PL228041B1 - Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierze transgeniczne. - Google Patents

Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierze transgeniczne.

Info

Publication number
PL228041B1
PL228041B1 PL413188A PL41318801A PL228041B1 PL 228041 B1 PL228041 B1 PL 228041B1 PL 413188 A PL413188 A PL 413188A PL 41318801 A PL41318801 A PL 41318801A PL 228041 B1 PL228041 B1 PL 228041B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
igf
amino acid
acid sequence
nucleic acid
Prior art date
Application number
PL413188A
Other languages
English (en)
Other versions
PL413188A1 (pl
Inventor
Bruce D. Cohen
Jean Beebe
Penelope E. Miller
James D. Moyer
Jose R. Corvalan
Michael Gallo
Original Assignee
Amgen Fremont Inc
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22987016&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL228041(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Fremont Inc, Pfizer filed Critical Amgen Fremont Inc
Publication of PL413188A1 publication Critical patent/PL413188A1/pl
Publication of PL228041B1 publication Critical patent/PL228041B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne.
Insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF-I, ang. insulin-like growth factor) jest polipeptydem o masie 7,5 kD, który krąży w osoczu w wysokim stężeniu i jest wykrywalny w większości tkanek. IGF-I stymuluje różnicowanie komórek i proliferację komórek i jest wymagany przez większość typów komórek ssaków do stałej proliferacji. Te typy komórek obejmują między innymi ludzkie diploidalne fibroblasty, komórki nabłonkowe, komórki mięśni gładkich, limfocyty T, komórki nerwowe, komórki szpiku, chondrocyty, osteoblasty i komórki macierzyste szpiku kostnego. Dla dokonania przeglądu szerokiej gamy typów komórek, dla których IGF-I/rcccptor IGF-I pośredniczy w proliferacji komórek patrz Goldring i wsp., Eukar. GeneExpress., 1: 31-326 (1991).
Pierwszym etapem w szlaku przekazywania sygnału prowadzącym do stymulowanej przez IGF-I proliferacji albo różnicowania komórkowego jest wiązanie się IGF-I lub IGF-II (albo insuliny w ponadfizjologicznych stężeniach) do receptora IGF-I. Receptor IGF-I składa się z dwóch typów podjednostek: podjednostki alfa (białko o wielkości 130-135 kD, które jest całkowicie zewnątrzkomórkowe i działa przy wiązaniu Uganda) i podjednostki beta (białko transbłonowe o wielkości 95 kD, z domenami transbłonową i cytoplazmatyczną). IGF-IR należy do rodziny receptorów czynników wzrostu o aktywności kinazy tyrozynowej (Ullrich i wsp., Cell 61: 203-212, 1990) i jest strukturalnie podobny do receptora insuliny (Ullrich i wsp., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). IGF-IR jest syntetyzowany wyjściowo jako jednołańcuchowy polipeptyd proreceptora, który ulega obróbce poprzez glikozylację, cięcie proteol ityczne i tworzenie wiązań kowalencyjnych, łącząc się w dojrzały heterodimer o wielkości 460 kD zawierający dwie podjednostki alfa i dwie podjednostki beta. Podjednostka(i) beta posiada aktywowaną ligandem aktywność kinazy tyrozynowej. Postuluje się udział tej aktywności w szlakach przekazywania sygnału, w których pośredniczy działanie Uganda, obejmujących o autofosforylację podjednostki beta i fosforylację substratów IGF-IR.
In vivo, poziomy IGF-I w surowicy są zależne od obecności przysadkowego hormonu wzrostu (GH, ang. growth hormone). Jakkolwiek głównym miejscem zależnej od GH syntezy IGF-I jest wątroba, ostatnie prace wskazują, że większość prawidłowych tkanek również wytwarza IGF-I. Wiele tkanek nowotworowych może również wytwarzać IGF-I. A zatem IGF-I może działać jako regulator prawidłowej i nieprawidłowej proliferacji komórek poprzez mechanizmy autowydzielnicze lub parawydzielnicze, jak również wewnątrzwydzielnicze. IGF-I i IGF-II wiążą się z białkami wiążącymi IGF (IGFBP, ang. IGF binding protein) in vivo. Dostępność wolnego IGF do oddziaływania z IGF-IR jest modulowana przez IGFBP. Dla dokonania przeglądu IGFBP i IGF-I patrz Grimberg i wsp., J. Cell. Physiol. 183: 1-9, 2000.
Istnieje wiele danych wskazujących na rolę IGF-I i/lub IGF-IR w utrzymywaniu się komórek nowotworowych in vitro i in vivo. Poziomy IGF-IR są podniesione w nowotworach płuc (Kaiser i wsp., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody i wsp., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley i wsp., Cancer Res., 50: 2511-2517, 1990), sutka (Poliak i wsp., Cancer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens i wsp., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen i wsp., Cancer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga i wsp., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423,1989), prostaty i okrężnicy (Remaole Bennet i wsp., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo i wsp., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). Rozregulowana ekspresja IGF-I w nabłonku prostaty prowadzi do nowotworzenia u transgenicznych myszy (DiGiovanni i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Ponadto, IGF-I wydaje się być autowydzielnicznym stymulatorem ludzkich glejaków (Sandberg-Nordqvist i wsp., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993), podczas gdy IGF-I stymulował wzrost włókniakomięsaków, u których miała miejsce nadekspresja IGF-IR (Butler i wsp., Cancer Res. 58: 3021-27, 1998). Co więcej, osobniki z „wysokimi prawidłowymi” poziomami IGF-I mają zwiększone ryzyko powszechnych nowotworów w porównaniu z osobnikami z poziomami IGF-I w „niskim prawidłowym” zakresie (Rosen i wsp., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999). Wiele z tych typów komórek nowotworowych odpowiada na IGF-I sygnałem proliferacyjnym w hodowli (Nakanishi i wsp., J. Clin. Invest. 82: 354 359, 1988; Freed i wsp., J. Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989) i opublikowano autowydzielnicze lub parawydzielnicze pętle proliferacji in vivo (LeRoith i wsp., Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995; Yee i wsp., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Dla dokonania przeglądu roli oddziaływania receptora IGFI/IGF-I we wzroście rozmaitych ludzkich nowotworów, patrz Macaulay, Br. J. Cancer, 65: 311-320, 1992.
PL 228 041 B1
Podwyższone poziomy IGF-I koreluje się również z kilkoma patologicznymi stanami nienowotworowymi, włączając w to akromegalię i gigantyzm (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 65: 343, 347-349, 1998), podczas gdy nieprawidłową funkcję receptora IGF-EIGF-I postuluje się w łuszczycy (Wraight i wsp., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), miażdżycy tętnic i nawrocie zawężenia przez mięśnie gładkie naczyń krwionośnych po plastyce naczynia (Bayes-Genis i wsp., Circ. Res. 86: 125-130, 2000). Zwiększone poziomy IGF-I mogą być również problemem w cukrzycy lub jej komplikacjach, takich jak proliferacja mikronaczyniowa (Smith i wsp., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Zmniejszone poziomy IGF-I, które występują między innymi w przypadkach, kiedy poziomy GH w surowicy są zmniejszone albo kiedy ma miejsce niewrażliwość albo odporność na GH, mają związek z chorobami, takimi jak niski wzrost (Faron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), neuropatia, zmniejszenie masy mięśni i osteoporoza (Rosen i wsp., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
Stosując antysensowne wektory ekspresyjne albo antysensowe oligonukleotydy wobec RNA IGF-IR pokazano, że przeszkadzanie w działaniu IGF-IR prowadzi do zahamowania wzrostu komórek, w którym pośredniczy IGF-I lub IGF-II (patrz np. Wraight i wsp., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). Strategia antysensowna przyniosła również sukces w hamowaniu proliferacji komórek w kilku prawidłowych typach komórek i ludzkich liniach komórek nowotworowych. Wzrost można również hamować poprzez zastosowanie peptydowych analogów IGF-I (Pietrzkowski i wsp., Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 1992 oraz Pietrzkowski i wsp., Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992) lub wektora do ekspresji antysensownego RNA wobec RNA IGF-I (Trojan i wsp., Science 259: 94-97, 1992). Ponadto, przeciwciała wobec IGF-IR (Arteaga i wsp., Breast Cane. Res. Treatm., 22: 101-106, 1992 oraz Kalebic i wsp., Cancer Res. 54: 5531-5534, 1994) i dominujące negatywne mutanty IGF-IR (Prager i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 2181-2185, 1994; Li i wsp., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 oraz Jiang i wsp., Oncogene 18: 6071-77, 1999) mogą odwracać transformowany fenotyp, hamować nowotworzenie i indukować utratę fenotypu przerzutowania.
IGF-I jest również ważny przy regulacji apoptozy. Apoptoza, która jest programowaną śmiercią komórkową, uczestniczy w różnych procesach rozwojowych, włączając w to dojrzewanie układu immunologicznego i nerwowego. Poza jej rolą w rozwoju, uważa się apoptozę za ważną straż komórkową przeciw nowotworzeniu (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991; Lane, Nature 362: 786-787, 1993). Zahamowanie programu apoptotycznego przez rozmaite uszkodzenia genetyczne może przyczyniać się do rozwoju i postępów nowotworów.
IGF-I chroni przed apoptozą indukowaną przez brak cytokin w zależnych od IL-3 komórkach krwiotwórczych (Rodriguez-Tarduchy, G. i wsp., J. Immunol. 149: 535-540, 1992) i przez brak surowicy w komórkach Rat-l/mycER (Harrington, E., i wsp., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). Funkcja przeciwapoptotyczna IGF-I jest ważnym podecyzyjnym stadium cyklu komórkowego, a także w komórkach z zablokowanym przez etopozyd lub tymidynę cyklem komórkowym. Wykazanie, że przeżywalność kierowanych przez c-myc fibroblastów jest zależna od IGF-I sugeruje, że IGF-IR odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu się komórek nowotworowych poprzez specyficzne zahamowanie apoptozy, rolę odrębną od efektów proliferacyjnych IGF-I lub IGF-IR. Byłaby to rola podobna do tej, którą, jak się uważa, odgrywają inne geny przeciwapoptotyczne, takie jak bcl-2, przy promowaniu przeżywania nowotworu (McDonnell i wsp., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry i wsp., Nature 348: 334-336, 1990).
Ochronne efekty IGF-I na apoptozę zależą od występowania na komórkach IGF-IR w celu oddziaływania z IGF-I (Resnicoff i wsp., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Poparcia dla przeciwapoptotycznej funkcji IGF-IR przy utrzymywaniu się komórek nowotworowych dostarczyły również badania z zastosowaniem antysensownych nukleotydów wobec IGF-IR, które zidentyfikowały związek ilościowy pomiędzy poziomami IGF-IR, stopniem apoptozy i potencjałem rakotwórczym szczurzych syngenicznych nowotworów (Rescinoff i wsp., Cancer Res. 55: 3739-3741, 1995). Stwierdzono, że nadekspresja IGF-IR chroni komórki nowotworowe in vitro przed indukowaną etopozydem apoptozą (Sell i wsp., Cancer Res. 55: 303-306, 1995), a nawet bardziej dramatycznie, że zmniejszenie poziomów IGF-IR poniżej poziomów typu dzikiego powoduje masową apoptozę komórek nowotworowych in vivo (Resnicoff i wsp., Cancer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Potencjalne strategie indukowania apoptozy albo hamowania proliferacji komórek związanej ze zwiększonym poziomem IGF-I, zwiększonym poziomem IGF-11 i/lub zwiększonym poziomem receptora IGF-IR obejmują obniżenie poziomów IGF-I lub IGF-II albo zapobieganie wiązaniu się IGF-I do IGF-IR. Przykładowo, analog somatostatyny o długotrwałym działaniu, oktreotydu, został zastosowany do zmniejszenia syntezy i/lub wydzielania IGF. Rozpuszczalny IGF-IR użyto do zaindukowania apoptozy w komórkach nowotworowych in vivo i zahamowania nowotworzenia w zwierzęcym układzie doświadczalnym
PL 228 041 B1 (D'Ambrosio i wsp., Cancer Res. 56: 4013-20, 1996). Ponadto, antysensowne oligonukleotydy IGF-IR, analogi peptydowe IGF-I oraz przeciwciała wobec IGF-IR zastosowano w celu zmniejszenia ekspresji IGF-I lub IGF-IR (patrz wyżej). Jednakże, żaden z tych związków nie jest odpowiedni do długotrwałego podawania pacjentom-ludziom. Ponadto, jakkolwiek był podawany pacjentom do leczenia niskiego wzrostu, osteoporozy, zmniejszonej masy mięśniowej, neuropatii lub cukrzycy, wiązanie się IGF-I do IGFBP czyniło często leczenie IGF-I trudnym albo nieskutecznym.
A zatem, w świetle roli, którą IGF-I i IGF-IR odgrywają w takich chorobach jak nowotwór i innych chorobach, w których ma miejsce proliferacja przy nadekspresji IGF-I i/lub IGF-IR oraz roli, którą ma zbyt mało IGF-I i IGF-IR w chorobach, takich jak niski wzrost i wątłość, przy niedostatecznej ekspresji IGF-I i/lub IGF-IR, byłoby pożądane wytworzenie przeciwciał wobec IGF-IR, które można by użyć aby hamować albo stymulować IGF-IR. Jakkolwiek istnieją doniesienia o znalezieniu przeciwciał anty-IGF-IR u niektórych pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, żadne z tych przeciwciał nie zostało oczyszczone i dla żadnego nie pokazano przydatności do hamowania aktywności IGF-I dla procedur diagnostycznych albo klinicznych. Patrz, np. Thompson i wsp., Pediat. Res. 32: 455-459, 1988; Tappy i wsp., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; Weightman i wsp., Autoimmunity 16: 251-257, 1993; Drexhage i wsp., Nether. J. of Med. 45: 285-293, 1994. A zatem byłoby pożądane otrzymanie ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR o wysokim powinowactwie, które można by użyć do leczenia chorób u ludzi.
Streszczenie wynalazku
W pierwszym aspekcie wynalazek dotyczy ludzkiego przeciwciała monoklonalnego albo jego części wiążącej antygen, które swoiście wiążą się z receptorem insulinopodobnego czynnika wzrostu I (IGF-IR), przy czym przeciwciało zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki, a sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego są odpowiednio wybrane z grupy składającej się z:
a) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790); oraz
b) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 12 oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 10.
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, której sekwencja obejmuje nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen Vk A30, A27, lub O12 linii zarodkowej.
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku obejmuje łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10 albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej.
Korzystniej, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku obejmuje o łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID 10.
Również korzystnie, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, której sekwencja zawiera nie więcej niż osiem zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen Vh DP47, DP35, DP71 lub VIV-4 linii zarodkowej.
Korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku obejmuje łańcuch ciężki zawierający sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej.
Korzystniej, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku obejmuje łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12.
Również korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki obejmują odpowiednio sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790).
W korzystnej postaci przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku jest:
a) cząsteczką immunoglobuliny G (IgG), IgM, IgE, IgA lub IgD albo jest z niej otrzymane; lub
b) fragmentem Fab, fragmentem F(ab')2, fragmentem Fv, przeciwciałem jednołańcuchowym lub przeciwciałem bispecyficznym.
PL 228 041 B1
Również w korzystnej postaci wykonania, przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790), lub przeciwciałem o takich samych sekwencjach aminokwasowych, jak wybrane przeciwciało.
Korzystnie przeciwciało według wynalazku obejmuje sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 oraz CDR3 z SEK NR ID: 12, przy czym przeciwciało obejmuje ponadto sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEK NR ID: 10. Korzystniej łańcuch ciężki zawiera SEK NR ID: 12 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 konserwatywnymi substytucjami aminokwasowym, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 10 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 substytucjami aminokwasowymi. Najkorzystniej sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego zawiera SEK NR ID: 12, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 10.
Ponadto korzystnie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku ma co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) współzawodniczy o wiązanie z IGF-IR z przeciwciałem 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790);
b) wiąże się z tym samym epitopem IGF-IR, co przeciwciało 2.14.3;
c) wiąże się z tym samym antygenem, jak ten wiązany przez przeciwciało 2.14.3;
d) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą KD jak przeciwciało 2.14.3;
e) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą szybkością dysocjacji jak przeciwciało 2.14.3;
f) współzawodniczy o wiązanie z IGF-IR z przeciwciałem, którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio;
g) wiąże się z tym samym epitopem IGF-IR, co przeciwciało którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio
h) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą KD, co przeciwciało którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio;
i) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą szybkością dysocjacji jak przeciwciało, którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio.
Korzystniej przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według wynalazku wykazują wszystkie właściwości.
Ponadto, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku ma co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) nie wiąże się z IGF-IR myszy, szczura, psa lub królika;
b) wiąże się z IGF-IR makaka z gatunku Macaca fascicularis albo rezusa, ale nie z IGF-IR marmozety;
c) hamuje wiązanie IGF-I albo IGF-II z IGF-IR;
d) wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż 2 o selektywność wobec receptora insuliny;
e) hamuje wzrost nowotworu in vivo;
f) powoduje zniknięcie IGF-IR z powierzchni komórki, podczas inkubacji z komórką wyrażającą IGF-IR;
g) hamuje indukowaną przez IGF-IR fosforylację tyrozyny;
h) wiąże się z IGF-IR z KD wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej; oraz
i) wykazuje Koff dla IGF-IR wynoszącą 10- s- lub mniejszą.
Korzystniej przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku wykazują wszystkie te właściwości. Najkorzystniej przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku hamuje wiązanie IGF-I lub IGF-II do IGF-IR, wiąże się do IGF-IR z KD wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej i wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny.
W korzystnej postaci wykonania, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według wynalazku hamuje wiązanie IGF-IR z IGF-I lub IGF-II z IC50 wynoszącą 100 nM lub mniej.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznej zawierającej przeciwciało albo jego część według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie kompozycja
PL 228 041 B1 farmaceutyczna według wynalazku zawiera ponadto czynnik przeciwnowotworowy, chemioterapeutyczny, antyangiogenny albo anty-rakowy.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania przeciwciała według wynalazku, który obejmuje etapy:
a) immunizowania ssaka innego niż człowiek immunogenem zawierającym IGF-IR, przy czym ssak ma zdolność wyrażania ludzkich przeciwciał w swoich komórkach B;
b) izolowania komórek B ze ssaka;
c) przeszukiwania takich komórek B albo linii komórkowych od nich pochodzących w celu zidentyfikowania linii komórkowej, która wytwarza przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR;
d) hodowania linii komórkowej, która wyraża przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR; oraz
e) izolowania przeciwciał, które wiążą się z IGF-IR z linii komórkowej.
