BR112013005699B1

BR112013005699B1 - Anticorpo isolado ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao 4-1bb humano, combinação, usos dos mesmos, bem como composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada e vetor

Info

Publication number: BR112013005699B1
Application number: BR112013005699-1A
Authority: BR
Inventors: Bianca AHRENS; Sangita M. Baxi; Simon Paul Bergqvist; Regis Doyonnas; Robert Lee Dufield; Mark William Elliott; Timothy Scott Fisher; Richard Michael Jerome; Heather Laurence Jones; Cris Kamperschroer; Victoria Alexandria Love; Kathrin Ladetzki-Baehs; Theodore Lawrence Oliphant; Adekunle Olatunbosun Onadipe; Wenning Qin; Vinay Radhakrishnan; Allison Karlyn Rohner; Leslie Lynne Sharp; Michael Tesar; Kristin Elizabeth Thomas
Original assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2021-08-17
Also published as: SG188313A1; US20180194851A1; AU2018201703A1; TW201300413A; ZA201502914B; RU2551963C2; PT2614082T; RU2015110632A3; DK2614082T3; IL250386A0; EP2614082B1; EP2614082A1; CO6690759A2; PL2614082T3; CA2810359C; SI2614082T1; TW201414748A; IL247054A0; NZ700891A; MX337040B

Abstract

moléculas de ligação a 4-1bb. a presente invenção provê moléculas ligantes isoladas que se ligam ao 4-1bb, a moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma sequência de aminoácidos das moléculas de ligação, vetores compreendendo as moléculas de ácidos nucleicos, métodos para produzir as moléculas de ligação, composições farmacêuticas contendo as moléculas de ligação e métodos para utilização das moléculas de ligação ou das composições.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção diz respeito a anticorpos e, especialmente, a anticorpos que se ligam ao 4-1BB humano.

Antecedentes da invenção

[002] A proteína transmembrana 4-1BB (também designado CD137, TNFRSF9, etc.) pertence à superfamília de receptores de Fatores de Necrose Tumoral (TNFRS). O entendimento atual sobre o 4- 1BB indica que a expressão depende em geral de ativação e a sua presença em um vasto subconjunto de células imunes, incluindo células NK e NKT, células T reguladoras, células dendríticas (DC), mastócitos estimulados, células mieloides em diferenciação, monócitos, neutrófilos e eosinófilos (Wang, 2009, Immunological Reviews 229: 192-215). A expressão de 4-1BB foi demonstrada também em vasos tumorais (Broll, 2001, Amer. J Clin. Pathol. 115(4):543-549; Seaman, 2007, Cancer Cell 11: 539-554) e sítios do endotélio afetados por inflamação ou aterosclerose (Drenkard, 2007 FASEB J. 21: 456-463; Olofsson, 2008, Circulation 117: 1292-1301). O ligante estimulador de 4-1BB, ou seja, o Ligante 4-1BB (4-1BBL), é expresso também em células apresentadoras de antígenos (APCs) ativadas, células progenitoras mieloides e células-tronco hematopoiéticas.

[003] A proteína 4-1BB é formada por 255 aminoácidos (No de Acesso NM_001561; NP_001552). A sequência completa de aminoácidos do 4-1BB humano é fornecida na SEQ ID NO: 68. A proteína compreende uma sequência de sinalização (resíduos de aminoácidos 1-17), seguida por um domínio extracelular (169 aminoácidos), uma região transmembrana (27 aminoácidos) e um domínio intracelular (42 aminoácidos) (Cheuk ATC et al. 2004 Cancer Gene Therapy 11: 215-226). O receptor é expresso na superfície celular em forma de monômeros e dímeros e provavelmente se trimeriza com o ligante 4-1BB para dar início à sinalização.

[004] Inúmeros estudos de células T murinas e humanas indicam que a proteína 4-1BB intensifica a proliferação celular, a sobrevida e a produção de citocinas (Croft, 2009, Nat Rev Immunol 9:271-285). Estudos apontaram que alguns MAbs agonistas contra 4-1BB aumentam a expressão de moléculas coestimuladoras e reforçam acentuadamente as respostas de linfócitos T citolíticos, resultando em eficácia antitumoral em vários modelos. MAbs agonistas contra 4-1BB demonstraram eficácia em contextos profiláticos e terapêuticos. Além disso, modelos tumorais de monoterapia e terapia combinada com 4- 1BB estabeleceram a presença de respostas protetoras antitumorais duradouras por células T de memória (Lynch, 2008, Immunol Rev. 22: 277-286). Os agonistas de 4-1BB mostraram também inibir reações autoimunes em uma variedade de modelos de autoimunidade reconhecidos na técnica (Vinay, 2006, J Mol Med 84:726-736). Essa atividade dupla de 4-1BB oferece o potencial para atuação antitumoral ao mesmo tempo em que amortece os efeitos colaterais autoimunes que podem ser associados a abordagens da imunoterapia, atribuídos à quebra da tolerância imunológica.

[005] Existe uma necessidade não atendida desde há muito sentida de anticorpos que se liguem à proteína 4-1BB humana, aumentem a resposta mediada por 4-1BB e que, com isso, ofereçam potencial terapêutico para o tratamento de várias doenças e condições, incluindo câncer.

Sumário da invenção

[006] A presente invenção tem como objeto prover uma molécula de ligação isolada que se ligue ao 4-1BB humano, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ou derivado deste. Outro objeto da presente invenção é prover uma composição contendo uma molécula de ligação que se ligue a 4-1BB. Adicionalmente, a presente invenção tem como objeto prover métodos para tratar uma doença e/ou condição associada ou mediada pela sinalização de 4-1BB por meio de uma ou mais moléculas de ligação da invenção. Estes e outros objetos da invenção são descritos mais detalhadamente neste pedido de patente.

[007] Em alguns aspectos, a invenção provê anticorpos isolados que se ligam ao 4-1BB humano.

[008] Em um aspecto específico, o anticorpo isolado liga-se ao 4- 1BB humano em um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos 115 - 156 da SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de H- CDR1 da SEQ ID NO: 29, a sequência de aminoácidos de H-CDR2 da SEQ ID NO: 30, e a sequência de aminoácidos de H-CDR3 da SEQ ID NO: 31. Em outras modalidades específicas, o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de L-CDR1 da SEQ ID NO: 34, a sequência de aminoácidos de L-CDR2 da SEQ ID NO: 35 a sequência de aminoácidos de L-CDR3 da SEQ ID NO: 36.

[009] Em outro aspecto específico, o anticorpo isolado liga-se ao 4-1BB humano com KD de 600 nM ou menos, 100 nM ou menos, 50 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos ou de 1 nM ou menos, para o domínio extracelular do 4-1BB humano, conforme medida com o ensaio BIACore descrito nesta invenção.

[0010] Em outro aspecto específico, o anticorpo isolado compreende: (a) uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 29; (b) uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 30; e (c) uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 31.

[0011] Em outro aspecto específico, o anticorpo isolado compreende: (a) uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 34; (b) uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 35; e (c) uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 55.

[0012] Em um aspecto adicional, o anticorpo isolado compreende: (a) uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 29; (b) uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 30; e (c) uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 31; e compreende ainda: (d) uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 34; (e) uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 35; e (f) uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 55.

[0013] Em alguns outros aspectos específicos, o anticorpo isolado, é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo: uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 1, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO:2, e uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3; (b) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 15, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 16, e uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 17, e (c) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 29, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 30, e uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 31.

[0014] Em alguns aspectos adicionais, a invenção provê um anticorpo isolado ou sua parte de ligação a antígeno, que se liga especificamente ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo ou parte de ligação a antígeno é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8. (b) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:20, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 22. (c) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 36; e (d) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 55.

[0015] Em alguns outros aspectos específicos, o anticorpo isolado é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo: uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:1, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO:2, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma L- CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8; (b) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 15, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO:16, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 17; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 20, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 22. (c) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 29, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 30, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 31; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 36; e (d) um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 29, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 30, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 31; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 55.

[0016] Em um aspecto adicional específico, o anticorpo isolado compreende uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 43.

[0017] Em um aspecto adicional específico, o anticorpo isolado compreende uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 64.

[0018] Em um aspecto adicional específico, o anticorpo isolado uma sequência de aminoácidos do domínio VH como apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 4, 18, 32 e :43 e compreende ainda uma sequência de aminoácidos do domínio VL como apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 64

[0019] Em um aspecto adicional específico, o anticorpo isolado é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 9; (b) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 18 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 23; (c) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 32 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 56; e (d) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 43 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 64.

[0020] Em ainda outro aspecto específico adicional, o anticorpo isolado provido pela presente invenção compreende uma cadeia de VH que é codificada por (i) uma sequência de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47 ou (ii) sequências de ácidos nucleicos que se hibridizam em condições de alto rigor com a fita complementar da SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 47.

[0021] Em ainda outro aspecto específico adicional, o anticorpo isolado compreende uma cadeia de VL que é codificada por (i) uma sequência de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 66 ou (ii) sequências de ácidos nucleicos que se hibridizam em condições de alto rigor com a fita complementar da SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 66.

[0022] Em um aspecto adicional específico, é provido um anticorpo isolado que compete e/ou compete de modo cruzado pela ligação ao 4- 1BB humano com um anticorpo ilustrativo selecionado a partir de MOR- 6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR 7483, MOR-7483.1 ou MOR-7483.2.

[0023] Em um aspecto adicional específico, é provido um anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopo no 4-1BB humano que qualquer um dos anticorpos dos anticorpos descritos neste pedido de patente. Em algumas modalidades, a invenção provê anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopo no 4-1BB humano que um anticorpo ilustrativo selecionado a partir de MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR- 7480.1, MOR-7480.2, MOR 7483, MOR-7483.1 ou MOR-7483.2.

[0024] Em um aspecto adicional específico, a presente invenção provê um anticorpo isolado que se liga a 4-1BB humano, compreendendo uma região variável de cadeia pesada, que é o produto ou derivada a partir de um gene VH 3-23, gene VH 1-69 ou VH 5 humano. Em outro aspecto específico, a presente invenção provê um anticorpo isolado que se liga a 4-1BB humano, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto ou é derivada a partir de um gene VL À3 ou À1-13 humano.

[0025] Em algumas modalidades, os anticorpos isolados aqui descritos possuem uma ou mais das seguintes propriedades ou características: a) ligam-se especificamente ao 4-1BB humano; b) ligam-se ao 4-1BB humano ou de cynomolgus; c) ligam-se ao 4-1BB humano ou ao 4-1BB de cynomolgus, mas não ao 4-1BB de rato ou camundongo; d) são IgG, como IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4; e e) são anticorpos humanos ou anticorpos humanizados.

[0026] Em alguns outros aspectos, a presente invenção provê uma parte de ligação a antígeno de qualquer um dos anticorpos providos pela presente invenção. Em algumas modalidades, a parte de ligação a antígeno é o fragmento Fab ou scFv.

[0027] Em alguns aspectos adicionais, a presente invenção provê um derivado de qualquer um dos anticorpos providos pela presente invenção.

[0028] Em alguns outros aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que codifica uma cadeia de VH de um anticorpo ou de sua parte de ligação a antígeno que se liga a 4-1BB humano, o qual é selecionado a partir do grupo constituído por: (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 43; (ii) uma sequência de ácido nucleico como apresentada na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 47; ou (iii) uma sequência de ácido nucleico que se hibridiza em condições de alto rigor com a fita complementar de uma sequência de ácido nucleico como apresentada na SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 39 ou SEQ ID NO: 47.

[0029] Em alguns outros aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que codifica uma cadeia de VL de um anticorpo ou de sua parte de ligação a antígeno que se liga a 4-1BB humano, o qual é selecionado a partir do grupo constituído por: (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 64; (ii) uma sequência de ácido nucleico como apresentada na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 66; ou (iii) sequências de ácidos nucleicos que se hibridizam em condições de alto rigor com a fita complementar de uma sequência de ácido nucleico como apresentada na SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 66.

[0030] Em alguns aspectos adicionais, a invenção provê um vetor compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos aqui descritos. Em ainda um aspecto adicional, a invenção provê uma célula hospedeira compreendendo qualquer um dos vetores aqui descritos. Tais células hospedeiras podem ser bacterianas ou de mamíferos.

[0031] Em alguns aspectos adicionais, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos, de suas partes de ligação a antígeno ou de seus derivados e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0032] A invenção provê ainda métodos para tratar o crescimento anormal de células em um indivíduo que necessita esse tratamento, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação da invenção ou de uma composição farmacêutica aqui descrita. A invenção provê ainda métodos para reduzir a metástase de células tumorais em um indivíduo, compreendendo administrar ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação ou de composições farmacêuticas aqui descritas.

[0033] Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso de qualquer uma das moléculas de ligação ou de uma composição farmacêutica aqui descrita, para a manufatura de um medicamento para o tratamento de crescimento celular anormal em um indivíduo que o necessita. Em um aspecto adicional, a invenção provê uma molécula de ligação ou uma composição farmacêutica, conforme aqui descritas, para uso no tratamento de crescimento celular anormal em um indivíduo que o necessita. Em ainda mais um aspecto, a invenção provê uma molécula de ligação ou uma composição farmacêutica, conforme aqui descritas, para uso no tratamento de metástase de células tumorais em um indivíduo que o necessita. Em ainda um aspecto adicional, a invenção provê o uso de qualquer uma das moléculas de ligação ou de uma composição farmacêutica aqui descrita, para a manufatura de um medicamento para o tratamento de metástase de células tumorais em um indivíduo que o necessita.

Breve descrição dos desenhos

[0034] A Figura 1 apresenta quatro gráficos de colunas mostrando a intensidade média de fluorescência de PBMC primárias não estimuladas (preto) e estimuladas com PHA (cinza claro) de humanos (parte superior à esquerda), cynomolgus (parte superior à direita), cão (parte inferior à esquerda) e rato (parte inferior à direita), que foram incubadas com o anticorpo contra 4-1BB indicado ou o anticorpo controle conjugados ao Alexafluor 647. O painel demonstra a ligação a PBMC humanas e de cynomolgus estimuladas com PHA.

[0035] A Figura 2 apresenta dois gráficos de linhas mostrando a atividade do repórter luciferase em células 293T que expressam 4-1BB e que foram estimuladas com diversas concentrações de mAb específico contra 4-1BB ou de mAB de isotipo controle. O painel esquerdo demonstra a atividade de repórter em células que expressam 4-1BB de cynomolgus. O painel direito demonstra a atividade em células que expressam 4-1BB humano. Os dados estão expressos em função do número de vezes de estimulação acima do isotipo controle.

[0036] A Figura 3 (3A e 3B) apresenta gráficos de linhas mostrando a concentração de IL-2 humana presente em meios de cultura celular após 72 horas de estimulação de células T humanas com anti-CD3 e diversas concentrações de anticorpos contra 4-1BB. Cada painel (A e B) representa um doador individual.

[0037] A Figura 4 é um diagrama de espalhamento mostrando a expansão de células mononucleares do sangue periférico humano em camundongos que foram tratados com mAb contra 4-1BB ou com o mAb de isotipo controle. Os dados estão expressos como o percentual de células que expressam CD45 humano no sangue periférico de camundongos NSG individuais nos Dias 24-28 do estudo que haviam sido injetados com seis milhões de células mononucleares do sangue periférico humano no Dia 0 e injetados com mAb contra 4-1BB 1 mg/kg ou com mAb de isotipo controle no Dia 9. A significância estatística foi determinada utilizando teste bilateral de Mann-Whitney: * p<0,05, ** p<0,005. Sem HBPT refere-se a animais que não foram injetados com células humanas.

[0038] A Figura 5 apresenta dois gráficos de colunas mostrando a alteração em células T CD8 de memória em proliferação, ocorrida em diversos momentos após a administração de mAb contra 4-1BB em macacos cynomolgus. Os dados são mostrados em colunas representando animais designados como (nível de dose-número de animal) e estão representados como alteração intra-animal no número de células Ki-67+ em relação ao número antes do estudo {[(no de células Ki-67+ no dia indicado do estudo - no de células Ki-67+ antes da dose)/no de células Ki-67+ antes da dose]*100}. Células centrais CD8 de memória foram identificadas como CD3+, CD8+, CD28+ e CD95+.

[0039] A Figura 6 apresenta gráficos de linhas mostrando o crescimento de tumores injetados por via subcutânea com células tumorais (PC3, painel esquerdo; LOVO, painel direito) e células mononucleares do sangue periférico humano no Dia 0 do estudo. Os camundongos foram injetados com 10 mg/kg do mAbs indicado contra 4-1BB no Dia 0.

[0040] O painel esquerdo da Figura 7 é um diagrama de espalhamento mostrando o percentual de PBMC que são positivas para o marcador de superfície CD8+ de células T e que incorporaram o análogo de nucleosídeo BrdU após o tratamento de camundongos knock in (com ganho de função) de 4-1BB com mAb contra 4-1BB ou veículo controle. O painel direito é um gráfico de linhas mostrando o crescimento de tumores melanoma murino injetados por via subcutânea em camundongos knock in de 4-1BB e tratados com a concentração indicada de mAb contra 4-1BB.

[0041] A Figura 8 mostra alinhamentos de Sequências de Aminoácidos das Regiões Variáveis de Cadeia Pesada e das Regiões Variáveis da Cadeia (com as CDRs sublinhadas) com as Sequências da Linhagem Germinativa Relevante.

Descrição detalhada da invenção A. Definições

[0042] A menos que definido de outra forma neste relatório descritivo, termos científicos e técnicos utilizados no âmbito da presente invenção terão os significados que são comumente entendidos pelos técnicos no assunto. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, termos no singular incluirão pluralidades e termos no plural incluirão o singular. Em geral, as nomenclaturas utilizadas em relação e com técnicas de cultura celular e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e de ácidos nucleicos e de hibridização descritos neste pedido de patente são as bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica.

[0043] Neste relatório descritivo, cada um dos termos a seguir possuem os significados aos quais são associados nesta seção.

[0044] O termo "anticorpo contra 4-1BB" refere-se a um anticorpo, conforme definido neste relatório descritivo, capaz de se ligar ao receptor 4-1BB humano.

[0045] Os termos "4-1BB" e "receptor 4-1BB" são utilizados alternadamente no presente pedido de patente, incluindo o receptor 4- 1BB humano, bem como variantes, isoformas e homólogos deste entre espécies. Dessa forma, uma molécula de ligação, conforme definida e revelada neste relatório descritivo, pode ligar-se também a 4-1BB de outras espécies além da humana. Em outros casos, uma molécula de ligação pode ser completamente específica para o 4-1BB humano e pode não exibir reatividade cruzada entre espécies ou outros tipos de reatividade cruzada.

[0046] Os artigos "um" e "uma" referem-se a um ou mais de um (ou seja, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.

[0047] O termo "agonista" refere-se a uma molécula de ligação, conforme definida neste relatório descritivo, que, quando da ligação a 4- 1BB, (1) estimula ou ativa o 4-1BB, (2) intensifica, aumenta, promove, induz ou prolonga uma atividade, função ou a presença de 4-1BB ou (3) intensifica, aumenta, promove ou induz a expressão de 4-1BB.

[0048] O termo "aminoácido" refere-se aos aminoácidos naturais e sintéticos, bem como aos análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que operam de maneira semelhante aos aminoácidos naturais. Aminoácidos naturais são os codificados pelo código genético, bem como aqueles que são modificados mais tarde, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato e O-fosfoserina. O termo "análogo de aminoácidos" refere-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido natural, mas cujo grupo carbóxi em C-terminal, o grupo amino em N-terminal ou um grupo funcional na cadeia lateral tenha sido modificado quimicamente para outro grupo funcional. O termo "mimético de aminoácidos" refere-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que opera de maneira semelhante a um aminoácido natural.

