인간 IgG4에 적절한 pMorph®_hIgG 벡터로 서브클로닝시켰다.
3B. 인간 IgG 의 일과성 발현 및 정제
1:1의 비율로 IgG 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 형질감염된 HKB11 세포에서 전장의 인간 IgG의 일과성 발현을 수행하였다. 형질감염 후, 세포 배양 상청액을 수거하고, 각각 3배의 형질감염 부피로 규모를 상향시켰다. 원심분리 및 여과에 의해 상청액을 제거한 후, 표준 단백질 A 친화성 크로마토그래피 (Mab셀렉트 슈어(MabSelect SURE, GE 헬쓰케어(GE Healthcare))하였다. 단백질을 용리시키고, 중화시켰다. 추가의 하류 공정으로는 완충제 교환 및 멸균 여과를 포함하였다. UV-분광광도법에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 변성, 환원 및 변성, 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에서 또는 애질런트 바이오애널라이저(Agilent BioAnalyzer)를 사용하여 IgG의 순도를 분석하였다. HP-SEC를 수행하여 천연 상태의 IgG 제제를 분석하였다.
3C. ELISA 검정을 이용한 IgG 특징 규명
직접 코팅된 환경하에 인간 4-1BB/Fc 및 마우스 4-1BB/Fc에 대한 ELISA 결합 특징 규명을 위해 IgG를 사용하였다. 하기 표 4에는 모두 IgG1 포맷인 항체 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, 및 MOR-7483에 대한 ELISA 결합 결과가 제시되어 있다.
Figure 112013055555339-pat00005
3D. 항체의 결합 선택성 ( FACS 검정)
4-1BB의 세포외 도메인 단백질 및 TNFR 수퍼패밀리의 다른 구성원에 대하여 4-1BB에 대한 항체의 선택성을 평가하였다. 이들 수용체로는 CD40 (TNFRSF5) 및 OX-40 (CD134, TNFRSF4)이 포함되었다. 음성 대조군 HEK293 세포 뿐만 아니라, 안정적으로 형질감염되고 인간 4-1BB를 발현하는 HEK293T-h4-1BB 세포, 및 안정적으로 형질감염되고 OX-40을 발현하는 300.19 세포, 및 안정적으로 형질감염되고 인간 CD40을 발현하는 300.19 세포에 대한 FACS 결합 특징 규명을 위해 IgG를 사용하였다. 모두 IgG1 포맷인 항체 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, 및 MOR-7483에 대한 FACS 결합 결과가 하기 표 5에 제시되어 있다. 최대 1,000 nM까지의 농도에서 OX-40 또는 CD40에 대한 유의적인 결합은 관찰되지 않았으며, 이는 항체가, 시험된 다른 관련 패밀리 구성원에 비하여 4-1BB에 대해 100배 이상 더 큰 선택성을 가지고 있음을 입증한다.
Figure 112013055555339-pat00006
3E. 루시퍼라제 리포터 유전자 검정을 이용한 IgG 특징 규명
또한, 플레이트 결합 검정, 가용성 결합 검정, 및 가교 결합 검정으로 HEK293T-h4-1BB 세포를 이용하는 루시퍼라제 리포터 유전자 검정을 사용하여 결합에 대해 IgG의 특징을 규명하였다. 하기 표 6에는 모두 IgG1 포맷인 항체 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, 및 MOR-7483에 대한 루시퍼라제 리포터 유전자 검정의 결과가 제시되어 있다.
Figure 112013055555339-pat00007
실시예 4. 항체 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, 및 MOR-7483의 구조에 관한 특징 규명
상기 실시예 1-3에 기술되어 있는 방법을 사용하여 "MOR-6032," "MOR-7361," "MOR-7480," 및 "MOR-7483"으로 지정된 항체를 비롯한, 수개의 완전 인간 항-4-1BB IgG2 항체를 제조하였다. 표준 PCR 기법을 사용하여 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, 및 MOR-7483 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 수득하고, 표준 DNA 서열 분석 기법을 사용하여 서열을 분석하였다.
IgG2 서브부류의 중쇄 가변 영역, 전장의 중쇄, 항체 MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1 및 MOR-7483.2의 경쇄 가변 영역 및 전장의 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 본 개시내용에서 제공한다; 상기 서열에 대한 서열 번호 인덱스는 표 1에 제공되어 있다.
MOR-6032 중쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열과 비교함으로써 MOR-6032 중쇄가 인간 배선 VH 1-69로부터의 VH 세그먼트, 인간 배선 4-23으로부터의 D 세그먼트, 및 인간 배선 JH 4a로부터의 JH 세그먼트를 이용한다는 것이 입증되었다.
CDR 영역 결정의 카바트 체계를 이용하여 MOR-6032 VH 서열을 추가로 분석함으로써 각각 서열 번호 1, 2 및 3으로 제시되는 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 영역을 상세히 설명할 수 있었다.
MOR-7361 중쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열과 비교함으로써 7361 중쇄가 인간 배선 VH 3-23으로부터의 VH 세그먼트, 인간 배선 2-8로부터의 D 세그먼트, 및 인간 배선 JH 4a로부터의 JH 세그먼트를 이용한다는 것이 입증되었다.
CDR 영역 결정의 카바트 체계를 이용하여 MOR-7361 VH 서열을 추가로 분석함으로써 각각 서열 번호 15, 16 및 17로 제시되는 중쇄 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 영역을 상세히 설명할 수 있었다.
MOR-7480 및 MOR-7483 중쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열과 비교함으로써 7480 및 7483 중쇄가 인간 배선 VH 5로부터의 VH 세그먼트, 인간 배선 5-18로부터의 D 세그먼트, 및 인간 배선 JH 4a로부터의 JH 세그먼트를 이용한다는 것이 입증되었다.
CDR 영역 결정의 카바트 체계를 이용하여 7480 및 7483 VH 서열을 추가로 분석함으로써 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 제시되는 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 영역을 상세히 설명할 수 있었다.
MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480 및 MOR-7483 경쇄 면역글로불린 서열을 공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열과 비교함으로써 6032, 7361, 7480 및 7483 경쇄 모두 인간 배선 λ3-r로부터의 VL 세그먼트, 및 인간 배선 JL 3b로부터의 JL 세그먼트를 이용한다는 것이 입증되었다.
CDR 영역 결정의 카바트 체계를 이용하여 MOR-6032 VL 서열을 추가로 분석함으로써 각각 서열 번호 6, 7, 및 8로 제시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 상세히 설명할 수 있었다.
CDR 영역 결정의 카바트 체계를 이용하여 MOR-7361 VL 서열을 추가로 분석함으로써 각각 서열 번호 20, 21, 및 22로 제시되는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 영역을 상세히 설명할 수 있었다.