Wynalazek dotyczy również wyizolowanej linii komórkowej wytwarzającej przeciwciało według wynalazku. Korzystnie linia komórkowa według wynalazku wytwarza przeciwciało 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790), albo przeciwciało o takiej samej sekwencji aminokwasowej jak wybrane przeciwciało.
W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania przeciwciała albo jego części wiążącej antygen według wynalazku do wytwarzania leku do diagnozowania obecności albo umiejscowienia nowotworu wyrażającego IGF-IR u osobnika potrzebującego takiej diagnostyki.
W alternatywnym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania przeciwciała albo jego części wiążącej antygen według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u człowieka lub do leczenia zaburzenia hiperproliferacyjnego u pacjenta. Korzystnie leczenie takie obejmuje etap podawania środka przeciwnowotworowego, anty-rakowego, antyangiogennego albo chemio terapeutycznego.
Wynalazek dotyczy również wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, zawierającej sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo s ekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała według wynalazku. Korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen przeciwciała 2.14.3;
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego, która zawiera sekwencje aminokwasową trzech CDR z SEK NR ID: 12;
d) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12; oraz
e) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 11;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 28.
Również korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha lekkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen przeciwciała 2.14.3;
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego, która zawiera sekwencje aminokwasową trzech CDR z SEK NR ID: 10;
d) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10; oraz
e) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 9;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 26.
PL 228 041 B1
W dalszym aspekcie wynalazek dostarcza wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, przy czym wektor ten zawiera ewentualnie sekwencję kontrolującą ekspresję połączoną funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego.
Wynalazek dostarcza również komórkę gospodarza zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała według wynalazku.
Dodatkowo wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania przeciwciała anty-IGF-IR albo jego części wiążącej antygen, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza albo linii komórkowej według wynalazku w odpowiednich warunkach i odzyskiwanie takiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen.
W innym aspekcie wynalazek dotyczy transgenicznego zwierzęcia innego niż człowiek, obejmującego sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała według wynalazku, przy czym zwierzę to wyraża ten kwas nukleinowy.
Wynalazek dotyczy również zastosowania jednej lub więcej izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia osobnika, przy czym cząsteczka lub cząsteczki izolowanego kwasu nukleinowego są wybrane z grupy składającej się z:
a) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała według wynalazku;
b) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała według wynalazku; oraz
c) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen oraz łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała według wynalazku;
d) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego z obu (a) i (b).
W dodatkowym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania medyczne przeciwciała albo jego części wiążącej antygen według wynalazku, jak również wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen, wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, lub wyizolowanej cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen jak i łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, przeciwciała lub jego części według wynalazku.
Krótki opis rysunków
Fig. 1A-1C przedstawiają dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych łańcucha lekkiego z sześciu ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR wzajemnie do siebie i do sekwencji z linii zarodkowej. Fig. 1A pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych łańcucha lekkiego (VL) przeciwciał 2.12.1 (SEK 20 NR ID: 1), 2.13.2 (SEK NR ID: 5), 2.14.3 (SEK NR ID: 9) i 4.9.2 (SEK NR ID: 13) wzajemnie do siebie i do sekwencji Vk z linii zarodkowej A30 (SEK NR ID: 39). Fig. 1B pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VL z przeciwciała 4.17.3 (SEK NR ID: 17) do sekwencji Vk z linii zarodkowej 012 (SEK NR ID: 41). Fig. 1C pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VL z przeciwciała 6.1.1 (SEK NR ID: 21) do sekwencji Vk z linii zarodkowej A27 (SEK NR ID: 37). Dopasowanie pokazuje również regiony CDR z VL każdego przeciwciała. Sekwencje najwyższej zgodności dla fig. 1A-1C są pokazane w SEK NR ID: 53-55, odpowiednio.
Fig. 2A-2D przedstawiają dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych łańcucha ciężkiego z sześciu ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR wzajemnie do siebie i do sekwencji z linii zarodkowej. Fig. 2A pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VH przeciwciała 2.12.1BRIEF DESCRIPTI (SEK NR ID: 3) do sekwencji VH z linii zarodkowej DP-35 (SEK NR ID: 29). Fig. 2B pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VH przeciwciała 2.14.3 (SEK NR ID: 11) do sekwencji z linii zarodkowej VIV-4/4.35 (SEK NR ID: 43). Fig. 2C-1 i 2C-2 pokazują dopasowanie sekwencji nukleotydowych VH przeciwciał 2.13.2 (SEK NR ID: 7), 4.9.2 (SEK NR ID: 15) i 6.1.1 (SEK NR ID: 23) wzajemnie do siebie i do sekwencji VH z linii zarodkowej DP-47 (SEK NR ID: 31). Fig. 2D pokazuje dopasowanie sekwencji nukleotydowej VH przeciwciała 4.17.3 (SEK NR ID: 19) do sekwencji VH z linii zarodkowej DP-71 (SEK NR ID: 35). Dopasowanie pokazuje również regiony CDR przeciwciał. Sekwencje najwyższej zgodności dla Fig. 2A-2D są pokazane w SEK NR ID: 56-59, odpowiednio.
Fig. 3 pokazuje, że przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2, 4.9.2 i 2.12.1 hamują wiązanie się IGF-I do komórek 3T3-IGF-IR.
PL 228 041 B1
Fig. 4 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 4.9.2 hamuje indukowaną przez IGF-I fosforylację tyrozyny receptora (górna część) i indukuje obniżenie poziomu IGF-IR na powierzchni komórek (dolna część).
Fig. 5 pokazuje, że przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i 4.9.2 zmniejszają sygnał z fosfotyrozyny IGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR.
Fig. 6 pokazuje, że przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i 4.9.2 zmniejszają poziom IGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR.
Fig. 7 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost nowotworu 3T3-IGF-IR in vivo, samo (lewa część) albo w połączeniu z adriamycyną (prawa część).
Fig. 8 pokazuje związek pomiędzy poziomami surowicy przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i obniżeniem poziomu IGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR.
Fig. 9 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu 3T3-IGF-IR in vivo, same albo w połączeniu z adriamycyną.
Fig. 10 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost dużego nowotworu in vivo w połączeniu z adriamycyną.
Fig. 11 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost nowotworu Colo 205 in vivo, samo albo w połączeniu z 5-deoksyurydyną (5-FU).
Fig. 12 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu Colo 205 in vivo, same albo w połączeniu z 5-FU.
Fig. 13 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu MCF-7 in vivo, same albo w połączeniu z taksolem.
Fig. 14 pokazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR 2.13.2 hamuje wzrost nowotworu MCF-7 in vivo, samo (lewa część) albo w połączeniu z adriamycyną (prawa część).
Fig. 15 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu MCF-7 in vivo, same albo w połączeniu z tamoksyfenem.
Fig. 16 pokazuje, że wielokrotne dawki przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 hamują wzrost nowotworu A431 in vivo same albo w połączeniu z inhibitorem kinazy tyrozynowej receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF-R) CP-358,774.
Fig. 17 przedstawia ocenę farmakokinetyczną pojedynczego dożylnego 15 wstrzyknięcia przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 makakom z gatunku Macaca fascicularis.
Fig. 18 pokazuje, że połączenie przeciwciała anty-IGF-IR 2.13.2 i adriamycyny zwiększa obniżenie poziomu IGF-IR w nowotworach 3T3-IGF-IR in vivo.
Fig. 19A przedstawia liczbę mutacji w różnych regionach łańcuchów lekkich i ciężkich 2.13.2 i 2.12.1 w porównaniu do sekwencji z linii zarodkowej.
Fig. 19A-D przedstawiają dopasowanie sekwencji aminokwasowych łańcuchów lekkich i ciężkich przeciwciał 2.13.2 i 2.12.1 do sekwencji z linii zarodkowej, z których pochodzą. Fig. 19B przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.13.2 (SEK NR ID: 45) z sekwencją linii zarodkowej DP-47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEK NR ID: 46). Fig. 19C pokazuje dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.13.2 (SEK NR ID: 47) do sekwencji z linii zarodkowej A30/Jk2 (SEK NR ID: 48). Fig. 19D przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.12.1 (SEK NR ID: 49) do sekwencji z linii DP-35 (3-ll)/D3-3/JH6 (SEK NR ID: 50). Fig. 19E przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.12.1 (SEK NR ID: 51) do sekwencji z linii zarodkowej A30/Jk2 (SEK NR ID: 52). Na Fig. 19B-E, sekwencje sygnałowe są zapisane kursywą, CDR są podkreślone, domeny zmienne są wytłuszczone, mutacje w regionie zrębowym (FR) są zaznaczone znakiem plus („+”) powyżej reszty aminokwasowej, a mutacje w CDR są zaznaczone gwiazdką powyżej reszty aminokwasowej.
Szczegółowy opis wynalazku
Definicje i ogólne techniki
O ile nie zdefiniowano tu inaczej, terminy naukowe i techniczne użyte w niniejszym zgłoszeniu będą miały znaczenia powszechnie zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie. Ponadto, o ile nie wymaga tego kontekst, terminy użyte w liczbie pojedynczej będą obejmować liczbę mnogą, a użyte w liczbie mnogiej będą obejmować liczbę pojedynczą. Ogólnie, nazewnictwo zastosowane w powiązaniu z oraz opisane tu techniki hodowli komórek i tkanek, biologii molekularnej, immunologii, mikr obiologii, genetyki i chemii białek i kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacji są tymi, które są dobrze znane i powszechnie stosowane w tej dziedzinie. Sposoby i techniki według niniejszego wynalazku przeprowadza się generalnie zgodnie ze zwykłymi metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie i jak
PL 228 041 B1 opisano w wielu ogólnych i bardziej szczegółowych odniesieniach, cytowanych i dyskutowanych w niniejszym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej. Patrz np. Sambrook i wsp. Molecular cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) i Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) oraz Harlow i Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990), które są tu włączone jako odniesienie. Reakcje enzymatyczne oraz techniki oczyszczania przeprowadzane są zgodnie z opisem producenta, jak to się zwykle czyni w tej dziedzinie albo jak tu opisano. Nazewnictwo zastosowane w powiązaniu z oraz opisane tu techniki i procedury laboratoryjne chemii analitycznej, chemii syntezy organicznej, chemii medycznej i farmaceutycznej są dobrze znane i powszechnie stosowane w tej dziedzinie. Standardowe techniki zastosowano do syntez chemicznych, analiz chemicznych, przygotowywania, wytwarzania i dostarczania farmaceutyków oraz leczenia pacjentów.
Następujące terminy, o ile nie zaznaczono inaczej, powinny być rozumiane w następujących znaczeniach:
Termin „polipeptyd” obejmuje białka natywne albo sztuczne, fragmenty białkowe albo analogi polipeptydowe sekwencji białkowej. Polipeptyd może być monomeryczny albo polimeryczny.
Termin „wyizolowane białko” albo „wyizolowany polipeptyd” to białko albo polipeptyd, który wskutek swego pochodzenia lub źródła, z którego pochodzi (1) nie jest 10 związany ze związanymi z nim naturalnie składnikami, które towarzyszą mu w jego stanie natywnym, (2) jest wolny od innych białek z tego samego gatunku, (3) jest wyrażany przez komórkę innego gatunku lub (4) nie występuje w naturze. A zatem polipeptyd, który jest zsyntetyzowany chemicznie albo zsyntetyzowany w systemie komórkowym różnym od komórki, z której naturalnie pochodzi, będzie „wyizolowany” w odniesieniu do związanych z nim naturalnie składników. Białko można uczynić zasadniczo wolnym od związanych z nim naturalnie składników poprzez izolację, przy zastosowaniu technik oczyszczania białka dobrze znanych w tej dziedzinie.
Białko albo polipeptyd jest „zasadniczo czysty”, zasadniczo homogenny” albo „zasadniczo oczyszczony” kiedy przynajmniej około 60 do 75% próbki stanowi pojedynczy rodzaj polipeptydu. Polipeptyd może być monomeryczny albo polimeryczny. Zasadniczo czysty polipeptyd albo białko będzie zawierało typowo około 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% wag./wag. próbki białkowej, zwykle około 95%, a korzystniej, będzie czysty w 99%. Czystość albo homogenność białka można wykazać wieloma sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie, takimi jak elektroforeza próbki białkowej w żelu poliakryloamidowym, a następnie wizualizacja pojedynczego prążka polipeptydowego po wybarwieniu żelu barwnikiem dobrze znanym w tej dziedzinie. Dla pewnych celów można dostarczyć lepszego rozdziału poprzez zastosowanie HPLC albo innych sposobów znanych w tej dziedzinie.
Stosowany tu termin „fragment polipeptydowy” odnosi się do polipeptydu, który ma delecję na końcu aminokwasowym i/lub karboksylowym, ale gdzie pozostała sekwencja aminokwasowa jest ide ntyczna z odpowiednimi pozycjami w sekwencji występującej naturalnie. Fragmenty zwykle mają długość przynajmniej 5, 6, 8 lub 10 aminokwasów, korzystnie długość przynajmniej 14 aminokwasów, bardziej korzystnie długość przynajmniej 20 aminokwasów, zazwyczaj długość przynajmniej 50 am inokwasów, a jeszcze korzystniej długość przynajmniej 70, 80, 90, 100, 150 albo 200 aminokwasów.
Stosowany tu termin „analog peptydowy” dotyczy polipeptydu, który składa się z odcinka przynajmniej 25 aminokwasów, który wykazuje zasadniczą identyczność z częścią 10 sekwencji aminokwasowej i który ma przynajmniej jedną z następujących właściwości: (1) specyficzne wiązanie do IGF-IR w odpowiednich warunkach wiązania, (2) zdolność do blokowania wiązania się IGF-I lub IGF-II z IGF-IR lub (3) zdolność do zmniejszania ekspresji IGF-IR na powierzchni komórek albo fosforylacji tyrozyny in vitro lub in vivo. Zazwyczaj analogi polipeptydowe zawierają konserwatywne podstawienie aminokwasowe (albo addycję lub delecję) w odniesieniu do sekwencji występującej naturalnie. Analogi zazwyczaj mają długość przynajmniej 20 aminokwasów, korzystnie długość przynajmniej 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 lub 200 aminokwasów albo więcej i często mogą być tak długie jak polipeptyd występujący naturalnie.
Korzystne podstawienia aminokwasowe to takie, które: (1) zmniejszają podatność na proteolizę, (2) zmniejszają podatność na utlenianie, (3) zmieniają powinowactwo wiązania do tworzenia kompleksów białkowych, (4) zmieniają powinowactwa wiązania i (4) nadają albo modyfikują inne właściwości fizykochemiczne albo funkcjonalne takich analogów. Analogi mogą obejmować różne muteiny s ekwencji inne niż występująca naturalnie sekwencja peptydowa. Przykładowo, można dokonać pojedynczych albo wielokrotnych podstawień aminokwasowych (korzystnie podstawień konserwowanych
PL 228 041 B1 aminokwasów) w naturalnie występującej sekwencji (korzystnie w części polipeptydu poza domeną(ami) tworzącą międzycząsteczkowe miejsca styku. Konserwatywne podstawienia nie powinny zasadniczo zmieniać właściwości strukturalnych sekwencji rodzicielskiej (np. zastępujący aminokwas nie powinien mieć tendencji do niszczenia helisy, która występuje w sekwencji rodzicielskiej albo niszczyć innych typów struktury drugorzędowej, która charakteryzuje sekwencję rodzicielską). Przykłady znanych w tej dziedzinie drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur polipeptydowych są opisane w Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, wyd., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, wyd., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)) oraz Thornton i wsp. Nature 354: 105 (1991), które są tu włączone jako odniesienie.
Analogi niepeptydowe są powszechnie używane w przemyśle farmaceutycznym jako leki o właściwościach analogicznych do właściwości peptydu będącego ich wzorem. Ten rodzaj niepeptydowych związków nazywa się „mimetykami peptydów” lub „peptydomimetykami”. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber i Freidinger TINS str. 392 (1985) oraz Evans i wsp. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), które są tu włączone jako odniesienie. Takie związki projektuje się często przy pomocy komputerowego modelowania cząsteczek. Mimetyki peptydów, które są strukturalnie podobne do przydatnych leczniczo peptydów, można zastosować w celu uzyskania ekwiwalentnego efektu profilaktycznego lub terapeutycznego. Ogólnie, peptydomimetyki są strukturalnie podobne do wzorcowego peptydu (tj. polipeptydu, który ma pożądaną właściwość biochemiczną lub aktywność farm akologiczną), takiego jak ludzkie przeciwciało, ale mają jedno lub więcej wiązań peptydowych fakultatywnie zastąpionych wiązaniem wybranym z grupy składającej się z -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- oraz -CH2SO-, przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Do wytworzenia bardziej stabilnego peptydu można wykorzystać systematyczne podstawianie jednego lub więcej aminokwasu sekwencji najwyższej zgodności D-aminokwasem tego samego rodzaju (np. D-lizyna w miejsce L-lizyny). Ponadto, można wytworzyć peptydy związane wewnętrznie zawierające sekwencję najwyższej zgodności albo zasadniczo identyczny wariant sekwencji najwyższej zgodności metodami znanymi w tej dziedzinie (Rizo i Gierasch Ann Rev. Biochem. 61:387 (1997), włączony tu jako odniesienie); przykładowo, dodając wewnętrzne reszty cysternowe, pozwal ające na tworzenie mostków dwusiarczkowych, które cyklizują peptyd.