[0049] O termo "anticorpo" é um termo reconhecido na técnica e refere-se a uma proteína de ligação a antígeno (ou seja, imunoglobulina) com uma estrutura básica formada por quatro cadeias polipeptídicas, consistindo em duas cadeias pesadas (H) idênticas e duas cadeias leves (L) idênticas. Cada cadeia L está unida a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H estão unidas entre si por uma ou mais ligações dissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia pesada possui, no N-terminal, uma região variável (abreviada neste relatório descritivo como VH) seguida por uma região constante. A região constante da cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve possui, no N-terminal, uma região variável (abreviada neste relatório descritivo como VL) seguida por uma região constante em sua outra extremidade. A região constante da cadeia leve é composta por um domínio, CL. A VL está alinhada com a VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). O pareamento de uma VH e uma VL forma em conjunto um único sítio de ligação a antígeno. Um anticorpo IgM é composto por 5 das unidades heterotetraméricas básicas, juntamente com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J e, portanto, contém 10 sítios de ligação a antígeno, enquanto anticorpos IgA secretados podem se polimerizar de modo a formar montagens polivalentes compreendendo 2-5 das unidades básicas de 4 cadeias juntamente com a cadeia J.

[0050] As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (arcabouço) (FR). As regiões CDR podem ser determinadas utilizando os sistemas de numeração de Kabat ou de Chothia, ambos os quais bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Ver, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Departamento de Saúde e de Serviços Humanos dos Estados Unidos, Publicação NIH No 91-3242; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). As VH e VL são compostas por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir da terminação amino para a terminação carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Por todo este relatório descritivo, as três CDRs da cadeia pesada são referidas como H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3. Do mesmo modo, as três CDRs da cadeia leve são referidas como L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem ser mediadoras da ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema clássico do complemento. Dentro das cadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de aproximadamente 12 ou mais aminoácidos, sendo que a cadeia pesada inclui também uma região "D" de aproximadamente 10 ou mais aminoácidos. Ver em geral, Fundamental Immunology, capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)).

[0051] A cadeia L de qualquer espécie vertebrada pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), os anticorpos podem ser atribuídos a diferentes classes ou isotipos. Há cinco classes de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com cadeias pesadas designadas α (alfa), δ (delta), ε (epsilon), Y (gama) e μ (mu), respectivamente. A classe IgG de anticorpo pode ser ainda classificada em quatro subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 pelas cadeias pesadas gama, Y1 - Y4, respectivamente.

[0052] O termo "derivado de anticorpo" ou "derivado" de um anticorpo refere-se a uma molécula que é capaz de se ligar ao mesmo antígeno (por exemplo, 4-1BB) que o anticorpo liga-se e compreende uma sequência de aminoácidos do anticorpo ligada a uma entidade molecular adicional. A sequência de aminoácidos do anticorpo que está contida no derivado do anticorpo pode ser de cadeia pesada completa, cadeia leve completa, qualquer parte ou partes de uma cadeia pesada completa, qualquer parte ou partes da cadeia leve do anticorpo, quaisquer outros fragmentos de um anticorpo do anticorpo completo. A entidade molecular adicional pode ser uma molécula química ou biológica. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem grupos químicos, aminoácidos, peptídeos, proteínas (tais como enzimas, anticorpos) e compostos químicos. A entidade molecular adicional pode ter qualquer utilidade, tais como para uso como agente de detecção, marcação, marcador, agente farmacêutico ou terapêutico. A sequência de aminoácidos de um anticorpo pode ser presa ou ligada à entidade molecular adicional por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou por outra forma qualquer. O termo "derivado de anticorpo" abrange também anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e moléculas que são derivadas a partir de modificações das sequências de aminoácidos de um anticorpo contra 4- 1BB, tais como substituições, adições e inserções conservadoras de aminoácidos.

[0053] O termo "fragmento de ligação a antígeno" ou "parte de ligação a antígeno" de um anticorpo refere-se a uma ou mais partes de um anticorpo que retêm a capacidade para se ligar ao antígeno ao qual o anticorpo se liga (por exemplo, 4-1BB). Exemplos de "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente constituído pelos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab unidos por uma ponte dissulfeto na região hinge (de articulação); (iii) fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)), o qual consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada.

[0054] O termo "molécula de ligação" abrange (1) anticorpo, (2) fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo e (3) derivado de um anticorpo, cada um conforme definido neste relatório descritivo.

[0055] O termo "ligar 4-1BB", "liga 4-1BB", "ligar-se a 4-1BB" ou "liga-se a 4-1BB" refere-se à ligação de uma molécula de ligação, como aqui definida, ao 4-1BB humano em um ensaio in vitro, tal como ensaio BIAcore como descrito no Exemplo 6, com afinidade (KD) de 500 nM ou menos.

[0056] O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo que compreende sequências de aminoácidos derivadas de espécies animais diferentes, tais como os que possuem uma região variável derivada de um anticorpo humano e uma região constante de imunoglobulina murina.

[0057] O termo "compete pela ligação" refere-se à interação de dois anticorpos em sua ligação a um alvo de ligação. Um primeiro anticorpo compete pela ligação com um segundo anticorpo, se a ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato diminuir de modo detectável na presença do segundo anticorpo, em comparação à ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, quando a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo diminui também de modo detectável na presença do primeiro anticorpo, pode, mas não precisa ser o caso. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epítopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo a seu respectivo epítopo. Contudo, quando cada anticorpo inibir de modo detectável a ligação do outro anticorpo com seu epítopo cognato, seja na mesma, em maior ou em menor medida, é dito que os anticorpos "competem de modo cruzado" entre si pela ligação a seu(s) respectivo(s) epítopo(s).

[0058] O termo "epítopo" refere-se a uma parte de um antígeno à qual um anticorpo (ou seu fragmento de ligação a antígeno) se liga. Epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pelo enovelamento terciário de uma proteína. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos ao serem expostos a solventes desnaturantes, ao passo que epítopos formados por enovelamento terciários são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo pode incluir vários números de aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Uma vez determinado um epítopo ou antígeno desejado, anticorpos contra aquele epítopo podem ser gerados, por exemplo, utilizando as técnicas aqui descritas. A geração e a caracterização de anticorpos pode também elucidar informações sobre epítopos desejáveis. A partir destas informações, é então possível rastrear por competição anticorpos que se liguem ao mesmo epítopo. Uma abordagem para realizá-lo é conduzir estudos de competição cruzada para descobrir anticorpos que liguem competitivamente um com o outro, ou seja, os anticorpos competem pela ligação ao antígeno. Um processo de alto rendimento para "compartimentar" anticorpos com base na sua competição cruzada é descrito na Publicação PCT No WO 03/48731.

[0059] O termo "linhagem germinativa" refere-se às sequências de nucleotídeos dos genes de anticorpos e de segmentos gênicos à medida que são transmitidos dos progenitores para a prole por intermédio das células germinativas. A sequência da linhagem germinativa distingue-se das sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos em células B maduras que foram alteradas por recombinação e por eventos de hipermutação no transcorrer da maturação de células B.

[0060] O termo "sítios de glicosilação" refere-se aos resíduos de aminoácidos que são reconhecidos por uma célula eucariótica como locais para o acoplamento de resíduos de açúcares. Os aminoácidos nos quais o carboidrato, tal como oligossacarídeo, é acoplado são tipicamente os resíduos asparagina (ligação em N), serina (ligação em O) e treonina (ligação em O). O sítio específico de acoplamento é tipicamente sinalizado por uma sequência de aminoácidos, designada neste relatório descritivo como "sequência de sítio de glicosilação". A sequência de sítio de glicosilação para glicosilação N-ligada é: -Asn-X- Ser- ou -Asn-X-Thr-, onde X pode ser qualquer um dos aminoácidos convencionais, com exceção de prolina. Os termos "N-ligado" e "O- ligado" referem-se ao grupo químico que serve como o sítio de acoplamento entre a molécula de açúcar e o resíduo de aminoácido. Açúcares N-ligados são acoplados através de um grupo amino; açúcares O-ligados são acoplados através de um grupo hidroxila. O termo "ocupação de glicano" refere-se à existência de um grupo carboidrato que está ligado a um sítio de glicosilação (ou seja, o sítio de glicano está ocupado). Quando houver pelo menos dois sítios potenciais de glicosilação em um polipeptídeo, nenhum (0 ocupação do sítio de glicano), um (1 ocupação do sítio de glicano) ou ambos (2 ocupações do sítio de glicano) os sítios podem estar ocupados por um grupo carboidrato.

[0061] O termo "célula hospedeira" refere-se a um sistema celular que pode ser construído para gerar proteínas, fragmentos de proteínas ou peptídeos de interesse. As células hospedeiras incluem, entre outras, células cultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamíferos derivadas de roedores (ratos, camundongos, cobaias ou hamsters) tais como CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0; ou células de tecidos humanos ou de hibridomas, células de levedura e células de insetos, incluídas em um animal transgênico ou tecido cultivado. O termo abrange não só a célula específica em questão, mas também a progênie de tal célula. Considerando que certas modificações podem ocorrer em gerações que se sucedem decorrentes de mutação ou de influências ambientais, tal progênie pode não ser idêntica às células precursoras, mas é ainda incluída no âmbito do termo "célula hospedeira".

[0062] O termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo no qual as sequências inteiras de aminoácidos das cadeias leves e pesadas são provenientes dos genes de imunoglobulinas humanas. Um anticorpo humano pode conter cadeias murinas de carboidratos se produzidas em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Anticorpos humanos podem ser preparados em uma variedade de maneiras conhecidas na técnica.

[0063] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico que contém resíduos de aminoácidos derivados a partir de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado pode conter algumas ou todas as CDRs de um anticorpo de animal não humano, enquanto as regiões framework e constantes do anticorpo contêm resíduos de aminoácidos derivados a partir de sequências de anticorpos humanos.

[0064] O termo "anticorpo ilustrativo" refere-se a qualquer um dos anticorpos descritos na invenção e designados MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1 e MOR-7483.2. Estes anticorpos podem estar em qualquer classe (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Por conseguinte, todo anticorpo identificado acima abrange anticorpos em todas as cinco classes que possuírem as mesmas sequências de aminoácidos para as regiões VL e VH. Além disso, os anticorpos na classe de IgG podem estar em qualquer subclasse (por exemplo, IgG1 IgG2, IgG3 e IgG4). Por conseguinte, todo anticorpo identificado acima na subclasse de IgG abrange anticorpos em todas as quatro subclasses que possuírem as mesmas sequências de aminoácidos para as regiões VL e VH. As sequências de aminoácidos das regiões constantes da cadeia pesada de anticorpos humanos nas cinco classes, bem como nas quatro subclasses de IgG, são conhecidas na técnica. Como exemplos, as sequências de aminoácidos das regiões constantes de IgG1 e IgG2 humanas são fornecidas em SEQ ID NOs: 69 e 71, respectivamente. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada completa para a subclasse IgG2 de cada um dos anticorpos ilustrativos é fornecida na invenção.

[0065] O termo "anticorpo isolado" ou "molécula de ligação isolada" refere-se a um anticorpo ou uma molécula de ligação, conforme definidos neste relatório descritivo, que: (1) não está associado com componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo; (2) está livre de outras proteínas da mesma espécie; (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente; ou (4) não ocorre na natureza. Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo contra 4-1BB que foi purificado por afinidade utilizando 4-1BB, um anticorpo contra 4-1BB que foi gerado por hibridomas ou outra linhagem celular in vitro e um anticorpo contra 4-1BB derivado a partir de um animal transgênico.

[0066] O termo "ácido nucleico isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico de origem genômica, de cDNA ou sintética ou uma combinação destes, que é separada das outras moléculas de ácido nucleico presentes na fonte natural do ácido nucleico. Por exemplo, no que diz respeito ao DNA genômico, o termo "isolado" inclui moléculas de ácido nucleico que são separadas do cromossomo com o qual o DNA genômico está naturalmente associado. De preferência, um ácido nucleico "isolado" está livre de sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (ou seja, sequências situadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico de interesse).

[0067] O termo "ka" refere-se à constante para a taxa de associação de uma determinada interação anticorpo-antígeno, ao passo que o termo "kd" refere-se à constante para a taxa de dissociação de uma determinada interação anticorpo-antígeno.

[0068] O termo "KD" refere-se à constante de dissociação em equilíbrio de uma determinada interação anticorpo-antígeno. É obtida a partir da razão de kd para ka (ou seja, kd/ka) e é expressa em concentração molar (M). KD é utilizada como uma medida para a afinidade de ligação de um anticorpo por seu parceiro de ligação. Quanto menor a KD, o mais firmemente ligado o anticorpo está ou mais alta é a afinidade entre o anticorpo e o antígeno. Por exemplo, um anticorpo com constante de dissociação nanomolar (nM) liga-se mais firmemente a um antígeno específico do que um anticorpo com constante de dissociação micromolar (μM). Valores de KD para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar a KD de um anticorpo é por meio de ressonância plasmônica de superfície, tipicamente utilizando um sistema biossensor tal como sistema Biacore®. Um procedimento de ensaio utilizando o sistema BIACORETM (ensaio BIAcore) é descrito na seção de Exemplos deste pedido de patente.

[0069] O termo "mamífero" refere-se a qualquer espécie animal da classe Mammalia. Exemplos de mamíferos incluem: humanos; animais de laboratório tais como ratos, camundongos, símios e cobaias; animais domésticos tais como gatos, cães, coelhos, bovinos, ovelha, cabras, cavalos e porcos; e animais selvagens em cativeiro tais como leões, tigres, elefantes e os semelhantes.

[0070] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais compondo a população são idênticos, exceto por possíveis mutações naturais que podem estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além do mais, ao contrário de preparados de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), todo anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados sem que sejam contaminados por outros anticorpos. O modificador "monoclonal" não deverá ser interpretado no sentido de ser necessária a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser preparados pela metodologia de hibridomas ou podem ser produzidos utilizando métodos do DNA recombinante em células bacterianas, de animais eucarióticos ou de plantas (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4 816 567). Os anticorpos monoclonais podem ser isolados também a partir de bibliotecas de anticorpos apresentadas em fagos, utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

[0071] O termo "prevenir" ou "prevenindo," com referência a uma determinada condição de doença em um mamífero, refere-se a prevenir ou retardar o início da doença ou prevenir a manifestação de seus sintomas clínicos ou subclínicos.

[0072] O termo "anticorpo recombinante" refere-se a um anticorpo que é preparado, expresso, criado ou isolado por meio recombinante, tais como anticorpos isolados a partir de um animal transgênico para genes de imunoglobulinas de outra espécie, anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca combinatória de anticorpos recombinantes ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências de genes de imunoglobulinas e inseridas em outras sequências de DNA.

[0073] Neste relatório descritivo, "identidade de sequência" entre duas sequências polipeptídicas indica o percentual de aminoácidos que são idênticos entre as sequências. A identidade de sequências de aminoácidos de polipeptídeos pode ser determinada convencionalmente utilizando programas conhecidos de computador tais como Bestfit, FASTA ou BLAST (ver, por exemplo, Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucelic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). Quando utilizando o Bestfit ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma determinada sequência é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, os parâmetros são definidos de tal forma que o percentual de identidade seja calculado sobre a extensão completa da sequência de aminoácidos de referência e que lacunas (gaps) em homologia de até 5% do número total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência sejam permitidas. Este método citado acima para determinar o percentual de identidade entre polipeptídeos pode ser aplicado a todas as proteínas, seus fragmentos ou variantes descritos neste pedido de patente.

[0074] O termo "liga especificamente" ou "liga-se especificamente a", em referência à interação de uma molécula de ligação, conforme definida neste relatório descritivo, (por exemplo, um anticorpo) com seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno), refere-se à capacidade da molécula de ligação para descriminar entre um antígeno de interesse de uma espécie animal e o ortólogo do antígeno de uma espécie animal diferente em dado conjunto de condições. Uma molécula de ligação a 4-1BB é dita que se liga especificamente ao 4-1BB humano se ligar-se a 4-1BB humano a uma EC50 que seja abaixo de 50 por cento da EC50 à qual se liga a 4-1BB de rato ou de camundongo conforme determinado em um ensaio in vitro. A especificidade de ligação de um anticorpo pode ser determinada por meio de métodos conhecidos na técnica. Exemplos de tais métodos incluem FACS utilizando células primárias estimuladas com PHA, técnica de Western blots, testes ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídeos.

[0075] O termo "liga seletivamente" ou "liga-se seletivamente a", em referência à interação de uma molécula de ligação, conforme definida neste relatório descritivo, (por exemplo, um anticorpo) com seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno), refere-se à capacidade da molécula de ligação para descriminar entre um antígeno de interesse de uma espécie animal (tal como 4-1BB humano) e um antígeno diferente da mesma espécie animal (tal como CD40 humano) em dado conjunto de condições. Uma molécula de ligação a 4-1BB é dita que se liga seletivamente ao 4-1BB humano se ligar-se ao 4-1BB humano a uma EC50 que seja abaixo de 10 por cento da EC50 à qual se liga ao CD40 humano ou ao CD134 humano, conforme determinado em um ensaio in vitro.

[0076] O termo "trata", "tratar" ou "tratamento", com referência a uma determinada condição de doença em um mamífero, refere-se a provocar um efeito desejável ou benéfico no mamífero apresentando a condição de doença. O efeito desejável ou benéfico pode incluir frequência ou gravidade reduzida de um ou mais sintomas da doença (ou seja, crescimento tumoral e/ou metástase ou outro efeito mediado pelos números e/ou pela atividade de células imunes e os semelhantes) ou interrupção ou inibição de desenvolvimento adicional da doença, condição ou transtorno. No contexto de tratamento de câncer em um mamífero, o efeito desejável ou benéfico pode incluir a inibição de crescimento adicional ou disseminação de células cancerosas, morte de células cancerosas, inibição de reincidência do câncer, redução da dor associada com o câncer ou sobrevida melhorada do mamífero. O efeito pode ser subjetivo ou objetivo. Por exemplo, se o mamífero for humano, o humano pode notar vigor ou vitalidade melhorada ou dor diminuída, como sintomas subjetivos de melhora ou resposta à terapia. Alternativamente, o médico pode notar diminuição em tamanho tumoral ou carga tumoral ao exame físico, em parâmetros laboratoriais, marcadores tumorais ou achados radiográficos. Alguns sinais laboratoriais que o médico pode observar para resposta ao tratamento incluem normalização de testes, tais como contagem de leucócitos, contagem de hemácias, contagem de plaquetas, velocidade de hemossedimentação e níveis de várias enzimas. Adicionalmente, o médico pode observar diminuição em um marcador tumoral detectável. Alternativamente, outros testes podem ser utilizados para avaliar a melhora objetiva, tais como sonogramas, testes com ressonância magnética nuclear e testes com emissões de pósitrons.

[0077] O termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar uma molécula de ácido nucleico exógeno. A molécula de ácido nucleico exógeno é ligada à molécula de ácido nucleico do vetor por uma técnica recombinante, tal como ligação ou recombinação. Isso permite que a molécula de ácido nucleico exógeno seja multiplicada, selecionada, adiante manipulada ou expressa em uma célula hospedeira ou organismo. Um vetor pode ser um plasmídeo, fago, transposon, cosmídeo, cromossomo, vírus ou vírion. Um tipo de vetores pode ser integrado no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e com isso são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro (por exemplo, vetores não epissomais de mamíferos). Outro tipo de vetores é capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamíferos). Outro tipo específico de vetores capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos exógenos passíveis de expressão aos quais estão ligados operacionalmente é comumente designado "vetores de expressão". Os vetores de expressão geralmente possuem sequências de controle para direcionar a expressão de ácidos nucleicos exógenos passíveis de expressão. Vetores mais simples, conhecidos como "vetores de transcrição", são somente capazes de serem transcritos, mas não traduzidos: estes vetores podem ser replicados em uma célula alvo, mas não expressos. O termo "vetor" abrange todos os tipos de vetores independentemente de sua função. Vetores capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos passíveis de expressão aos quais estão operacionalmente ligados são comumente designados "vetores de expressão".

[0078] Os métodos e as técnicas da presente invenção são em geral executados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e conforme descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por todo o presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma. Tais referências incluem, por exemplo, Sambrook e Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002) e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação foram realizadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme efetuadas na técnica ou conforme descritas neste pedido de patente. As nomenclaturas utilizadas relacionadas e os procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química orgânica sintética e de química medicinal e farmacêutica, descritos neste pedido de patente, são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados na técnica. Técnicas padrões são utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, para o preparo, formulação e liberação farmacêutica e para o tratamento de pacientes.

[0079] Neste relatório descritivo, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology--A Synthesis (2a edição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).

B. Moléculas de ligação que se ligam ao 4-1bb humano

[0080] A presente invenção provê moléculas de ligação isoladas que se ligam ao 4-1BB humano, incluindo anticorpos contra 4-1BB, fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos contra 4-1BB e derivados dos anticorpos contra 4-1BB.