CDR 영역 결정의 카바트 체계를 이용하여 MOR-7480 VL 서열을 추가로 분석함으로써 각각 서열 번호 34, 35, 및 36으로 제시되는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 영역을 상세히 설명할 수 있었다.
CDR 영역 결정의 카바트 체계를 이용하여 MOR-7483 VL 서열을 추가로 분석함으로써 각각 서열 번호 34, 35, 및 55로 제시되는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 영역을 상세히 설명할 수 있었다.
실시예 5: 항체 MOR-7480 및 MOR-7483의 "배선" 버전
MOR-7480 및 MOR-7483 항체의 면역원성을 최소화시키기 위해, 하기와 같이 수개의 아미노산 잔기를 배선 서열로 복귀 돌연변이화시켰다. 중쇄 가변의 FR1 영역 중 2개의 아미노산을 배선 서열로 복귀시킴으로써 MOR-7480.1로 지정되는 MOR-7480의 "배선" 버전을 제조하였다. 더욱 구체적으로, 아미노산 잔기 번호 1번의 Q를 배선 E로 복귀시키고, 아미노산 잔기 번호 19번의 K를 R로 복귀시켰다. 중쇄 가변 영역에서 변이된 두 아미노산 잔기는, MOR-7480의 아미노산 서열 (서열 번호 32)과 MOR-7480.1의 아미노산 서열 (서열 번호 43)을 비교함으로써 알 수 있었다. MOR-7480의 경쇄 가변 영역 중, FR1 영역에서 5개의 아미노산 (D1S, I2Y, A13S, R19S, S21T), FR2 영역에서 2개의 아미노산 (A42S, V45L), 및 FR3 영역에서 하나 (E80M)를 배선 서열로 복귀시켰다. 경쇄 가변 영역에서 변이된 8개의 아미노산은, MOR-7480의 아미노산 서열 (서열 번호 37)과 MOR-7480.1의 아미노산 서열 (서열 번호 45)을 비교함으로써 알 수 있었다.
또한, MOR-7480의 제3의 버전은 MOR-7480.1의 경쇄 가변 영역 서열 (서열 번호 45)로부터 출발하여 L45를 V로 복귀시켜 MOR-7480.2 (서열 번호 51)를 수득함으로써 제조하였다.
중쇄 가변의 FR1 영역 중 2개의 아미노산을 배선 서열로 복귀 돌연변이화시킴으로써 MOR-7483.1로 지정되는 MOR-7483의 "배선" 버전을 제조하였다. 항체 쇄의 배선 버전으로부터 출발하여, 이어서, CDR 중의 원하는 아미노산을 변이시키거나, 또는 임의의 버전으로부터 출발하는 돌연변이의 임의의 조합에 의해 배선 버전을 제조할 수 있었다. MOR-7483.1을 제조하기 위해, 아미노산 잔기 번호 1번의 Q를 배선 E로 복귀시키고, 아미노산 잔기 번호 19번의 K를 R로 복귀시켰다. 중쇄 가변 영역에서 변이된 두 아미노산 잔기는, MOR-7483의 서열 (서열 번호 32)과 MOR-7483.1의 서열 (서열 번호 43)을 비교함으로써 알 수 있었다. MOR-7483의 경쇄 가변 영역 중, FR1 영역에서 5개의 아미노산 (D1S, I2Y, A13S, R19S, S21T), FR2 영역에서 2개의 아미노산 (A42S, V45L), 및 FR3 영역에서 하나 (E80M)를 배선 서열로 복귀시켰다. 경쇄 가변 영역에서 변이된 8개의 아미노산은, MOR-7483의 아미노산 서열 (서열 번호 56)과 MOR-7483.1의 아미노산 서열 (서열 번호 60)을 비교함으로써 알 수 있었다.
또한, MOR-7483의 제3 버전은 MOR-7483.1의 경쇄 가변 영역 서열 (서열 번호 60)의 L45를 배선 V45로 복귀 돌연변이화시켜 MOR-7483.2 (서열 번호 64)를 수득함으로써 제조하였다.
실시예 6: 배선 버전을 비롯한, 항체의 시험관내 특성
항체의 결합 친화도 ( 비아코어 검정)
비아코어 3000 장치 (GE 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 인간 4-1BB에 결합하는 특정 항체의 결합 동역학적 성질을 측정하였다. 서열 번호 68의 아미노산 24-186을 포함하는 재조합 인간 4-1BB/Fc 키메라 단백질을 R&D 시스템즈 인코퍼레이티드(R&D Systems Inc.) (#838-4B)로부터 구입하였다. R&D 시스템즈에 의해 제공된 분자량 예측치 (44.8 kDa)에 기초하여 최종 농도가 80 nM이 되도록 150 mM NaCl, 25 mM HEPES (pH 8.0), 6 mM MgCl2, 0.005% 폴리소르베이트 20, 및 0.5 mM 아지드화나트륨을 함유하는 완충제 중에 동결건조된 단백질을 용해시켰다. 3% 소 인자 Xa (피어스(Pierce), #32521) (4-1BB 키메라 100 ㎍당 인자 Xa 3 ㎍)와 함께 22℃에서 20시간 동안 인큐베이션시키는 방법을 사용하여, 150 mM NaCl, 25 mM HEPES (pH 8.0), 6 mM MgCl2, 0.005% 폴리소르베이트 20, 0.5 mM 아지드화나트륨 중에서 상기 인자 Xa로 처리함으로써 분자의 Fc 부분을 절단하였다. 분자의 4-1BB 부분은 인간 4-1BB 단백질의 아미노산 잔기 24부터 186까지를 포함한다. 25℃에서 150 mM NaCl, 25 mM HEPES (pH 8.0), 6 mM MgCl2, 0.005% 폴리소르베이트 20, 및 0.5 mM 아지드화나트륨을 포함하는 러닝 완충제 중에서 결합 실험을 수행하였다. 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0) 중의 0.1 mg/mL 항체 용액을 사용하여 CM5 센서칩 (GE 헬쓰케어)에의 표준 아민 커플링에 의해 항체를 고정화시켰다. 비아코어 3000 장치의 킨젝트(Kinject) 기구를 사용하여 50 ㎕/분 유속으로 3.6분 동안 80 nM 내지 0.16 nM의 농도 범위로 4-1BB를 주입한 후, 26분 동안의 해리 기간이 이어졌다. 물 중 10 mM 인산의 1분간 펄스로 결합 복합체가 재생성되었다. 스크러버2(Scrubber2) 소프트웨어 (바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software))를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 단순 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델로 센서그램을 피팅하였다. 항체는 재조합 인간 4-1BB에 가역적으로 결합하는 것으로 나타났다. 결과 (평균값)는 하기 표 7에 제시되어 있다.