„Immunoglobulina” to cząsteczka tetrameryczna. W naturalnie występującej immunoglobulinie każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, gdzie każda para ma jeden łańcuch „lekki” (około 25 kDa) i jeden łańcuch „ciężki” (około 50-70 kDa). Część aminokońcowa każdego łańcucha zawiera region zmienny złożony ze 100 do 110 lub więcej aminokwasów odpowiedzialnych przede wszystkim za rozpoznanie antygenu. Część karboksy-końcowa każdego łańcucha definiuje region stały odpowiedzialny głównie za funkcję efektorową. Ludzkie łańcuchy lekkie są sklasyfikowane jako łańcuchy κ i λ. Łańcuchy ciężkie są sklasyfikowane jako μ, Δ, γ, α lub ε i definiują izotyp przeciwciała jako odpowiednio, IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. W obrębie łańcuchów lekkiego i ciężkiego, regiony zmienne i stałe są połączone przez region „J” składający się z około 12 lub więcej aminokwasów, z łańcuchem ciężkim obejmującym również region „D” składający się z około 10 lub więcej aminokwasów. Patrz ogólnie, Fundamental Immunology Roz. 7 (Paul, W., Wyd., wyd. 2. Raven Press, N. Y. (1989)) (włączone tu w całości jako odniesienie dla wszelkich celów). Regiony zmienne każdej pary łańcuchów lekkiego/ciężkiego tworzą miejsce wiązania przeciwciała, a zatem nienaruszona immunoglobulina ma dwa miejsca wiązania.
Łańcuchy immunoglobulin mają taką samą ogólną strukturę stosunkowo konserwowanych regionów zrębowych (FR) połączonych trzema regionami hiperzmiennymi, zwanymi również regionami determinującymi dopasowanie lub CDR. CDR z dwóch łańcuchów z każdej pary są odpowiednio umiejscowione dzięki regionom zrębowym, co umożliwia wiązanie swoistego epitopu. Od końca N do końca C, obydwa łańcuchy, lekki i ciężki zawierają domeny FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Aminokwasy przypisuje się do odpowiedniej domeny zgodnie z definicją z Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) albo Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia i wsp. Nature 342: 878-883 (1989).
„Przeciwciało” odnosi się do nienaruszonej immunoglobuliny lub jej części wiążącej antygen, która współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem w swoistym wiązaniu. Fragmenty wiążące antygen można wytworzyć technikami rekombinowania DNA lub przez chemiczne albo enzymatyczne cięcie nienaruszonych przeciwciał. Fragmenty wiążące antygen obejmują między innymi Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb oraz fragmenty regionów determinujących dopasowanie (CDR), przeciwciała jednoPL 228 041 B1 łańcuchowe (scFv), przeciwciała chimerowe, diciała i polipeptydy, które zawierają co najmniej część immunoglobuliny, która jest wystarczająca dla nadania polipeptydowi specyficzności wiązania antygenu.
W tym zgłoszeniu przeciwciało, które jest określane jako np. 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1, to przeciwciało, które pochodzi z hybrydomy o tej samej nazwie. Przykładowo, przeciwciało 2.12.1 pochodzi z hybrydomy 2.12.1.
Fragment Fab to monowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH I; fragment F(ab')2 to dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkami dwusiarczkowymi w regionie zawiasowym; fragment Fd składa się z domen VH i CH1; fragment Fv składa się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, a fragment dAb (Ward i wsp., Nature 341: 544-546, 1989) składa się z domeny VH.
Przeciwciało jednołańcuchowe (scFv) to przeciwciało, w którym regiony VL i VH są sparowane tworząc cząsteczkę monowartościową za pośrednictwem syntetycznego łącznika, który umożliwia wytworzenie go w postaci pojedynczego łańcucha białkowego (Bird i wsp., Science 242: 423-426, 1988 oraz Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Diciała to dwuwartościowe, bispecyficzne przeciwciała, w których regiony VL i VH są wyrażane jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy, ale przy użyciu łącznika, który jest za krótki aby umożliwić parowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, forsując w ten sposób parowanie komplementarnych domen z innego łańcucha i tworząc dwa miejsca wiązania antygenu (patrz np., Holliger, P., i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993 oraz Poljak, R. J., i wsp., Structure 2: 1121-1123, 1994). Do cząsteczki może być wstawiony kowalencyjnie albo niekowalencyjnie jeden albo więcej CDR, co czyni je immunoadhezyną. Immunoadhezyna może zawierać CDR(y) jako część większego łańcucha polipeptydowego, może wiązać kowalencyjnie CDR(y) z innym łańcuchem polipeptydowym albo może mieć wstawiony CDR(y) niekowalencyjnie. CDR umożliwiają immunoadhezynie swoiste wiązanie z konkretnym antygenem będącym przedmiotem zainteresowania.
Przeciwciało może mieć jedno albo więcej miejsc wiążących. Jeżeli występuje więcej niż jedno miejsce wiążące, miejsca więżące mogą być identyczne względem siebie albo mogą być równoważne. Przykładowo, naturalnie występująca immunoglobulina ma dwa identyczne miejsca wiążące, przeciwciało jednołańcuchowe albo fragment Fab ma jedno miejsce wiążące, podczas gdy przeciwciało „bispecyficzne” lub „bifunkcyjne” ma dwa miejsca wiążące.
„Przeciwciało wyizolowane” to przeciwciało, które (1) nie jest związane ze składnikami związanymi z nim naturalnie, które towarzyszą mu w jego stanie natywnym, (2) jest wolne od innych białek z tego samego gatunku, (3) jest wyrażane przez komórkę innego gatunku lub (4) nie występuje w naturze. Przykłady wyizolowanych przeciwciał obejmują przeciwciało anty-IGF-IR, które zostało oczyszczone przez powinowactwo z użyciem IGF-IR, przeciwciało anty-IGF-IR, które zostało zsyntetyzowane przez hybrydomę albo inną linię komórkową in vitro oraz ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR pochodzące z myszy transgenicznej.
Termin „przeciwciało ludzkie” obejmuje wszystkie przeciwciała, które mają jeden albo więcej r egionów zmiennych i stałych pochodzących z sekwencji ludzkich immunoglobulin. W korzystnym wykonaniu wszystkie domeny zmienne i stałe pochodzą z sekwencji ludzkich immunoglobulin (całkowicie ludzkie przeciwciało). Przeciwciała te można wytworzyć wieloma sposobami, jak opisano poniżej.
Przeciwciało humanizowane to przeciwciało, które pochodzi z gatunków innych niż człowiek, w których pewne aminokwasy w domenach zrębowych i stałych zostały zmutowane, tak aby uniknąć albo znieść odpowiedź immunologiczną u ludzi. Alternatywnie, przeciwciało humanizowane można wytworzyć poprzez połączenie domen stałych przeciwciała ludzkiego z domenami zmiennymi gatunków innych niż człowiek. Przykłady, w jaki sposób wytwarzać humanizowane przeciwciała można znaleźć w patentach USA nr 6054297, 5886152 i 5877293.
Termin „przeciwciało chimerowe” dotyczy przeciwciała, które zawiera jeden albo więcej regionów z jednego przeciwciała i jeden albo więcej regionów z innych przeciwciał. W korzystnym wykonaniu jeden albo więcej CDR pochodzi z ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu, wszystkie CDR pochodzą z ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR. W innym korzystnym wykonaniu, CDR z więcej niż jednego ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR są pomieszane i dopasowane w chimerowym przeciwciele. Przykładowo, chimerowe przeciwciało może zawierać CDR1 z łańcucha lekkiego pierwszego ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR, który może być połączony z CDR2 i CDR3 z łańcucha lekkiego drugiego ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR, a CDR łańcucha ciężkiego mogą pochodzić z trzeciego przeciwciała anty-IGF-IR. Ponadto, regiony zrębowe mogą pochodzić z jednego z tych samych prze12
PL 228 041 B1 ciwciał anty-IGF-IR, z jednego albo większej liczby innych przeciwciał, takich jak przeciwciało ludzkie albo z przeciwciała humanizowanego.
„Przeciwciało neutralizujące” albo „przeciwciało hamujące” to przeciwciało, które hamuje wiązanie IGF-IR z IGF-I, kiedy nadmiar przeciwciała anty-IGF-IR zmniejsza ilość IGF-I związanego z IGF-IR o co najmniej 20%. W korzystnym wykonaniu przeciwciało zmniejsza ilość IGF-I związanego z IGF-IR o co najmniej 40%, korzystniej 60%, jeszcze korzystniej 80%, a nawet bardziej korzystnie 85%. Zmniejszenie wiązania można mierzyć dowolnymi sposobami znanymi specjaliście w tej dziedzinie, na przykład mierzyć jako test współzawodnictwa o wiązanie in vitro. Przykład pomiaru zmniejszania wiązania się IGF-I z IGF-IR jest przedstawiony poniżej w przykładzie IV.
„Przeciwciało aktywujące” to przeciwciało, które aktywuje IGF-IR o co najmniej 20% po dodaniu do komórki, tkanki albo organizmu wyrażającego IGF-IR. W korzystnym wykonaniu przeciwciało aktywuje aktywność IGF-IR o co najmniej 40%, korzystniej 60%, jeszcze korzystniej 80%, a nawet bardziej korzystnie 85%. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu aktywujące przeciwciało dodaje się w obecności IGF-I lub IGF-II. W innym korzystnym wykonaniu aktywność przeciwciała aktywującego mierzy się poprzez ustalenie ilości autofosforylacji tyrozyny IGF-IR.
Fragmenty lub analogi przeciwciał mogą zostać łatwo wytworzone przez specjalistę w tej dziedzinie na podstawie wskazówek z tego opisu. Korzystne końce aminowe i karboksylowe fragmentów lub analogów występują blisko granic domen funkcjonalnych. Domeny strukturalne i funkcjonalne można zidentyfikować porównując dane o sekwencji nukleotydowej i/lub aminokwasowej z publiczn ymi lub prywatnymi bazami danych sekwencji. Korzystne jest wykorzystanie komputerowych metod porównawczych do identyfikacji motywów sekwencji lub przewidywanych domen konformacjyjnych białka występujących w innych białkach o znanej strukturze i/lub funkcji. Znane są metody identyfikacji sekwencji białkowych, które fałdują się w znane struktury trójwymiarowe. Bowie i wsp., Science 253: 164 (1991).
Stosowany tu termin „powierzchniowy rezonas plazmonowy” dotyczy zjawiska optycznego, które umożliwia analizę oddziaływań bio specyficznych w czasie rzeczywistym poprzez wykrywanie zmian w stężeniach białek w obrębie matrycy biosensora, na przykład przy użyciu systemu BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden oraz Piscataway, N. J.). Dla dalszych szczegółów, patrz, Jonsson, U., i wsp. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., i wsp. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., i wsp. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 oraz Johnson, B., i wsp. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.
Termin „Koff” dotyczy stałej odłączania się przy dysocjacji przeciwciała z kompleksu przeciwciało/antygen.
Termin „Kd” dotyczy stałej dysocjacji dla konkretnego oddziaływania 2 o przeciwciało-antygen.
Termin „epitop” obejmuje dowolne białko zdolne do specyficznego wiązania z immunoglobuliną lub receptorem komórki T. Determinanty epitopów zwykle składają się z chemicznie aktywnych powierzchniowych zgrupowań cząsteczek, takich jak aminokwasy lub boczne łańcuchy cukrowe i zazwyczaj posiadają specyficzną trójwymiarową charakterystykę, jak również specyficzny ładunek. Uważa się, że przeciwciało wiąże swoiście antygen, jeśli stała dysocjacji wynosi <1 pM, korzystnie <100 nM, najkorzystniej <10 nM.
Stosowane tu nazwy dwudziestu zwykłych aminokwasów i ich skróty są zgodne z konwencjonalnym użyciem. Patrz Immunology - A Synthesis (drugie wydanie, E.S. Golub D.R. Green, Wyd., Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991)), które jest tu włączone jako odniesienie. Odpowiednimi składnikami polipeptydów według niniejszego wynalazku mogą również być stereoizomery (np. D-aminokwasy) dwudziestu zwykłych aminokwasów, aminokwasy nie występujące w naturze, takie jak jak α,α-dipodstawione aminokwasy, N-alkiloaminokwasy, kwas mlekowy i inne niekonwencjonalne aminokwasy. Przykłady niekonwencjonalnych aminokwasów obejmują: 4-hydroksyprolinę, γ-karboksyglutaminian, e-N,N,N-trimetylolizynę, ε-N-acetylolizynę, O-fosfoserynę, N-acetyloserynę, N-formylometioninę, 3-metylohistydynę, 5-hydroksylizynę, σ-N-metyloragininę i inne podobne aminokwasy oraz iminokwasy (np. 4-hydroksyprolinę). W stosowanym tu zapisie polipeptydu lewa strona odpowiada końcowi aminowemu, a prawa strona końcowi karboksylowemu, zgodnie ze standardowym zapisem i zwyczajem.
Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin „polinukleotyd” oznacza polimeryczną formę nukleotydów o długości co najmniej zasad, bądź to rybonukleotydów, bądź deoksyrybonukleotydów, bądź zmodyfikowanej postaci któregokolwiek typu nukleotydu.
Termin obejmuje jednoniciowe i dwuniciowe formy DNA.
PL 228 041 B1
Użyty w niniejszym zgłoszeniu termin „wyizolowany polinukleotyd” ma oznaczać polinukleotyd pochodzenia genomowego, cDNA, bądź syntetycznego lub też pewnych ich kombinacji, który wskutek swego pochodzenia (1) nie jest połączony z całym lub fragmentem polinukleotydu, w którym „wyizolowany polinukleotyd” znajduje się w naturze, (2) jest połączony funkcjonalnie z polinukleotydem, z którym nie jest połączony w naturze albo (3) nie występuje naturalnie jako część większej sekwencji.
Stosowany tu termin „oligonukleotyd” obejmuje występujące naturalnie oraz modyfikowane nukleotydy połączone razem występującymi naturalnie oraz nie występującymi naturalnie wiązaniami oligonukleotydowymi. Oligonukleotydy są podzbiorem polinukleotydów o długości 200 zasad lub mniej. Korzystnie oligonukleotydy mają długość 10 do 60 zasad, a najkorzystniej długość 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 do 40 zasad. Oligonukleotydy zwykle są jednoniciowe, np. jako sondy, choć oligonukleotydy mogą również być dwuniciowe, np. stosowane do konstrukcji zmutowanego genu. Oligonukleotydy według wynalazku mogą być zarówno sensowne, jak i antysensowne.
Używany tu termin „nukleotydy występujące naturalnie” obejmuje deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy. Stosowany tu termin „nukleotydy zmodyfikowane” obejmuje nukleotydy z modyfikowaną lub podstawioną grupą cukrową i tym podobne. Używany tu termin „wiązania oligonukleotydowe” obejmuje takie wiązania oligonukleotydowe jak fosforotionianowe, fosforoditionianowe, fosforoselenianowe, fosforodwuselenianowe, fosforoanilotionianowe, fosforoanilidowe, fosforoamidowe i tym podobne. Patrz np. LaPlanche i wsp. Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec i wsp. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein i wsp. Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon i wsp. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon i wsp. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, wyd. Oxford Uniwersity Press, Oxford England (1991)); Stec i wsp. Patent USA nr 5 151 510; Uhlmann i Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), ujawnienia których są tu włączone jako odniesienia. Oligonukleotyd może zawierać znacznik do wykrywania, jeśli to pożądane.
Sekwencje „połączone funkcjonalnie” obejmują zarówno sekwencje kontrolne dla ekspresji, które są ciągłe z genem będącym przedmiotem zainteresowania, jak i sekwencje kontrolne dla ekspresji, które działają w układzie trans albo w pewnej odległości kontrolując gen będący przedmiotem zainteresowania. Stosowany tu termin „sekwencje kontrolne dla ekspresji” dotyczą sekwencji polinukleot ydowych, które są niezbędne dla uzyskania ekspresji i obróbki sekwencji kodujących, z którymi są połączone poprzez ligację. Sekwencje kontrolne dla ekspresji obejmują odpowiednie sekwencje dla inicjacji transkrypcji, terminacji, sekwencje promotora i wzmacniacza; wydajne sygnały obróbki RNA, takie jak sygnały składania mRNA i poliadenylacji; sekwencje, które stabilizują cytoplazmatyczny m RNA; sekwencje, które wzmacniają wydajność translacji (tj. sekwencję najwyższej zgodności Kozak); sekwencje, które zwiększają stabilność białek oraz, jeśli to pożądane, sekwencje, które zwiększają wydzielanie białek. Natura takich sekwencji kontrolnych jest różna w zależności od organizmu gospodarza; u organizmów prokariotycznych takie sekwencje kontrolne obejmują generalnie promotor, miejsce wiązania rybosomów, sekwencję terminacji dla transkrypcji; u organizmów eukariotycznych takie sekwencje kontrolne obejmują promotory, miejsce wiązania rybosomów i sekwencję terminacji dla transkrypcji. Termin „sekwencje kontrolne” ma obejmować co najmniej wszystkie składniki, których obecność jest niezbędna dla ekspresji i obróbki, a także może obejmować dodatkowe składniki, których obecność jest korzystna, na przykład sekwencje liderowe i sekwencje partnera fuzji.
Stosowany tu termin „wektor” ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, do którego został dołączony. Jednym z typów wektora jest „plazmid”, który oznacza kolistą dwuniciową pętlę, do której można dołączać poprzez ligację dodatkowe odcinki DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, gdzie dodatkowe odcinki DNA można włączyć poprzez ligację do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne mające bakteryjny początek replikacji i episomowe wektory ssacze). Inne wektory (np. nie-episomowe wektory ssacze) mogą zostać włączone do genomu komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i dzięki temu ulegają replikacji razem z genomem gospodarza. Ponadto, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi zostały połączone funkcjonalnie. Takie wektory określa się tu jako „zrekombinowane wektory ekspresyjne (albo po prostu „wektory ekspresyjne”). Generalnie, wektory ekspresyjne mające zastosowanie w technikach rekombinowania DNA mają często postać plazmidu. W niniejszym zgłoszeniu „plazmid” i „wektor” mogą być używane wymiennie jako że plazmid jest najpowszechniej używaną postacią wektora. Jednakże wynalazek ma obejmować te inne postaci wektorów ekspresyjnych, takie jak wektory wirusowe (np. retrowirusy defektywne pod
PL 228 041 B1 względem replikacji, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami), które spełniają ekwiwalentne funkcje.
Stosowany tu termin „zrekombinowana komórka gospodarza” (albo po prostu „komórka gospodarza”) ma odnosić się do komórki, do której został wprowadzony zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być zrozumiałe, że takie terminy mają dotyczyć nie tylko konkretnej komórki osobnika, ale potomstwa takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach mogą nastąpić pewne modyfikacje, bądź na skutek mutacji, bądź wpływów środowiska, takie potomstwo może nie być w rzeczywistości identyczne z komórką rodzicielską, ale jest nadal objęte zakresem stosowanego tu terminu „komórka gospodarza”.