B-1. Anticorpos contra 4-1BB

[0081] Em alguns aspectos, a presente invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano em um epítopo incluído nos resíduos de aminoácidos 115 - 156 da SEQ ID No: 68. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende a sequência de aminoácidos de H-CDR1 da SEQ ID NO: 29, a sequência de aminoácidos de H-CDR2 da SEQ ID NO: 30 e a sequência de aminoácidos de H-CDR3 da SEQ ID NO: 31. Em algumas outras modalidades, o anticorpo isolado compreende a sequência de aminoácidos de L-CDR1 da SEQ ID NO: 34, a sequência de aminoácidos de L-CDR2 da SEQ ID NO: 35 e a sequência de aminoácidos de L-CDR3 de SEQ ID NO: 36. Em algumas outras modalidades, os anticorpos descritos acima possuem uma ou mais propriedades biológicas descritas abaixo.

[0082] Em outros aspectos, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga a 4-1BB humano, em que o referido anticorpo compreende: (a) uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 29; (b) uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 30; e (c) uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 31.

[0083] Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga a 4-1BB humano, em que o referido anticorpo compreende: (a) uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO:3 4; (b) uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 35; e (c) uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 55.

[0084] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga a 4-1BB humano, em que o referido anticorpo compreende: (a) uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 29; (b) uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 30; e (c) uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 31; e compreende ainda: (d) uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 34; (e) uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 35; e (f) uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO: 55.

[0085] Em alguns aspectos adicionais, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 1, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3; (b) um anticorpo compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 15, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 16 e uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 17; e (c) um anticorpo compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 29, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 30 e uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 31.

[0086] Em alguns aspectos adicionais, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8; (b) um anticorpo compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 20, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 22; (c) um anticorpo compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 36; e (d) um anticorpo compreendendo uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 55.

[0087] Em alguns aspectos adicionais, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 1, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 2, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 8; (b) um anticorpo compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:15, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 16, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 17; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 20, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 22; (c) um anticorpo compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 29, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 30, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO:31; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO: 34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 36; e (d) um anticorpo compreendendo uma H-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:29, uma H-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 30, uma H-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 31; uma L-CDR1 como apresentada na SEQ ID NO:34, uma L-CDR2 como apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma L-CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 55.

[0088] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:43.

[0089] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 64.

[0090] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo compreende (1) uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 43 e (2) uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 64.

[0091] Em um aspecto adicional, a invenção provê um anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, em que o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo constituído por: (a) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 9; (b) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 18 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 23; (c) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 32 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 56; e (d) um anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos de VH na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 43 e uma sequência de aminoácidos de VL na cadeia como apresentada na SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 64.

[0092] Em algumas modalidades, os anticorpos descritos acima, incluindo anticorpos descritos com referência à ligação de epítopos e anticorpos descritos com referência a sequências específicas de aminoácidos de CDRs ou de regiões variáveis, possuem ao menos uma das seguintes propriedades funcionais: (a) ligam-se a 4-1BB humano com KD de 500 nM ou menos; (b) exibem atividade agonista em 4-1BB humano; (c) não se ligam ao receptor CD40 humano em concentração de até 1000 nM; (d) não se ligam ao receptor CD134 humano em concentrações de até 1000 nM; (e) não se ligam a 4-1BB de rato ou de camundongo em concentrações de até 100 nM; (h) são capazes de inibir o crescimento de células tumorais; e (i) possuem efeito terapêutico sobre um câncer. Em algumas modalidades adicionais, os anticorpos ligam-se especificamente ao 4-1BB humano com KD de 500 nM ou menos, 100 nM ou menos, 50 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos ou 1 nM ou menos, para o domínio extracelular de 4-1BB humano, conforme medida com o ensaio BIACore descrito nesta invenção. Em ainda outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano ou anticorpo humanizado que se liga especificamente ao 4-1BB humano com KD de 500 nM ou menos, 100 nM ou menos, 50 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos ou 1 nM ou menos, para o domínio extracelular de 4-1BB, conforme medida com o ensaio BIACore descrito nesta invenção. Em algumas modalidades adicionais, o anticorpo é um anticorpo humano que se liga especificamente e se liga seletivamente ao 4-1BB humano.

[0093] Em outras modalidades, os anticorpos descritos acima compreendem uma região variável de cadeia pesada proveniente de um gene de cadeia pesada de imunoglobulina de uma linhagem germinativa em particular e/ou uma região variável de cadeia leve proveniente de um gene de cadeia leve de imunoglobulina de uma linhagem germinativa em particular, tal como um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia pesada, que é o produto ou derivada a partir de um gene VH 1-69, gene VH 3-23 ou gene VH 5 humano. Anticorpos exemplares incluem MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483.1 e MOR- 7483.2, cada um destes contendo aminoácidos que derivaram a partir do gene VH5 da linhagem germinativa humana.

[0094] Em ainda outras modalidades, os anticorpos descritos acima compreendem uma região variável de cadeia leve que é derivado a partir de um gene VL À3 humano. Em ainda outras modalidades, os anticorpos descritos acima compreendem uma região variável de cadeia pesada, que é o produto ou derivada a partir de um gene VH 1-69 humana, gene VH 3-23 ou gene VH 5 humano e compreende ainda uma região variável de cadeia leve que é o produto ou derivada a partir de um gene VL À3 humano, em que o anticorpo ou parte deste liga-se especificamente ao 4-1BB humano. Anticorpos exemplares incluem MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483.1 e MOR-7483.2, cada um destes contendo aminoácidos que derivaram a partir do gene VH5 e gene VL À3 da linhagem germinativa humana, respectivamente.

[0095] Neste relatório descritivo, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que são "derivadas a partir de" uma determinada sequência de linhagem germinativa se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas a partir de um sistema que utiliza genes de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico portador de genes de imunoglobulinas humanas com o antígeno de interesse ou rastrear uma biblioteca de genes de imunoglobulinas humanas apresentada em fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "derivado a partir de" uma sequência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal comparando-se a sequência de aminoácidos do anticorpo humano às sequências de aminoácidos de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana e selecionando-se a sequência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana que mais se assemelha em termos de sequência (ou seja, com maior % de identidade) à sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "derivado a partir de" uma determinada sequência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana pode conter diferenças em aminoácidos quando comparada à sequência da linhagem germinativa, que se devem, por exemplo, a mutações somáticas naturais ou a introdução intencional de mutação sítio-dirigida. Contudo, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico em termos de sequência de aminoácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina da linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como humano quando comparado às sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências da linhagem germinativa murina). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em termos de sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulinas da linhagem germinativa. Em certos casos, o anticorpo humano é idêntico em termos de sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de Ig da linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado a partir de uma determinada sequência da linhagem germinativa humana exibirá no máximo 10 diferenças em aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir no máximo 5 ou mesmo no máximo 4, 3, 2 ou 1 diferenças em aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulinas da linhagem germinativa. Alinhamentos das sequências de aminoácidos de regiões variáveis dos anticorpos ilustrativos e as linhagens germinativas pertinentes são fornecidos na Figura 6.

[0096] Em outro aspecto, a invenção provê anticorpos isolados que competem ou competem de modo cruzado pela ligação ao 4-1BB humano com qualquer um dos anticorpos ilustrativos da invenção, tais como MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1 ou MOR-7483.2. Em uma modalidade específica, a invenção provê anticorpos isolados que competem ou competem de modo cruzado pela ligação ao mesmo epítopo no 4-1BB humano com qualquer um dos anticorpos ilustrativos da invenção. A capacidade de um anticorpo competir de modo cruzado com outro anticorpo pela ligação pode ser determinada utilizando ensaios padrão de ligação conhecidos na técnica, tais como análise BIAcore, ensaios pela técnica ELISA ou citometria de fluxo. Por exemplo, pode-se permitir a um anticorpo ilustrativo da invenção que se ligue ao 4-1BB humano em condições saturantes e, em seguida, a capacidade do anticorpo em teste para se ligar ao 4-1BB é medida. Se o anticorpo em teste for capaz de se ligar ao 4-1BB ao mesmo tempo em que o anticorpo ilustrativo, então, o anticorpo em teste se liga a um epítopo diferente que o anticorpo ilustrativo. Contudo, se o anticorpo em teste não for capaz de se ligar ao 4-1BB ao mesmo tempo, o anticorpo em teste, nesse caso, se liga ao mesmo epítopo, a um epítopo sobreposto ou a um epítopo em grande proximidade ao epítopo ligado pelo anticorpo ilustrativo. Esse experimento pode ser realizado empregando vários métodos, tais como ELISA, RIA, FACS ou ressonância plasmônica de superfície.

[0097] Os anticorpos contra 4-1BB aqui descritos podem pertencer a qualquer classe, tal como IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD. É preferido que o anticorpos contra 4-1BB pertençam à classe de IgG, tais como as subclasses IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, mais preferivelmente à subclasse IgG2. Um anticorpo contra 4-1BB pode ser convertido de uma classe ou subclasse para outra classe ou subclasse utilizando métodos conhecidos na técnica. Um método exemplar para produzir um anticorpo em uma classe ou subclasse desejada compreende as etapas de isolar um ácido nucleico codificador de uma cadeia pesada de um anticorpo contra 4-1BB e um ácido nucleico codificador de uma cadeia leve de um anticorpo contra 4-1BB, isolar a sequência que codifica a região VH, ligar a sequência de VH a uma sequência que codifica uma região constante da cadeia pesada da classe ou subclasse desejada, expressar o gene da cadeia leve e da cadeia pesada construída em uma célula e coletar o anticorpo contra 4-1BB.

[0098] Adicionalmente, os anticorpos providos pela presente invenção podem ser monoclonais ou policlonais, mas preferivelmente monoclonais.

[0099] Exemplos de anticorpos isolados específicos providos pela presente invenção incluem os seguintes anticorpos ilustrativos: MOR- 6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.1, MOR- 7480.2, MOR-7483, MOR-7483, MOR-7483.1 e MOR-7483.2. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada, a cadeia pesada completa para a subclasse IgG2, a região variável da cadeia leve e a cadeia leve completa destes anticorpos são fornecidas neste relatório descritivo; um índice das SEQ ID NOs para estas sequências é apresentado na Tabela 1. As sequências de aminoácidos das CDRs destes anticorpos ilustrativos são mostradas na Tabela 2. Tabela: 1. Índice de SEQ ID NOs

Tabela 2: Sequência de aminoácidos de CDRs

[00100] Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por técnicas conhecidas na área, incluindo a metodologia convencional para anticorpos monoclonais, por exemplo, a técnica padrão de hibridização de células somáticas (Ver, por exemplo, Kohler e Milstein, Nature 256:495 (1975)), transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou tecnologias de anticorpos recombinantes conforme descritas detalhadamente abaixo.

[00101] A produção de hibridomas é um procedimento muito bem estabelecido. O sistema animal comum para preparar hibridomas é o sistema murino. Protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos para a fusão são também conhecidos. Um método bem conhecido que pode ser utilizado para produzir os anticorpos contra 4- 1BB humano providos pela presente invenção envolve o uso de um sistema animal XenoMouseTM. Os camundongos do XenoMouseTM pertencem a linhagens construídas de camundongos que compreendem grandes fragmentos de lócus da cadeia pesada e da cadeia leve de imunoglobulinas humanas e são deficientes na produção de anticorpos de camundongos. Ver, por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) e WO2003/040170. O animal é imunizado com um antígeno de 4-1BB. O antígeno de 4-1BB é 4-1BB isolado e/ou purificado, de preferência 4-1BB. Este pode ser um fragmento de 4-1BB, como o domínio extracelular de 4-1BB, especialmente um fragmento do domínio extracelular de 4-1BB compreendendo os resíduos de aminoácidos 115 - 156 da SEQ ID NO: 68. A imunização dos animais pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para imunizar animais não humanos como camundongos, ratos, ovelha, cabras, porcos, bovinos e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra e a Patente U.S. No 5 994 619. O antígeno de 4-1BB pode ser administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Adjuvantes exemplares incluem adjuvante completo ou incompleto de Freund, RIBI (muramil dipeptídeos) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Depois da imunização de um animal com um antígeno de 4-1BB, linhagens celulares imortalizadas produtoras de anticorpos são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificado e células de linfonodos ou esplênicas B são imortalizadas. Métodos para imortalizar células incluem, entre outros, a transferência das células com oncogenes, sua modulação com o vírus oncogênico e seu cultivo em condições nas quais células imortalizadas são selecionadas, submetê- las a compostos carcinogênicos ou que provoquem mutações, fundir as células a uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma, e inativar um gene supressor de tumor. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Se for utilizada fusão com células de mieloma, as células de mieloma de preferência não secretam polipeptídeos de imunoglobulinas (uma linhagem celular não secretora). As células imortalizadas são rastreadas utilizando 4-1BB, parte deste ou uma célula que expressa 4-1BB. Células produtoras de anticorpos contra 4- 1BB, por exemplo, hibridomas, são selecionadas, clonadas e ainda rastreadas quanto a características desejadas, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpos e características desejáveis de anticorpos, conforme discutidas mais detalhadamente abaixo. Os hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singênicos, em animais desprovidos de sistema imune, por exemplo, camundongos nude ou em cultura celular in vitro. Métodos para selecionar, clonar e expandir hibridomas são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

[00102] Os anticorpos da invenção podem ser preparados também utilizando métodos de apresentação em fagos. Tais métodos de apresentação em fagos para isolar anticorpos humanos são estabelecidos na técnica, tais como as Bibliotecas HuCAL® como descritas mais detalhadamente no Exemplo 1. Ver também, por exemplo: Achim Knappik, et al: Fully Synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) Based on Modular Consensus Frameworks and CDRs Randomized with Trinucleotides. J. Mol. Biol. (2000) 296, 5786.

B-2. Fragmentos de ligação a antígeno

[00103] Em alguns outros aspectos, a presente invenção provê fragmentos de ligação a antígenos de qualquer um dos anticorpos contra 4-1BB providos pela presente invenção.

[00104] O fragmento de ligação a antígeno pode compreender quaisquer sequências do anticorpo. Em algumas modalidades, o fragmento de ligação a antígeno compreende a sequência de aminoácidos de: (1) uma cadeia leve de um anticorpo contra 4-1BB; (2) uma cadeia pesada de um anticorpo contra 4-1BB; (3) uma região variável da cadeia leve de um anticorpo contra 4-1BB; (4) uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo contra 4-1BB; (5) uma ou mais CDRs (duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de um anticorpo contra 4-1BB; ou (6) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada de um anticorpo contra 4-1BB.

[00105] Em algumas modalidades específicas, a invenção provê um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo selecionado a partir de: MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1 ou MOR-7483.2.

[00106] Em algumas outras modalidades específicas, os fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo contra 4-1BB incluem: (i) fragmento Fab, que é um fragmento monovalente formado pelos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab')2, que é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região hinge; (iii) fragmento Fd constituído pelos domínios VH e CH1; (iv) fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; (v) fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; (vi) uma CDR isolada e (vii) anticorpo de cadeia única (scFv), que é um polipeptídeo compreendendo uma região VL de um anticorpo ligada a uma região VH de um anticorpo. Bird et al., (1988) Science 242:423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.

[00107] Em algumas modalidades específicas, o fragmento de ligação a antígeno é um fragmento Fab selecionado a partir do grupo constituído por Fab-6032, Fab-7361, Fab-7480 e Fab-7483.

B.3. Derivados de anticorpos

[00108] Em alguns aspectos adicionais, a presente invenção provê derivados de qualquer um dos anticorpos contra 4-1BB providos pela presente invenção.

[00109] Em um aspecto, o derivado de anticorpo é derivado a partir de modificações das sequências de aminoácidos de um anticorpo ilustrativo ("anticorpo precursor") da invenção ao mesmo tempo em que conservando a estrutura molecular global da sequência de aminoácidos do anticorpo precursor. Sequências de aminoácidos de quaisquer regiões do anticorpo precursor podem ser modificadas, tais como de regiões framework, regiões CDR ou regiões constantes. Os tipos de modificações incluem substituições, inserções, deleções, ou suas combinações, de um ou mais aminoácidos do anticorpo precursor. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região VH que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 18, 32 ou 43. Em algumas outras modalidades, o derivado de anticorpo compreende uma região VL que é pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 23, 37, 45, 51, 56, 60 ou 64. Em algumas modalidades específicas, o derivado compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições conservadoras ou não conservadoras e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 adições e/ou deleções a uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 18, 32, 43, 9, 23, 37, 45, 51, 56, 60 ou 64.

[00110] Substituições de aminoácidos abrangem substituições conservadoras e substituições não conservadoras. O termo "substituição conservadora de aminoácidos" significa uma troca de um aminoácido por outro aminoácido, em que os dois aminoácidos possuem similaridade em certas propriedades químicas, tais como polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, as substituições podem tipicamente ser efetuadas dentro de cada um dos seguintes grupos: (a) aminoácidos não polares (hidrofóbicos), como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; (b) aminoácidos neutros polares, como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; (c) aminoácidos com carga positiva (básicos), como arginina, lisina e histidina; e (d) aminoácidos com carga negativa (ácidos), como ácido aspártico e ácido glutâmico.

[00111] As modificações podem ser efetuadas em quaisquer posições das sequências de aminoácidos do anticorpo, incluindo as CDRs, regiões framework ou regiões constantes. Em uma modalidade, a presente invenção provê um derivado de anticorpo que contém as sequências de CDRs de VH e VL de um anticorpo ilustrativo desta invenção, contudo contém sequências framework diferentes daquelas do anticorpo ilustrativo. Estas sequências framework podem ser obtidas a partir de bancos de dados públicos de DNA ou de referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA da linhagem germinativa para genes de regiões variáveis da cadeia pesada e leve humanas podem ser encontradas no banco de dados Genbank ou no banco de dados "VBase" de sequências da linhagem germinativa humana (Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Departamento de Saúde e de Serviços Humanos dos Estados Unidos, Publicação NIH No 91-3242 (1991); Tomlinson, I. M., et al., J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992); e Cox, J. P. L. et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836 (1994)). Sequências framework que podem ser utilizadas para construir um derivado de anticorpo incluem as que são estruturalmente semelhantes às sequências framework utilizadas pelos anticorpos ilustrativos da invenção, por exemplo, semelhante às sequências framework VH 3-23 e/ou às sequências framework VL À3 ou À1-13 utilizadas pelos anticorpos ilustrativos da invenção. Por exemplo, as sequências de H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 e as sequências de L- CDR1, L-CDR2 e L-CDR3 de um anticorpo ilustrativo podem ser enxertadas em regiões framework que possuem a sequência idêntica à encontrada no gene de imunoglobulinas da linhagem germinativa a partir do qual a sequência framework deriva ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões framework que contenham uma ou mais mutações quando comparadas às sequências da linhagem germinativa.

[00112] Em uma modalidade específica, o derivado de anticorpo é um anticorpo quimérico que compreende uma sequência de aminoácidos de um anticorpo ilustrativo da invenção. Em um exemplo, uma ou mais CDRs de um ou mais anticorpos humanos ilustrativos são combinadas com CDRs de um anticorpo de um animal não humano, tal como de camundongo ou rato. Em outro exemplo, todas as CDRs do anticorpo quimérico são derivadas a partir de um ou mais anticorpos ilustrativos. Em algumas modalidades específicas, o anticorpo quimérico compreende uma, duas ou três CDRs da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve de um anticorpo ilustrativo. Anticorpos quiméricos podem ser gerados por meio de métodos convencionais bem conhecidos na técnica.

[00113] Outro tipo de modificação é provocar a mutação de resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da cadeia VH e/ou VL. Mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR podem ser realizadas para introduzir a(s) mutação(ões), e o efeito sobre a ligação do anticorpo ou outra propriedade funcional de interesse pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo conhecidos na técnica. Tipicamente, são introduzidas substituições conservadoras. As mutações podem ser adições e/ou deleções de aminoácidos. Além disso, tipicamente não mais de um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados. Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos nas H-CDRs e/ou nas CDRs da cadeia leve. Em outra modalidade, a substituição de aminoácidos é trocar uma ou mais cisteínas em um anticorpo por outro resíduo, tais como, entre outros, alanina ou serina. A cisteína pode ser uma cisteína canônica ou não canônica. Em uma modalidade, o derivado de anticorpo possui 1, 2, 3 ou 4 substituições conservadoras de aminoácidos nas regiões H-CDR em relação às sequências de aminoácidos de um anticorpo ilustrativo.