4-1 BB 의 세포외 도메인에의 결합 ( ELISA 검정)
0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 둘베코 인산 완충처리된 염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline: DPBS)를 사용하여 인간 4-1BB IgG1Fc 키메라 (R&D 시스템즈: 미국 미네소타주 미니애폴리스)를 0.2 mg/ml로 재현탁시키고, DPBS를 사용하여 0.03 ug/ml의 최종 농도로 희석시켰다. 비특이적 결합 대조군을 위한 웰은 빈 상태로 남겨두면서, 눈크-이뮤노 맥시소프 (Nunc-Immuno Maxisorp) 96 웰 플레이트를 0.1 ml/웰의 재조합 4-1BB 키메라로 코팅하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 4-1BB 용액을 제거하고, 플레이트를 0.2 ml 세척 완충제 (DPBS 중 0.05% 트윈-20)로 3회에 걸쳐 세척하였다. 0.2 ml 차단 완충제 (DPBS 중 5% BSA, 0.05% 트윈-20)를 모든 웰에 첨가하고, 혼합하면서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 차단 완충제를 제거하고, 플레이트를 0.2 ml 세척 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. DPBS 중에서 4-1BB 시험 항체의 일련의 희석액을 제조하고, 각 웰당 0.1 ml의 희석된 Ab를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 항체 용액을 제거하고, 플레이트를 각 웰당 0.2 ml 세척 완충제로 3회에 걸쳐 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 표지된 염소 항-인간 IgG, F(ab')2 특이적 F(ab')2 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) #109-036-097: 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브)를 DPBS를 이용하여 1:5,000으로 희석시키고, 0.1 ml/웰로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 0.2 ml/웰 세척 완충제로 세척하였다. 0.1 ml 슈어블루(SureBlue) TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 (커크가드 & 페리 랩스(Kirkegaard & Perry Labs: 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 동량의 2 M H2SO4을 첨가하여 반응을 종결시키고, 몰레큘러 디바이시스 스펙트라 맥스 340(Molecular Devices Spectra Max 340) (몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices: 미국 캘리포니아주 서니베일)) 상에서 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 결과는 하기 표 8에 제시되어 있다.
리간드 경쟁 결합 ( ELISA 검정)
항체를 인간 4-1BB_IgG1Fc 키메라의 플레이트 결합된 재조합 4-1BB 리간드 (4-1BBL)에의 결합을 차단할 수 있는 그의 능력에 관해 시험하였다. 재조합 인간 4-1BB 리간드 (바이오소스/인비트로겐(Biosource/Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 DPBS + 0.1% 소 혈청 알부민 중에 0.2 mg/mL로 재현탁시킨 후, DPBS 중 1 ㎍/mL로 희석시켰다. 4℃에서 밤새도록 눈크-이뮤노 맥시소프 표면 96 웰 플레이트를 0.1 ml/웰의 4-1BBL 용액으로 코팅시켰다. 다음날, 4-1BBL 용액을 제거하고, 0.2 mL 차단 완충제 (DPBS 중 1% 소 혈청 알부민, 0.05% 트윈-20)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 차단 단계 동안, 항체 스톡을 DPBS 중 8 ng/mL 내지 6 ㎍/mL 범위로 희석시켰다. 재조합 인간 4-1BB_IgG1Fc (R&D 시스템즈: 미국 미네소타주 미니애폴리스)를 DPBS + 0.1% 소 혈청 알부민 중에 0.2 mg/mL로 재현탁시킨 후, DPBS 중에 0.02 ㎍/mL로 희석시켰다. 차단된 4-1BBL로 코팅된 플레이트를 0.2 mL 세척 완충제 (DPBS 중 0.05% 트윈 20)로 3회에 걸쳐 세척하였다. 60 ㎕의 4-1BB_IgG1 Fc 키메라와 함께 60 ㎕ 항체의 희석액을 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 앞서 기술된 바와 같이 세척하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 항-6x히스티딘 태그 항체 (R&D 시스템즈: 미국 미네소타주 미니애폴리스, #MAB050H)를 DPBS 중에 1:1,000으로 희석시키고, 생성된 용액 50 ㎕를 세척된 플레이트의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 앞서 기술된 바와 같이 세척하고, 50 ㎕의 TMB 기질 용액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 50 ㎕ 0.2 N H2SO4로 반응을 종결시키고, 몰레큘러 디바이시스 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 결과는 하기 표 8에 제시되어 있다.
항체의 종 교차 반응성
인간, 시노몰구스 원숭이 (시노), 개 및 래트의 피토헤마글루티닌 (PHA)으로 자극받은 1차 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 예시적인 항체의 종-교차 반응성을 측정하였다. 하기 기술하는 방법에 따라 세포를 단리시켰다. 세포 (~5.0 x 105개의 세포/튜브)를 냉 세척 완충제 (PBS, 2% FBS 및 0.02% 아지드화나트륨)로 1회 세척하고, 100 ㎕/튜브의 알렉사 플루오르 647 접합된 대조군 또는 4-1BB 반응성 항체를 15.5 ㎍/mL (100 nM)로, 표지된 종 특이적 T 세포 마커 항체와 함께 각 샘플에 첨가하였다. 사용된 T 세포 마커 항체는 하기와 같았다: FITC 항-인간 CD3e (BD 파민겐(BD Pharmingen), #555332), FITC 항-래트 CD3e (BD 파민겐, #559975), FITC 항-토끼 CD4 + FITC 항-토끼 CD8 (AbD 세로테크(AbD Serotec), #MCA799F 및 #MCA1576F), FITC 항-개 CD3e (AbD 세로테크, #MCA1774F), 및 PerCP 항-인간/시노 CD3e (BD 파민겐, #552851). 암실에서 30분 동안 세포를 얼음 상에서 형광체 항체와 함께 인큐베이션시키고, 3회에 걸쳐 세척하고, 분석을 위해 0.3 ml 세척 완충제 중에 재현탁시켰다. 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACS Calibur 및 FlowJo 8.8.2 소프트웨어를 사용하여 항체 염색을 측정하고, 분석하였다.