Stosowany tu termin „wybiórczo hybrydyzuje” odnosi się do wykrywalnego i specyficznego wiązania. Polinukleotydy, oligonukleotydy i ich fragmenty według niniejszego wynalazku wybiórczo hybr ydyzują z łańcuchami kwasów nukleinowych w warunkach hybrydyzacji i płukania, które minimalizują znaczne ilości wykrywalnego wiązania do niespecyficznych kwasów nukleinowych. Przykładem warunków „o wysokiej ostrości” albo „wysoce ostrych” jest metoda inkubowania polinukleotydu z innym polinukleotydem, gdzie jeden polinukleotyd może być przytwierdzony do stałej powierzchni, takiej jak membrana, w buforze do hybrydyzacji zawierającym 6X SSPE lub SSC, 50% formamid, 5X odczynnik Denhardta, 0,5% SDS, 100 pg/ml zdenaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia w temperaturze hybrydyzacji 42°C przez 1216 godzin, po czym następuje dwukrotne płukanie w 55°C przy użyciu bufom do płukania zawierającego IX SSC, 0,5% SDS. Patrz również Sambrook i wsp., jak wyżej, str. 9.509.55.
Termin „procent identyczności sekwencji” w kontekście sekwencji kwasów nukleinowych dotyczy reszt w dwóch sekwencjach, które są takie same po dopasowaniu tak, aby maksymalnie sobie odpowiadały. Porównywanie identyczności sekwencji można przeprowadzić na odcinku o długości co najmniej około dziewięciu nukleotydów, zwykle co najmniej około 18 nukleotydów, częściej co najmniej około 18 nukleotydów, typowo co najmniej około 28 nukleotydów, jeszcze bardziej typowo co najmniej około 32 nukleotydów, a korzystnie co najmniej około 36, 48 lub więcej nukleotydów. Istnieje kilka różnych algorytmów znanych w tej dziedzinie, które można zastosować do mierzenia identyczn ości sekwencji nukleotydowych. Przykładowo, sekwencje polinukleotydowe można porównywać stosując FASTA, Gap lub Bestfit, które są programami w pakiecie Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, który obejmuje np. programy FASTA2 i FASTA3, dopasowuje sekwencje i określa procent identyczności sekwencji dla regionów, które najlepiej pasują do siebie w sekwencjach stanowiących zapytanie i przeszukiwanych (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998); włączone tu jako odniesienie). O ile nie zaznaczono inaczej dla konkretnego programu albo algorytmu stosuje się parametry domyślne. Przykładowo, procent identyczności sekwencji pomiędzy sekwencjami kwasu nukleinowego można określić stosując FASTA z jego parametrami domyślnymi (wielkość słowa 6 i czynnik NOPAM dla tablicy porównania) albo stosując Gap z parametrami dostarczonymi w GCG Wersja 6.1, włączone tu jako odniesienie.
Odniesienie się do sekwencji kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję do niego komplementarną, o ile nie zaznaczono inaczej. A zatem powinno być zrozumiałe, że odniesienie się do cząsteczki kwasu nukleinowego mającej określoną sekwencję obejmuje jej nić komplementarną o sekwencji do niej komplementarnej.
W dziedzinie biologii molekularnej badacze stosują termin „procent identyczności sekwencji”, „procent podobieństwa sekwencji”, „procent homologii sekwencji” wymiennie. W tym zgłoszeniu terminy te będą miały takie samo znaczenie jedynie w odniesieniu do sekwencji kwasów nukleinowych.
Termin „zasadnicze podobieństwo” albo „zasadnicze podobieństwo sekwencji” w odniesieniu do kwasu nukleinowego albo jego fragmentu wskazuje, że po optymalnym dopasowaniu, z uwzględnieniem odpowiednich insercji albo delecji nukleotydowych, z innym kwasem nukleinowym (albo jego nicią komplementarną) ma miejsce identyczność sekwencji nukleotydowej dla co najmniej 85%, k orzystnie co najmniej około 90%, a korzystniej co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% zasad nukleotydowych, mierzonej przy zastosowaniu dowolnego dobrze znanego algorytmu identyczności sekwencji takiego jak FASTA, BLAST lub Gap, jak dyskutowano powyżej.
Stosowany w odniesieniu do polipeptydów termin „zasadnicza identyczność” oznacza, że dwie sekwencje peptydowe, po optymalnym dopasowaniu, np. przy pomocy programów GAP czy BESTFIT z typowymi wagami dla przerw, wykazują, co najmniej 75% lub 80% identyczności sekwencji, korzystPL 228 041 B1 niej, co najmniej 90% lub 95% identyczności sekwencji, bardziej korzystnie co najmniej 98% lub 99% identyczności sekwencji. Korzystnie, jeżeli pozycje reszt, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi. „Konserwatywne podstawienie aminokwasowe” to takie, w którym reszta aminokwasowa jest zastąpiona przez inną resztę aminokwasową mającą łańcuch boczny (grupę R) o podobnych właściwościach chemicznych (np. ładunku albo hydrofobowości). Ogólnie, konserwatywne podstawienie aminokwasowe nie będzie zasadniczo zmieniać właściwości funkcjonalnych białka. W przypadku, gdy dwie lub więcej sekwencje aminokwasowe różnią się od siebie konserwatywnymi podstawieniami, procent identyczności sekwencji albo stopień można zwiększyć dokonując korekty z uwzględnieniem konserwatywnej natury podstawienia. Sposoby dokonywania takiej korekty są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Patrz np., Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 (1994), włączone tu jako odniesienie. Przykłady grupy aminokwasów, które mają łańcuchy boczne o podobnych właściwościach chemicznych obejmują 1) alifatyczne łańcuchy boczne: glicyna, alanina, walina, lecucyna i izoleucyna; 2) alifatyczno-hydroksylowe łańcuchy boczne: seryna i treonina; 3) łańcuchy boczne zawierające grupę amidową: asparagina i glutamina; 4) aromatyczne łańcuchy boczne: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; 5) zasadowe łańcuchy boczne: lizyna, arginina i histydyna; 6) łańcuchy boczne zawierające siarkę: cysteina i metionina. Korzystnymi konserwatywnymi grupami podstawień aminokwasowych są: walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina, asparaginian-gtlutaminian i asaragina-glutamina.
Alternatywnie, konserwatywne podstawienie jest dowolną zmianą mającą wartość dodatnią w macierzy log wiarygodności PAM250 ujawnionej w Gonnet i wsp., Science 256: 1443-45 (1992), włączone tu jako odniesienie. „Średnio konserwatywne podstawienie” to dowolna zmiana mająca wartość macierzy log wiarygodności PAM250.
Podobieństwo sekwencji dla polipeptydów, które określa się również jako identyczność sekwencji mierzy się zazwyczaj przy zastosowaniu analizy komputerowej. Oprogramowanie do analizy białek dopasowuje podobne sekwencje stosując miary podobieństwa przypisane różnym podstawieniom, delecjom i innym modyfikacjom, włączając w to konserwatywne podstawienia aminokwasowe. Przykładowo, GCG zawiera programy, takie jak „Gap” i „Bestfit”, które można użyć z parametrami domyślnymi w celu ustalenia homologii sekwencji albo identyczności sekwencji pomiędzy ściśle sp okrewnionymi polipeptydami, takimi jak homologiczne polipeptydy z różnych gatunków organizmów albo pomiędzy białkiem typu dzikiego a jego muteiną. np. GCG Version 6.1. Sekwencje polipeptydowe można również porównywać przy użyciu FASTA z zastosowaniem parametrów domyślnych albo zalecanych, program w GCG Version 6.1. FASTA (np. FASTA2 i FASTA3) daje dopasowanie i procent identyczności sekwencji najlepiej pasujących regionów sekwencji wyjściowej i przeszukiwanych (Pearson (1990); Pearson (2000). Innym korzystnym algorytmem przy porównywaniu sekwencji według wynalazku z bazą danych zawierającą dużą liczbę sekwencji z różnych organizmów jest program komputerowy BLAST, a w szczególności blastp lub tblastn, z zastosowaniem parametrów domyślnych. Patrz, np. Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); włączone tu jako odniesienie.
Długość sekwencji polipeptydowych porównywanych pod kątem homologii będzie wynosiła generalnie co najmniej 16 reszt aminokwasowych, zwykle co najmniej 20 reszt, jeszcze częściej co najmniej 24 reszty, typowo co najmniej 28 reszt, a korzystnie ponad 35 reszt. Kiedy przeszukuje się bazę danych zawierającą sekwencje z dużej liczby różnych organizmów, korzystne jest porównywanie s ekwencji aminokwasowych.
Stosowane tu terminy „znacznik” albo „wyznakowany” dotyczy włączania innej cząsteczki do przeciwciała. W jednym z wykonań znacznikiem jest wykrywalny marker, np. włączenie wyznakowanego radioaktywnie aminokwasu lub dołączenie do polipeptydu cząsteczek biotynylowych, które można wykryć znakowaną awidyną (np. streptawidyną zawierającą znacznik fluorescencyjny lub o aktywności enzymatycznej, który można wykryć metodami optycznymi bądź enzymatycznymi). W innym wykonaniu znacznik lub marker mogą również być lecznicze, np. połączenie z lekiem albo toksyną. Można zastosować rozmaite metody znakowania polipeptydów i glikoprotein znane w tej dziedzinie. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują między innymi następujące: radioizotopy lub radionuklidy (np. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), znaczniki fluorescencyjne (np. FITC, rodamina, lantanidofosfory), znaczniki enzymatyczne (np. peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, alkaliczna fosfataza), znaczniki chemiluminescencyjne, grupy biotynylowe, określone uprzednio epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez drugorzędowy wskaźnik (sekwencje suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla przeciwciał drugorzędowych, domeny wiązania metali, znaczniki epitopowe)
PL 228 041 B1 czynniki magnetycze, takie jak chelaty gadoliny, toksyny, takie jak toksyna krztuśca, taksol, cytochalasyna B, gramicydyna D, bromek etydyny, emetyna, mitomycyna, etopozyd, tenopozyd, winkrystyna, winblastyna, kolchicyna, doksorubicyna, daunorubicyna, dihydroksyantracynodion, mitoksantron, mitramycyna, aktynomycyna D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokaina, tetrakaina, lidokaina, propranolol oraz puromycyna i jej analogi lub homologi. W niektórych wykonaniach, znaczniki są przyłączone poprzez ramiona łącznikowe o różnej długości, aby zmniejszyć potencjalną zawadę steryczną.
Termin „czynnik” jest tu stosowany w odniesieniu do związku chemicznego, mieszaniny związków chemicznych, makrocząsteczki biologicznej lub wyciągu sporządzonego z materiału biologicznego.
Stosowany tu termin „środek farmaceutyczny lub lek” dotyczy związku chemicznego lub kompozycji zdolnej do wywołania pożądanego skutku leczniczego przy podaniu w odpowiedni sposób pacjentowi. Inne terminy chemiczne tu używane są zgodnie z konwencjonalnym użyciem w tej dziedzinie, jak na przykład w The MacGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker S., wyd. McGraw-Hill, San Francisco (1985) włączone tu jako odnośnik).
Stosowany tu termin „czynnik przeciwnowotworowy” odnosi się do czynników, które mają funkcjonalną właściwość hamowania rozwoju lub postępów nowotworu u człowieka, w szczególności złośliwych zmian nowotworowych (rakowych), takich jak rak, mięsak, chłoniak lub białaczka. Hamowanie przerzutowania jest częstą właściwością czynników przeciwnowotworowych.
Termin pacjent obejmuje ludzi i podmioty weterynaryjne.
Ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR i ich właściwości
Ludzkie przeciwciała pozwalają uniknąć pewnych problemów związanych z przeciwciałami, które posiadają mysie lub szczurze regiony zmienne i/lub stale. Obecność takich sekwencji pochodzących od myszy lub szczurów może prowadzić do szybkiego znikania przeciwciał albo może prowadzić do wytwarzania odpowiedzi immunologicznej wobec przeciwciała u pacjenta. A zatem, niniejszym opisano dostarczanie humanizowanych przeciwciał anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu wynalazek dostarcza całkowicie ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR poprzez wprowadzenie ludzkich genów immunoglobulinowych do gryzonia, tak, że gryzoń wytwarza całkowicie ludzkie przeciwciała. Bardziej korzystne są całkowicie ludzkie przeciwciała anty-ludzki IGF-IR. Spodziewane jest, że całkowicie ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR będą minimalizować immunogenne i alergiczne odpowiedzi charakterystyczne dla mysich albo derywatyzowanych mysich przeciwciał monoklonalnych (Mab), a zatem zwiększać skuteczność i bezpieczeństwo podawanych przeciwciał. Można się spodziewać, że zastosowanie całkowicie ludzkich przeciwciał dostarczy znacznych korzyści przy leczeniu przewlekłych i nawracających ludzkich chorób, takich jak zapalenie albo nowotwór, które mogą wymagać powtarzanego podawanie przeciwciała. W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które nie wiąże dopełniacza.
W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem anty-IGF-IR jest 2.14.3. Jednakże inne przeciwciała 2.12.1, 2.13.2, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 albo 6.1.1 - są również niniejszym ujawnione. Przeciwciało anty-IGF-IR zawiera łańcuch lekki o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 lub 22 albo jeden lub więcej CDR z tych sekwencji aminokwasowych. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR zawiera łańcuch ciężki o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 lub 24 albo jeden lub więcej CDR z tych sekwencji aminokwasowych.
Klasy i subklasy przeciwciał anty-IGF-IR
Przeciwciałem może być cząsteczka IgG, IgM, IgE, IgA lub IgD. W korzystnym wykonaniu, przeciwciałem jest IgG i podtyp IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciałem anty-IGF-IR jest podklasa IgG2. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciałem anty-IGF-IR jest taka sama klasa lub podklasa co przeciwciało 2.14.3, którą jest IgG2.
Klasę lub podklasę przeciwciał anty-IGF-IR można określić przy zastosowaniu dowolnej metody znanej w tej dziedzinie. Generalnie klasę lub podklasę przeciwciał anty-IGF-IR można określić przy użyciu przeciwciał, które są swoiste dla konkretnej klasy i podklasy przeciwciała. Takie przeciwciała są dostępne handlowo. Klasę lub podklasę można określić przy zastosowaniu ELISA, techniki Western jak również innych technik. Alternatywnie, klasę lub podklasę można ustalić poprzez sekwencjonow anie całej albo części domen zmiennych łańcuchów ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciał, porównując ich sekwencje aminokwasowe ze znanymi sekwencjami aminokwasowymi z różnych klas i o podklas immunoglobulin i określając klasę lub podklasę przeciwciał.
Selektywność gatunkowa i cząsteczkowa
W innym aspekcie wynalazku przeciwciało anty-IGF-IR wykazuje zarówno selektywność gatunkową, jak i cząsteczkową. W jednym z wykonań przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z IGF-IR ludzkim,
PL 228 041 B1 makaka z gatunku Macaca fascicularis albo rezusa. W korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR nie wiąże się z IGF-IR z myszy, szczura, psa lub królika. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR nie wiąże się z gatunkami małp z Nowego Świata, takich jak marmozeta. Na podstawie nauk płynących z tego opisu można ustalić selektywność gatunkową dla przeciwciał anty-IGF-IR przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie. Przykładowo, można ustalić selektywność gatunkową przy zastosowaniu techniki Western, FACS, lub RIA. Możliwe jest ustalenie selektywności gatunkowej przy zastosowaniu techniki Western.
W innym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż wobec receptora insuliny. W korzystnym wykonaniu, selektywność przeciwciała anty-IGF-IR jest ponad 100 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR nie wykazuje widocznego swoistego wiązania z żadnym białkiem innym niż IGF-IR. Można ustalić selektywność przeciwciał anty-IGF-IR wobec IGR-IR przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie kierując się naukami płynącymi z tego opisu. Przykładowo, można ustalić selektywność przy zastosowaniu techniki Western, FACS, ELISA lub RIA. W korzystnym wykonaniu można ustalić selektywność cząsteczkową przy zastosowaniu techniki Western.
Powinowactwo wiązania się anty-IGF-IR z IGF-IR
Przeciwciała anty-IGF-IR wiążą się z IGF-IR z wysokim powinowactwem. W jednym z wykonań przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z IGF-IR z Kd wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z Kd wynoszącą 1 x 10-9 M lub mniej. W jeszcze ko10 rzystniejszym wykonaniu przeciwciało wiąże się z IGF-IR z Kd wynoszącą 5 x 10- M lub mniej.
W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z Kd wynoszącą 1 x 10-10 M lub mniej. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą Kd co przeciwciało 2.14.3. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą Kd, co przeciwciało o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 12 oraz 10. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą Kd, co przeciwciało, które zawiera CDR z przeciwciała obejmującego sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEK NR ID: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 lub 24.
W innym aspekcie wynalazku, przeciwciało anty-IGF-IR ma niską szybkość dysocjacji. W jednym z wykonań, przeciwciało anty-IGF-IR ma Koff wynoszącą 1 x 10 s- lub mniejszą. W korzystnym wykonaniu, Koff wynosi 5 x 10- s- lub mniej. W innym korzystnym wykonaniu, Koff jest zasadniczo taka sama co przeciwciała 2.14.3. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taka samą Koff co przeciwciało, które zawiera CDR z przeciwciała 2.14.3. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taka samą Koff co przeciwciało o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 10 oraz 12. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taka samą Koff co przeciwciało, które zawiera CDR z przeciwciała o jednej z sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 10 oraz 12.
Powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji przeciwciała anty-IGF-IR wobec IGF-IR można określić przy zastosowaniu dowolnej metody znanej w tej dziedzinie. W jednym z wykonań, powinowactwo wiązania można zmierzyć przy zastosowaniu ELISA, RIA albo powierzchniowego rezonansu plazmonowego takiego jak, BIAcore. Szybkość dysocjacji można zmierzyć przy zastosowaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego. W bardziej korzystnym wykonaniu, powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się przy zastosowaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się przy zastosowaniu BIAcore. Przykład określania powinowactwa wiązania i szybkości dysocjacji jest opisany poniżej w Przykładzie II.