[00114] As modificações podem ser efetuadas também aos resíduos do framework (arcabouço) dentro das regiões VH e/ou VL. Tipicamente, tais variantes de framework têm como finalidade diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Uma abordagem de "mutação reversa" em um ou mais resíduos do framework para a sequência correspondente da linhagem germinativa. Um anticorpo que tenha sofrido uma mutação somática pode conter resíduos do framework que diferem da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências framework do anticorpo às sequências da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo é derivado. Para que as sequências da região framework retornem à sua configuração da linhagem germinativa, as mutações somáticas podem sofrer "mutação reversa" para a sequência da linhagem germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida ou por mutagênese mediada por PCR. Diversos dos anticorpos ilustrativos da presente invenção passaram por tais "mutações reversas" para certas sequências da linhagem germinativa, conforme descrito detalhadamente no Exemplo 6.

[00115] Adicionalmente, podem ser efetuadas modificações também dentro da região Fc de um anticorpo ilustrativo, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia-vida no soro, fixação do complemento, ligação de Fc ao receptor e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Em um exemplo, a região hinge (articulação) de CH1 é modificada de tal forma que o número de resíduos de cisteína seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem está descrita mais detalhadamente na Patente U.S. No 5 677 425. O número de resíduos de cisteína na região hinge de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo. Em outro caso, a região ringe de Fc de um anticorpo sofre uma mutação para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo.

[00116] Além disso, um anticorpo da invenção pode ser modificado para alterar seu sítio ou padrão potencial de glicosilação. Os anticorpos ilustrativos MOR-7480 e MOR-7483 e quaisquer variantes de suas linhagens germinativas e anticorpos que compreendem as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de MOR-7480 e MOR-7483, compreendem um sítio potencial de glicosilação N-ligada (NYS) na asparagina 59 do domínio variável da cadeia pesada. Versões de IgG destes anticorpos compreendem ainda um segundo sítio de glicosilação N-ligada no domínio Fc da cadeia pesada. Mais especificamente, para a versão de IgG2 destes anticorpos, o sítio de glicosilação N-ligada em Fc (NST) ocorre na asparagina 292 do domínio CH2 da cadeia pesada. Dessa forma, cada cadeia pesada pode compreender 0, 1 (em Fab ou Fc) ou 2 ocupações de glicano de tal forma que um anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves possam compreender qualquer combinação variando de 0 ocupação de glicano (ou seja, sem glicosilação em qualquer um dos quatro possíveis sítios de glicosilação) a 4 ocupações de glicano (ou seja, glicosilado nos sítios de Fab e de Fc em cada cadeia). Em outro aspecto, a presente invenção provê um derivado de um anticorpo contra 4-1BB da invenção que contém pelo menos uma mutação em uma região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada a qual altera o padrão de glicosilação na região variável. Tal derivado de anticorpo pode apresentar afinidade aumentada e/ou especificidade modificada pela ligação a um antígeno. As mutações podem adicionar um novo sítio de glicosilação na região V, alterar a localização de um ou mais sítios de glicosilação na região V ou remover um sítio pré-existente de glicosilação na região V. Em uma modalidade, a presente invenção provê um derivado de um anticorpo contra 4-1BB tendo um sítio potencial de glicosilação N-ligada na asparagina 59 da região variável da cadeia pesada, em que o sítio potencial de glicosilação N-ligada em uma região variável de cadeia pesada é removido. Em outra modalidade, a presente invenção provê um derivado de um anticorpo contra 4-1BB tendo um sítio potencial de glicosilação N-ligada na asparagina 59 da região variável da cadeia pesada, em que o sítio potencial de glicosilação N-ligada em ambas as regiões variáveis da cadeia pesada é removido. O método para alterar o padrão de glicosilação de um anticorpo é conhecido na técnica, tais como os descritos na Patente U.S. No 6 933 368, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência neste pedido de patente.

[00117] Em outro aspecto, a presente invenção provê um derivado de anticorpo que compreende um anticorpo contra 4-1BB ou seu fragmento de ligação a antígeno, conforme aqui descrito, ligado a uma entidade molecular adicional. Exemplos de entidades moleculares adicionais incluem agentes farmacêuticos, peptídeos ou proteínas, agente de detecção ou marcações e anticorpos.

[00118] Em algumas modalidades, o derivado de anticorpo compreende um anticorpo da invenção ligado a um agente farmacêutico. Exemplos de agentes farmacêuticos incluem agentes citotóxicos ou outros agentes terapêuticos para câncer e isótopos radioativos. Exemplos específicos de agentes citotóxicos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes. Os agentes terapêuticos podem incluir também, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoruracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a antibióticos para uso diagnóstico ou terapêutico incluem, entre outros, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. Métodos para ligar um anticorpo a um agente farmacêutico são conhecidos na técnica, tais como utilizando várias tecnologias de ligantes. Exemplos de tipos de ligante incluem hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e ligantes contendo peptídeos. Para uma discussão mais detalhada sobre ligantes e métodos para ligar agentes terapêuticos a anticorpo, ver também Saito et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215 (2003); Trail, et al., Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337 (2003); Payne, Cancer Cell 3:207212 (2003); Allen, Nat. Rev. Cancer 2:750-763 (2002); Pastan, I. e Kreitman, Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091 (2002); Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

[00119] Em uma modalidade específica, o derivado de anticorpo é um multímero de anticorpo contra 4-1BB, o qual é uma forma multimérica de um anticorpo contra 4-1BB, tais como dímeros, trímero ou múltimeros de ordens mais altas de anticorpos monoméricos. Os monômeros individuais dentro de um multímero de anticorpo podem ser idênticos ou diferentes. Adicionalmente, os anticorpos individuais dentro de um multímero podem apresentar as mesmas ou diferentes especificidades de ligação. A multimerização de anticorpos pode ser realizada através de agregação natural de anticorpos. Por exemplo, algum percentual de preparados de anticorpos purificados (por exemplo, moléculas purificadas de IgG1) forma espontaneamente agregados proteicos contendo homodímeros de anticorpos e outros multímeros de ordem mais alta de anticorpos. Alternativamente, homodímeros de anticorpos podem ser formados através de técnicas de ligação química conhecidas na área, tais como por intermédio de agentes de reticulação. Reticulantes adequados incluem os heterobifuncionais, que possuem dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriador (como éster de m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, succinimidil 4-(maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato e N-succinimidil S-acetiltio- acetato), ou os homobifuncionais (como dissuccinimidil suberato). Tais ligantes são disponibilizados comercialmente pela, por exemplo, Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Anticorpos podem também ser induzidos a se multimerizarem através de técnicas do DNA recombinante conhecidas na área.

[00120] Exemplos de outros derivados de anticorpos providos pela presente invenção incluem anticorpos de cadeia única, diabodies, anticorpos de domínios, nanobodies e unibodies. Um "anticorpo de cadeia única" (scFv) é constituído por uma única cadeia polipeptídica compreendendo um domínio VL ligado a um domínio VH, em que o domínio VL e o domínio VH estão pareados e formam uma molécula monovalente. O anticorpo de cadeia única pode ser preparado de acordo com um método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Um "diabody" é constituído por duas cadeias, cada cadeia compreendendo uma região variável de cadeia pesada conectada a uma região variável de cadeia leve na mesma cadeia polipeptídica conectada por um peptídeo ligante curto, em que as duas regiões na mesma cadeia não pareiam entre si, mas com domínios complementares na outra cadeia e formam uma molécula biespecífica. Métodos para preparar diabodies são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Holliger P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 e Poljak R. J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Anticorpos de domínio (dAbs) são pequenas unidades funcionais de ligação de anticorpos, correspondentes às regiões variáveis das cadeias pesadas ou das leves de anticorpos. Anticorpos de domínios são bem expressos em sistemas de células bacterianas, de levedura e de mamíferos. Detalhes adicionais sobre anticorpos de domínios e métodos para sua produção são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6 291 158; 6 582 915; 6 593 081; 6 172 197; 6 696 245; as Patentes Europeias 0368684 e 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 e WO03/002609). Nanobodies são derivados a partir das cadeias pesadas de um anticorpo. Um nanobody compreende tipicamente um único domínio variável e dois domínios constantes (CH2 e CH3) e retém a capacidade de ligação a antígeno do anticorpo original. Os nanobodies podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 6 765 087, a Patente U.S. No 6 838 254, WO 06/079372). Unibodies consistem em uma cadeia leve e uma cadeia pesada de um anticorpo IgG4. Unibodies podem ser produzidos pela retirada da região hinge de anticorpos IgG4. Detalhes adicionais sobre unibodies e métodos para seu preparo podem ser encontrados em WO2007/059782.

C. Ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e métodos recombinantes para produzir anticorpos contra 4-1BB

[00121] Outro aspecto da invenção provê uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma sequência de aminoácidos de uma molécula de ligação provida pela presente invenção. A sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos pode ser qualquer parte de um anticorpo, como uma CDR, uma sequência compreendendo um, duas ou três CDRs, uma região variável de uma cadeia pesada, uma região variável de uma cadeia leve ou ode ser uma cadeia pesada completa ou uma cadeia leve completa. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode conter ou não sequências intrônicas. Tipicamente, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

[00122] Em algumas modalidades, a invenção provê uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos codificadora de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído por: (1) sequência de aminoácidos de H-CDR3 ou L-CRD3 de um anticorpo ilustrativo; (2) região variável de uma cadeia pesada ou região variável de uma cadeia leve de um anticorpo ilustrativo; ou (3) cadeia pesada completa ou cadeia leve completa de um anticorpo ilustrativo.

[00123] Em outras modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs:1 - 10, 15- 24, 29 - 38, 43, 44, 45, 46, 51,52, 5557, 60, 61, 64 e 65.

[00124] Em ainda outras modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende ou consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 11-14, 2528, 39-42, 47-50, 53, 54, 58, 59, 62, 63, 66 e 67.

[00125] Ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos por meio de qualquer técnica adequada de biologia molecular. Para anticorpos expressos por hibridomas, cDNAs codificadores das cadeias leve e pesada do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos por técnicas de amplificação por PCR ou de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulinas (por exemplo, utilizando técnicas de apresentação em fagos), o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser recuperado a partir da biblioteca.

[00126] O DNA isolado codificador da região VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada completa, ligando operativamente o DNA codificador da VH a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes de regiões constantes de cadeias pesadas humanas são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Departamento de Saúde e de Serviços Humanos dos Estados Unidos, Publicação NIH No 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação padrão por PCR. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, porém, o mais preferível é uma região constante de IgG1 ou IgG4. A sequência da região constante de IgG1 pode ser qualquer um dos vários alelos ou alotipos conhecidos por ocorrerem entre diferentes indivíduos, tais como Gm(1), Gm(2), Gm(3) e Gm(17). Estes alotipos representam uma substituição de aminoácidos naturais nas regiões constantes de IgG1. Para um gene de cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA codificador de VH pode ser ligado operativamente à outra molécula de DNA que codifica somente a região constante CH1 da cadeia pesada.

[00127] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve completa (bem como um gene de cadeia leve de Fab), ligando operativamente o DNA codificador da VL a outra molécula de DNA que codifica a região constante da cadeia leve, CL. As sequências de genes de regiões constantes de cadeias leves humanas são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Departamento de Saúde e de Serviços Humanos dos Estados Unidos, Publicação NIH No 91-3242) e fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos por amplificação padrão por PCR. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kappa ou lambda.

[00128] Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA codificadores de VH e VL são ligados operativamente a outro fragmento que codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal forma que as sequências de VH e VL possam ser expressas em uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexível (ver, por exemplo, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); e McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).

[00129] A presente invenção provê ainda um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico provida pela presente invenção. A molécula de ácido nucleico pode codificar uma parte de cadeia leve ou cadeia pesada (como uma CDR ou uma região variável), uma cadeia leve ou pesada completa, um polipeptídeo que compreenda parte ou a cadeia pesada ou leve ou uma sequência de aminoácidos de derivado de anticorpo ou de fragmento de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão útil para a expressão de uma molécula de ligação, como um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno.

[00130] A fim de expressar uma molécula de ligação da invenção, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou completas são inseridos em vetores de expressão de tal forma que as moléculas de DNA sejam ligadas operativamente a sequências de controle transcricional e traducional. Nesse contexto, o termo "ligado operativamente" significa que o gene de um anticorpo é ligado a um vetor de tal forma que sequências de controle transcricional e traducional dentro do vetor atuam em sua função pretendida de regular a transcrição e a tradução da molécula de DNA. O vetor de expressão e as sequências de controle da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira utilizada para a expressão. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vetor de expressão por quaisquer métodos adequados (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento gênico do anticorpo e no vetor ou ligação em extremidades cegas se não houver presentes sítios de restrição). As regiões variáveis da cadeia leve e da pesada dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes completos de anticorpos de qualquer isotipo e subclasse de anticorpos, inserindo-as em vetores de expressão que já codificam regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve do isotipo e subclasse desejada, de tal forma que o segmento VH seja ligado operativamente ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento VK seja ligado operativamente ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo de sinalização que facilita a secreção da cadeia do anticorpo a partir uma célula hospedeira. O gene das cadeias do anticorpo pode ser clonado no vetor de tal forma que o peptídeo de sinalização seja ligado in frame (no quadro de leitura) à terminação amino do gene das cadeias do anticorpo. O peptídeo de sinalização pode ser um peptídeo de sinalização de imunoglobulinas ou um peptídeo de sinalização heterólogo (ou seja, um peptídeo de sinalização de uma proteína diferente de imunoglobulina).

[00131] Além dos genes de cadeias do anticorpo, os vetores de expressão da invenção carregam tipicamente sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeias do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou a tradução dos genes de cadeias do anticorpo. Estas sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será reconhecido pelos técnicos no assunto que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a se transformar, o nível desejado de expressão da proteína, etc. Exemplos de sequências reguladoras para expressão em célula hospedeira mamífera incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína, tais como promotores e/ou intensificadores derivados a partir do citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio maior do adenovírus (AdMLP)) e de polioma. Alternativamente, sequências reguladoras não virais podem ser utilizadas, tais como o promotor de ubiquitina ou o promotor de β-globina. Além disso, elementos reguladores compostos por sequências de diferentes fontes, tais como o sistema promotor SR, que contém sequências do promotor inicial do SV40 e o terminal de longa repetição do vírus da leucemia humana de células T tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

[00132] Além dos genes de cadeias do anticorpo e de sequências reguladoras, os vetores de expressão podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes de marcadores selecionáveis. O gene de marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4 399 216, 4 634 665 e 5 179 017, todas concedidas a Axel et al.). Por exemplo, tipicamente, o gene do marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, a uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Genes de marcadores selecionáveis incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr- com seleção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para seleção com G418).

[00133] Para a expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesada e leve é(são) transfectado(s) em uma célula hospedeira por quaisquer técnicas adequadas. As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e as semelhantes. Embora seja possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas e tipicamente células hospedeiras mamíferas é mais típica.

[00134] A presente invenção provê ainda uma célula hospedeira contendo uma molécula de ligação provida pela presente invenção. A célula hospedeira pode ser virtualmente qualquer célula para as quais existam disponíveis vetores de expressão. Pode ser, por exemplo, célula hospedeira eucariótica de classe superior, tal como célula de mamífero, célula hospedeira eucariótica de classe inferior, tal como célula de levedura, e pode ser célula procariótica, tal como célula bacteriana. A introdução do ácido nucleico recombinante construído na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE, dextrano, eletroporação ou infecção por fago.

[00135] Hospedeiros procarióticos adequados para transformação incluem E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus.

[00136] Células hospedeiras mamíferas para a expressão de uma molécula de ligação da invenção incluem, por exemplo, células do Ovário do Hamster Chinês (CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)), utilizadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159:601621 (1982), células NS0 de mieloma, células COS e células Sp2. Em particular, para uso com células NS0 de mieloma ou CHO, outro sistema de expressão é o sistema de expressão do gene GS (glutamina sintetase) revelado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338,841. Quando vetores de expressão codificadores de genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras mamíferas, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura utilizando quaisquer métodos adequados de purificação de proteínas.

D. Composições

[00137] Em outros aspectos, a presente invenção provê uma composição contendo uma molécula de ligação provida pela invenção. Em um aspecto, a composição é uma composição farmacêutica incluindo uma molécula de ligação e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições podem ser preparadas por métodos convencionais conhecidos na técnica.

[00138] Os termos "composição farmacêutica" e "formulação farmacêutica" referem-se a composições incluindo qualquer uma das moléculas de ligação, qualquer um dos anticorpos, qualquer uma de suas partes de ligação a antígeno, conforme aqui descritos, juntamente com um ou mais excipientes, diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis, conforme necessários para preparar as formas farmacêuticas para a liberação eficaz da molécula de ligação.

[00139] Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma composição incluindo um anticorpo ou sua parte de ligação a antígeno, provido pela presente invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o referido anticorpo ou parte de ligação a antígeno compreende um domínio variável contendo a sequência de aminoácidos de CDR apresentada na SEQ ID NO: 30 e em que a referida composição não inclui mais de aproximadamente 11%, 10%, 8%, 5%, 3% ou 2% do referido anticorpo ou da parte de ligação a antígeno que esteja glicosilado na asparagina da referida sequência de aminoácidos, quando comparado à quantidade total de anticorpo ou de sua parte de ligação a antígeno, presente na referida composição. Em outra modalidade, a composição inclui pelo menos aproximadamente 2% do referido anticorpo ou da parte de ligação a antígeno, que esteja glicosado na asparagina da referida sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30, quando comparado à quantidade total de anticorpo ou de sua parte de ligação a antígeno, presente na referida composição.

[00140] Neste relatório descritivo, o termo "excipiente" significa as substâncias utilizadas para formular os ingredientes farmacêuticos ativos em formulações farmacêuticas; em uma modalidade preferida, um excipiente não reduz ou interfere com o efeito terapêutico primário dos ingredientes farmacêuticos ativos. De preferência, um excipiente é terapeuticamente inerte. O termo "excipiente" abrange carreadores, diluentes, veículos, solubilizantes, estabilizantes, agentes de volume, agentes para ajuste de pH ácido ou básico e aglutinantes. Os excipientes podem ser também aquelas substâncias presentes em uma formulação farmacêutica como resultado indireto ou não pretendido do processo de manufatura. De preferência, os excipientes são aprovados ou considerados serem seguros para administração humana e animal, ou seja, substâncias GRAS (geralmente consideradas como seguras). As substâncias GRAS são listadas pela Food and Drug administration no Código de Normas Federais (CFR) em 21 CFR 182 e 21 CFR 184, aqui incorporado por referência neste pedido de patente.

[00141] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer substância inativa que é adequada para uso em uma formulação para a liberação de uma molécula de ligação. Um veículo pode ser um antiaderente, aglutinante, revestimento, material de preenchimento ou diluente, conservante (como agente antioxidante, antibacteriano ou antifúngico), adoçante, agente retardador de absorção, agente umectante, agente emulsionante, tampão e os semelhantes. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem água, etanol, polióis (como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e os semelhantes) dextrose, óleos vegetais (como óleo de oliva), solução salina, tampão, solução salina com tampão e agentes isotônicos com açúcares, poliálcoois, sorbitol e cloreto de sódio.

[00142] O termo "agente de tamponamento" refere-se a um excipiente farmaceuticamente aceitável que estabiliza o pH de um preparado farmacêutico. Tampões adequados são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados na literatura. Por exemplo, tampões de histidina, tampões de glicina, tampões tris ou de acetato e/ou os seus respectivos ácidos ou bases livres, bem como misturas dos vários sais e/ou ácidos e bases destes podem ser empregados. Em uma modalidade específica, os tampões são tampões de histidina, ou seja, tampões tendo a histidina, em geral L-histidina, como agente de tamponamento. Um tampão em particular é o tampão L-histidina/HCl, compreendendo L-histidina, monocloridrato de L-histidina ou misturas de L-histidina e monocloridrato de L-histidina. Os tampões de L-histidina são geralmente utilizados a uma concentração de aproximadamente 0,05 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL ou de aproximadamente 0,5 mg/mL a aproximadamente 1 mg/mL. Os tampões de monocloridrato de L-histidina são geralmente utilizados a uma concentração de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 5 mg/mL ou de aproximadamente 2 mg/mL a aproximadamente 4 mg/mL.