인간 T 림프구 단리. 1 mL 0.5 M EDTA를 함유하는 시린지 내로 인간 전혈을 수집한 후, 제조사에 의해 기술된 바와 같이 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리시키기 위해 시그마 어큐스핀(Sigma Accuspin) 튜브 (시그마(Sigma: 미국 미주리주 세인트루이스))로 옮겼다. 5 mM EDTA를 함유하는 DPBS로 PBMC를 2회에 걸쳐 세척하고, 제조사에 의해 기술된 바와 같이 T 세포 정제 칼럼 (R&D 시스템즈: 미국 미네소타주 미니애폴리스)을 사용하여 T 림프구를 단리시켰다. 간략하면, PBMC를 2 mL 칼럼 완충제 중에 재현탁시키고, 미리 세척된 T 세포 단리 칼럼으로 로딩하였다. PBMC를 실온에서 10분 동안 인큐베이션시키고, T 세포를 칼럼 완충제로 용리시키고, 1회에 걸쳐 세척하고, 10% 우태아 혈청 (시그마: 미국 미주리주 세인트루이스) 및 L-글루타민 (2 mM), Hepes (10 mM), 페니실린 (100 U/ml), 스트렙토마이신 (50 ug/ml) (기브코(Gibco: 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드))으로 보충된 RPMI 1640 (시그마: 미국 미주리주 세인트루이스)으로 이루어진 TCM에 2x106개의 세포/mL로 재현탁시켰다.
시노몰구스 PBMC 의 단리. 시노몰구스 전혈 (바이오레클러메이션 (Bioreclamation: 미국 뉴욕주 힉스빌)을 시트르산나트륨 CPT 진공 채혈관 (BD; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)에 수집한 후, 실온에서 20분 동안 1,500 x g로 회전시켰다. 상기 진공 채혈관을 4℃에서 밤새도록 운송하였다. PBMC 분획을 CPT 진공 채혈관으로부터 수집하고, 5 mM EDTA를 함유하는 PBS로 2회에 걸쳐 세척하였다. 세척 단계 이후, PBMC를 계수하고, 조직 배양 배지 (TCM) 중에 2x106개의 세포/mL로 재조정하였다. TCM은 10% 우태아 혈청 (시그마: 미국 미주리주 세인트루이스) 및 L-글루타민 (2 mM), HEPES (10 mM), 페니실린 (100 U/ml), 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml) (기브코 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로부터 구입)으로 보충된 RPMI 1640 (시그마: 미국 미주리주 세인트루이스)으로 구성되었다. 4-1BB의 발현을 유도하기 위해 2-3일 동안 10 ㎍/mL PHA로 세포를 자극시켰다.
개 PBMC 의 단리. 개 전혈을 헤파린 처리된 진공 채혈관 (BD; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)으로 채혈하고, 5 mM EDTA를 함유하는 PBS를 사용하여 1:2로 희석시켰다. 혼합한 후, 4 mL의 희석된 혈액을 3 mL 림포라이트-매멀(Lympholyte-Mammal) (씨더레인 라보라토리즈(Cedarlane Laboratories: 미국 뉴욕주 웨스트베리)) 상에 주의하여 층상화시키고, 25℃에서 20분 동안 800 x g로 원심분리하였다. PBMC 계면을 수집하고, PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, 10 ㎍/mL PHA (레멜(Remel: 미국 캔자스주 르넥사))를 함유하는 TCM 중에 2x106개의 세포/mL로 재현탁시켰다. 유세포 분석법에 의해 항체 결합에 대하여 시험하기 전 48-72시간 동안 세포를 배양하였다.
래트 PBMC 의 단리. 래트 전혈을 헤파린 처리된 진공 채혈관 (BD; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)으로 채혈하고, 5 mM EDTA를 함유하는 PBS를 사용하여 1:3으로 희석시켰다. 혼합한 후, 6 mL의 희석된 혈액을 4.5 mL 림포라이트-매멀 (씨더레인 라보라토리즈: 미국 뉴욕주 웨스트베리) 상에 주의하여 층상화시키고, 25℃에서 20분 동안 800 x g로 원심분리하였다. PBMC 계면을 수집하고, PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, 10 ㎍/mL PHA (레멜: 미국 캔자스주 르넥사)를 함유하는 TCM 중에 2x106개의 세포/mL로 재현탁시켰다. 유세포 분석법에 의해 항체 결합에 대하여 시험하기 전 48-72시간 동안 세포를 배양하였다.
결합 결과는 도 1에 제공되어 있다. 항체는 인간 및 시노 4-1BB에 고친화도로 결합하는 것으로 나타난 반면, 개 및 래트 4-1BB에의 결합은 시험된 최고 농도인 100 nM 농도에서는 관찰되지 않았다.
Figure 112013055555339-pat00008
Figure 112013055555339-pat00009
에피토프 지도화
4-1BB 효능제 항체의 에피토프 결합 영역을 결정하기 위해, 공개된 개 4-1BB 서열 (참조 서열 XM_845243)에 대한 인간 4-1BB 세포외 도메인에 대하여 일련의 돌연변이 (하기 표 9)를 제조하였다.
Figure 112013055555339-pat00010
진 다이내믹스 LLC(Gene Dynamics LLC: 미국 오리건주 포틀랜드)에 의해 레트로바이러스 발현 벡터 pMSCVpuro (클론테크 라보라토리즈(Clontech Laboratories: 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰))에서 모든 인간-대-개 돌연변이를 제조하였다. 추가로, 참조 서열 XM_845243에 상응하는 전장의 개 cDNA 서열을 유전자 합성법을 통해 제조하였다.
T-75 플라스크에서 대략 40-50%로 컨플루언트된 293T 세포를 일과적으로 형질감염시킴으로써 바이러스 제제를 확립하였다. 배양한 후, 이어서 바이러스 상청액을 멸균 여과시키고, 농축시켰다. 농축된 바이러스를 수집하고, -80℃에서 보관하였다.
대수증식 방식으로 성장한 300-19 세포에 8 ug/ml 폴리브렌과 함께, 완전 DMEM 중의 농축된 바이러스의 1:250 희석액을 사용하여 레트로바이러스를 형질도입시켰다. 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 2 ug/ml 퓨로마이신을 배양물에 첨가하고, 연구 진행 동안 유지시켰다.
1 ug/ml 폴리클로날 염소 항-인간 4-1BB 항체 (R&D 시스템즈 인코퍼레이티드) + PE 표지된 당나귀 항-염소 IgG (H+L) F(ab')2 (잭슨 이뮤노리서치 인코퍼레이티드(Jackson Immunoresearch Inc.))의 1:200 희석액으로 염색하여 퓨로마이신 선별 풀에 의한 4-1BB 수용체의 양성 발현을 확인하였다. 시험 항체에 의한 돌연변이체 4-1BB 수용체의 인식을 측정하기 위해, 퓨로마이신 선별 풀을 얼음 상에서 30분 동안 100 nM의 비표지된 1차 항체 희석액으로 염색한 후, FACS 완충제로 2회에 걸쳐 세척하고, 종 특이적 PE 표지된 당나귀 항-IgG (H+L) F(ab')2의 1:200 희석액으로 염색하였다. BD FACS Calibur 및 FlowJo 8.8.6 소프트웨어를 사용하여 FACS에 의해 세포를 분석하였다.