Okres półtrwania przeciwciał anty-IGF-IR
Według innego przedmiotu wynalazku, przeciwciało anty-IGF-IR ma okres półtrwania co najmniej jeden dzień in vitro lub in vivo. W korzystnym wykonaniu przeciwciało albo jego część ma okres półtrwania co najmniej trzy dni. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało albo jego część ma okres półtrwania co najmniej cztery dni albo dłuższy. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część ma okres półtrwania co najmniej osiem dni albo dłuższy. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część wiążąca antygen jest poddana derywatyzacji lub zmodyfikowana w taki sposób, że ma dłuższy okres półtrwania, jak dyskutowano poniżej. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało może zawierać mutacje punktowe dla zwiększenia okresu półtrwania w surowicy, jak opisano w WO 00/09560, opublikowanym 24 lutego, 2000.
PL 228 041 B1
Okres półtrwania przeciwciała można zmierzyć przy zastosowaniu dowolnej metody znanej specjaliście w tej dziedzinie. Przykładowo okres półtrwania przeciwciała można zmierzyć przy zast osowaniu techniki Western, ELISA lub RIA na przestrzeni odpowiedniego okresu czasu. Okres półtrwania przeciwciała można zmierzyć w dowolnym odpowiednim zwierzęciu, np. małpie, takiej jak makak z gatunku Macaca fascicularis, naczelnym albo człowieku.
Identyfikacja epitopów IGF-IR rozpoznawanych przez przeciwciało anty-IGF-IR
Wynalazek dostarcza również przeciwciała anty-IGF-IR, które wiąże się z tym samym antygenem albo epitopem co ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR. Ponadto, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które współzawodniczy z ludzkim przeciwciałem anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, ludzkim przeciwciałem anty-IGF-IR jest 2.14.3. W innym korzystnym wykonaniu, ludzkie anty-IGF-IR CDR z przeciwciała 2.14.3. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, ludzkie anty-IGF-IR ma sekwencję aminokwasową spośród SEK NR ID: 10 oraz 12. W innym korzystnym wykonaniu, ludzkie anty-IGF-IR zawiera CDR z przeciwciała o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEK NR ID: 10 i 12.
Można ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z tym samym antygenem stosując rozmaite metody znane w tej dziedzinie. Przykładowo, można ustalić czy testowane przeciwciało anty-IGFIR wiąże się z tym samym antygenem przy zastosowaniu przeciwciała anty-IGF-IR do wyłapania antygenu, o którym wiadomo że wiąże się z przeciwciałem anty-IGF-IR, takim jak IGF-IR, odmycie antygenu od przeciwciała, a następnie ustalenie, czy testowane przeciwciało wiąże się z wymytym antyg enem. Można ustalić, czy przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem co przeciwciało anty-IGF-IR poprzez wiązanie przeciwciała anty-IGF-IR do IGF-IR w warunkach wysycenia, a następnie mierzenie zdolności testowanego przeciwciała do wiązania się z IGF-IR. Jeżeli testowane przeciwciało jest zdolne do wiązania się z IGF-IR w tym samym czasie co przeciwciało anty-IGF-IR, wówczas testowane przeciwciało anty-IGF-IR wiąże się z tym innym epitopem niż przeciwciało anty-IGF-IR. Jednakże, jeżeli testowane przeciwciało nie jest zdolne do wiązania się z IGF-IR w tym samym czasie, wówczas testowane przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem co ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR. Doświadczenie to można przeprowadzić stosując ELISA, RIA lub powierzchniowy rezonans plazmonowy. W korzystnym wykonaniu, doświadczenie przeprowadza się stosując powierzchniowy rezonans plazmonowy. W bardziej korzystnym wykonaniu, stosuje się BIAcore. Można również ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR współzawodniczy z przeciwciałem anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, one można ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR współzawodniczy z innym poprzez zastosowanie tej samej metody co przy badaniu czy przeciwciało anty-IGF-IR jest zdolne do wiązania się z tym samym epitopem co inne przeciwciało anty-IGF-IR.
Użycie łańcucha lekkiego i ciężkiego
Wynalazek dostarcza również przeciwciała anty-IGF-IR, które zawiera sekwencje zmienne kodowane przez ludzki gen K. W korzystnym wykonaniu, sekwencje zmienne są kodowane przez ludzką rodzinę genów Vk A27, A30 albo 012. W korzystnym wykonaniu, sekwencje zmienne są kodowane przez rodzinę ludzkich genów Vk A30. W bardziej korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki zawiera nie więcej niż dziesięć podstawień aminokwasowych w stosunku do Vk A27, A30 lub 012 linii zarodkowej, korzystnie nie więcej niż sześć podstawień aminokwasowych, a korzystniej nie więcej niż trzy p odstawienia aminokwasowe. W korzystnym wykonaniu, podstawienia aminokwasowe są podstawieniami konserwatywnymi.
SEK NR ID: 2, 6, 10, 14, 18 i 22 dostarczają sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych sześciu łańcuchów lekkich k anty-IGF-IR. SEK NR ID: 38, 40 i 42 dostarczają sekwencje aminokwasowe trzech łańcuchów lekkich K linii zarodkowej, z których pochodzi sześć łańcuchów lekkich k antyIGF-IR. Fig. 1A-1C pokazują dopasowanie sekwencji nukleotydowych regionów zmiennych sześciu łańcuchów lekkich sześciu przeciwciał anty-IGF-IR wzajemnie do siebie i do sekwencji linii zarodkowej, z których pochodzą. Na podstawie nauk płynących z tego opisu specjalista w tej dziedzinie będzie mógł określić zakodowaną sekwencję aminokwasową sześciu łańcuchów lekkich K i łańcuchów lekkich K linii zarodkowej i ustalić różnice pomiędzy sekwencjami linii zarodkowej i sekwencjami przeciwciała.
W korzystnym wykonaniu VL z przeciwciała anty-IGF-IR zawiera te same podstawienia aminokwasowe w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej, co dowolny jeden lub więcej VL z przeciwciał 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. Przykładowo, VL z przeciwciała anty-IGFIR może zawierać jedno lub więcej one podstawień aminokwasowych, które są takie same jak te obecne w przeciwciele 2.13.2, inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 2.14.3 oraz inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 4.9.2.
PL 228 041 B1
W ten sposób można mieszać i dopasowywać różne właściwości wiązania przeciwciała w celu zmiany, np. powinowactwa przeciwciała wobec IGF-IR albo jego szybkości oddysocjowywania od antygenu. W innym wykonaniu, dokonuje się podstawień aminokwasowych w tej samej pozycji co znajdywane w jednym lub więcej VL z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1, ale dokonuje się raczej konserwatywnych podstawień aminokwasowych niż stosuje ten sam aminokwas. Przykładowo, jeżeli podstawieniem aminokwasowym w porównaniu do linii zarodkowej w jednym z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, .1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1 jest glutaminian, można go zastąpić konserwatywnie asparaginianem. Podobnie, jeżeli podstawieniem aminokwasowym jest seryna, można ją zastąpić konserwatywnie treoniną.
W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasową, która jest taka sama jak sekwencja aminokwasowa VL z 2.14.3. W innym wysoce korzystnym wykonaniu łańcuch lekki zawiera taką samą sekwencję aminokwasową, co regiony CDR łańcucha lekkiego z 2.14.3. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 10. W innym wykonaniu, łańcuch lekki ma sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 9 albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową mającą w stosunku do niej 1-10 insercji, delecji albo podstawień aminokwasowych. Korzystnie, jeżeli podstawienia aminokwasowe są podstawieniami konserwatywnymi. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część zawiera łańcuch lekki lambda.
Niniejszy wynalazek dostarcza również przeciwciała anty-IGF-IR albo jego część, która zawiera ludzki łańcuch ciężki albo sekwencję pochodzącą z ludzkiego łańcucha ciężkiego. Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego może być otrzymana z rodziny ludzkich genów VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 lub VIV-4/4.35. Sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego korzystnie pochodzi z rodziny ludzkiego genu VH DP47. Łańcuch ciężki powinien zawierać nie więcej niż osiem podstawień aminokwasowych w stosunku do genów VH DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 lub VIV-4/4 linii zarodkowej, korzystniej nie więcej niż sześć podstawień aminokwasowych, a nawet bardziej korzystnie nie więcej niż trzy podstawienia aminokwasowe.
SEK NR ID: 4, 8, 12, 16, 20 i 24 dostarczają sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych sześciu łańcuchów ciężkich anty-IGF-IR. SEK NR ID: 30, 32, 34, 36 i 44 dostarczają sekwencje aminokwasowe, a SEK NR ID: 29, 31, 33, 35 i 43 dostarczają sekwencje nukleotydowe trzech łańcuchów ciężkich linii płciowych, odpowiednio, DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 i VIV-4. Fig. 2A-2D pokazują dopasowanie sekwencji aminokwasowych regionów zmiennych sześciu przeciwciał anty-IGF-IR do odpowiadających im sekwencji linii zarodkowej. Na podstawie nauk płynących z tego opisu specjalista w tej dziedzinie będzie mógł określić zakodowaną sekwencję aminokwasową sześciu łańcuchów ciężkich anty-IGF-IR i łańcuchów ciężkich linii zarodkowej i ustalić różnice pomiędzy sekwencjami linii zarodkowej i sekwencjami przeciwciała.
W korzystnym wykonaniu VH z przeciwciała anty-IGF-IR zawiera te same podstawienia aminokwasowe w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej, co VH z przeciwciał 2.14.3. Podobnie, jak dyskutowano powyżej, VH z przeciwciała anty-IGF-IR może zawierać jedno lub więcej podstawień aminokwasowych, które są takie same, jak te obecne w przeciwciele 2.13.2, inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 2.14.3 oraz inne podstawienie aminokwasowe, które jest takie same jak obecne w przeciwciele 4.9.2. W ten sposób można mieszać i dopasowywać różne właściwości wiązania przeciwciała w celu zmiany, np. powinowactwa przeciwciała wobec IGF-IR albo jego szybkości oddysocjowywania od antygenu. W innym wykonaniu, dokonuje się podstawień aminokwasowych w tej samej pozycji co znajdywane w jednym lub więcej VH z przeciwciał 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 204.17.3 lub 6.1.1, ale dokonuje się raczej konserwatywnych podstawień aminokwasowych niż stosuje ten sam aminokwas.
W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasową, która jest taka sama jak sekwencja aminokwasowa VH z 2.14.3. W innym wysoce korzystnym wykonaniu łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową, która jest taka sama co regiony CDR łańcucha ciężkiego z 2.14.3. W innym korzystnym wykonaniu, łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 12. W innym wykonaniu, łańcuch ciężki ma sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kwasu nukleinowego SEK NR ID: 11 albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową mającą w stosunku do niej 1-10 insercji, delecji albo podstawień aminokwasowych. W innym wykonaniu, podstawienia aminokwasowe są podstawieniami konserwatywnymi.
Hamowanie aktywności IGF-IR przez przeciwciało anty-IGF-IR
Hamowanie wiązania się IGF-I do IGF-IR
PL 228 041 B1
W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które hamuje wiązanie się IGF-I do IGF-IR albo wiązanie IGF-II do IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, IGF-IR jest ludzki. W innym wykonaniu, przeciwciało albo jego część hamuje wiązanie między IGF-IR a IGF-I z IC50 nie większą niż 100 nM. W korzystnym wykonaniu, IC50 jest nie większa niż 10 nM. W bardziej korzystnym wykonaniu, IC50 jest nie większa niż 5 nM. IC50 można zmierzyć dowolną metodą znaną w tej dziedzinie. Typowo, IC50 można mierzyć poprzez ELISA lub RIA. W korzystnym wykonaniu, IC50 mierzy się poprzez RIA.
W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza przeciwciała anty-IGR-IF, które zapobiega aktywacji IGF-IR w obecności IGF-I. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR hamuje indukowaną przez IGF-IR fosforylację tyrozyny, która następuje po zajęciu receptora. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR hamuje zajście kolejnych zdarzeń komórkowych. Przykładowo, antyIGF-IR może hamować fosforylację tyrozyny She i substratu dla receptora insuliny (1RS) 1 i 2, z których każdy jest normalnie fosforylowany, kiedy komórki traktuje się IGF-I (Kim i wsp., J. Biol. Chem. 273: 34543-34550, 1998). Można ustalić, czy przeciwciało anty-IGF-IR może zapobiegać aktywacji IGF-IR w obecności IGF-1 poprzez ustalenie poziomów autofosforylacji dla IGF-IR, She, IRS-1 lub IRS-2 poprzez zastosowanie techniki Western albo immunoprecypitacji. W korzystnym wykonaniu, można określić poziomy autofosforylacji IGF-IR poprzez zastosowanie techniki Western. Patrz np. przykład VII.
W innym aspekcie wynalazku, przeciwciało powoduje obniżenie poziomu IGF-IR na komórkach traktowanych przeciwciałem. W jednym z wykonań, IGF-IR jest internalizowany do cytoplazmy komórki. Po związaniu się przeciwciała anty-IGF-IR z IGF-IR, przeciwciało jest internalizowane, co zostało pokazane przy zastosowaniu mikroskopii konfokalnej. Bez zamiaru przywiązywania się do jakiejkolwiek teorii, uważa się, że kompleks przeciwciało-IGF-IR jest internalizowany do lizosomu i degradowany.
Można zmierzyć obniżenie poziomu IGF-IR przy zastosowaniu dowolnej metody znanej w tej dziedzinie, włączając w to immunoprecypitację, mikroskopię konfokalną lub technikę Western. Patrz np. przykład VII. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest przeciwciałem 2.14.3, albo zawiera jego łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego region wiążący antygen.
Aktywacja IGF-IR przez przeciwciało anty-IGF-IR
Aktywujące przeciwciała anty-IGF-IR różnią się od przeciwciała hamującego ponieważ zwiększają albo zastępują działanie IGF-I wobec IGF-IR. Przeciwciało aktywujące ma zdolność do wiązania się z IGF-IR i powoduje jego aktywację w 10 nieobecności IGF-I. Ten typ przeciwciała aktywującego jest zasadniczo imitatorem IGF-1. Przeciwciało aktywujące zwiększa działanie IGF-I na IGF-IR. Ten typ przeciwciała sam nie aktywuje IGF-IR, ale zwiększa raczej aktywację IGF-IR w obecności IGF-1. Naśladujące przeciwciało anty-IGF-IR można łatwo odróżnić od przeciwciała anty-IGF-IR zwiększającego efekt poprzez traktowanie komórek in vitro przeciwciałem w obecności albo nieobecności niskich poziomów IGF-1. Jeżeli przeciwciało ma zdolność powodowania aktywacji IGF-IR w nieobecności IGF-I, np. zwiększa fosforylację tyrozyny przez IGF-IR, wówczas przeciwciało jest przeciwciałem naśladującym. Jeżeli przeciwciało nie może powodować aktywacji IGF-IR w obecności IGF-I, ale ma zdolność do zwiększenia stopnia aktywacji IGF-IR wówczas przeciwciało jest przeciwciałem zwiększającym efekt. Przeciwciało 4.17.3 lub przeciwciało zawierające jeden albo więcej CDR z 4.17.3 jest przykładem przeciwciała aktywującego. Takie przeciwciało pochodzi z jednej albo obydwu sekwencji linii zarodkowej 012 (łańcuch lekki) i/lub D71 (łańcuch ciężki).
Hamowanie fosforylacji tyrozyny IGF-IR, poziomów IGF-IR i wzrostu komórek nowotworowych in vivo przez przeciwciała anty-IGF-IR
Inne wykonanie wynalazku dostarcza przeciwciała anty-IGF-IR, które hamuje fosforylację tyrozyny IGF-IR i poziomy receptora in vivo. W jednym z wykonań, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR zwierzętom powoduje zmniejszenie sygnału fosfotyrozynowego IGF-IR w nowotworach wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR powoduje zmniejszenie sygnału fosfotyrozynowego o co najmniej 20%. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR powoduje zmniejszenie sygnału fosfotyrozynowego o co najmniej 60%, korzystniej 50%. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało powoduje co najmniej 40% zmniejszenie sygnału fosfotyrozyn owego, korzystniej 30%, a jeszcze korzystniej 20%. W korzystn ym wykonaniu, przeciwciało podaje się około 24 godziny przed pomiarem poziomów fosforylacji tyrozyny. Poziomy fosforylacji tyrozyny można zmierzyć dowolną metodą znaną w tej dziedzinie, jak te opisane tutaj. Patrz np. Przykład III i fig. 5. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest przeciwciałem 2.14.3 albo przeciwciałem zawierającym jego łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
PL 228 041 B1
W innym wykonaniu, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR zwierzętom powoduje zmniejszenie poziomów IGF-IR w nowotworach wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało antyIGF-IR powoduje zmniejszenie poziomów receptora o co najmniej 20% w porównaniu do zwierząt nie traktowanych. W bardziej korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR powoduje zmniejszenie poziomów receptora do co najmniej 60%, korzystniej 50% poziomu receptora u zwierząt nie traktowanych. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało powoduje zmniejszenie poziomów receptora do najmniej 40%, korzystniej 30%. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało podaje się około 24 godziny przed pomiarem poziomów IGF-IR. Poziomy IGF-IR można zmierzyć dowolną metodą znaną w tej dziedzinie, jak te opisane tutaj. Patrz np. przykład VIII i fig. 6. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest przeciwciałem 2.14.3 albo zawiera jego łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
W innym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR hamuje wzrost komórek nowotworowych in vivo. Komórki nowotworowe mogą pochodzić z dowolnego typu komórek, włączając w to, bez ograniczania, komórki naskórkowe, nabłonkowe, śródbłonkowe, białaczkowe, mięsaka, szpiczaka mnogiego i me zodermalne. Przykłady komórek nowotworowych obejmują komórki A549 (rak płuc nie z małych komórek), komórki MCF-7, komórki Colo 205, komórki 3T3/IGF-IR i komórki A431. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało hamuje wzrost komórek nowotworowych w porównaniu ze wzrostem nowotworu w zwierząt nie traktowanych. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało hamuje wzrost komórek nowotworowych o 50%. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało hamuje wzrost komórek nowotworowych o 60%, 65%, 70% lub 75%. W jednym z wykonań, hamowanie wzrostu komórek nowotworowych mierzy się co najmniej 7 dni po rozpoczęciu traktowania zwierzęcia przeciwciałem. W bardziej korzystnym wykonaniu, hamowanie wzrostu komórek nowotworowych mierzy się co najmniej 14 dni po rozpoczęciu traktowania zwierzęcia przeciwciałem. W innym korzystnym wykonaniu zwierzęciu podaje się inny czynnik przeciwnowotworowy razem z przeciwciałem anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, czynnik przeciwnowotworowy ma zdolność dalszego hamowania wzrostu komórek nowotworowych. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, czynnikiem przeciwnowotworowym jest adriamycyna, taksol, tamoksifen, 5-fluorodeoksyurydyna (5-FU) albo CP-358,774. W korzystnym wykonaniu, jednoczesne podawanie czynnika przeciwnowotworowego i przeciwciała anty-IGF-IR hamuje wzrost komórek nowotworowych o co najmniej 50%, korzystniej 60%, 65%, 70% lub 75%, jes zcze korzystniej 80%, 85% lub 90% po okresie 22-24 dni. Patrz np. fig. 7 i przykład IX. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest przeciwciałem 2.14.3 albo zawiera jego łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
Indukcja apoptozy przez przeciwciała anty-IGF-IR
Inny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza przeciwciała anty-IGF-IR, które indukuje śmierć komórki. W jednym z wykonań, przeciwciało powoduje apoptozę. Przeciwciało może indukować apoptozę in vivo albo in vitro. Generalnie, komórki nowotworowe są bardziej wrażliwe na apoptozę niż komórki prawidłowe, a zatem podawanie przeciwciała anty-IGF-IR powoduje apoptozę komórek nowotworowych preferencyjnie wobec komórek prawidłowych. W innym wykonaniu, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR zmniejsza poziomy enzymu akt, który uczestniczy w szlaku kinazy fosfatydyloinozytolowej (PI). Szlak kinazy PI z kolei uczestniczy w proliferacji komórek i zapobiega apoptozie. A zatem hamowanie akt może powodować apoptozę. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało podaje się in vivo w celu spowodowania apoptozy komórek wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest przeciwciałem 2.14.3 albo zawiera jego łańcuch ciężki, łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen.