[00143] Independentemente do tampão utilizado, o pH pode ser ajustado para um valor no intervalo de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0 ou de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 com um ácido ou uma base conhecido na técnica, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido cítrico, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio.

[00144] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica compreendendo: 0,1 a 1 mg/mL de L- Histidina; 1 a 5 mg/mL de monocloridrato de L-Histidina; 50 a 100 mg/mL de Trealose desidratada; 0,01 a 0,1 mg/mL de EDTA Dissódico dihidratado; e 0,05 a 1 mg/mL de polissorbato 80; em pH no intervalo de 4,0 a 7,0.

[00145] Em uma modalidade específica, a concentração da molécula de ligação incluída na composição de acordo com a invenção está no intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 22 mg/mL.

[00146] Em outra modalidade específica, o agente de tamponamento incluído na composição de acordo com a invenção é um tampão de histidina, por exemplo, tampão L-histidina/HCl ou tampão acetato ou tampão de acetato de sódio. Em uma modalidade específica, o agente de tamponamento é L-histidina/HCl.

[00147] Em uma modalidade específica, o tampão está a uma concentração de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 50 mM ou de aproximadamente 1mM a aproximadamente 25 mM.

[00148] O pH de uma composição da invenção pode ser escolhido a partir dos seguintes intervalos: de 3 a 10 ou de 4 a 9. Em uma modalidade específica, o agente de tamponamento fornece pH de 5,0 a 6,0 ou 5,5 ± 0,3. Ajustes de rotina do pH dentro e fora destes intervalos podem ser necessários para melhorar a solubilidade ou a estabilidade do polipeptídeo ou de outros componentes da composição.

[00149] Em uma modalidade, a composição inclui um polissorbato, por exemplo, polissorbato 20 ou polissorbato 80. Em uma modalidade específica, o polissorbato 80 está a uma concentração de 0,01 a 10 mg/mL, de 0,5 a 5 mg/mL ou de 0,1 a 0,5 mg/mL.

[00150] Em uma modalidade, pelo menos um estabilizante incluído na composição de acordo com a invenção é selecionado a partir do grupo de sais, por exemplo, cloreto de sódio, sacarídeos, trealose dihidratada ou sacarose e aminoácidos, como cloridrato de arginina. Em uma modalidade específica, menos um estabilizante está a uma concentração de 10 a 200 mg/mL, de 20 a 150 mg/mL ou de 50 a 100 mg/mL.

[00151] Neste relatório descritivo, o termo "agente quelante" refere- se geralmente a um excipiente que é capaz de formar pelo menos uma ligação (por exemplo, covalente, iônica ou outra qualquer) com um íon de metal. Um agente quelante é tipicamente um ligante multidentado que pode ser utilizado em composições líquidas selecionadas como estabilizante para formar complexos com espécies que poderiam promover a instabilidade. Frequentemente, compostos que podem atuar como agente quelante terão grupos funcionais ricos em elétrons. Grupos funcionais adequados ricos em elétrons incluem grupos de ácido carboxílico, grupos hidróxi e grupos amino. O arranjo destes grupos em ácidos aminopolicarboxílicos, ácidos hidroxipolicarboxílicos, ácidos hidroxiaminocarboxílicos e nos semelhantes resulta em grupamentos que possuem a capacidade para ligar metal.

[00152] Entretanto, a presente invenção não se destina a ser limitada a agentes quelantes que aumentam a estabilidade do anticorpo primariamente pela capacidade do agente quelante de formar ligações com um íon de metal. Por conseguinte, a presente invenção não se destina a ser limitada pelo mecanismo específico pelo qual o agente quelante estabiliza as composições da presente invenção, e os excipientes denominados agentes quelantes neste relatório descritivo podem alcançar suas propriedades de reforço da estabilidade do anticorpo primariamente através de mecanismos que não estão absolutamente relacionados à capacidade do agente quelante de formar ligações com um íon de metal.

[00153] Agentes quelantes que são adequados para uso na presente invenção incluem, entre outros, ácidos aminopolicarboxílicos, ácido hidroxiaminocarboxílicos, glicinas N-substituídas, ácido 2-(2-amino-2- oxoetil) aminoetano sulfônico (BES), deferoxamina (DEF), ácido cítrico, niacinamida e desoxicolatos. Exemplos de ácidos aminopolicarboxílicos adequados incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriamianopentacético 5 (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), bis(aminoetil)glicoléter, ácido N,N,N‘,N‘-tetracético-(EGTA), ácido trans-diaminociclohexano tetracético (DCTA), ácido glutâmico e ácido aspártico. Exemplos de ácidos hidroxiaminocarboxílicos adequados incluem ácido N- hidroxietiliminodiacético (HIMDA), N,N-bis-hidroxietilglicina (bicina) e N- (tris-hidroximetilmetil) 10 glicina (tricina). Um exemplo de glicina N- substituída adequada é glicilglicina. Um exemplo de desoxicolato adequado é desoxicolato de sódio.

[00154] Agentes quelantes utilizados na invenção podem estar presentes, quando possível, na forma de ácido livre ou de base livre do composto (por exemplo, aqui designados alternadamente como "EDTA" ou "edetato") ou em forma de um sal correspondente (por exemplo, o sal correspondente de adição ácida ou de adição de básica, como edetato dissódico). Sais adequados de adição ácida incluem, por exemplo, sais de metais alcalinos (por exemplo, sais de sódio ou de potássio), sais de metais alcalinos terrosos (por exemplo, de cálcio) e sais podem ser preparados utilizando outros íons de metal fracamente ligados. Conforme conhecido na técnica, a natureza do sal e o número de cargas a serem neutralizadas dependerá do número de grupos carboxila presentes e do pH no qual o agente quelante estabilizante é suprido. Tal como é também conhecido na técnica, agentes quelantes possuem forças variadas com as quais íons alvos em particular são ligados. A título de ilustração adicional, sais adequados de EDTA incluem edetato dipotássico, edetato de cálcio dissódico, edetato sódico, edetato trissódico e edetato potássico; e um sal adequado de deferoxamina (DEF) é mesilato de deferoxamina (DFM).

[00155] Agentes quelantes utilizados na invenção podem estar presentes em forma anidra, solvatada ou hidratada do composto ou do sal correspondente. Quando está em forma solvatada ou hidratada, o agente quelante pode estar presente em estados variados de solvatação ou hidratação (incluindo, por exemplo, formas anidras, hidratadas, dihidratadas e trihidratadas). A título de ilustração adicional, um hidrato adequado de EDTA é EDTA dissódico dihidratado. Em uma modalidade, o EDTA dissódico dihidratado está a uma concentração de 0,001 a 5 mg/mL, de 0,01 a 2 mg/mL e de 0,02 a 0,5 mg/mL. Em outra modalidade, o agente quelante pode reduzir ou prevenir a agregação dos anticorpos nas composições aqui descritas. Estes agentes quelantes podem reduzir ou prevenir a degradação de um anticorpo que é formulado sem a proteção de um agente quelante.

[00156] As composições farmacêuticas podem em geral ser adaptadas para a via de administração específica pretendida. Existem múltiplas técnicas para administrar um composto na técnica, incluindo, entre outras, administração oral, em aerossol, parenteral e tópica. As composições podem estar em quaisquer formas adequadas, tais como formas farmacêuticas líquidas, semissólidas e sólidas. Exemplos de formas farmacêuticas líquidas incluem solução (por exemplo, soluções injetáveis e para infusão), microemulsão, lipossomo, dispersão ou suspensão. Exemplos formas farmacêuticas sólidas incluem comprimido, pílula, cápsula, microcápsula e pó. Uma forma em particular da composição adequada para liberar uma molécula de ligação é líquida estéril, em solução, suspensão ou dispersão, para injeção ou infusão. Soluções estéreis podem ser preparadas incorporando o anticorpo na quantidade desejada em um veículo apropriado, seguido por microfiltração e esterilização. Em geral, dispersões são preparadas incorporando o anticorpo em um veículo estéril que contenha um meio básico de dispersão e outros carreadores. No caso de pó estéril para o preparo de líquido estéril, os métodos de preparo incluem secagem a vácuo e congelamento-secagem (liofilização) para produzir um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril deste. As várias formas farmacêuticas das composições podem ser preparadas por técnicas convencionais conhecidas na área.

[00157] A quantidade relativa de uma molécula de ligação incluída na composição variará dependendo de alguns fatores, tais como a molécula de ligação e os veículos especificamente utilizados, a forma farmacêutica e as características desejadas de liberação e farmacodinâmicas. Em uma modalidade, a composição compreende uma molécula de ligação, em que a concentração da referida molécula de ligação é entre 1 e 100 mg/mL, entre 5 e 50 mg/mL ou entre 10 e 22 mg/mL. A quantidade de uma molécula de ligação em uma forma farmacêutica única será geralmente aquela quantidade que produz um efeito terapêutico, mas pode ser também uma quantidade menor. Em geral, esta quantidade variará de aproximadamente 0,1 por cento a aproximadamente 70 por cento ou de aproximadamente 1 por cento a aproximadamente 30 por cento em relação ao peso total da forma farmacêutica.

[00158] Além da molécula de ligação, um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser incluídos na composição. Exemplos de agentes terapêuticos adicionais estão descritos abaixo. A quantidade adequada do agente terapêutico adicional a ser incluído na composição pode ser rapidamente selecionada por um técnico no assunto e variará dependendo de alguns fatores, tais como o agente e os veículos em particular utilizados, a forma farmacêutica e as características desejadas de liberação e farmacodinâmicas. A quantidade do agente terapêutico adicional incluído em uma forma farmacêutica isolada será geralmente aquela quantidade que produz um efeito terapêutico, mas pode ser também uma quantidade menor.

E. Uso das moléculas de ligação e das composições farmacêuticas

[00159] As moléculas de ligação e as composições farmacêuticas providas pela presente invenção são úteis para fins terapêuticos, diagnósticos ou outros, tais como intensificar uma resposta imune, tratar câncer, intensificar a eficácia de outra terapia contra câncer, intensificar a eficácia de vacinas ou tratar doenças autoimunes. Por conseguinte, em outros aspectos, a presente invenção provê métodos para usar as moléculas de ligação ou as composições farmacêuticas. Em um aspecto, a presente invenção provê um método para tratar um transtorno em um mamífero, o qual compreende administrar ao mamífero que necessita de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação provida pela invenção. A molécula de ligação um agonista ou antagonista de 4-1BB. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um agonista de 4- 1BB. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.

[00160] Em algumas modalidades, o transtorno é um câncer. Uma variedade de cânceres nos quais há o envolvimento de 4-1BB, sejam malignos ou benignos e sejam primários ou secundários, pode ser tratada ou prevenida com um método provido pela invenção. Exemplos de tais cânceres incluem cânceres pulmonares como carcinoma broncogênico (por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de pequenas células, carcinoma de grandes células e adenocarcinoma), carcinoma de células alveolares, adenoma brônquico, hamartoma condromatoso (não cancerosos) e sarcoma (canceroso); câncer cardíaco como mixoma, fibromas e rabdomiomas; cânceres ósseos como osteocondromas, condromas, condroblastomas, fibromas condromixoides, osteomas osteoides, tumores de células gigantes, condrossarcoma, mieloma múltiplo, osteossarcoma, fibrossarcomas, histiocitomas fibrosos malignos, tumor de Ewing (sarcoma de Ewing) e sarcoma de células reticulares; câncer cerebral como gliomas (por exemplo, glioblastoma multiforme), astrocitomas anaplásicos, astrocitomas, oligodendrogliomas, meduloblastomas, cordoma, Schwannomas, ependimomas, meningiomas, adenoma hipofisário, pinealoma, osteomas, hemangioblastomas, craniopfaringiomas, cordomas, germinomas, teratomas, cistos dermoides e angiomas; cânceres no sistema digestivo como leiomiomaepidermoid carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, adenocarcinoma do estômago, lipomas intestinais, neurofibromas intestinais, fibromas intestinais, pólipos no intestino grosso e cânceres colorretais; cânceres hepáticos como adenomas hepatocelulares, hemangioma, carcinoma hepatocelular, carcinoma fibrolamelar, colangiocarcinoma, hepatoblastoma e angiossarcoma; cânceres renais como adenocarcinoma renal, carcinoma de células renais, hipernefroma e transitional cell carcinoma de células transicionais da pelve renal; cânceres da bexiga; cânceres hematológicos como leucemia linfocítica aguda (linfoblástica), leucemia mieloide aguda (mielocítica, mielogênica, mieloblástica, mielomonocítica), leucemia linfocítica crônica (por exemplo, Síndrome de Sezary e leucemia das células cabeludas), leucemia mielocítica crônica (mieloide, mielogênica, granulocítica), linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, linfoma de células B, micose fungoide e transtornos mieloproliferativos (incluindo transtornos mieloproliferativos como policitemia vera, mielofibrose, trombocitemia e leucemia mielocítica crônica); cânceres da pele como carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, melanoma, sarcoma de Kaposi e doença de Paget; cânceres da cabeça e pescoço; cânceres relacionados ao olho como retinoblastoma e melanocarcinoma intraocular; cânceres do sistema reprodutor masculino como hiperplasia benigna da próstata, câncer de próstata e cânceres testiculares (por exemplo, seminoma, teratoma, carcinoma embrionário e coriocarcinoma); câncer de mama; cânceres do sistema reprodutor feminino como câncer de útero (carcinoma endometrial), câncer cervical (carcinoma cervical), câncer dos ovários (carcinoma ovariano), carcinoma vulvar, carcinoma vaginal, câncer da trompa de Falópio e mola hidatidiforme; câncer da tireoide (incluindo câncer papilar, folicular, anaplásico ou medular); feocromocitomas (glândula adrenal); crescimentos não cancerosos das glândulas paratireoides; cânceres pancreáticos; e cânceres hematológicos como leucemias, mieloma, linfomas não Hodgkin e linfomas de Hodgkin.

[00161] Em algumas outras modalidades, o transtorno é uma doença autoimune. Exemplos de doenças autoimunes que podem ser tratadas com as moléculas de ligação incluem encefalomielite autoimune, lúpus eritematoso e artrite reumatoide. A molécula de ligação pode ser utilizada também para tratar inflamação (tal como asma alérgica) e doença do enxerto contra hospedeiro.

[00162] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para intensificar uma resposta imune em um mamífero, o qual compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação provida pela invenção. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é um anticorpo contra 4-1BB, ou seu fragmento de ligação a antígeno, e o mamífero é um ser humano. Em ainda outra modalidade, a molécula de ligação é um anticorpo agonista contra 4-1BB ou seu fragmento de ligação a antígeno. A expressão "intensificar a resposta imune" ou suas variações gramaticais, significa estimular, suscitar, elevar, melhorar ou aumentar qualquer resposta do sistema imune de um mamífero. A resposta imune pode ser resposta celular (ou seja, mediada por células, como mediada por linfócitos T citotóxicos) ou resposta humoral (ou seja, resposta mediada por anticorpo) e pode ser resposta imune primária ou secundária. Exemplos de resposta imune intensificada incluem atividade aumentada de células T helper CD4+ e geração de células T citolíticas. A intensificação da resposta imune pode ser avaliada utilizando uma série de mensurações in vitro ou in vivo conhecidas pelos técnicos no assunto, incluindo, entre outras, ensaios de linfócitos T citotóxicos, liberação de citocinas (por exemplo, produção de IL-2), regressão de tumores, sobrevida de animais portadores de tumores, produção de anticorpos, proliferação de células imunes, expressão de marcadores de superfície celular e citotoxicidade. Tipicamente, os métodos da invenção intensificam a resposta imune por um mamífero quando comprada à resposta imune por um mamífero não tratado ou um mamífero não tratado utilizando os métodos reivindicados. Em uma modalidade, a molécula de ligação é utilizada para intensificar a resposta imune de um ser humano a um patógeno microbiano (como um vírus). Em outra modalidade, a molécula de ligação é utilizada para intensificar a resposta imune de um ser humano a uma vacina. A molécula de ligação pode ser agonista ou antagonista de 4-1BB. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é agonista de 4-1BB. Em uma modalidade, o método intensifica uma resposta imune celular, especialmente resposta de células T citotóxicas. Em outra modalidade, a resposta imune celular é resposta de células T helper. Em ainda outra modalidade, a resposta imune é produção de citocinas, especialmente produção de IL-2. A molécula de ligação pode ser utilizada para intensificar a resposta imune de um ser humano a um patógeno microbiano (como um vírus) ou a uma vacina. A molécula de ligação pode ser agonista ou antagonista de 4-1BB. Em algumas modalidades, a molécula de ligação é agonista de 4-1BB.

[00163] Na prática dos métodos terapêuticos, as moléculas de ligação podem ser administradas isoladamente em monoterapia ou administrada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos ou terapias adicionais. Por conseguinte, em outro aspecto, a presente invenção provê uma terapia combinada, a qual compreende uma molécula de ligação combinada com uma ou mais terapias ou agentes terapêuticos adicionais para administração separada, em sequência ou simultânea. O termo "terapia adicional" refere-se a uma terapia que não emprega uma molécula de ligação provida pela invenção como agente terapêutico. O termo "agente terapêutico adicional" refere-se a qualquer agente terapêutico diferente de uma molécula de ligação provida pela invenção. Em um aspecto específico, a presente invenção provê uma terapia combinada para o tratamento de câncer em um mamífero, a qual compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de ligação provida pela invenção em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em outra modalidade, o mamífero é um ser humano.

[00164] Uma grande variedade de agentes terapêuticos contra câncer pode ser utilizada em combinação com uma molécula de ligação provida pela presente invenção. Qualquer técnico no assunto reconhecerá a presença e o desenvolvimento de outras terapias contra câncer que podem ser utilizadas em combinação com métodos e as moléculas de ligação da presente invenção e não se restringirá às formas de terapia apresentadas neste relatório descritivo. Exemplos de categorias de agentes terapêuticos adicionais que podem ser utilizados na terapia combinada para tratar câncer incluem (1) agentes quimioterápicos, (2) agente imunoterápicos e (3) agentes terapêuticos hormonais.

[00165] O termo "agente quimioterápico" refere-se a uma substância química ou biológica que pode ser utilizada para causar a morte de células cancerosas ou para interferir com o crescimento, a divisão, o reparo e/ou a função de células cancerosas. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem aqueles descritos em WO 2006/088639, WO 2006/129163 e US 20060153808, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Exemplos de agentes quimioterápicos específicos incluem: (1) agentes alquilantes, como clorambucil (LEUKERAN), mciclofosfamida (CYTOXAN), ifosfamida (IFEX), cloridrato de mecloretamina (MUSTARGEN), tiotepa (THIOPLEX), estreptozotocina (ZANOSAR), carmustina (BICNU, GLIADEL WAFER), lomustina (CEENU) e dacarbazina (DTIC-DOME); (2) alcaloides ou alcaloides da planta vinca, incluindo antibióticos citotóxicos, como doxorrubicina (ADRIAMYCIN), epirrubicina (ELLENCE, PHARMORUBICIN), daunorrubicina (CERUBIDINE, DAUNOXOME), nemorrubicina, idarrubicina (IDAMYCIN PFS, ZAVEDOS), mitoxantrona (DHAD, NOVANTRONE). dactinomicina (actinomicina D, COSMEGEN), plicamicina (MITHRACIN), mitomicina (MUTAMYCIN) e bleomicina (BLENOXANE), tartarato de vinorelbina (NAVELBINE), vinblastina (VELBAN), vincristina (ONCOVIN) e vindesina (ELDISINE); (3) antimetabólito, como capecitabina (XELODA), citarabina (CYTOSAR-U), fludarabina (FLUDARA), gencitabina (GEMZAR), hidroxiureia (HYDRA), metotrexato (FOLEX, MEXATE, TREXALL), nelarabina (ARRANON), trimetrexato (NEUTREXIN) e pemetrexede (ALIMTA); (4) antagonistas de pirimidina, como 5-fluoruracil (5-FU); capecitabina (XELODA), raltitrexede (TOMUDEX), tegafur-uracil (UFTORAL) e gencitabina (GEMZAR); (5) taxanos, como docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel (TAXOL); (6) fármacos com platina, como cisplatina (PLATINOL), carboplatina (PARAPLATIN) e oxaliplatina (ELOXATIN); (7) inibidores da topoisomerase, como irinotecano (CAMPTOSAR), topotecano (HYCAMTIN), etoposídeo (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR) e teniposídeo (VUMON); (8) epipodofilotoxinas (derivados de podofilotoxina), como etoposídeo (ETOPOPHOS, VEPESSID, TOPOSAR); (9) derivados de ácido fólico, como leucovorina (WELLCOVORIN); (10) nitrosoureias, como carmustina (BiCNU), lomustina (CeeNU); (11) inibidores do receptor tirosina quinase, incluindo receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGFR), receptor do fator de crescimento de hepatócitos (HGFR) e receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), como gefitinibe (IRESSA), erlotinibe (TARCEVA), bortezomibe (VELCADE), mesilato de imatinibe (GLEEVEC), genefitinibe, lapatinibe, sorafenibe, talidomida, sunitinibe (SUTENT), axitinibe, rituximabe (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumabe (HERCEPTIN), cetuximabe (ERBITUX), bevacizumabe (AVASTIN) e ranibizumabe (LUCENTIS), lym-1 (ONCOLYM), anticorpos contra o receptor do fator 1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1R) que são descritos em WO2002/053596); (12) inibidores da angiogênese, como bevacizumabe (AVASTIN), suramin (GERMANIN), angiostatina, SU5416, talidomida e inibidores de metaloproteinases da matriz (como batimastat e marimastat) e aqueles que são descritos em WO2002055106; e (13) inibidores do proteassoma, como bortezomibe (VELCADE).