각 세포 풀의 상대적인 염색은 하기 표 10에 요약되어 있다.
Figure 112013055555339-pat00011
클론 N&E.5의 돌연변이 내에서 유사한 서열을 가진 항체 (MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, 및 MOR-7483.1) 간에 결합 차이가 있는 것으로 발견되었는데, 이는 항체 인식에 대한 결정기가 돌연변이화된 영역 내에 존재한다는 것을 제안한다.
인간 4-1BB 세포외 도메인 및 인간 4-1BB 세포외 도메인의 돌연변이체인 돌연변이체 N&E.5에 대한 상기 항체의 상대적인 친화도를 측정하기 위해, 각 항체에 대한 용량 반응 FACS 곡선을 측정하였다. 알렉사 플루오르 647 표지된 MOR-7480, MOR-7480.1, 및 MOR-7480.2를 FACS 완충제 중에, 1 uM로부터 출발하여 8 포인트로 1:5의 일련의 희석액으로 희석시키고, 이를 사용하여 모체 300-19, hu4-1BB, hu4-1BB N&E.5, 및 개 4-1BB 세포 풀을 염색하였다. BD FACS Calibur 및 FlowJo 8.8.6 소프트웨어를 사용하여 FACS에 의해 세포를 분석하였다. 각 수용체 발현 풀의 형광의 기하 평균치를 모 세포의 염색으로 정규화시키고, 염색 배수로 표시하고, 용량 반응에 대한 EC50을 측정하였다. EC50에 대한 요약은 하기 표 11에 제시되어 있다. 인간 4-1BB 돌연변이체 N&E.5에 대한 MOR-7480.2 및 MOR-7480 둘 모두의 결합에서 5배 초과의 감소가 관찰되었다.
Figure 112013055555339-pat00012
항체의 효능제 활성 ( 루시퍼라제 활성 검정)
안정하게 통합된 NFκB 루시퍼라제 리포터와 함께 인간 4-1BB를 발현하는 293T 세포를 제조하였다. 세포를 수거하고, 세척하고, 페놀 레드 무함유 완전 배지 (10% 우태아 혈청, HEPES 완충제, 비필수 아미노산 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM) 중에 0.6 X 106개의 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다. 50 ㎕의 세포를 백색 96 웰 플레이트 (퍼킨엘머(PerkinElmer: 미국 매사추세츠주 월섬))의 각 검정 웰에 플레이팅하였다. 시험 항체를 가교 결합 항체 Fab' 염소 항-인간 IgG Fc (잭슨 이뮤노리서치: 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 2.5:1의 존재비로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 75 ㎕의 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시퍼라제 시약 (프로메가(Promega: 미국 위스콘신주 매디슨))을 첨가하고, 패커드 탑카운트(Packard TopCount) NXT 섬광 계수기를 사용하여 루시퍼라제 활성량을 측정하였다.
바이러스 형질도입 및 2 ㎍/ml 퓨로마이신을 함유한 안정한 풀을 선별하여 시노몰구스 원숭이 4-1BB를 발현하는 293T 세포를 제조하였다. 시노 4-1BB 발현 293T 세포를 T-75 플라스크에 플레이팅시켜 대략 60-70% 컨플루언시가 되도록 한 후, 형질감염 대조군으로서 10 ㎍ pLuc_6xNFκB + 0.1 ㎍ pRL-CMV로 형질감염시켰다. 제조사의 설명서에 따라 1 ㎍ 플라스미드 DNA에 대해 6 ㎕의 퓨진(Fugene)인 비로 퓨진 6 형질감염 시약 (로슈(Roche: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 그 다음날 세포를 수거하고, 세척하고, 페놀 레드 무함유 완전 배지 (10% 우태아 혈청, 비필수 아미노산 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM) 중에 0.6 X 106개의 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다. 50 ㎕의 세포를 백색 96 웰 플레이트 (퍼킨엘머: 미국 매사추세츠주 월섬)의 각 검정 웰에 플레이팅하였다. 시험 항체를 가교 결합 Fab' 염소 항-인간 IgG Fc 항체 (잭슨 이뮤노리서치: 미국 펜실베이니아주 웨스트 그로브)와 2.5:1의 존재비로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 75 ㎕의 루시퍼라제 검정 시약을 첨가하고, 패커드 탑카운트 NXT 섬광 계수기를 사용하여 반딧불 루시퍼라제 활성량을 측정하였다. 추가로, 75 ㎕의 스톱 & 글로(Stop & Glo) 시약을 첨가하여 레닐라 루시퍼라제 활성을 평가하였다. 패커드 탑카운트 NXT 섬광 계수기를 사용하여 레닐라 루시퍼라제 활성량을 측정하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다.
항체의 효능제 활성 (1차 T 세포 IL -2 방출 검정)
플레이트를 코팅시키기 전에 눈크 맥시소프 96 웰 플레이트를 UV로 멸균시켰다. 시험 항체를 PBS 중에 60 ㎍/ml로 희석시켰다. 희석된 Ab 0.2 ml를 폴리프로필렌 96 웰 플레이트의 두 웰로 나누고, 1:3으로 일련으로 희석시켰다. 희석된 Ab 50 ㎕를 멸균 맥시소프 96 웰 검정 플레이트에 첨가하고, 즉시 20 ㎍/ml 항-인간 CD3e 클론 UCHT1 50 ㎕를 첨가하였다 (바이오레전드(Biolegend: 미국 캘리포니아주 샌디에고)). 이어서, 모든 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, Ab로 코팅된 플레이트를 PBS로 1회 세척하고, 0.15 ml RPMI 완전 배지를 눈크 맥시소프 플레이트의 웰에 첨가하였다. 앞서 본원 어디에나 기술되어 있는 바와 같이 인간 T 세포를 단리시키고, 50 ㎕의 정제된 T 세포를 2 x 106개의 세포/ml (100,000개의 세포/웰)로 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 각 웰로부터의 상청액을 수집하고, 즉시 검정하거나, 또는 검정 전 -20℃에서 보관하였다. IL-2 ELISA 검정 (R&D 시스템즈: 미국 미네소타주 미니애폴리스)에 앞서 상청액을 완전 배지로 희석시켰다. 결과는 도 3에 제시되어 있다.