Sposoby wytwarzania przeciwciał i linii komórkowych wytwarzających przeciwciała Immunizacja
W jednym z wykonań niniejszego wynalazku ludzkie przeciwciała wytwarza się poprzez immunizację zwierzęcia oprócz człowieka zwierającego część albo cały locus immunoglobulinowy antygenem IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, zwierzęciem oprócz człowieka jest XENOMOUSE™, czyli poddany zabiegom inżynierii genetycznej szczep myszy, który zawiera duże fragmenty ludzkich loci immunoglobulin i jest defektywny pod 10 względem wytwarzania mysiego przeciwciała. Patrz np. Green i wsp. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) oraz patenty USA 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 oraz 6130364. Patrz również WO 91/10741, opublikowany 25 lipca, 1991, WO 94/02602, opublikowany 3 lutego, 1994, WO 96/34096 i WO 96/33735, obydwa opublikowane 31 października, 1996, WO 98/16654, opublikowany 23 kwietnia, 1998, WO 98/24893, opublikowany 11 czerwca, 1998, WO 98/50433, opublikowany 12 listopada, 1998, WO 99/45031, opublikowany 10 września, 1999, WO 99/53049, opublikowany 21 października, 1999, WO 00 09560,
PL 228 041 B1 opublikowany 24 lutego, 2000 i WO 00/037504, opublikowany 29 czerwca, 2000. XENOMOUSE™ wytwarza ludzki repertuar w pełni ludzkich przeciwciał typu dojrzałego i wytwarza swoiste wobec ant ygenu ludzkie Mab. Druga generacja XENOMOUSE™ zawiera około 80% repertuaru ludzkich przeciwciał poprzez wprowadzenie fragmentów YAC o wielkości megazasad w konfiguracji linii zarodkowej ludzkich loci łańcuchów ciężkich i loci łańcuchów lekkich K. Patrz Mendez i wsp. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green i Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), ujawnienia których są tu włączone jako odniesienie.
Wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania przeciwciał anty-IGF-IR ze zwierząt innych niż człowiek i innych niż mysz poprzez immunizację zwierząt transgenicznych innych niż człowiek, które zawierają ludzkie loci immunoglobulin. Można wytworzyć takie zwierzęta przy zastosowaniu metod opisanych bezpośrednio powyżej. Metody ujawnione w tych patentach mogą być zmodyfik owane, jak opisano w patencie USA 5994619. W korzystnym wykonaniu zwierzętami innymi niż człowiek mogą być szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie.
W innym wykonaniu zwierzętami innymi niż człowiek zawierającymi ludzkie loci immunoglobulin są zwierzęta, które mają „minilocus” ludzkich immunoglobulin. W strategii minilocus, egzogenny locus Ig jest naśladowany poprzez włączenie poszczególnych genów pochodzących z locus Ig. A zatem do konstruktu do wstawienia do zwierzęcia wprowadza się jeden lub więcej genów VH, jeden lub więcej genów Dh jeden lub więcej genów JH, region stały mu i drugi region stały (korzystnie region stały gamma). Podejście to jest opisane między innymi w patencie USA nr 5545807, 5545806, 5625825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215 oraz 5643763, włączone tu jako odniesienie.
Zaletą podejścia minilocus jest tempo, w jakim można wytworzyć i wprowadzić do zwierząt konstrukty zawierające części locus Ig. Jednakże z drugiej strony znaczącą wadą podejścia minilocus jest to, że można uzyskać niedostateczne zróżnicowanie immunoglobulin dla podtrzymania pełnego rozwoju komórek B, a zatem może mieć miejsce wytwarzanie niższego poziomu przeciwciał.
W celu wytworzenia ludzkiego przeciwciała anty-IGF-IR zwierzę inne niż człowiek zawierające część albo cały locus immunoglobulinowy immunizuje się antygenem IGF-IR i izoluje się ze zwierzęcia przeciwciało albo komórkę wytwarzającą przeciwciało. Antygenem IGF-IR może być wyizolowany i/lub oczyszczony IGF-IR, a korzystnie jeśli jest IGF-IR ludzki. W innym wykonaniu antygenem IGF-IR jest fragment IGF-IR, korzystnie domena zewnątrzkomórkowa IGF-IR. W innym wykonaniu antygenem IGF-IR jest fragment, który zawiera co najmniej część epitopu IGF-IR. W innym wykonaniu antygenem IGF-IR jest komórka, która wyraża IGF-IR na swojej powierzchni, korzystnie komórka z nadekspresją IGF-IR na swojej powierzchni.
Immunizację zwierząt można przeprowadzić dowolną metodą znaną w tej dziedzinie. Patrz np. Harlow i Lane, Przeciwciała: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Sposoby immunizowania zwierząt innych niż człowiek, takich jak szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Harlow i Lane oraz patent USA 5994619. W korzystnym wykonaniu, antygen IGF-IR podaje się z adiuwantem w celu stymulacji odpowiedzi immunologicznej. Takie adiuwanty obejmują kompletny albo niekompletny adiuwant Freunda, RIBI (muramylodipeptydy) albo ISCOM (kompleksy immunostymulujące). Takie adiuwanty mogą chronić polipeptyd przed szybkim rozproszeniem poprzez odseparowanie go w postaci miejscowego depozytu albo mogą one zawierać substancje, które stymulują gospodarza do wydzielania czynników, które są chemotaktyczne dla makrofagów i innych składników systemu immunologicznego. Korzystne jest przy podawaniu polipeptydu, jeżeli harmonogram immunizacji będzie obejmował dwa albo więcej podawań polipeptydu na przestrzeni kilku 10 tygodni.
Przykład I dostarcza protokołu immunizacji XENOMOUSE™ ludzkim IGF-IR pełnej długości w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.
Wytwarzanie przeciwciał i linii komórkowych wytwarzających przeciwciała
Po immunizacji zwierzęcia antygenem IGF-IR, ze zwierzęcia można otrzymać przeciwciała i/lub komórki wytwarzające przeciwciała. Surowicę zawierającą przeciwciało anty-IGF-IR otrzymuje się ze zwierzęcia poprzez skrwawienie albo uśmiercenie zwierzęcia. Surowicę można użyć taką jak jest otrzymana ze zwierzęcia, z surowicy można otrzymać frakcję immunoglobulin albo z surowicy można oczyścić przeciwciała anty-IGF-IR. Surowica albo immunoglobuliny otrzymane w ten sposób są poliklonalne, co jest niekorzystne, ponieważ ilość przeciwciał, które można w ten sposób otrzymać jest ograniczona, a przeciwciała poliklonalne mają heterogenny zestaw właściwości.
PL 228 041 B1
W innym wykonaniu, z immunizowanego zwierzęcia można otrzymać wytwarzające przeciwciała unieśmiertelnione hybrydomy. Po immunizacji zwierzę uśmierca się i komórki B ze śledziony łączy się z unieśmiertelnionymi komórkami szpiczaka, co jest dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Harlow i Lane, jak wyżej. W korzystnym wykonaniu, komórki szpiczaka nie wydzielają peptydów immunoglobulinowych (nie wydzielająca linia komórkowa). Po fuzji i selekcji na antybiotyk hybrydomy przeszukuje się przy użyciu IGF-IR, jego części albo komórek wyrażających IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, wyjściowe przeszukiwanie przeprowadza się przy zastosowaniu enzymatycznego testu immunologicznego (ELISA) albo (RIA), korzystnie ELISA. Przykład przeszukiwania ELISA jest dostarczony w WO 00/37504, włączone tu jako odniesienie.
W innym wykonaniu, komórki wytwarzające przeciwciała można otrzymać od osoby, która ma chorobę autoimmunologiczną i która wyraża przeciwciała anty-IGF-IR. Komórki wyrażające przeciwciała anty-IGF-IR można wyizolować poprzez izolację białych komórek krwi i poddanie ich aktywowanemu fluorescencją sortowaniu komórek (FASC) albo przeszukiwaniu na płytkach opłaszczonych IGF-IR albo jego częścią. Te komórki można łączyć z ludzkim nie wydzielającym szpiczakiem w celu wytworzenia ludzkich hybrydom wyrażających ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR. Generalnie, jest to mniej korzystne wykonanie, ponieważ jest prawdopodobne, że przeciwciała anty-IGF-IR będą miały niskie powinowactwo wobec IGF-IR.
Hybrydomy wytwarzające przeciwciało anty-IGF-IR wybiera się, klonuje i dalej przeszukuje pod kątem pożądanych właściwości, włączając w to obfity wzrost hybrydomy, wysoki poziom wytwarzania przeciwciał i pożądaną charakterystykę przeciwciał, jak dyskutowano dalej poniżej. Hybrydomy można hodować i namnażać in vivo w syngenicznych zwierzętach, w zwierzętach, którym brak układu immunologicznego np. u nagich myszy albo w hodowli komórek in vitro. Sposoby selekcji, klonowania i namnażania hybrydom są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Korzystne jest, jeżeli immunizowanym zwierzęciem jest zwierzę inne niż człowiek, które wyraża geny immunoglobulinowe, a komórki B śledziony łączy się ze szpiczakiem pochodzącym z tego samego gatunku co zwierzę inne niż człowiek. Bardziej korzystnie, jeżeli immunizowanym zwierzęciem jest XENOMOUSE™, a liną komórkowa szpiczaka jest nie wydzielający mysi szpiczak, taki jak linia komórkowa szpiczaka NSO-bcl2. Patrz np. przykład I.
W jednym z aspektów wynalazek dostarcza hybrydom, które wytwarzają ludzkie przeciwciała anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu hybrydomami są hybrydomy mysie, jak opisano powyżej. W innym korzystnym wykonaniu, hybrydomy są wytwarzane w gatunkach innych niż człowiek i mysz, takich jak szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie. W innym wykonaniu, hybrydomami są hybrydomy ludzkie, w których nie wydzielający ludzki szpiczak jest połączony z ludzką komórką wyrażającą przeciwciało anty-IGF-IR.
Kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarza oraz sposoby wytwarzania przeciwciał poprzez rekombinowanie DNA
Dostarczone są cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku. W jednym z wykonań cząsteczka kwasu nukleinowego koduje łańcuch ciężki i/lub lekki immunoglobuliny anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu pojedyncza cząsteczka kwasu nukleinowego koduje łańcuch ciężki immunoglobuliny anty-IGF-IR, a inna cząsteczka kwasu nukleinowego koduje łańcuch lekki immunoglobuliny anty-IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu zakodowaną immunoglobuliną jest immunoglobulina ludzka, korzystnie ludzka IgG. Zakodowanym łańcuchem lekkim może być łańcuch λ albo łańcuch k, korzystnie łańcuch k.
Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region zmienny łańcucha lekkiego może pochodzić z genu Vk A30, A27 lub 012. W korzystnym wykonaniu, łańcuch lekki pochodzi z genu Vk A30. W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca łańcuch lekki zawiera region łączący pochodzący z Jk1 , Jk2 albo Jk4. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca łańcuch lekki zawiera nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do genu Vk z linii zarodkowej A30, korzystnie nie więcej niż sześć zmian aminokwasowych, a jeszcze korzystniej nie więcej niż trzy zmiany aminokwasowe.
Wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego (VL) zawierający co najmniej trzy zmiany aminokwasowe w porównaniu do sekwencji linii zarodkowej, gdzie zmiany aminokwasowe są identyczne do zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji linii zarodkowej w VL jednego z przeciwciał 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego 2.14.3.
PL 228 041 B1
Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową wszystkich CDR łańcucha lekkiego z 2.14.3. W innym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową SEK NR ID: 10 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEK NR ID: 9. W bardziej korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową wszystkich CDR z SEK NR ID: 10 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wszystkich CDR z SEK NR ID: 9.
Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową VL o sekwencji aminokwasowej, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z opisanym powyżej VL, a w szczególności VL o sekwencji aminokwasowej z SEK NR ID: 10. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z sekwencją kwasu nukleinowego jednej z SEK NR ID: 9. W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą VL jak opisano powyżej, a w szczególności cząsteczką kwasu nukleinowego, która zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL, która hybrydyzuje w 2 0 wysoce ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego o sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 9.
Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje region zmienny łańcucha lekkiego (VH) może pochodzić z genu VH DP-35, DP-47, DP-71 lub Vit-4/4.35, korzystnie genu VH DP-35. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera region łączący pochodzący z JH6 lub JH5, korzystniej JH6. Segment D pochodzi z 3-3, 6-19 lub 4-17. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do genu z linii zarodkowej DP-47, korzystnie nie więcej niż sześć zmian aminokwasowych, a jeszcze korzystniej nie więcej niż trzy zmiany am inokwasowe. W korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera co najmniej jedną zmianę aminokwasową w porównaniu do sekwencji z linii zarodkowej, gdzie zmiana aminokwasowa jest identyczna co zmiana aminokwasowa w stosunku do sekwencji z linii zarodkowej z łańcucha ciężkiego jednego z przeciwciał 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VH zawiera co najmniej trzy zmiany aminokwasowe w porównaniu do sekwencji z linii zarodkowej, gdzie zmiany aminokwasowe są identyczne co zmiany aminokwasowe w stosunku do sekwencji z linii zarodkowej z VH jednego z przeciwciał 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2, 4.17.3 lub 6.1.1.
W jednym z wykonań cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową VH z 2.14.3. W korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową wszystkich CDR łańcucha ciężkiego z 2.14.3. W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu 15 nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 albo taką, która zawiera sekwencję kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 11. W korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje sekwencję aminokwasową wszystkich CDR z SEK NR ID: 12 albo zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wszystkich CDR z SEK NR ID: 11.
W innym korzystnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje sekwencję aminokwasową VH, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z jedną z sekwencji aminokwasowych kodujących VH jak opisano bezpośrednio powyżej, a w szczególności VH o sekwencji aminokwasowej z SEK NR ID: 12. Wynalazek dostarcza również cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% albo 99% identyczna z sekwencją kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 11. W innym wyk onaniu, cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą VL, jest taka, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą VH jak opisano powyżej, a w szczególności VH, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12. Wynalazek dostarcza cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL, która hybrydyzuje w wysoce ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego o sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 11.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą jeden z albo obydwa całe łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciała anty-IGF-IR albo ich regiony zmienne można otrzymać z dowolnego źródła, które wytwarza przeciwciało anty-IGF-IR. Sposoby izolowania mRNA kodującego przeciwciało są dobrze znane
PL 228 041 B1 w tej dziedzinie. Patrz np. Sambrook i wsp. mRNA można użyć do wytworzenia cDNA do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) albo klonowania cDNA genów dla przeciwciała. W jednym z wykonań o wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego można otrzymać z hybrydomy, która wyraża przeciwciało anty-IGF-IR, jak opisano powyżej, korzystnie hybrydomy, która ma jako jednego z partnerów fuzji komórkę transgenicznego zwierzęcia, które wyraża ludzkie geny immunoglobulinowe, takiego jak XENOMOUSE™, zwierzęcia transgenicznego innego niż człowiek będącego myszą, zwierzęcia transgenicznego innego niż mysz. W innym wykonaniu hybrydoma pochodzi ze zwierzęcia nietransgenicznego innego niż człowiek, które można użyć np. do przeciwciał humanizowanych.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą cały łańcuch ciężki przeciwciała anty- IGF-IR można skonstruować poprzez połączenie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej domenę zmienną łańc ucha ciężkiego albo jego domenę wiążącą antygen z domeną stałą łańcucha ciężkiego. Podobnie, cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch lekki przeciwciała anty-IGF-IR można skonstruować poprzez połączenie cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej domenę zmienną łańcucha lekkiego albo jego domenę wiążącą antygen z domeną stalą łańcucha lekkiego. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch VH i VF można przekształcić w geny dla przeciwciał pełnej długości poprzez wstawienie ich do wektorów ekspresyjnych już kodujących, odpowiednio, regiony stałe łańcucha ciężkiego i regiony stałe łańcucha lekkiego, tak że segment VH jest połączony funkcjonalnie z segmentem(ami) regionu stałego łańcucha ciężkiego (CH) w obrębie wektora, a segment VF jest połączony funkcjonalnie z segmentem(ami) regionu stałego łańcucha lekkiego (CF) w obrębie wektora.
Alternatywnie, cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy VH lub VL przekształca się w geny dla przeciwciał pełnej długości poprzez łączenie np. poprzez ligację cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch VH z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą łańcuch CH przy zastosowaniu standardowych technik biologii molekularnej. To samo można osiągnąć stosując cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy VL i CL. Sekwencje ludzkich genów dla regionów stałych łańcucha ciężkiego i lekkiego są znane w tej dziedzinie. Patrz, np. Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wyd. 5. Publikacja NIH nr 91-3242, 1991. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy ciężkie i/lub lekkie pełnej długości można następnie wyrazić z komórki, do której zostały one wprowadzone i wyizolować przeciwciało anty-IGF-IR.