[00166] O termo "agente imunoterápico" refere-se a uma substância química ou biológica capaz de intensificar uma resposta imune de um mamífero. Exemplos de agentes imunoterápicos incluem: bacilo Calmette-Guerin (BCG); citocinas como interferons; vacinas como imunoterapia personalizada MyVax, Onyvax-P, Oncophage, GRNVAC1, FavId, Provenge, GVAX, Lovaxina C, BiovaxID, GMXX e NeuVax; e anticorpos como alentuzumabe (CAMPATH), bevacizumabe (AVASTIN), cetuximabe (ERBITUX), gentuzunabe ozogamicina (MYLOTARG), ibritumomabe tiuxetano (ZEVALIN), panitumumabe (VECTIBIX), rituximabe (RITUXAN, MABTHERA), trastuzumabe (HERCEPTIN), tositumomabe (BEXXAR), ipilimumabe (YERVOY) tremelimumabe, CAT-3888, anticorpos agonistas contra o receptor OX40 (como os descritos em WO2009/079335), anticorpos agonistas contra o receptor CD40 (como os descritos em WO2003/040170 e agonistas de TLR-9 (como os descritos em WO2003/015711, WO2004/016805 e WO2009/022215).

[00167] O termo "agente terapêutico hormonal" refere-se a uma substância química ou biológica que inibe ou elimina a produção de um hormônio ou que inibe ou neutraliza o efeito de um hormônio sobre o crescimento e/ou a sobrevida de células cancerosas. Exemplos de tais agentes adequados para os métodos desta invenção incluem os que estão descritos em US20070117809. Exemplos de agentes terapêuticos hormonais específicos incluem tamoxifeno (NOLVADEX), toremifeno (Fareston), fulvestrant (FASLODEX), anastrozol (ARIMIDEX), exemestano (AROMASIN), letrozol (FEMARA), acetato de megestrol (MEGACE), goserelina (ZOLADEX) e leuprolida (LUPRON). As moléculas de ligação desta invenção podem ser utilizadas também em combinação com terapias hormonais não medicamentosas tais como (1) métodos cirúrgicos que removem todo ou parte dos órgãos ou das glândulas que participam na produção do hormônio, tais como os ovários, os testículos, a glândula adrenal e a glândula hipófise (2) tratamento com radiação, no qual os órgãos ou as glândulas do paciente são submetidos à radiação em quantidade suficiente para inibir ou eliminar a produção do hormônio direcionado.

[00168] A terapia combinada para tratar câncer abrange também uma molécula de ligação combinada com cirurgia para remover um tumor. A molécula de ligação pode ser administrada ao mamífero, antes, durante ou depois da cirurgia.

[00169] A terapia combinada para tratar câncer abrange também uma molécula de ligação combinada com radioterapia, tal como terapia com radiação ionizante (eletromagnética) (por exemplo, raios-X ou raios gama) e terapia com radiação por feixe de partículas (por exemplo, radiação de alta energia linear). A fonte de radiação pode ser interna ou externa ao mamífero. A molécula de ligação pode ser administrada antes, durante ou depois da radioterapia.

[00170] As moléculas de ligação e as composições providas pela presente invenção podem ser administradas por qualquer via enteral ou parenteral adequada de administração. O termo "via enteral" de administração refere-se à administração através de qualquer parte do trato gastrointestinal. Exemplos de vias enterais incluem via oral, mucosa, bucal e retal ou via intragástrica. "Via parenteral" de administração refere-se a uma via de administração diferente da via enteral. Exemplos de vias parenterais de administração incluem administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral, intravesical, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, transtraqueal, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal, subcutânea, ou administração tópica. Os anticorpos e as composições da invenção podem ser administrados utilizando qualquer método adequado, como por ingestão oral, tubo nasogástrico, tubo de gastrostomia, injeção, infusão, bomba implantável de infusão e bomba osmótica. A via e o método adequados de administração podem variar dependendo de alguns fatores tais como o anticorpo específico em uso, a taxa desejada de absorção, a formulação ou forma farmacêutica utilizada, o tipo ou a gravidade do transtorno em tratamento, o sítio específico de ação e condições do paciente, e podem ser selecionadas rapidamente pelo técnico no assunto.

[00171] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma molécula de ligação refere-se a uma quantidade que seja eficaz para o propósito terapêutico pretendido. Por exemplo, no contexto de intensificar uma resposta imune, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade que seja eficaz em estimular, suscitar, elevar, melhorar ou aumentar qualquer resposta do sistema imune de um mamífero. No contexto de tratar uma doença, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é qualquer quantidade que seja suficiente para provocar qualquer efeito desejável ou benéfico no mamífero em tratamento. Especificamente, no tratamento de câncer, exemplos de efeitos desejáveis ou benéficos incluem a inibição de crescimento adicional ou disseminação de células cancerosas, a morte de células cancerosas, a inibição de reincidência do câncer, a redução de dor associada com o câncer ou sobrevida melhorada do mamífero. A quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contra 4-1BB varia geralmente de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 500 mg/kg e mais geralmente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal do mamífero. Por exemplo, a quantidade pode ser de aproximadamente 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg ou 100 mg/kg de peso corporal do mamífero. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contra 4-1BB está no intervalo de aproximadamente 0,01 - 30 mg/kg de peso corporal do mamífero. Em algumas outras modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contra 4-1BB está no intervalo de aproximadamente 0,05 - 15 mg/kg de peso corporal do mamífero. O nível preciso da dose a ser administrada pode ser rapidamente determinado pelo técnico no assunto e dependerá de alguns fatores, como o tipo e a gravidade do transtorno em tratamento, a molécula de ligação específica empregada, a via de administração, o horário de administração, a duração do tratamento, a terapia adicional específica empregada, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico prévio do paciente em tratamento e fatores semelhantes bem conhecidos nas artes médicas.

[00172] Uma molécula de ligação ou composição é geralmente administrada em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre doses isoladas podem ser, por exemplo, semanais, mensais, a cada três meses ou anuais. Um esquema exemplar de tratamento requer a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez ao mês, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada três a seis meses. Esquemas típicos de dose para um anticorpo contra 4-1BB incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal via administração intravenosa, utilizando um dos seguintes esquemas de administração: (i) a cada quatro semanas por seis doses, em seguida a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

[00173] A presente invenção é ilustrada mais detalhadamente pelos exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como limitação adicional. Os conteúdos de todas as figuras e todas as referências, patentes, publicações de pedidos de patentes citados por todo este relatório descritivo são aqui expressamente incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Geração de fragmentos fab que se ligam a 4-1BB

[00174] Certos anticorpos providos pela presente invenção foram originalmente gerados a partir de Fabs que se ligam ao 4-1BB humano. Os Fabs foram selecionados a partir de uma biblioteca de apresentação em fago, a biblioteca de fagemídeos MorphoSys HuCAL GOLD®, seguido por seleções por afinidade (panning) alternando 4-1BB FC e células expressando 4-1BB humano. Estes Fabs incluem os designados como "Fab-6032", "Fab-7361", "Fab-7480" e "Fab-7483". Os anticorpos contra 4-1BB, MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480 e MOR-7483 descritos neste pedido de patente, foram gerados a partir de "Fab- 6032", "Fab-7361", "Fab-7480" e "Fab-7483", respectivamente. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve e da região variável da cadeia pesada de um determinado Fab são idênticas à sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve e da região variável da cadeia pesada, respectivamente, de um anticorpo ilustrativo, cuja designação compartilhe a mesma representação numérica com a designação do Fab. Por exemplo, o Fab-7480 e o anticorpo MOR-7480 possuem sequências idênticas de aminoácidos para sua região variável da cadeia leve e sua região variável da cadeia pesada, respectivamente.

[00175] A biblioteca de fagemídeos tem como base o conceito HuCAL® (Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296(1):57-86) e emprega a tecnologia CysDisplayTM para a apresentação do Fab na superfície do fago (Lohning, WO 01/05950). HuCAL GOLD® oferece a opção de seleções realizadas com seis sub-bibliotecas isoladas, cada uma compreendendo um gene máster de VH (VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6) combinado com todos os setes genes máster de VL ou de realizar seleções utilizando agrupamentos combinados de fagos. Fagos para a primeira rodada de seleções por afinidade foram preparados por Hyperphage (M13KO7ΔpIII, obtido da Progen, Heidelberg, Alemanha). HuCAL GOLD® é descrito detalhadamente em Christine Rothe, et. al, J. Mol. Biol. (2008) 376, 1182-1200.

[00176] A seleção por afinidade em fase sólida foi realizada utilizando 4-1BB humano-Fc recombinante (R&D Systems, Cat. No 8384B; Minneapolis, MN).

EXEMPLO 2: Caracterizações de Fabs

[00177] As caracterizações dos quatro Fabs descritos no Exemplo 1 foram determinadas nos ensaios descritos abaixo, utilizando o formato de Fab monovalente compreendendo um Fab com etiqueta (tag) Flag/His.

2A. Afinidade determinada com o método de titulação de solução em equilíbrio (SET)

[00178] A afinidade (expressa em KD) dos quatro Fabs foi determinando o método SET, utilizando instrumentação da Meso Scale Discovery ("MSD"). Frações de monômeros de proteína do anticorpo foram utilizadas (pelo menos 90% de conteúdo de monômeros, analisados por SEC analítico; Superdex75 (Amersham Pharmacia) para Fab ou Tosoh G3000SWXL (Tosoh Bioscience) para IgG, respectivamente).

[00179] A determinação da afinidade em solução foi realizada basicamente conforme descrito na literatura (Friguet et al. 1985). A fim de melhorar a sensibilidade e a exatidão do método SET método, este foi transferido de ELISA clássico para tecnologia com base em ECL (Haenel et al. 2005).

[00180] Anticorpos de cabra anti-fragmentos (Fab)2 específicos humanos 1 mg/mL (Dianova) foram marcados com MSD Sulfo-TAGTM NHS-Ester (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00181] Os experimentos foram executados em placas de microtitulação de polipropileno e PBS, pH 7,4, com BSA 0,5% e Tween 20 0,02%como tampão de ensaio. 4-1BB humano não marcado foi diluído em uma 2a série, iniciando com uma concentração pelo menos 10 vezes mais alta do que a KD esperada. Cavidades sem antígeno foram utilizadas para determinar os valores de Bmax; cavidades com tampão de ensaio foram utilizadas para determinar o fundo. Depois da adição de, por exemplo, Fab 30 pM (concentração final em volume final de 60 μL), a mistura foi incubada durante a noite à temperatura ambiente. A concentração aplicada de Fab foi semelhante ou abaixo da KD esperada.

[00182] Placas padrão da MSD foram revestidas com 4-1BB humano 0,05 μg/mL em PBS (30 μL/cavidade), incubadas durante a noite e bloqueadas com BSA 3% em PBS por 1 hora. Após lavagem da placa com tampão de ensaio, as amostras equilibradas foram transferidas para aquelas placas (30 μL por cavidade) e incubadas por 20 minutos. Após lavagem, 30 μL/cavidade do anticorpo de detecção marcado com MSD Sulfo-tag (de cabra anti-(Fab)2 humano) em diluição final de 1:1500 foi adicionado à placa MSD e incubado por 30 minutos em agitador Eppendorf (700 rpm).

[00183] Após lavagem da placa e adição de Tampão T de Leitura MSD 30 μL/cavidade com surfactante, sinais de eletroquimioluminescência foram detectados com um Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EUA).

[00184] Os dados foram avaliados com o software XLfit (IDBS), aplicando modelos de ajustes de ajustes personalizados. Para a determinação de KD de moléculas de Fab, o modelo de ajuste abaixo foi utilizado (Haenel et al., 2005) e modificado de acordo com Abraham et al. (1996, J. Molec. Recog. 9(5-6):456-461):

[00185] [Fab]t: Concentração total aplicada de Fab

[00186] x: Concentração total aplicada de antígeno solúvel (sítios de ligação)

[00187] Bmax: Sinal máximo de Fab sem antígeno

[00188] KD: Afinidade

[00189] Os resultados são apresentados na Tabela 3.

2B. Determinação de KD por Biacore em antígeno diretamente revestido

[00190] Para a determinação de KD, frações monoméricas de Fab (pelo menos 90% de conteúdo de monômeros, analisados por SEC analítico; Superdex75, Amersham Pharmacia) foram utilizadas como analito. A ligação a antígeno imobilizado foi analisada utilizando um instrumento BIAcore3000 (Biacore, Suécia).

[00191] As constantes cinéticas para as taxas kon e koff foram determinadas com diluições seriadas do respectivo Fab ligado covalentemente ao antígeno imobilizado CD137/ 4-1BB HUMANO utilizando o instrumento Biacore 3000 (Biacore, Uppsala, Suécia). Para a imobilização covalente do antígeno, a química padrão de acoplamento de EDC-NHS amina foi utilizada. As mensurações cinéticas foram efetuadas em HBS-EP (HEPES 10 mM; pH 7,4; NaCl 150 mM; EDTA 3 mM; Tween 20 0,005%) a uma vazão de 20 μl/minuto, utilizando concentrações de Fab que variaram de aproximadamente 16 a 500 nM. O tempo de injeção para cada concentração foi de 1 minuto, seguido por fase de dissociação durante pelo menos 3 minutos. Para regeneração, uma ou mais injeções de 5 μL de Glicina/HCl, pH 2, foram utilizadas.

[00192] Para estimativa de KD de moléculas inteiras de IgG, IgGs foram injetadas em um chip sensor F1 com baixa densidade de 4-1BB humano imobilizado covalentemente (aprox. 130 RU), utilizando uma 2a diluição seriada com concentrações variando de 16 a 500 nM. Os sensogramas foram avaliados utilizando um modelo de ajuste bivalente de comparação qualitativa para ordenar os valores correspondentes de KD.

[00193] Todos os sensogramas foram ajustados utilizando o software 3.1 de avaliação BIA (Biacore). Os resultados são apresentados na Tabela 3.

2C. Ligação de Fabs em ensaio ELISA

[00194] A ligação dos quatro Fabs foi determinada utilizando técnicas ELISA padrão em 4-1BB humano/Fc. Diretamente revestidos. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

2D. Ligação de Fabs em ensaio FACS

[00195] A ligação dos quatro Fabs foi determinada utilizando técnicas FACS padrão em células HEK293 estavelmente transfectadas e expressando 4-1BB humano, bem como em células 300.19 (linhagem murina de células B) de controle negativo. Os resultados são apresentados na Tabela 3. Tabela 3. Propriedades de ligação de Fabs

EXEMPLO 3: Caracterização de IgGs

[00196] Diversos Fabs obtidos da seleção por afinidade conforme aqui descrita, incluindo Fab-6032, Fab-7361, Fab-7480 e Fab-7483, foram selecionados para conversão em anticorpos completos em formatos de IgG1 e IgG4 para caracterizações mais detalhadas conforme descritas neste exemplo. Os quatro anticorpos ilustrativos identificados neste exemplo, ou seja, MOR-6032, MOR-7361, MOR- 7480 e MOR-7483, foram convertidos a partir de Fab-6032, Fab- 7361, Fab-7480 e Fab-7483, respectivamente. Os anticorpos em formato de IgG foram expressos e purificados e, depois, caracterizados em ensaios ELISA, FACS e com gene repórter da luciferase.

3A. Conversão para IgG

[00197] A fim de expressar IgG completa, fragmentos de domínios variáveis de cadeias pesada (VH) e leve (VL) foram subclonados a partir de vetores de expressão de Fab em vetores pMorph®_hIgG apropriados para IgG1 humana e IgG4 humana.

3B. Expressão transitória e purificação de IgG humana

[00198] A expressão transitória de IgG humana completa foi realizada em células HKB11, as quais foram transfectadas com vetores de expressão de cadeia pesada e leve de IgG em proporção de 1:1. O sobrenadante da cultura celular foi colhido após a transfecção e seu volume ampliado para 3 vezes o da transfecção, respectivamente. O sobrenadante foi liberado por centrifugação e filtração e então submetido à cromatografia padrão de afinidade com proteína A (MabSelect SURE, GE Healthcare). As proteínas foram eluídas e neutralizadas. O processamento posterior adicional envolveu a troca de tampão e a filtração estéril. As concentrações de proteínas foram determinadas por espectrofotometria de UV. A pureza de IgG foi analisada em condições desnaturantes, redutoras e desnaturantes, não redutoras em SDS-PAGE ou utilizando BioAnalyzer da Agilent. A HP- SEC foi realizada para analisar preparados de IgG em estado nativo.

3C. Caracterização de IgGs em ensaio ELISA

[00199] IgGs foram utilizadas para caracterização da ligação por ELISA em 4-1BB humano/Fc e 4-1BB de camundongo/Fc em configuração de revestimento direto. A Tabela 4 apresenta os resultados de ligação por ELISA para os anticorpos MOR-6032, MOR-7361, MOR- 7480 e MOR-7483, todos em formato de IgG1. Tabela 4. Ligação de IgG1s em ensaio ELISA

3D. Seletividade de ligação de anticorpos (Ensaio FACS)

[00200] A seletividade de anticorpos por 4-1BB foi avaliada contra a proteína do domínio extracelular de 4-1BB e por outros membros da superfamília de TNFR. Estes receptores incluíram CD40 (TNFRSF5) e OX-40 (CD134, TNFRSF4). IgGs foram utilizadas para caracterização da ligação por FACS em células HEK293 como controle negativo, bem como em células HEK293T-h4-1BB, transfectadas estavelmente e expressando 4-1BB humano, em células 300.19, transfectadas estavelmente e expressando OX-40, e em células 300.19 transfectadas estavelmente e expressando CD40. Os resultados de ligação do FACS para os anticorpos MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480 e MOR-7483, todos em formato de IgG1, são apresentados na Tabela 5. Não foi observada ligação significativa a OX-40 ou a CD40 em concentrações de até 1000 nM, demonstrando que os anticorpos são pelo menos 100 vezes mais seletivos para 4-1BB em comparação a outros membros testados da família. Tabela 5. Seletividade de ligação de anticorpos (IgG1) em ensaio FACS

3E. Caracterização de IgGs em ensaio com gene repórter d a luciferase

[00201] IgGs foram também caracterizadas quanto à ligação em um ensaio com gene repórter da luciferase utilizando células HEK293T-h4- 1BB em um ensaio em que estavam ligadas à placa e um ensaio de ligação cruzada. A Tabela 6 apresenta os resultados do ensaio com gene repórter da luciferase para os anticorpos MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480 e MOR-7483, todos em formato de IgG1. Tabela 6. Caracterização de IgG1 em ensaio com gene repórter da luciferase

EXEMPLO 4: Caracterização estrutural dos anticorpos MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480 E MOR-7483

[00202] Os procedimentos descritos acima nos Exemplos 1 - 3 foram utilizados para produzir diversos anticorpos IgG2 completos anti-4-1BB humano, incluindo os anticorpos designados "MOR-6032", "MOR- 7361", "MOR-7480" e "MOR-7483." As sequências de cDNA, codificadoras das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve dos anticorpos monoclonais MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480 e MOR-7483, foram obtidas utilizando técnicas padrão de PCR e foram sequenciadas por meio de técnicas padrão de sequenciamento de DNA.