실시예 7: 생체내에서의 4-1BB 항체에 의해 유도된 인간 백혈구 확장
뮤린 4-1BB와의 4-1BB 항체의 검출가능한 교차 반응성이 부족하고, 인간 면역 세포가 존재하여야 하기 때문에 4-1BB 항체에 관한 생체내 기능 평가를 위해서는 모델 개발이 필요하였다. 중증 복합형 면역결핍성 (SCID) 돌연변이 및 IL-2 수용체 공통 감마 쇄 결핍을 보유하는 NOD 유전적 배경을 가진 마우스 (통상 NSG로 명명)가 다수의 인간 말초 혈액 백혈구 (huPBL)의 생착을 지지할 수 있고, 30일 이상 동안 생착을 유지시킬 수 있다 (문헌 [King, 2008, Clin. Immunol. 126:303-314]). huPBL-NSG 모델로도 알려져 있는 상기 마우스 모델을 사용하여 항체의 생체내 전신 투여가 인간 면역 세포에 미치는 기능적 효과에 관하여 평가하였다. 구체적으로, 정맥내 주사를 통해 6백만개의 새로 단리된 인간 PBMC를 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/Szj (NSG) 숙주 마우스 내로 채택적으로 옮겼다. PBMC 주사 후 9일 경과하였을 때, 복강내 주사를 통해 1 mg/kg의 단일 용량으로 MOR-7480, MOR-7480.1 또는 IgG2 이소형 대조군 항체를 동물에 투여하였다. PBMC 생착 후 24일째 내지 28일째, PBMC를 인간에 대한 항체로 염색하고, 뮤린 CD45를 유세포 분석법으로 평가하였다. 전방 산란 및 측방 산란 프로파일을 사용하여 림프구 게이트를 측정하였다. 도 4에 제시되어 있는 바와 같이, 생착된 마우스의 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포의 비율이 증가한 것으로 입증되는 바와 같이, MOR-7480 및 MOR-7480.1은 인간 백혈구의 확장을 증진시킬 수 있다. 각 군당 마우스의 마리수 (n)는 6 이상 (n≥6)이었다.
추가로, 시노몰구스 원숭이의 MOR-7480.1 처리는 PBMC 샘플에서 세포독성 중추 기억 T 세포 (CD8 TCM) 중 증식을 증가시켰다. 시노몰구스 원숭이 (각 용량 수준당 동물 2마리씩)에게 MOR-7480.1을 명시된 용량으로 단일 정맥내 주사하여 투여하였다. 항체 투여 7일전 (투여 이전) 및 MOR-7480.1의 투여에 대해 상대적인 명시된 연구일에 (연구 1일째) PBMC를 수거하였다. CD3, CD4, CD8, CD28, CD95, 및 Ki-67에 대한 항체로 PBMC를 염색하고, 유세포 분석법을 통해 분석하였다. 캔토 II(Canto II) (벡톤 디킨슨) 상에 데이터를 수집하고, DIVA 소프트웨어 (벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석하였다. CD8 중추 기억 세포는 CD3+, CD8+, CD28+ 및 CD95+인 것으로 확인되었다. (용량 수준-동물 번호)로서 표시된 개별 동물에 대한 데이터를 제시하고, 이를 연구 전 개수에 대해 상대적인 Ki-67+ 세포 개수의 동물내 변화 {[(명시된 연구일의 Ki-67+ 세포 개수 - 투여 이전의 Ki-67+ 세포 개수)/투여 이전의 Ki-67+ 세포 개수]*100}로서 나타내었다. 도 5에 제시되어 있는 바와 같이, 0.3 mg/kg 이상으로 처리된 모든 군 중 1마리 이상의 동물에서 연구 후 처음 7-13일 동안 증식 중추 기억 T 세포가 1.5배 이상 증가한 것이 관찰되었다.
실시예 8: 4-1BB 항체의 항종양 활성 (생체내 모델)
PC3 인간 전립샘암 모델
4-1BB 항체의 설치류 교차 반응성 부족으로 인해 항체의 항-인간 종양 효능 평가를 위한 표준 뮤린 동계 또는 인간 이종이식편 종양 모델을 사용하지 못했다. 따라서, 베이지 (Bg) 돌연변이 결핍 뮤린 T 및 B 림프구 및 기능성 NK 세포를 보유하는, SCID-Bg 마우스 (CB.17/lcr.Cg PkrdcscidLystbg/Crl)를 사용하여 신규한 huPBL-SCID-Bg 이종 종양 마우스 모델을 생성하였다. 하기 기술하는 바와 같이, 상기 모델을 사용하여 4-1BB 항체의 항-인간 종양 효능을 평가하였다.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 PC3 인간 전립샘 또는 LOVO 인간 결장 세포주를 입수하고, 하기 인비트로겐 보충물: L-글루타민, 피루브산나트륨, 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, Hepes, 및 10% 열 불활성화된 우태아 혈청 (FBS; 카탈로그 번호 F2442, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))으로 강화된 RPMI-1640 (인비트로겐) 중에서 배양하였다. 세포를 T-225 팔콘(Falcon) 플라스크에서 컨플루언시까지 성장시켰다. 이어서, 세포를 트립신으로 처리하고 (트립신 0.25%-EDTA; 카탈로그 번호 2500-056, 인비트로겐), 히퍼플라스크(Hyperflask) (카탈로그 번호 3319, 코닝 라이프 사이언시즈(Corning Life Sciences))에서 3일 동안 성장을 확대시켰다. 트립신을 사용하여 세포주를 수거하고, 이를 10% FBS로 보충된 빙냉 PRMI 중에서 3회에 걸쳐 세척하였다. 건강한 지원자로부터 300 ml 이하의 말초 혈액을 수집하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 어큐스핀 튜브 (카탈로그 번호 A0561-100x15 ml, 알드리치(Aldrich))를 사용하여 말초 혈액 림프구(PBMC)를 헤파린 처리된 혈액으로부터 단리시켰다. 각 마우스가 0.2 mL의 단일 볼루스 주사로 PBS 중 1.5 x 106개의 PBMC 및 3 x 106개의 종양 세포를 주사맞을 수 있도록 계수된 세포 현탁액을 조합하였다. 조합된 세포 현탁액을 냉 PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, 얼음 상에 놓고, 제조된 마우스에 즉시 주사하였다.