W korzystnym wykonaniu, kwas nukleinowy kodujący region zmienny łańcucha ciężkiego koduje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca region zmienny łańcucha lekkiego koduje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10. SEK NR ID: 28 przedstawia sekwencję aminokwasową, a SEK NR ID: 28 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego kodującego region stały łańcucha ciężkiego przeciwciał anty-IGF-IR 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1. A zatem, w korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha ciężkiego koduje SEK NR ID: 28, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha lekkiego koduje SEK NR ID: 26. W bardziej korzystnym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha ciężkiego ma sekwencję kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 27, a cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę stałą łańcucha lekkiego ma sekwencję kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 25.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą bądź łańcuch ciężki przeciwciała anty-IGF-IR, bądź jego domenę wiążącą antygen albo łańcuch lekki przeciwciała anty-IGF-IR, bądź jego domenę wiążącą antygen można wyizolować ze zwierzęcia innego niż człowiek i innego niż mysz, które wyraża ludzkie geny immunoglobulinowe i zostało poddane immunizacji antygenem IGF-IR. W innym wykonaniu cząsteczkę kwasu nukleinowego można wyizolować z komórki wytwarzającej przeciwciało antyIGF-IR pochodzącej ze zwierzęcia nietransgenicznego albo od człowieka - pacjenta, który wytwarza przeciwciała anty-IGF-IR. mRNA z komórek wytwarzających przeciwciała anty-IGF-IR można izolować przy zastosowaniu standardowych technik, klonować i/lub powielać stosując techniki PCR i konstrukcje bibliotek i przeszukiwać stosując standardowe protokoły do otrzymywania cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących łańcuchy ciężkie i lekkie przeciwciała anty-IGF-IR.
Cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do wyrażenia poprzez rekombinowanie DNA dużych ilości przeciwciał anty-IGF-IR, jak opisano powyżej.
Cząsteczki kwasu nukleinowego można również użyć do wytworzenia przeciwciał chimerowych, przeciwciał jednołańcuchowych, immunoadhezyn, diciał, przeciwciał zmutowanych i pochodnych przeciwciał, jak opisano dalej poniżej. Jeżeli cząsteczka kwasu nukleinowego pochodzi ze zwierzęcia innego niż człowiek, innego niż zwierzę transgeniczne, cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do humanizacji przeciwciała, jak opisano poniżej.
PL 228 041 B1
W innym wykonaniu cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku można użyć jako sondy albo startery do PCR dla specyficznych sekwencji przeciwciała. Przykładowo, cząsteczkę kwasu nukleinowego - sondę można zastosować w metodach diagnostycznych albo cząsteczkę kwasu nukleinowego starter do PCR można zastosować do powielania regionów DNA, które można użyć między innymi do izolowania sekwencji kwasów nukleinowych do wytwarzania domen zmiennych przeciwciał anty-IGF-IR. W korzystnym wykonaniu cząsteczkami kwasu nukleinowego są oligonukleotydy. W bardziej korzystnym wykonaniu oligonukleotydy pochodzą z regionów zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, oligonukleotydy kodują cały albo część jednego albo większej liczby CDR.
Wektory
Wynalazek dostarcza wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, które kodują łańcuch ciężki albo jego część wiążącą antygen.
Wynalazek dostarcza wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, które kodują łańcuch lekki albo jego część wiążącą antygen. Wynalazek dostarcza wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, kodujących fuzje białkowe, przeciwciała zmodyfikowane, fragmenty przeciwciał i sondy z nich pochodzące.
W celu wyrażenia przeciwciał albo części przeciwciał według wynalazku, DNA kodujący łańcuchy lekkiego i ciężkie pełnej długości otrzymane jak opisano powyżej wstawia się do wektorów ekspresyjnych, tak, że geny są połączone funkcjonalnie z transkrypcyjnymi i translacyjnymi sekwencjami kontrolnymi. Wektory ekspresyjne obejmują plazmidy, retrowimsy, kosmidy, YAC, episomy pochodzące od EBV i temu podobne. Gen dla przeciwciała wstawia się poprzez ligację do wektora, tak aby transkrypcyjne i translacyjne sekwencje kontrolne w obrębie wektora spełniały swoją zamierzoną funkcję regulowania transkrypcji i translacji genu dla przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące transkrypcję wybiera się tak, aby pasowały do zastosowanych komórek gospodarza do ekspresji. Gen dla łańcucha lekkiego przeciwciała i gen dla łańcucha ciężkiego przeciwciała można wstawić do odrębnych wektorów. W korzystnym wykonaniu obydwa geny są wstawione do tego s amego wektora ekspresyjnego. Geny dla przeciwciała wstawia się do wektora ekspresyjnego przy zastosowaniu standardowych metod (np. ligacji komplementarnych miejsc restrykcyjnych we fragmencie genu dla przeciwciała i wektorze albo ligację tępych końców jeżeli miejsca restrykcyjne są nieobecne).
Dogodny wektor jest takim, który koduje funkcjonalnie kompletną ludzką sekwencję CH lub CL immunoglobuliny, z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi utworzonymi w taki sposób, aby można było wstawić i wyrazić dowolną sekwencję VH lub VL, jak opisano powyżej. W takich wektorach, składanie mRNA zwykle następuje pomiędzy donorowym miejscem składania we wstawionym regionie J i akceptorowym miejscem składania, poprzedzającym ludzki region C, a także regionach składania, które występują w obrębie ludzkich eksonów CH. Poliadenylacja i terminacja transkrypcji następują w natywnych miejscach chromosomowych za regionami kodującymi.
Zrekombinowany wektor ekspresyjny może również kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia wydzielenie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen dla łańcucha przeciwciała można sklonować w wektorze w taki sposób, że peptyd sygnałowy jest połączony w ramce z końcem aminowym genu dla łańcucha przeciwciała. Peptydem sygnałowym może być peptyd sygnałowy immunoglobuliny albo heterologiczny peptyd sygnałowy (tj. peptyd sygnałowy z białka innego niż immunoglobulina).
Poza genami dla łańcucha przeciwciała zrekombinowane wektory ekspresyjne przenoszą sekwencje regulacyjne, które kontrolują ekspresję genów dla łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Będzie wiadome dla specjalisty w tej dziedzinie, że zaprojektowanie wektora ekspresyjnego, włączając w to wybór sekwencji regulacyjnych może zależeć od takich czynników jak wybór komórki gospodarza, która ma być transformowana, pożądany poziom ekspresji białka, itd. Korzystne sekwe ncje regulacyjne dla ekspresji w komórkach ssaków obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokimi poziomami ekspresji białka w komórkach ssaków, takie jak promotory i wzmacniacze pochodzące z retrowirusowych LTR, cytomegalowirusa (CMV) (takie jak promotor/wzmacniacz CMV), Simian Virus 40 (SV40)(takie jak promotor/wzmacniacz SV40), adenowirusa (np. główny późny promotor adenowirusa (AdMLP)), polioma oraz mocne promotory ssacze, takie jak natywne promotory immunoglobulinowe i aktynowe. Dla dalszego opisu wirusowych elementów regulacyjnych i ich sekwencji patrz np. patent USA nr 5168062 dla Stinski, patent USA nr 4510245 dla Bell i wsp. oraz patent USA nr 4968615 dla Schaffner i wsp.
Poza genami dla łańcucha przeciwciała i sekwencjami regulacyjnymi zrekombinowane wektory ekspresyjne mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora
PL 228 041 B1 w komórkach gospodarza (np. początki replikacji) i geny dla markerów selekcyjnych. Geny dla markerów selekcyjnych ułatwiają selekcję w komórkach gospodarza, do którego wektor został wprowadzony (patrz np. patenty USA nr 4399216, 4634665 i 5179017, wszystkie dla Axel i wsp.). Przykładowo, na ogół gen markera selekcyjnego nadaje oporność na leki, takie jak G418, higromycyna albo metotreksan, komórce gospodarza, do której wektor został wprowadzony. Korzystne geny markera selekcyjnego obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do zastosowania z komórkami gospodarza dhfr- z selekcją/amplifikacją na metotreksanie) oraz gen neo (do selekcji na G418).
Komórki gospodarza innego niż hybrydoma i sposoby wytwarzania białka poprzez rekombinowanie DNA
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące bądź łańcuch ciężki, bądź jego domenę wiążącą a ntygen albo łańcuch lekki, bądź jego domenę wiążącą antygen przeciwciała anty-IGF-IR oraz wektory zawierające te cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do transformacji odpowiedniej ssaczej komórki gospodarza. Transformację można przeprowadzić przy zastosowaniu dowolnej metody wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza. Sposoby wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują transfekcję za pośrednictwem dekstranu, precypitację fosforanem wapniowym, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektroporację, bombardowanie cząstkami, zamykanie polinukleotydów w liposomach, koniugaty peptydowe, dendrymery i bezpośrednie wstrzykiwanie DNA do jąder. Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego można wprowadzać do komórek ssaków przy zastosowaniu wektorów wirusowych. Sposoby transformowania komórek są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. patenty USA 4399216, 4912040, 4740461 i 4959455.
Ssacze linie komórkowe dostępne jako gospodarze dla ekspresji są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych dostępnych z American Type Culture Collection (ATCC), włączając w to między innymi komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), NSO, komórki SP2, komórki HeLa, komórki nerki młodego chomika (BHK), komórki małpiej nerki (COS), ludzkie komórki raka wątroby (np., Hep G2), komórki A549, komórki 3T3 i wiele innych linii komórkowych. Ssacze komórki gospodarza obejmują komórki człowieka, myszy, szczura, owcy, świni, kozy, bydła, konia lub chomika. Szczególnie korzystne linie komórkowe wybiera się poprzez ustalenie, które linie komórkowe mają wysokie poziomy ekspresji. Innymi liniami komórkowymi, które można zastosować są linie komórek owadzich, takie jak komórki Sf9, komórki płazów, komórki bakteryjne, komórki roślinne i komórki grzybów. Po wprowadzeniu do ssaczych komórek gospodarza zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych kodujących łańcuch ciężki albo jego domenę wiążącą antygen, łańcuch lekki albo jego domenę wiążącą antygen, przeciwciała wytwarza się poprzez hodowanie komórek gospodarza przez okres czasu wystarczający dla umożliwienia ekspresji przeciwciała w komórkach gospodarza, albo korzystniej, wydzielenia przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której komórki gospodarza są hodowane. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej przy zastosowaniu standardowych metod oczyszczania białka.
Ponadto, ekspresję przeciwciał według wynalazku (lub innych pochodzących z nich cząsteczek) z wytwarzających je linii komórkowych można wzmocnić poprzez zastosowanie wielu znanych technik. Przykładowo, system ekspresji genu syntetazy glutaminowej jest powszechnie stosowanym podejściem do wzmacniania ekspresji w pewnych warunkach. System GS jest dyskutowany w całości albo częściowo w powiązaniu z europejskimi patentami nr 0216846, 0256055 i 0323997 oraz europejskim zgłoszeniem patentowym nr 89303964.4.
Jest prawdopodobne, że przeciwciała wyrażane w różnych liniach komórkowych albo zwierzętach transgenicznych będą miały odmienny wzór glikozylacji. Jednakże wszystkie przeciwciała kodowane przez dostarczone tu cząsteczki kwasu nukleinowego albo zawierające dostarczone tu sekwencje kwasu nukleinowego są częścią niniejszego wynalazku, niezależnie od glikozylacji przeciwciał.
Zwierzęta transgeniczne
Wynalazek dostarcza zwierząt transgenicznych innych niż człowiek zawierających jedną albo więcej cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku. Przeciwciała można wytwarzać i odzyskiwać z tkanki albo płynów ciała, takich jak mleko, krew albo mocz kóz, krów, koni, świń, szczurów, myszy, królików, chomików i innych ssaków. Patrz np. patenty USA nr 5827690, 5756687, 5750172 i 5741957. Jak opisano powyżej, zwierzęta transgenicznie inne niż człowiek, które zawierają ludzkie loci immunglobulin można wytwarzać poprzez immunizację IGF-IR albo jego częścią.
W innym wykonaniu zwierzęta transgeniczne inne niż człowiek wytwarza się poprzez wprowadzenie jednej albo więcej cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku do zwierzęcia przy
PL 228 041 B1 zastosowaniu standardowych technik. Patrz Hogan, jak wyżej. Komórkami transgenicznymi używanymi do wytworzenia zwierzęcia transgenicznego mogą być embrionalne komórki macierzyste albo komórki somatyczne.
Organizmami transgenicznymi innymi niż człowiek mogą być chimerowe, niechimerowe heterozygoty i niechimerowe homozygoty. Patrz np. Hogan i wsp., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual wyd. 2., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson i wsp., Mose Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000) oraz Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). W innym wykonaniu organizmy transgeniczne inne niż człowiek mogą mieć ukierunkowane przerwanie i wymianę na fragment, który koduje łańcuch ciężki i/lub łańcuch lekki będący przedmiotem zainteresowania. W korzystnym wyk onaniu zwierzęta transgeniczne zawierają i wyrażają cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuchy ciężkie i lekkie, które wiążą się swoiście z IGL-IR, korzystnie ludzkim IGL-IR. W innym wykonaniu zwierzęta transgeniczne zawierają cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące zmodyfikowane przeci wciało, takie jak przeciwciało jednołańcuchowe, przeciwciało chimerowe albo przeciwciało humanizowane. Przeciwciała anty-IGL-IR można wytworzyć w dowolnym zwierzęciu transgenicznym. W korzystnym wykonaniu zwierzętami transgenicznymi innymi niż człowiek są myszy, szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie. Zwierzęta transgeniczne inne niż człowiek wyrażają takie zakodowane polipeptydy we krwi, mleku, moczu, ślinie, łzach, śluzie i innych płynach ciała.
Biblioteki w oparciu o prezentację na fagach
Przeciwciało anty-IGL-IR albo jego części wiążące antygen może być wytworzone sposobem obejmującym etapy syntetyzowania biblioteki ludzkich przeciwciał na fagach, przeszukiwanie biblioteki IGL-IR lub jego częścią, izolowanie faga, który wiąże się z IGL-IR i otrzymanie przeciwciała z faga. Jedna z metod wytwarzania ludzkich przeciwciał obejmuje etap immunizowania zwierzęciagospodarza innego niż człowiek zawierającego locus ludzkiej immunoglobuliny stosując IGL-IR lub jego immunogenną część w celu uzyskania odpowiedzi immunologicznej, wydzielenia ze zwierzęcia komórek, które są odpowiedzialne za wytwarzanie przeciwciał, izolowania RNA z wydzielonych komórek, przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji na RNA w celu wytworzenia cDNA, powielenia cDNA z zastosowaniem startera i wstawienia cDNA do wektora do prezentacji na fagu, tak że przeciwciała są wyrażane na fagu. Można w ten sposób otrzymać zrekombinowane przeciwciała anty-IGF-IR.
Poza ujawnionymi tu przeciwciałami anty-IGF-IR zrekombinowane ludzkie przeciwciała antyIGF-IR według wynalazku można wyizolować poprzez przeszukiwanie zrekombinowanej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał, korzystnie biblioteki scFv w oparciu o prezentację na fagach, wytworzonej przy użyciu ludzkich cDNA VL i VH wytworzonych z mRNA pochodzącego z ludzkich limfocytów. Sposoby wytwarzania i przeszukiwania takich bibliotek są dobrze znane w tej dziedzinie. Istnieją dostępne handlowo zestawy do wytwarzania bibliotek w oparciu o prezentację na fagach (np. Pharmacia Recombinant Phage Antybody System, nr katalogowy 27-9400-01 oraz zestaw do Stratagene SurQAP phage display kit, nr katalogowy 240612). Są również inne metody i odczynniki, które można zastosować do wytwarzania i przeszukiwania bibliotek w oparciu o prezentację na fagach (patrz np., Ladner i wsp. patent USA nr 5223409; Kang i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/18619; Dower i wsp. Publikacja PCT nr WO 91/17271; Winter i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/20791; Markland i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/15679; Breitling i wsp. Publikacja PCT nr WO 93/01288; McCafferty i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/01047; Garrard i wsp. Publikacja PCT nr WO 92/09690; Fuchs i wsp. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay i wsp. (1992) Hum. Antybod. Hybridomas 3: 81-85; Huse i wsp. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths i wsp. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins i wsp. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson i wsp. (1991) Nature 352: 624-628; Gram i wsp. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad i wsp. (1991) Bio/Technology 9: 13731377; Hoogenboom i wsp. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137 oraz Barbas i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982.
W celu wyizolowania ludzkich przeciwciał anty-IGF-IR o pożądanych cechach, ludzkie przeciwciało anty-IGF-IR jak tu opisano stosuje się najpierw do selekcji ludzkich sekwencji łańcucha lekkiego i ciężkiego mających podobną aktywność wiązania wobec IGF-IR przy użyciu metod piętnowania epitopowego opisanych w Hoogenboom i wsp. Publikacja PCT nr WO 93/06213. Korzystne jest, jeżeli bibliotekami przeciwciał zastosowanymi w tej metodzie są biblioteki scFv wytworzone i przeszukiwane jak opisano w McCafferty i wsp., publikacja PCT nr WO 92/01047, McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: 552-554 oraz Griffiths i wsp., (1993) EMBO J 12: 725-734. Korzystne jest przeszukiwane bibliotek przeciwciała przy zastosowaniu jako antygen ludzkiego IGF-IR.
PL 228 041 B1
Po wstępnej selekcji ludzkich segmentów VL i VH, przeprowadza się doświadczenia „mieszania i dopasowywania”, w którym różne pary wyselekcjonowanych wstępnie segmentów VL i VH przeszukuje się pod kątem wiązania IGF-IR w celu wybrania korzystnej kombinacji pary VL/VH. Dodatkowo, w celu dalszego polepszenia jakości przeciwciała, segmenty VL i VH z korzystnej pary (par) VL/VH można poddać losowej mutagenezie, korzystnie w obrębie regionu CDR3 VH i/lub VL, w procesie analogicznym do procesu powstawania mutacji somatycznych in vivo odpowiedzialnego za dojrzewanie powinowactwa przeciwciał w czasie naturalnej odpowiedzi immunologicznej. Takie dojrzewanie powinowactwa in vitro można uzyskać poprzez powielenie regionów VH i VL stosując startery do PCR komplementarne odpowiednio do VH CDR3 lub VL CDR3 przy użyciu starterów, które zostały „naszpikowane” w pewnych pozycjach losową mieszaniną czterech zasad nukleotydowych, tak że otrzymane w rezultacie fragmenty PCR kodują segmenty VH i VL, do których w regionach CDR3 VH i/lub VL zostały wprowadzone losowe mutacje. Te losowo zmutowane segmenty VH i VL można przeszukiwać ponownie pod kątem wiązania się z IGF-IR.