[00203] As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada, da cadeia pesada completa da subclasse IgG2, da região variável da cadeia leve e da cadeia leve completa dos anticorpos MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480, MOR-7480.1, MOR- 7480.2, MOR-7483, MOR-7483.1 e MOR-7483.2 são fornecidas na presente invenção; um índice das SEQ ID NOs para estas sequências é mostrado na Tabela 1.

[00204] A comparação da sequência da cadeia pesada de imunoglobulina de MOR-6032 às sequências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulina da linhagem germinativa demonstrou que a cadeia pesada de MOR-6032 utiliza um segmento VH de VH 1-69 proveniente da linhagem germinativa humana, um segmento D proveniente de 4-23 da linhagem germinativa humana e um segmento JH proveniente de JH 4a da linhagem germinativa humana.

[00205] A análise adicional da sequência de VH de MOR-6032, utilizando o sistema de Kabat de determinação de regiões CDR, levou à delineação das regiões H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 de cadeia pesada, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, respectivamente.

[00206] A comparação da sequência da cadeia pesada de imunoglobulina de MOR-7361 às sequências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulina da linhagem germinativa demonstrou que a cadeia pesada de 7361 utiliza um segmento VH proveniente de VH 3-23 da linhagem germinativa, um segmento D proveniente de 2-8 da linhagem germinativa humana e um segmento JH proveniente de JH 4a da linhagem germinativa humana.

[00207] A análise adicional da sequência de VH de MOR-7361, utilizando o sistema de Kabat de determinação de regiões CDR, levou a delineação das regiões H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 de cadeia pesada, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 15, 16 e 17, respectivamente.

[00208] A comparação das sequências da cadeia pesada de imunoglobulina de MOR-7480 e de MOR-7483 às sequências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulina da linhagem germinativa demonstrou que a cadeia pesada de 7480 e de 7483 utilizam um segmento VH proveniente de VH 5 da linhagem germinativa humana, um segmento D proveniente de 5-18 da linhagem germinativa humana e um segmento JH proveniente de JH 4a da linhagem germinativa humana.

[00209] A análise adicional das sequências de VH de 7480 e 7483, utilizando o sistema de Kabat de determinação de regiões CDR, levou a delineação das regiões H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 29, 30 e 31, respectivamente.

[00210] A comparação das sequências da cadeia leve de imunoglobulina de MOR-6032, MOR-7361, MOR-7480 e MOR-7483 às sequências conhecidas de cadeia leve de imunoglobulina da linhagem germinativa demonstrou que as cadeias leves de 6032, 7361, 7480 e 7483, todas utilizam um segmento VL proveniente de À3-r da linhagem germinativa e um segmento JL proveniente de JL 3b da linhagem germinativa.

[00211] A análise adicional da sequência de VL de MOR-6032, utilizando o sistema de Kabat de determinação de regiões CDR, levou a delineação das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente.

[00212] A análise adicional da sequência de VL de MOR-7361, utilizando o sistema de Kabat de determinação de regiões CDR, levou a delineação das regiões L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respectivamente.

[00213] A análise adicional da sequência de VL de MOR-7480,L utilizando o sistema de Kabat de determinação de regiões CDR, levou a delineação das regiões L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 34, 35 e 36, respectivamente.

[00214] A análise adicional da sequência de VL de MOR-7483, utilizando o sistema de Kabat de determinação de regiões CDR, levou a delineação das regiões L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3, conforme mostradas nas SEQ ID NOs: 34, 35 e 55, respectivamente.

EXEMPLO 5: Versões alinhadas à linhagem germinativa dos anticorpos MOR-7480 E MOR-7483

[00215] Visando minimizar a imunogenicidade dos anticorpos MOR- 7480 e MOR-7483, diversos resíduos de aminoácidos sofreram mutação reversa para a sequência da linhagem germinativa na maneira a seguir. Uma versão alinhada à linhagem germinativa de MOR-7480, designado MOR-7480.1, foi preparada retornando dois aminoácidos na região FR1 da cadeia pesada variável para a sequência da linhagem germinativa. Mais especificamente, Q no resíduo de aminoácido número 1 foi retornado para E da linhagem germinativa e K no resíduo de aminoácido número 19 foi retornado para R. Os dois resíduos de aminoácido que foram trocados na região variável da cadeia pesada podem ser vistos comparando a sequência de aminoácidos de MOR- 7480 (SEQ ID NO: 32) com a de MOR-7480.1 (SEQ ID NO: 43). Na região variável da cadeia leve de MOR-7480, cinco aminoácidos na região FR1 (D1S, I2Y, A13S, R19S, S21T), dois aminoácidos na região FR2 (A42S, V45L), e um na região FR3 (E80M) foram revertidos para a sequência da linhagem germinativa. Os oito aminoácidos que foram trocados na região variável da cadeia leve podem ser vistos comparando a sequência de aminoácidos de MOR-7480 (SEQ ID NO: 37) com a de MOR-7480.1 (SEQ ID NO: 45).

[00216] Além disso, uma terceira versão de MOR-7480 foi preparada, iniciando com a sequência da região variável da cadeia leve de MOR-7480.1 (SEQ ID NO: 45) e revertendo L45 de volta para V para produzir MOR-7480.2 (SEQ ID NO: 51).

[00217] Uma versão "alinhada à linhagem germinativa" de MOR- 7483, designada MOR-7483.1, foi preparada pela mutação reversa de dois aminoácidos na região FR1 da cadeia variável pesada para a sequência da linhagem germinativa. As versões alinhadas à linhagem germinativa podem ser preparadas iniciando com a versão da linhagem germinativa da cadeia do anticorpo e em seguida trocando os aminoácidos desejados nas CDRs ou qualquer combinação de mutações iniciado a partir de qualquer versão. Para produzir MOR- 7483.1, Q no resíduo de aminoácido número 1 foi retornado para o E da linhagem germinativa e K no resíduo de aminoácido número 19 foi retornado para R. Os dois resíduos de aminoácidos que foram trocados na região variável da cadeia pesada podem ser vistos comparando a sequência de MOR-7483 (SEQ ID NO: 32) com a de MOR-7483.1 (SEQ ID NO: 43). Na região variável da cadeia leve de MOR-7483, cinco aminoácidos na região FR1 (D1S, I2Y, A13S, R19S, S21T), dois aminoácidos na região FR2 (A42S, V45L) e um na região FR3 (E80M) foram revertidos para a sequência da linhagem germinativa. Os oito aminoácidos que foram trocados na região variável da cadeia leve podem ser vistos comparando a sequência de aminoácidos de MOR- 7483 (SEQ ID NO: 56) com a de MOR-7483.1 (SEQ ID NO: 60).

[00218] Além disso, uma terceira versão de MOR-7483 foi preparada por mutação reversa em L45 da sequência da região variável da cadeia leve de MOR-7483.1 (SEQ ID NO:60) para V45 da linhagem germinativa para produzir MOR-7483.2 (SEQ ID NO:64).

EXEMPLO 6: Propriedades IN VITRO DE ANTICORPOS, incluindo versões alinhadas à linhagem germinativa Afinidades de ligação de anticorpos (Ensaio BIAcore)

[00219] A cinética de ligação de certos anticorpos que se ligam ao 4- 1BB humano foi mensurada pela tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando um instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). A proteína Chimera recombinante 4-1BB humano/Fc, compreendendo os aminoácidos 24 - 186 da SEQ ID NO:68, foi adquirida da R&D Systems Inc. (no 838-4B). A proteína liofilizada foi dissolvida em tampão contendo NaCl 150 mM, HEPES 25 mM, pH 8,0, MgCl2 6 mM, polissorbato 20 0,005% e azida sódica 0,5 mM para concentração final de 80 nM com base no peso molecular previsto (44,8 kDa) informado pela R&D Systems. A parte Fc da molécula foi clivada por tratamento com Fator Bovino Xa (Pierce, no 32521) em NaCl 150 mM, HEPES 25 mM, pH 8,0, 6 MgCl2 6 mM, polissorbato 20 0,005%, azida sódica 0,05 mM, utilizando incubação por 20 horas a 22 °C com % Fator Xa 3% (3 μg de Fator Xa por 100 μg de quimera 4-1BB). A parte de 4-1BB da molécula compreende os resíduos de aminoácidos 24 ao 186 da proteína humana 4-1BB. Os experimentos de ligação foram realizados a 25 °C em tampão de corrida compreendendo NaCl 150 mM, HEPES 25 mM, pH 8,0, MgCl2 6 mM, polissorbato 20 0,005% e azida sódica 0,5 mM. Os anticorpos foram imobilizados por acoplamento padrão com amino a um chip sensor CM5 (GE Healthcare), utilizando uma solução 0,1 mg/mL do anticorpo em acetato de sódio 10 mM e pH 5,0. O 4-1BB foi injetado em um intervalo de concentrações de 80 nM a 0,16 nM, a uma vazão de 50 μL/minuto, por 3,6 minutos seguido por um período de dissociação de 26 minutos, utilizando o recurso Kinject do instrumento Biacore 3000. O complexo ligado foi regenerado por um pulso de 1 minuto de ácido fosfórico 10 mM em água. A análise de dados foi realizada com o software Scrubber2 (BioLogic Software). Os sensogramas foram ajustados a um modelo de ligação simples 1:1 de Langmuir. Os anticorpos demonstraram que se ligavam reversivelmente ao 4-1BB humano recombinante. Os resultados (valores médios) são apresentados na Tabela 7.

Ligação ao domínio extracelular de 4-1BB (ensaio ELISA)

[00220] A quimera 4-1BB humano-IgG1Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi novamente suspense com solução salina com tampão fosfato de Dulbecco (DPBS), contendo albumina sérica bovina 0,1% (BSA) para 0,2 mg/mL, e diluída com DPBS até uma concentração final de 0,03 μg/mL. Placas Nunc-Immuno Maxisorp de 96 cavidades foram revestidas com a quimera de 4-1BB recombinante a 0,1 mL por cavidade, deixando cavidades vazias para controles de ligação não específica, e incubadas a 4 °C durante a noite. A solução de 4-1BB foi retirada e as placas foram lavadas três vezes com 0,2 mL de tampão de lavagem (Tween-20 0,05% em DPBS). 0,2 mL de tampão de bloqueio (BSA 5%, Tween-20 0,05% em DPBS) foram adicionados a todas as cavidades, que foram incubadas a 4°C por 1 hora com mistura. O tampão de bloqueio foi retirado e as placas lavadas três vezes com 0,2 mL de tampão de lavagem. Diluições seriadas dos anticorpos contra 4- 1BB em teste foram preparadas em DPBS e 0,1 mL de Ab diluído foram adicionados por cavidade. As placas foram incubadas por 1,5 horas à temperatura ambiente. A solução de anticorpos foi retirada e as placas foram lavadas três vezes com 0,2 mL de tampão de lavagem por cavidade. Anticorpo F(ab’)2 específico F(ab’)2 de cabra marcado com peroxidase de rábano anti-IgG humana (Jackson Immunoresearch no 109-036-097, West Grove, PA) foi diluído 1:5000 com DPBS e 0,1 mL adicionados por cavidade. As placas foram incubadas 1 hora à temperatura ambiente e lavadas com 0,2 mL por cavidade de tampão de lavagem. 0,1 mL de substrato de peroxidase SureBlue TMB de microcavidades (Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) foram adicionado e incubados por 20 minutos à temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de volume igual de H2SO4 2 M, e a absorbância foi lida a 450 nm em um Molecular Devices Spectra Max 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os resultados são apresentados na Tabela 8.

Competição por ligação com ligante (Ensaio ELISA)

[00221] Anticorpos foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a ligação da quimera 4-1BB humano_IgG1Fc ao ligante 4-1BB (4-1BBL) recombinante ligado à placa. O ligante 4-1BB humano recombinante (Biosource/Invitrogen, Carlsbad, CA) foi novamente suspenso para 0,2 mg/mL em DPBS + albumina sérica bovina 0,1% e depois diluído para 1 μg/mL em DPBS. Placas Nunc-Immuno MaxiSorp com 96 cavidades na superfície foram revestidas com 0,1 mL/cavidade da solução de 4-1BBL durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, a solução de 4-1BBL foi retirada, e 0,2 mL de tampão de Bloqueio (albumina sérica bovina 1%, Tween-20 0,05% em DPBS) adicionados e incubados à temperatura ambiente por 2 horas. Durante a etapa de bloqueio, os estoques de anticorpos foram diluídos em um intervalo de 8 ng/mL a 6 μg/mL em DPBS. O 4-1BB humano_IgG1Fc recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi novamente suspenso para 0,2 mg/mL em DPBS + albumina sérica bovina 0,1% e depois diluído para 0,02 μg/mL em DPBS. As placas bloqueadas revestidas com 4-1BBL foram lavadas três vezes com 0,2 mL de tampão de lavagem (Tween 20 0,05% em DPBS). 60 μL de diluições de anticorpo foram adicionados juntamente com 60 μL da quimera 4-1BB_IgG1Fc e incubados à temperatura ambiente por 1,5 horas. As placas foram lavadas como descrito anteriormente. Anticorpo anti-tag de 6xHistidina marcado com peroxidase de rábano (R&D Systems, Minneapolis MN no MAB050H) foi diluído 1:1000 em DPBS, 50 μL da solução resultante foram adicionados às cavidades das placas lavadas e incubados à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas como previamente descrito. 50 μL de solução com substrato TMB foram adicionados a cada cavidade e incubados à temperatura ambiente por 20 minutos. A reação foi interrompida com 50 μL de H2SO4 0,2 N, sendo a absorbância lida a 450 nm com leitor de placa Molecular Devices. Os resultados são apresentados na Tabela 8.

Reatividade cruzada de anticorpos entre espécies

[00222] A reatividade cruzada entre espécies dos anticorpos exemplares foi medida utilizando células mononucleares primárias do sangue periférico (PBMC) estimuladas com fito-hemaglutinina (PHA) de seres humanos, macaco cynomolgus (cyno), cão e de rato. As células foram isoladas de acordo com o procedimento descrito abaixo. As células (~5,0 x 105 células/tubo) foram lavadas uma vez em tampão de lavagem gelado (PBS, FBS 2% e azida sódica 0,02%) e 100 μL/tubo de controle conjugado a Alexa Fluor 647 ou anticorpos reativos contra 4- 1BB a 15,5 μg/mL (100 nM) foram adicionados a cada amostra, juntamente com anticorpos marcados contra marcador de células T específico das espécies. Os anticorpos utilizados contra marcador de células T foram os seguintes: FITC anti-CD3e humano (BD Pharmingen, no 555332), FITC anti-CD3e de rato (BD Pharmingen, no 559975), FITC anti-CD4 de coelho + FITC anti-CD8 de coelho (AbD Serotec, no MCA799F e no CA1576F), FITC anti-CD3e de cão (AbD Serotec, no MCA1774F) e PerCP anti-CD3e humano/cyno (BD Pharmingen, no 552851). As células foram incubadas no escuro com os anticorpos marcados com os fluorocromos em gelo por 30 minutos, lavadas três vezes e novamente suspensas em 0,3 mL de tampão de lavagem para análise. A coloração de anticorpo foi medida e analisada com Becton Dickinson FACS Calibur e o software FlowJo 8.8.2.

[00223] Isolamento de linfócitos T humanos. Sangue total humano foi coletado em seringas contendo 1,0 mL de EDTA 0,5 M e depois transferido para tubos Sigma Accuspin (Sigma, St. Louis, MO) para o isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) como descrito pelo fabricante. As PBMCs foram lavadas duas vezes com DPBS contendo EDTA 5 mM, e os linfócitos T foram isolados por meio de uma coluna de purificação de células T conforme descrito pelo fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Resumidamente, as PBMCs foram novamente suspensas em 2 mL de tampão da coluna e carregadas em uma colada previamente lavada para isolamento de células T. As PBMCs foram incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente e as células T foram eluídas com tampão da coluna, lavadas uma vez e novamente suspensas em TCM a 2 x 106 células/mL, consistindo em RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO) suplementado com soro fetal bovino 10% (Sigma, St. Louis, MO) e L-glutamina (2 mM), Hepes (10 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (50 μg/mL) (Gibco, Grand Island, NY.).

[00224] Isolamento de PBMCs de Cynomolgus. Sangue total de Cynomolgus (Bioreclamation; Hicksville, NY) foi coletado em tubos CPT vacutainer contendo citrato de sódio (BD; Franklin Lakes, NJ) que foram depois girados a 1500 x g por 20 minutos à temperatura ambiente. Os tubos foram enviados durante a noite a 4oC. A fração de PBMC foi coletada dos tubos CPT e lavada 2x com PBS contendo EDTA 5 mM. Após a etapa de lavagem, as PBMCs foram contadas e reajustadas para 2 x 106 células/mL em meio de cultura de tecido (TCM). O meio TCM consistia em RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO) suplementado com soro fetal bovino 10% (Sigma, St Louis, MO) and L-glutamina (2 mM), HEPES (10 mM), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (50 μg/mL) adquiridos da Gibco (Grand Island, NY). As células foram estimuladas com PHA 10 μg/mL PHA por 2-3 dias para induzir a expressão de 4-1BB.

[00225] Isolamento de PBMCs caninas. Sangue total canino foi coletado em tubos vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) e diluído 1:2 com PBS contendo EDTA 5mM. Após mistura, 4 mL do sangue diluído foram cuidadosamente dispostos em camada sobre 3 mL de Lympholyte-Mammal (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) e centrifugados a 800 x g por 20 minutos a 25 °C. A interface de PBMC foi coletada, lavada duas vezes com PBS e novamente suspensa para 2 x 106 células/mL em TCM contendo PHA a 10 μg/mL (Remel, Lenexa, KS). As células foram cultivadas por 48-72 horas antes de serem testadas quanto à ligação de anticorpos por citometria de fluxo.

[00226] Isolamento de PBMCs de rato. Sangue total de rato foi coletado em tubos vacutainer heparinizados (BD; Franklin Lakes, NJ) e diluído 1:3 com PBS contendo EDTA 5 mM. Após mistura, 6 mL do sangue diluído foram cuidadosamente dispostos em camada sobre 4,5 mL de Lympholyte-Mammal (Cedarlane Laboratories, Westbury, NY) e centrifugados a 800 x g por 20 minutos a 25 °C. A interface de PBMC foi coletada, lavada duas vezes com PBS e novamente suspensa para 2 x 106 células/mL em TCM contendo PHA a 10 μg/mL (Remel, Lenexa, KS). As células foram cultivadas por 48-72 horas antes de serem testadas quanto à ligação de anticorpos por citometria de fluxo.

[00227] Os resultados de ligação são fornecidos na Figura 1. Foi constatado que os anticorpos se ligam ao 4-1BB humano e cyno com alta afinidade, enquanto a ligação ao 4-1BB de cão e de rato não foi observada nas concentrações de 100 nM, a mais alta concentração testada. Tabela 7: Afinidades de ligação de anticorpos IgG (Biacore)

Tabela 8: Valores de ligação e de competição com ligante pe o ensaio ELISA

Mapeamento de epítopos

[00228] A fim de determinar a região de ligação a epítopos dos anticorpos agonistas contra 4-1BB, uma série de mutações (Tabela 9) foram efetuadas ao domínio extracelular do 4-1BB humano para a sequência publicada do 4-1BB canino (Seq. de Ref. XM_845243). Tabela 9. Domínio extracelular mutante de 4-1BB humano

[00229] Todas as mutações de humano para canino foram preparadas por Gene Dynamics LLC, (Portland ou) no vetor de expressão retroviral pMSCVpuro (Clontech Laboratories Mountain View, CA). Adicionalmente, a sequência canina completa do cDNA foi preparada por intermédio de síntese do gene correspondente à Seq. de Ref. XM_845243.