각 마우스에 대해, 0.2 mL 부피의 조합된 세포 현탁액을 동물의 우측 옆구리 내로 피하 주사하고, 단일 용량 (0.2 mL)의 4-1BB 항체 또는 대조군 항체를 좌측 옆구리내로 피하 주사하여 투여하였다. 실험 기간 동안 매주 2회에 걸쳐 프레시에르(Pressier) 캘러퍼로 종양을 측정하고, 체중 또한 기록하였다. 하기 계산식: 길이 x 너비2 x 0.44= 용적 (㎣)을 사용하여 종양 용적을 계산하였다. 종양 용적이 2,000 ㎣에 도달하였을 때, 또는 실험 종결 이전에 동물의 체중이 20% 감소되었을 때에는, 마우스를 본 연구로부터 탈락시켰다. 23일째, IACUC에 의해 개략적으로 설명된 방법에 따라 모든 군으로부터의 마우스를 안락사시켰다 (도 6). 최종 연구일에 종양 성장 억제율(%)을 측정하고, 100-{1-(처리군의 값최종일/대조군의 값최종일)}로서 계산하였다. 주사 후 6일째 종양을 측정하였을 때 유사한 결과를 얻었고, 동물을 종양 용적에 따라 무작위화하고, 이식 후 7일째 4-1BB mAb를 단일 용량으로 투여하였다. 대부분의 연구에서, 각 군은 8마리의 마우스를 포함하였다.
실시예 9: 인간 4-1BB 넉인 마우스에서 4-1BB 항체의 활성에 관한 생체내 평가
인간 4-1BB 넉인 마우스 생성
뮤린 4-1BB와 교차반응하지 않는 항-인간 4-1BB 모노클로날 항체의 면역 조절 활성에 관해 보다 잘 다루기 위해서, 마우스 4-1BB 유전자가 인간 4-1BB 유전자로 대체된 마우스 모델을 생성하였다. 인간 또는 뮤린 4-1BB 게놈 단편을 보유하는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론을 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼즈배드)으로부터 주문하고, 이를 사용하여 Red/ET 재조합 기술에 기초한 4-1BB 표적 벡터를 구축하였다 (문헌 [Zhang, 1998, Nat Genet 20: 123-128]). 첫번째로, Xba1 분해로 개방시켰을 때, 2개의 뮤린/인간 키메라 상동성 아암 (각각 400 bps씩)이, 인간 4-1BB BAC 클론으로부터 엑손 2에 위치하는 번역 출발 코돈 ATG로 시작하여 엑손 8의 종결 코돈 TGA로 종결되는 19,994 bps의 인간 4-1BB 게놈 서열을 회수할 수 있도록, pBR322 골격 상에서 회수용 벡터를 조립하였다. 두번째로, PGK/EM7 프로모터의 제어하에 있는 네오마이신 발현 카세트를 조립하고, 인간 4-1BB 유전자의 인트론 2 서열과 상동성인 100 염기쌍 (bps)의 서열 측면에 위치시켰다. 이어서, 상기 네오마이신 발현 카세트를 1단계에서 수득된, 회수된 인간 4-1BB 게놈 단편으로 표적화시켰다. 마지막으로, 네오마이신 발현 카세트를 보유하는, 회수된 인간 4-1BB 게놈 단편을 뮤린 BAC 클론으로 표적화시켜, ATG 출발 코돈에서부터 TGA 종결 코돈까지의 변형된 인간 4-1BB 게놈 단편으로 뮤린 4-1BB 유전자를 대체시켰다.
표준 프로토콜에 따라 C57BL/6NTAC 배경 (PRX-BL6N #1, 프리모게닉스(Primogenix: 미국 미주리주 로리)) 상의 마우스 배아 줄기 세포주로 상기 BAC 표적 벡터를 전기천공시키고, 뮤린 4-1BB 유전자의 인트론 2 및 엑손 8에 대한 두 택맨(Taqman) 검정으로 G418 (이는 또한 게네티신으로도 공지)로부터 생존하는 클론 선별을 스크리닝하여, 상동성 재조합 기전에 의해 뮤린 4-1BB 유전자좌에서 변형된 클론을 확인하였다. 스크리닝된 116개의 ES 클론 중 7개의 클론이 뮤린 4-1BB 유전자좌 중 하나의 대립유전자를 손실한 것으로 밝혀졌다 (표적 효율 6%). 코리엘 의료연구소(Coriell Institute for Medical Research: 미국 뉴저지주 캠던)에 의해 핵형 분석 및 계내 혼성화 (FISH)가 수행되었다. 클론 LH15의 경우, 20개의 세포 중 19개가 40 XY이고, LH80의 경우, 20개의 세포 중 20개가 40 XY였다. 두 클론 모두에서, 프로브로서 4-1BB 유전자를 보유하는 뮤린 BAC 클론을 사용하여 FISH를 수행하였을 때, 밴드 E2 영역 중 각각의 염색체 4 쌍에서 4-1BB 혼성화 신호 하나가 나타났다. 임의의 다른 위치에서는 어떤 신호도 관찰되지 않았다.
클론 LH 15 및 LH80 둘 모두를 BALB/c 계통의 배반포 내로 주사하고, CD1 가임신 암컷 마우스에 배아를 이식시켜 임신시켰다. 수컷 키메라를 C57BL/6 배경 상의 EIIa-cre 마우스와 교배시켜 네오마이신 내성 카세트를 제거하고, 인간 4-1BB 유전자에 대해 동형접합성인 마우스를 본 연구에 사용하였다.
4-1 BB 효능제 mAb 매개 림프구 증식.
4-1BB 넉인 마우스에서 림프구 증식을 유도할 수 있는 4-1BB 효능제 mAb의 능력을 평가하였다. 연구 0일째 30 mg/kg의 MOR-7480.1을 복강내 주사를 통해 4-1BB 넉인 마우스에 투여하였다 (매주 투여하기 위해, 0일째 및 7일째에 4-1BB mAb를 동물에게 주사하였다). 샘플 수집 24시간 전, 2 mg BrdU를 동물 복강내로 주사하였다. 투여 후 명시된 날짜에 심장내 천자를 통해 말초 혈액 샘플을 수집하였다. PBMC를 CD3, CD4, CD8에 대한 항체 및 BrdU로 염색하고, 유세포 분석법을 통해 평가하였다. 결과는 도 7 패널 A에 제시되어 있다.