[00230] Preparados virais foram estabelecidos pela transfecção transitória de células 293T com confluência de aproximadamente 4050% em frascos T-75. Após a cultura, o sobrenadante viral foi então filtrado estéril e submetido à concentração. O vírus concentrado foi coletado e armazenado a -80 oC.

[00231] O material genético de células 300-19 em crescimento logarítmico foi transferido com retrovírus, utilizando o vírus concentrado em diluição 1:250 mais polibreno 8 μg/mL em DMEM completo. Depois de incubação por 24 horas, puromicina 2 μg/mL foi adicionada às culturas e mantida durante o transcorrer do estudo.

[00232] A expressão positiva dos receptores 4-1BB por agrupamentos selecionados pela puromicina foi confirmada por coloração com anticorpo policlonal de cabra anti-4-1BB humano 1 μg/mL (R&D Systems Inc.) mais (H+L) F(ab’)2 marcado com PE de burro anti-IgG de cabra (Jackson Immunoresearch Inc.) em diluição de 1:200. A fim de determinar o reconhecimento dos receptores 4-1BB mutantes pelos anticorpos em teste, os agrupamentos selecionados pela puromicina foram corados com diluição a 100 nM do anticorpo primário não marcado em gelo por 30 minutos, seguido por duas lavagens com tampão FACS e (H+L) F(ab’)2 marcado com PE de burro anti-IgG específica para espécie em diluição de 1:200. As células foram analisadas por FACS com BD FACS Calibur e o software FlowJo 8.8.6.

[00233] A coloração relativa de cada agrupamento de células está resumida na Tabela 10. Tabela 10. Coloração relativa de cada agrupamento de células

[00234] A diferenciação da ligação entre anticorpos com sequências semelhantes (MOR-7480, MOR-7480.1, MOR-7480.2, MOR-7483 e MOR-7483.1) foi descoberta dentro das mutações do clone N&E.5, sugerindo que os determinantes para o reconhecimento do anticorpo residem dentro da região mutante.

[00235] A fim de determinar a afinidade relativa destes anticorpos para o domínio extracelular do 4-1BB humano e para o mutante do domínio extracelular do 4-1BB, o mutante N&E.5, uma curva de dose-resposta por FACS foi determinada para cada anticorpo. MOR_7480, MOR_7480.1 e MOR_7480.2 marcados com Alexa Fluor 647 foram diluídos em tampão FACS a partir de 1 μM em uma série de diluições 1:5 de 8 pontos e utilizados para corar agrupamentos de células precursoras 300-19, hu4- 1BB, hu4-1BB N&E.5 e 4-1BB canino. As células foram analisadas por FACS com BD FACS Calibur e o software FlowJo 8.8.6. A média geométrica da fluorescência de cada agrupamento expressando o receptor foi normalizada para a coloração das células precursoras e expressa em vezes de coloração, e determinada uma EC50 para resposta à dose. O resumo de EC50 é mostrado na Tabela 11. Foi notado que a ligação de MOR_7480.2 e MOR_7480 reduziu mais de 5 vezes para o mutante N&E.5 de 4-1BB humano. Tabela 11. EC50 (nM) da ligação de anticorpos

Atividade agonista de anticorpos (Ensaio de atividade da luciferase)

[00236] Células 293T expressando 4-1BB humano juntamente com um repórter luciferase integrado estavelmente a NFkB foram preparadas. As células foram colhidas, lavadas e novamente suspensas em meio completo livre de vermelho fenol (DMEM contendo soro fetal bovino 10%, tampão HEPES, aminoácidos não essenciais e L- glutamina) a uma densidade de 0,6 X 106 células/mL. 50 μL de células foram semeadas em cada cavidade de ensaio de uma placa branca com 96 cavidades (PerkinElmer, Waltham, MA). Anticorpos em teste foram adicionados a cada cavidade na presença de um Fab’ de anticorpo com ligação cruzada de cabra anti-Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) em proporção 2,5:1. A placa foi incubada 5 horas a 37 °C. 75 μL de reagente Bright-Glo Luciferase (Promega, Madison WI) foram adicionados, e a quantidade de atividade da luciferase foi medida utilizando um contador de cintilação Packard TopCount NXT.

[00237] Células 293T expressando 4-1BB de macaco cynomolgus foram preparadas por transdução viral e seleção com puramici8na 2 μg/mL de um agrupamento estável. Células 293T expressando 4-1BB cyno foram semeadas em um frasco T-75 até atingirem confluência de aproximadamente 60-70%, em seguida transfectadas com 10 μg de pLuc_6xNFkB mais 0,1 μg de pRL-CMV como controle de transfecção. As transfecções foram realizadas utilizando o reagente de transfecção Fugene 6 (Roche Indianapolis, IN) a uma proporção de 6 μL de Fugene para 1 μg de DNA de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. As células foram colhidas, no dia seguinte, lavadas e novamente suspensas em meio completo livre de vermelho fenol (DMEM contendo soro fetal bovino 10%, aminoácidos não essenciais e L-glutamina) a uma densidade de 0,6 x 106células/mL. 50 μL de células foram semeadas em cada cavidade de ensaio de uma placa branca com 96 cavidades (PerkinElmer, Waltham, MA). Anticorpos em teste foram adicionados a cada cavidade na presença de um Fab’ de anticorpo com ligação cruzada de cabra anti-Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) em proporção 2,5:1. A placa foi incubada 5 horas a 37 °C. 75 μL de reagente de ensaio de luciferase foram adicionados, e a quantidade de atividade da luciferase de vaga- lume foi medida utilizando um contador de cintilação Packard TopCount NXT. Adicionalmente, 75 μL de reagente Stop & Glo foram adicionados para avaliar a atividade da luciferase de Renilla foi medida com contador de cintilação Pakcard TopCount NXT. Os resultados são apresentados na Figura 2.

Atividade agonista de anticorpos (ensaio de liberação de IL-2 por células T primárias)

[00238] Placas Nunc Maxisorp de 96 cavidades foram esterilizadas com UV antes de serem revestidas. Os anticorpos em teste foram diluídos em PBS para 60 μg/mL. 0,2 mL do Ab diluído foram divididos em 2 cavidades de uma placa de polipropileno com 96 cavidades e diluídos em série 1:3. 50 μL do Ab diluído foram adicionados à placa de ensaio Maxisorp estéril de 96 cavidades e imediatamente 50 μL do clone UCHT1 anti-CD3ε humano (Biolegend San Diego, CA) 20 μg/mL foram adicionados. Todas as placas foram então incubadas durante a noite a 4 oC. No dia seguinte, as placas revestidas com Ab foram lavadas 1x com PBS e 0,15 mL de meio completo RPMI foram adicionados às cavidades das placas Nunc Maxisorp. Células T humanas foram isoladas como descrito previamente neste pedido de patente, e 50 μL de células T purificadas a 2 x 106 células/mL (100.000 células/cavidades) foram adicionadas a cada cavidade. As células foram incubadas a 37 °C, CO2 5% durante 3 dias. O sobrenadante de cada cavidade foi coletado e analisado imediatamente ou armazenado a -20oC antes do ensaio. Os sobrenadantes foram diluídos com meios completos antes do ensaio ELISA para IL-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Os resultados são apresentados na Figura 3.

EXEMPLO 7: EXPANSÃO DE LEUCÓCITOS HUMANOS INDUZIDA POR ANTICORPOS CONTRA 4-1BB IN VIVO

[00239] A falta de reatividade cruzada detectável dos anticorpos contra 4-1BB com o 4-1BB murino e a exigência da presença de células imunes humanas tornou necessário o desenvolvimento de modelos para avaliação funcional in vivo dos anticorpos contra 4-1BB. Camundongos com antecedentes genéticos NOD portadores da mutação das imunodeficiências combinadas graves (SCID) e de deficiência na cadeia gama comum do receptor de IL-2 (comumente denominada NSG) são capazes de suportar o enxerto de um grande número de leucócitos do sangue periférico humano (huPBL) e manter o enxerto durante ao menos 30 dias (King, 2008, Clin. Immunol. 126:303314). Esse modelo de camundongo, também conhecido como modelo huPBL-NSG, foi utilizado para avaliar o efeito funcional da administração sistêmica in vivo dos anticorpos em células imunes humanas. Especificamente, 6 milhões de PBMCs humanas recentemente isoladas foram adotivamente transferidas via injeção intravenosa para camundongos hospedeiros NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/SzJ (NSG). Nove dias depois das injeções de PBMC, os animais receberam a administração de uma única dose 1 mg/kg de MOR7480, MOR7480.1 ou do anticorpo controle de isotipo IgG2 por injeção intraperitoneal. No Dia 24 a 28 após o enxerto de PBMC, as PBMC foram coradas com anticorpos contra CD45 humano e murino, avaliado por intermédio de citometria de fluxo. Perfis de espalhamento adiante e lateral foram utilizados para determinar um limite (gate) de linfócitos. De acordo com a Figura 4, MOR7480 e MOR7480.1 foram capazes de intensificar a expansão de leucócitos humanos, conforme evidenciado pela proporção aumentada de células CD45+ humanas no sangue periférico de camundongos com enxertos. Para cada grupo, n>6 camundongos.

[00240] Adicionalmente, o tratamento com MOR7480.1 de macacos cynomolgus aumentou a proliferação entre células T citotóxicas de memória central (CD8 TCM) em amostras de PBMC. Macacos cynomolgus (2 animais por nível de dose) receberam uma única injeção intravenosa de MOR7480.1 na dose indicada. As PBMCs foram colhidas 7 antes da dose do anticorpo (pré-dose) e nos dias indicados do estudo em relação à administração de MOR7480.1 (no Dia 1 do Estudo). As PBMCs foram coradas com anticorpos para CD3, CD4, CD8, CD28, CD95 e Ki-67 e analisadas por citometria de fluxo. Os dados são coletados em um Canto II (Beckton Dickinson) e analisados com o software DIVA (Becton Dickinson). Células CD8 de memória central foram identificadas como CD3+, CD8+, CD28+ e CD95+. Os dados são mostrados para animais individuais designados como (nível de dose- número do animal) e são representados em alteração intra-animal no número de células Ki-67+ em relação ao número antes do estudo {[(no de células Ki-67+ células no dia indicado do estudo - no de células Ki- 67+ células na pré-dose)/no de células Ki-67+ células na pré-dose]*100}. Como mostrado na Figura 5, foi observado aumento de 5 vezes ou mais em células T de memória central em proliferação durante os primeiros 7-13 dias do estudo em pelo menos um animal de todos os grupos tratados com 0,3 mg/kg ou dose maior.

EXEMPLO 8: Atividade antitumoral de anticorpos contra 4-1BB (MODELO IN VIVO) Modelo de câncer de próstata humano PC3

[00241] A falta de reatividade cruzada em roedores dos anticorpos contra 4-1BB impediu o uso de modelos padrão de tumores murinos singênicos ou de enxerto humano para a avaliação da eficácia antitumoral humana dos anticorpos. Consequentemente, um novo modelo de tumor xenogênico huPBL-SCID-Bg em camundongos foi gerado utilizando camundongo SCID-Bg (CB.17/lcr.Cg PkrdcscidLystbg/Crl), que abriga os linfócitos T e B e células NK funcionais murinos sem a mutação bege (Bg). A eficácia antitumoral humana dos anticorpos contra 4-1BB foi avaliada utilizando este modelo conforme descrito abaixo.

[00242] A linhagem de células PC3 de próstata humana ou LOVO de cólon humano foi obtida da American Type Culture Collection e cultivada em RPMI-1640 (Invitrogen) enriquecido com os seguintes suplementos da Invitrogen: L-glutamina, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais, penicilina/estreptomicina, Hepes e soro fetal bovino 10% inativado com o calor (FBS; Cat. No F2442, Sigma Aldrich). As células foram cultivadas para confluência em frascos T-225 Falcon. Subsequentemente, as células foram tratadas com tripsina (Tripsina 0,25%-EDTA; Cat. No 2500-056, Invitrogen) e o crescimento foi ampliado em Hyperflasks (Cat. No.3319 Corning Life Sciences) por três dias. Tripsina foi utilizada para colher a linhagem celular que foi lavada 3 vezes em PRMI gelado suplementado com FBS 10%. Não mais de 300 mL de sangue periférico foi coletado de voluntários saudáveis. Linfócitos do sangue periférico (PBMCs) foram isolados do sangue heparinizado utilizando tubos Accuspin de acordo com o protocolo dos fabricantes (Cat. No. A0561-100x 15 mL, Aldrich). Suspensões celulares contadas foram combinadas de tal forma que cada camundongo recebeu uma injeção de 1,5 x 106 PBMCs e 3 x 106 células tumorais em uma única injeção em bolus de 0,2 mL em PBS. A suspensão celular combinada foi lavada duas vezes com PBS frio, colocada em gelo e imediatamente injetada em camundongos preparados.

[00243] Para cada camundongo, um volume de 0,2 mL da suspensão celular combinada foi injetado por via subcutânea no flanco direito do animal e aplicada uma única dose (0,2 mL) do anticorpo contra 4-1BB ou anticorpo controle por injeção subcutânea no flanco esquerdo. O tumor foi medido duas vezes por semana com paquímetro Pressier pela duração dos experimentos e os pesos corporais foram registrados também. O volume tumoral foi determinado por meio do seguinte cálculo: comprimento x largura2 x 0,44= volume (mm3). Os camundongos eram retirados caso o volume tumoral atingisse 2000 mm3 ou se houvesse 20% de perda do peso pelo animal antes do término do experimento. No Dia 23, camundongos de todos os grupos foram sacrificados de acordo com procedimento delineados pela IACUC (Figura 6). A inibição percentual do crescimento tumoral foi medida no último dia do estudo e é calculada como 100-{1-(Tratado dia final/Controle dia final)}. Resultados semelhantes foram observados quando os tumores foram medidos no Dia 6 após a injeção, e os animais eram randomizados de acordo com o volume tumoral e recebiam uma única dose de mAb contra 4-1BB no Dia 7 após o implante. Para a maioria dos estudos, cada grupo continha 8 camundongos.

EXEMPLO 9: Avaliação in vivo da atividade de anticorpos contra 4-1BB em camundongos KNOCK IN para 4-1BB humano Geração de camundongos knock in para 4-1BB humano

[00244] A fim de abordar melhor as atividades moduladoras imunes de anticorpos monoclonais anti-4-1BB humano que não reagem de modo cruzado com H-1BB murino, um modelo de camundongos no qual o gene de 4-1BB de camundongo foi substituído pelo gene do 4-1BB humano foi gerado. Clones com cromossomo artificial bacteriano (BAC), portadores do fragmento genômico de 4-1BB humano ou murino, foram pedidos para a Invitrogen (Carlsbad, CA.) e utilizados para construir o vetor direcionado ao 4-1BB com base na tecnologia de recombinação Red/ET (Zhang, 1998, Nat Genet 20:123-128). Primeiramente, um vetor de recuperação foi montado na estrutura do pBR322 de tal modo que, quando aberto por digestão com Xba1, os dois braços de homologia quimérica murino/humano (400 bps cada) retomarão do clone BAC de 4-1BB humano os 19.994 bps da sequência genômica do 4-1BB humano, iniciando com o códon de partida de tradução ATG situado no éxon 2 e finalizando com o códon de parada TGA no éxon 8. Em segundo lugar, um cassete de expressão de neomicina sob o controle dos promotores PGK/EM7 foi montado e flanqueado por 100 pares de base (bps) de sequências homólogas às sequências do íntron 2 do gene do 4-1BB humano. Este cassete de expressão de neomicina foi então direcionado para o fragmento genômico recuperado do 4-1BB humano obtido na etapa 1. Finalmente, o fragmento genômico recuperado do 4- 1BB humano, portador do cassete de expressão de neomicina, foi direcionado para um clone BAC murino para substituir o gene do 4-1BB murino com o fragmento genômico modificado de 4-1BB humano, do códon de partida ATG ao códon de parada TGA.

[00245] Este vetor direcionado por BAC foi eletroporado em uma linhagem de células embrionárias de camundongo com antecedente C57BL/6NTAC (PRX-BL6N no 1, Primogenix, Laurie, MO.), seguindo um protocolo padrão, e clones sobreviventes à seleção com G418 (também conhecido como geneticina) foram rastreados por dois ensaios Taqman contra o íntron 2 e o éxon 8 do gene de 4-1BB murino para identificar clones que tivessem sido modificados no lócus do 4-1BB murino por um mecanismo de recombinação homóloga. Dos clones 116 ES rastreados, 7 clones mostraram ter perdido um alelo do lócus do 4-1BB murino (eficiência do direcionamento: 6%). A análise de cariótipos e a hibridização in situ (FISH) foram realizadas pelo Coriell Institute for Medical Research (Camden, N.J.). Para o clone LH15, 19 de 20 células eram 40 XY e para o LH80, 20 das 20 células eram 40XY. Nos dois clones, a FISH com um clone BAC murino portador do gene de 4-1BB como sonda mostrou um sinal de hibridização de 4-1BB em cada um do par de 4 cromossomos na região da banda E2. Nenhum sinal foi visto em quaisquer outras localizações.

[00246] Os clones LH15 e LH80 foram injetados em blastócitos da linhagem BALB/c e implantados os embriões nos camundongos fêmeas pseudoprenhes CD1 para carregá-los. Quimeras masculinas foram acasalados com os camundongos EIIa-cre com antecedente C57BL/6 para retirar o cassete de resistência à neomicina e camundongos homozigotos para o gene de 4-1BB humano foram utilizados no estudo.

Proliferação de linfócitos mediada por mAb agonista contra 4-1BB

[00247] A capacidade de mAbs agonistas contra 4-1BB para induzir a proliferação de linfócitos foi avaliada em camundongos knock in para 4-1BB. Camundongos knock in para 4-1BB receberam a dose por injeção intraperitoneal com 30 mg/kg de MOR7480.1 no Dia 0 do estudo (para animais com administração semanal, foram aplicadas injeções de mAb contra 4-1BB no Dia 0 e Dia). 24 horas antes da coleta de amostras, foi aplicada injeção por via intraperitoneal com 2 mg de BrdU nos animais. No dia indicado de pós-dose, amostras de sangue periférico foram coletadas por punção intracardíaca. As PBMC foram coradas com anticorpos contra CD3, CD4, CD8 e BrdU e avaliados por citometria de fluxo. Os resultados são apresentados no Painel A da Figura 7.

Eficácia antitumoral mediada por mAb agonista contra 4-1BB

[00248] A atividade antitumoral de MOR7480.1 foi avaliada em camundongos knock in para 4-1BB utilizando B16-OVA/luc, uma linhagem de melanoma que foi construída para expressar o antígeno do modelo de ovalbumina (OVA) e a luciferase (luc). Um milhão de células tumorais foram implantadas no flanco de camundongos knock in para 4- 1BB. Os animais foram randomizados com base em tamanho tumoral ou quando os tumores atingissem aproximadamente 50-100 mm3 (em geral 7-10 dias depois da inoculação do tumor) e receberam uma única injeção na dose indicada de mAb contra 4-1BB. O tamanho tumoral foi avaliado pela medição com paquímetro duas a três vezes por semana até o encerramento do estudo. Os resultados são apresentados no Painel B da Figura 7.

Claims

1. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos da região VH como apresentada na SEQ ID NO: 43 e uma sequência de aminoácidos da região VL como apresentada na SEQ ID NO: 45.

2. Anticorpo isolado que se liga ao 4-1BB humano, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada como apresentada na SEQ ID NO: 44 e compreende ainda uma sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 46, desde que o resíduo de lisina no C-terminal da SEQ ID NO: 44 esteja opcionalmente ausente.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o isotipo do anticorpo é selecionado a partir de lgG1 ou lgG2.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Combinação, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um veículo farnaceuticamente aceitável em combinação com um agente imunoterapêutico.

6. Combinação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o dito agente imunoterapêutico é rituximab.

7. Uso de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para a redução do crescimento de tumor em um indivíduo.

8. Uso de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para a redução de metástase em células tumorais em um indivíduo.

9. Uso de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer colorretal, linfoma não-Hodgkin, câncer de próstata e melanoma.

11. Uso da combinação, como definida na reivindicação 5 ou6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para a redução do crescimento de tumor em um indivíduo.

12. Uso da combinação, como definida na reivindicação 5 ou6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para a redução de metástase em células tumorais em um indivíduo.

13. Uso da combinação, como definida na reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.

14. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada de SEQ ID NO: 47, 48, 49 ou 50.

15. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 14.