4-1 BB 효능제 mAb 매개 항-종양 효능
오브알부민 (OVA) 모델 항원 및 루시퍼라제 (luc)를 발현하도록 조작된 흑색종 세포주인 B16-OVA/luc를 사용하여 4-1BB 넉인 마우스에서 MOR-7480.1의 항-종양 효능에 관하여 평가하였다. 1백만개의 종양 세포를 4-1BB 넉인 마우스의 옆구리에 이식시켰다. 종양이 대략 50-100 ㎣에 도달하였을 때 (일반적으로 종양 접종 후 7-10일째) 종양 크기에 기초하여 동물을 무작위화하고, 4-1BB mAb를 명시된 용량으로 단일 주사하여 투여하였다. 연구 종결시까지 주당 2 내지 3회에 걸쳐 캘러퍼 측정을 사용하여 종양 크기를 평가하였다. 결과는 도 7 패널 B에 제시되어 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. <120> 4-1BB BINDING MOLECULES <130> PC33845A <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 1 Asn Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 2 Gly Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 3 Arg Lys Asn Glu Glu Asp Gly Gly Phe Asp His 1 5 10 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Gly Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Asn Glu Glu Asp Gly Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly 100 105 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attattattg ccagacttgg gatggtactc ttcattttgt gtttggcggc 300 ggcacgaagt taaccgttct tggtcagccc aaggctgccc cctcggtcac tctgttccca 360 ccctcctctg aggagcttca agccaacaag gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc 420 tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg 480 gagaccacca caccctccaa acaaagcaac aacaagtacg cggccagcag ctacctgagc 540 ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg 600 agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca gaatgttca 639 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 15 Ser Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 16 Val Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 17 Arg Leu Tyr Ala Gln Phe Glu Gly Asp Phe 1 5 10 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg 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gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggttctaag tatgtttctt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttcttgtgat ttattctgat tctgagcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ccagtcttgg gatggttcta tttctcgtgt gtttggcggc 300 ggcacgaagt taaccgtcct aggtcag 327 <210> 27 <211> 1332 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 27 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct gattattata tgcattgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt atctctggtt ctggtagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtctttat 300 gctcagtttg agggtgattt ttggggccaa ggcaccctgg tgacggttag ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgctc tgaccagcgg 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gcgataatat tggtgatcag tatgctcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttgttgtgat ttatcaggat aagaatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg cgctacttat actggttttg gttctcttgc tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt ccta 324 <210> 41 <211> 1326 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 41 caggtgcaat tggttcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60 agctgcaaag gttccggata ttccttttct acttattgga tttcttgggt gcgccagatg 120 cctgggaagg gtctcgagtg gatgggcaag atctatccgg gtgatagcta taccaattat 180 tctccgagct ttcagggcca ggtgactatt agcgcggata aaagcattag caccgcgtat 240 cttcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat acggccatgt attattgtgc gcgtggttat 300 ggtatttttg attattgggg ccaaggcacc ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gctctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg 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accctgacca tcagcggcac ccaggccatg 240 gacgaggccg actactactg cgccacctac accggcttcg gcagcctggc cgtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 54 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 54 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg tccgtgagcc ctggccagac cgccagcatc 60 acctgcagcg gcgacaacat cggcgaccag tacgcccact ggtatcagca gaagcccggc 120 cagagccccg tggtggtgat ctaccaggac aagaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccatg 240 gacgaggccg actactactg cgccacctac accggcttcg gcagcctggc cgtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 55 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Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Thr Phe Val Gly Phe Thr 85 90 95 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 58 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 58 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggtgatcag tatgctcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttgttgtgat ttatcaggat aagaatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ctctacttat acttttgttg gttttactac tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt ccta 324 <210> 59 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 59 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgataatat tggtgatcag tatgctcatt ggtaccagca gaaacccggg 120 caggcgccag ttgttgtgat ttatcaggat aagaatcgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ctctacttat acttttgttg gttttactac tgtgtttggc 300 ggcggcacga agttaaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210> 60 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 60 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Thr Phe Val Gly Phe Thr 85 90 95 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 61 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 61 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Thr Phe Val Gly Phe Thr 85 90 95 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 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Homo sapien <400> 63 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg tccgtgagcc ctggccagac cgccagcatc 60 acctgcagcg gcgacaacat cggcgaccag tacgcccact ggtatcagca gaagcccggc 120 cagagccccg tgctggtgat ctaccaggac aagaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccatg 240 gacgaggccg actactactg ctctacttat acttttgttg gttttactac tgtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210> 64 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 64 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Val Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Thr Phe Val Gly Phe Thr 85 90 95 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 65 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 65 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Val Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Thr Phe Val Gly Phe Thr 85 90 95 Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 66 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 66 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg tccgtgagcc ctggccagac cgccagcatc 60 acctgcagcg gcgacaacat cggcgaccag tacgcccact ggtatcagca gaagcccggc 120 cagagccccg tggtggtgat ctaccaggac aagaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccatg 240 gacgaggccg actactactg ctctacttat acttttgttg gttttactac tgtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt ccta 324 <210> 67 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 67 agctacgagc tgacccagcc ccccagcgtg tccgtgagcc ctggccagac cgccagcatc 60 acctgcagcg gcgacaacat cggcgaccag tacgcccact ggtatcagca gaagcccggc 120 cagagccccg tggtggtgat ctaccaggac aagaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 180 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccatg 240 gacgaggccg actactactg ctctacttat acttttgttg gttttactac tgtgttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 360 ccaccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 420 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210> 68 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 68 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 69 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 69 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 70 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 70 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 71 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 71 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 72 <211> 978 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 72 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtagtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt cgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaa 978 <210> 73 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 73 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 74 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 74 ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact ctgttcccac cctcctctga ggagcttcaa 60 gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg 120 gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa 180 caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag 240 tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg 300 gcccctacag aatgttca 318

Claims (11)

  1. (a) 서열 번호 1에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 2에 제시된 H-CDR2, 서열 번호 3에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 6에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 7에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 8에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분;
    (b) 서열 번호 15에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 16에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 17에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 20에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 21에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 22에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분; 및
    (c) 서열 번호 29에 제시된 H-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 H-CDR2, 및 서열 번호 31에 제시된 H-CDR3; 서열 번호 34에 제시된 L-CDR1, 서열 번호 35에 제시된 L-CDR2, 및 서열 번호 55에 제시된 L-CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분
    으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 서열 번호 68의 아미노산 잔기 115-156 내에 위치한 에피토프에서 인간 4-1BB 세포외 도메인과 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 비아코어(BIACore) 검정으로 측정되는 바, 인간 4-1BB 세포외 도메인에 대하여 10 nM 이하인 KD로 인간 4-1BB와 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  3. 유효량의 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 대상체에서 종양 세포 전이를 감소시키기 위한 제약 조성물.
  4. 치료 유효량의 제1항의 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암이 결장직장암, 비-호지킨 림프종, 전립샘암, 또는 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 치료시에 하나 이상의 추가의 치료제 또는 요법과 함께 병용 투여되는 제약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 추가의 치료제가 면역치료제인 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역치료제가 리툭시맙인 제약 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  10. 제9항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

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