Po przeszukiwaniu i izolacji przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku z biblioteki zrekombinowanych przeciwciał w oparciu o prezentację, z układu do prezentacji (np. genomu faga) można odzyskać kwas nukleinowy kodujący wybrane przeciwciało i subklonować w innych wektorach ekspresyjnych przy zastosowaniu standardowych technik rekombinowania DNA. Jeśli to pożądane, kwas nukleinowy można poddać dalszym manipulacjom w celu utworzenia innych postaci przeciwciała według wynalazku, jak opisano poniżej. W celu wyrażenia zrekombinowanego ludzkiego przeciwciała wyizolowanego poprzez przeszukiwanie biblioteki kombinatorycznej, DNA kodujący przeciwciało klonuje się do zrekombinowanego wektora ekspresyjnego i wprowadza do ssaczych komórek gospodarza, jak opisano powyżej.
Przełączanie klas
Niniejszym opisany został mechanizm, poprzez który jedna klasa przeciwciała anty-IGF-IR może zmienić się na inną. Kwas nukleinowy kodujący VL albo VH izoluje się przy zastosowaniu metod dobrze znanych w tej dziedzinie, tak że nie zawierają żadnych sekwencji kwasu nukleinowego kodujących CL lub CH. Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą VL lub VH łączy się następnie funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą CL lub CH z innej klasy cząsteczek immunoglobulin. Można tego dokonać stosując wektor albo cząsteczkę kwasu nukleinowego, która zawiera łańcuch CL lub CH, jak opisano powyżej. Przykładowo, klasę przeciwciała anty-IGF-IR, które wyjściowo było IgM można zmienić na IgG. Ponadto, zmianę klas można zastosować do przekształcenia jednej podklasy IgG w inną, np. z IgG1 na IgG2. Korzystny sposób wytwarzania przeciwciała według wynalazku o pożądanym izotypie obejmuje etapy izolowania kwasu nukleinowego kodującego łańcuch ciężki przeciwciała anty-IGF-IR i kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki przeciwciała anty-IGF-IR, otrzymanie regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, połączenie poprzez ligację regionu zmiennego łańcucha ciężkiego z domeną stałą łańcucha ciężkiego o pożądanym izotypie, wyrażenie łańcucha lekkiego i poddanego ligacji łańcucha ciężkiego w komórce i zebranie przeciwciała anty-IGF-IR o pożądanym fenotypie.
Pochodne przeciwciał
Można użyć opisane powyżej cząsteczki kwasu nukleinowego do wytworzenia pochodnych przeciwciał stosując techniki i metody dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie.
Przeciwciała humanizowane
Jak dyskutowano powyżej w związku z wytwarzaniem ludzkiego przeciwciała, istnieją zalety wytwarzania przeciwciał z obniżoną immunogennością. Do pewnego stopnia można to uzyskać w powiązaniu z technikami humanizacji i technikami prezentacji stosując odpowiednie biblioteki. Będzie można dostrzec, że mysie przeciwciała albo przeciwciała z innych gatunków można humanizować albo upodobnić do naczelnych stosując techniki znane w tej dziedzinie. Patrz na przykład, Winter i Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) oraz Wright i wsp. Crit. Reviews in Immunol 12:125-168 (1992).
Przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania można skonstruować poprzez techniki rekombinowania DNA w celu zastąpienia CH1, CH2, CH3, domen zawiasowych i/lub domeny zrębowej odpowiednimi sekwencjami ludzkimi (patrz WO 92/02190 i patenty USA nr 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 i 5777085). W korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być humanizowane poprzez zastąpienie CH1 , CH2, CH3, domen zawiasowych i/lub domeny zrębowej odpowiednimi sekwencjami ludzkimi, zachowując CDR łańcucha ciężkiego, łańcucha lekkiego albo obydwu, łańcucha ciężkiego i lekkiego.
PL 228 041 B1
Przeciwciała zmutowane
Cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza można użyć do wytworzenia zmodyfikowanych przeciwciał anty-IGF-IR. Przeciwciała mogą być zmutowane w domenach zmiennych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich w celu zmiany właściwości wiązania przeciwciała. Przykładowo, mutacji można dokonać w jednym z regionów CDR w celu zwiększenia lub zmniejszenia Kd przeciwciała wobec IGF-IR, zwiększenia lub zmniejszenia Koff albo zmiany swoistości wiązania przeciwciała. Techniki ukierunkowanej mutagenezy są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. Sambrook i wsp. oraz Ausubel i wsp., jak wyżej. W korzystnym wykonaniu, mutacji dokonuje się w miejscu reszty am inokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu do linii zarodkowej w regionie zmiennym przeciwciała anty-IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu jedną albo większą liczbę mutacji dokonuje się w miejscu reszty aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu do linii zarodkowej w regionie zmiennym albo regionie CDR przeciwciała anty-IGF-IR 2.14.3. W innym wykonaniu jedną albo większą liczbę mutacji dokonuje się w miejscu reszty aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu do linii zarodkowej w regionie zmiennym albo regionie CDR, których sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona w SEK NR ID: 10 i 12 albo których sekwencja kwasu nukleinowego jest przedstawiona w SEK NR ID: 9 i 11. W innym wykonaniu cząsteczki kwasu nukleinowego są zmutowane w jednym albo większej liczbie regionów zrębowych. Mutacji można dokonać w regionie zrębowym albo domenie stałej w celu zwiększenia okresu półtrwania przeciwciała anty-IGF-IR. Patrz np. WO 00/09560, opublikowane 24 lutego, 2000, włączone tu jako odniesienie. W jednym z wykonań może mieć miejsce jedna, trzy albo pięć mutacji punktowych i nie więcej niż dziesięć mutacji punktowych. Mutacji w regionie zrębowym albo domenie stałej można również dokonać w celu zmiany immunogenności przeciwciała, w celu dostarczenia miejsca dla kowalencyjn ego albo niekowalencyjnego wiązania z inną cząsteczką albo zmiany takich właściwości, jak wiązanie dopełniacza. Mutacje mogą być dokonane w każdym z regionów zrębowych, każdej z domen stałej i każdym z regionów zmiennych w pojedynczym zmutowanym przeciwciele. Alternatywnie, mutacje mogą być dokonane tylko w jednym z regionów zrębowych, domen stałych i regionów zmiennych w pojedynczym zmutowanym przeciwciele.
W jednym z wykonań, ma miejsce nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w każdym z regionów VH lub VL zmutowanego przeciwciała anty-IGF-IR w porównaniu do przeciwciała antyIGF-IR przed mutacją. W bardziej korzystnym wykonaniu ma miejsce nie więcej niż pięć zmian aminokwasowych w każdym z regionów VH lub VF zmutowanego przeciwciała anty-IGF-IR, korzystniej nie więcej niż trzy zmiany aminokwasowe. W innym wykonaniu, ma miejsce nie więcej niż piętnaście zmian aminokwasowych w domenach stałych, korzystniej nie więcej niż dziesięć zmian aminokwas owych, a jeszcze korzystniej nie więcej niż pięć zmian aminokwasowych.
Przeciwciała zmodyfikowane
W innym wykonaniu można wytworzyć fuzję przeciwciałową albo immunoadhezynę, która zawiera całe albo część przeciwciała anty-IGF-IR połączone z innym polipeptydem. W korzystnym wykonaniu, jedynie regiony zmienne przeciwciała anty-IGF-IR są połączone z innym polipeptydem. W innym korzystnym wykonaniu domena VH przeciwciała anty-IGF-IR jest połączona z pierwszym polipeptydem, podczas gdy domena VL przeciwciała anty-IGF-IR jest połączona z drugim polipeptydem, który jest połączony z pierwszym polipeptydem w taki sposób, że domeny VH i VL mogą oddziaływać ze sobą z wytworzeniem miejsca wiązania przeciwciała. W innym korzystnym wykonaniu dom ena VH jest oddzielona od domeny VL przez łącznik w taki sposób, że domeny VH i VL mogą ze sobą oddziaływać (patrz poniżej pod „Przeciwciała jednołańcuchowe”). Przeciwciało VH-łącznik-VL łączy się następnie z polipeptydem będącym przedmiotem zainteresowania. Fuzja przeciwciałowa jest przydatna do kierowania polipeptydu do komórki albo tkanki wyrażającej IGF-IR. Polipeptyd może być czynnikiem terapeutycznym, takim jak toksyna, czynnik wzrostu albo inne białko regulacyjne albo może być czynnikiem diagnostycznym, takim jak enzym, który można łatwo uwidocznić, takim jak peroksydaza chrzanowa. Ponadto, można wytworzyć fuzję przeciwciałową, w której dwa (albo większa liczba) przeciwciał jednołańcuchowych jest połączonych ze sobą. Jest to przydatne, kiedy chce się wytworzyć przeciwciało dwuwartościowe albo wielowartościowe z jednego łańcucha polipeptydowego albo kiedy chce się wytworzyć przeciwciało bispecyficzne.
W celu wytworzenia przeciwciała jednołańcuchowego, (scFv), fragmenty DNA kodujące VH i VL łączy się funkcjonalnie z innym fragmentem kodującym elastyczny łącznik, np. kodującym sekwencję aminokwasową (Gly4-Ser)3 (SEK NR ID: 60), tak że sekwencje VH i VL mogą być wyrażane jako ciągły pojedynczy łańcuch białkowy z regionami VL i VH połączonymi przez elastyczny łącznik (patrz np.
PL 228 041 B1
Bird i wsp. (1988) Science 242: 423-426; Huston i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 58795883; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: 552-554). Przeciwciało jednołańcuchowe może być jednowartościowe, jeżeli użyje się jednego VH i VL, dwuwartościowe jeżeli użyje się dwóch VH i VL albo wielowartościowe jeżeli użyje się więcej niż dwóch VH i VL.
W innym wykonaniu można wytworzyć przeciwciała zmodyfikowane wykorzystując cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała anty-IGF-IR. Na przykład, można wytworzyć „Kappaciała” (111 i wsp., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), „Miniciała” (Martin i wsp., EMBO J 13: 53-39 (1994)), „Diciała” (Holliger i wsp., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)) albo „Janusiny” (Traunecker i wsp., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) oraz Traunecker i wsp. „Janusin: new molecular design for bispecific reagents” Int J Cancer Suppl 7: 51 -52 (1992)) stosując standardowe techniki biologii molekularnej według nauk z tego opisu.
W innym aspekcie można wytworzyć przeciwciała chimerowe i bispecyficzne.
Można wytworzyć przeciwciała chimerowe, które zawierają CDR i regiony zrębowe z różnych przeciwciał. W korzystnym wykonaniu CDR przeciwciała chimerowego obejmują wszystkie CDR regionów zmiennych łańcucha ciężkiego albo łańcucha lekkiego przeciwciała anty-IGF-IR, podczas gdy regiony zrębowe pochodzą z jednego lub większej liczby odmiennych przeciwciał. W bardziej korzys tnym wykonaniu CDR przeciwciała chimerowego obejmują wszystkie CDR regionów zmiennych łańcucha lekkiego i łańcuch ciężki przeciwciała anty-IGF-IR. Regiony zrębowe mogą być z innych gatunków i mogą być, w korzystnym wykonaniu, humanizowane. Alternatywnie, regiony zrębowe mogą być z innego przeciwciała ludzkiego.
Można wytworzyć przeciwciało bispecyficzne, które wiąże się swoiście z IGF-IR poprzez jedną domenę wiążącą i z drugą cząsteczką poprzez drugą domenę wiążącą. Przeciwciało bispecyficzne można wytworzyć przy zastosowaniu technik biologii molekularnej albo może być połączone razem fizycznie. Ponadto, można wytworzyć przeciwciała jednołańcuchowe zawierające więcej niż jeden VH i VL które wiążą się swoiście z IGF-IR i z inną cząsteczką. Takie przeciwciała bispecyficzne można wytworzyć przy zastosowaniu technik dobrze znanych w tej dziedzinie, na przykład według (i) i (ii) patrz np. Fanger i wsp. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) oraz Wright i Harris, jak wyżej oraz według (iii) patrz np. Traunecker i wsp. Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). W innym korzystnym wykonaniu przeciwciała bispecyficzne wiążą się z IGF-IR i z inną cząsteczką wyrażaną na wysokim poziomie na komórkach rakowych albo nowotworowych. W bardziej korzystnym wykonaniu inną cząsteczką jest receptor erbB2, VEGF, CD20 lub EGF-R.
W jednym wykonaniu opisane są zmodyfikowane przeciwciała wytworzone przy użyciu jednego albo większej liczby regionów CDR przeciwciała 2.14.3. W innym wykonaniu zmodyfikowane przeciwciała są wytworzone przy użyciu regionów CDR, których sekwencja aminokwasowa jest przedstawiona w SEK NR ID: 10 lub 12, albo których sekwencja kwasu nukleinowego jest przedstawiona w SEK NR ID: 9 lub 11.
Przeciwciała derywatyzowane i wyznakowane
Przeciwciało albo część przeciwciała według wynalazku można poddać derywatyzacji albo połączyć z inną cząsteczką (np. innym peptydem albo białkiem). Generalnie, przeciwciała albo ich część poddaje się derywatyzacji w taki sposób, że derywatyzacja albo znakowanie nie zmienia w niekorzystny sposób wiązania IGF-IR. A zatem przeciwciała albo ich część według wynalazku mają obejmować zarówno nienaruszone, jak i zmodyfikowane postaci opisanych tu ludzkich przeciwciał antyIGF-IR. Przykładowo, przeciwciała albo ich część według wynalazku mogą być połączone funkcjonalnie (poprzez połączenie chemiczne, fuzję genetyczną, połączenie niekowalencyjne albo w inny sposób) z jedną albo więcej reszt molekularnych, takich jak inne przeciwciało (np. przeciwciało bispecyficzne albo diciało), czynnik do wykrywania, czynnik cytotoksyczny, czynnik farmaceutyczny i/lub białko albo peptyd, który może pośredniczyć w wiązaniu się przeciwciała albo części przeciwciała z inną cząsteczką (taką jak rdzeń streptawidyny albo znacznik polihistydynowy).
Jeden z typów przeciwciała derywatyzowanego wytwarza się poprzez łączenie krzyżowe dwóch albo większej liczby przeciwciał (tego samo typu albo innego typu, np. w celu wytworzenia przeciwciał bispecyficznych). Odpowiednie łączniki krzyżowe obejmują łączniki heterobifunkcjonalne, mające dwie grupy o odrębnej reaktywności oddzielone przez odpowiedni łącznik (np. ester m-maleimidobenzoiloN-hydroksysuckcynimidowy) lub homobifunkcjonalne (np. suberan disukcynimidylowy). Takie łączniki są dostępne z Pierce Chemical Company, Rockford, 111.
Innym typem przeciwciała derywatyzowanego jest przeciwciało wyznakowane. Przydatne odczynniki do wykrywania, z którymi przeciwciało albo część przeciwciała według wynalazku mogą być
PL 228 041 B1 połączone obejmują związki fluorescencyjne, włączając w to fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, chlorek 5-dimetyloamino-1-naftalenosulfonylowy, fikoerytrynę, lantanidofosfory i temu podobne. Przeciwciało może być również wyznakowane enzymami, które są przydatne do wykrywania, takimi jak peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, alkaliczna fosfataza, oksydaza glukozowa i temu podobne. Kiedy przeciwciało jest wyznakowane wykrywalnym enzymem, wykrywa się go poprzez dodanie dodatkowych czynników, które wykorzystuje enzym dla wytworzenia produktu reakcji, który można wyróżnić. Przykładowo, kiedy obecnym czynnikiem jest peroksydaza chrzanowa dodatek nadtlenku wodom i diaminobenzydyny prowadzi do barwnego produktu reakcji, który można wykryć. Przeciwciało może być również wyznakowane biotyną i wykrywane poprzez pośredni pomiar wiązania awidyny albo streptawidyny. Przeciwciało może być również wyznakowane czynnikiem magnetycznym, takim jak gadolin. Przeciwciało może być również wyznakowane określonymi uprzednio epitopami polipeptydowymi rozpoznawanymi przez drugorzędowy wskaźnik (np. para sekwencji suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla przeciwciał drugorzędowych, domeny wiązania metali, znaczniki epitopowe). W niektórych wykonaniach, znaczniki są przyłączone poprzez ramiona łącznikowe o różnej długości, aby zmniejszyć potencjalną zawadę steryczną.
Przeciwciało anty-IGF-IR może być również wyznakowane radioaktywnym aminokwasem. Znacznik radioaktywny można zastosować zarówno dla celów diagnostycznych jak i terapeutycznych. Przykładowo, znacznik radioaktywny można zastosować w celu wykrycia nowotworów wyrażających IGF-IR poprzez zastosowanie promieni X albo innych technik diagnostycznych. Ponadto, znacznik radioaktywny można zastosować leczniczo jako toksynę dla komórek nowotworowych albo nowotworów. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują między innymi następujące: radioizotopy lub radionuklidy - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 1251,131I.
Przeciwciało anty-IGF-IR może być również derywatyzowane przy użyciu grupy chemicznej, takiej jak glikol polietylenowy (PEG), grupy metylowej lub grupy etylowej albo grupy węglowodanowej. Grupy te mogą być przydatne do polepszenia właściwości biochemicznych przeciwciała, np. dla zwiększenia okresu półtrwania w surowicy albo zwiększenia wiązania w tkance.
Kompozycje i zestawy farmaceutyczne
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzenia związanego z hiperproliferacją u ssaka, która zawiera skuteczną terapeutycznie ilość związku według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. W jednym z wykonań, taka kompozycja farmaceutyczna służy do leczenia raka, takiego jak rak mózgu, płuca, płaskokomórkowy, pęcherza, żołądka, trzustki, sutka, głowy, szyi, nerki, jajnika, prostaty, jelita grubego, przełyku, ginekologicznego lub tarczycy. W innym wykonaniu, taka kompozycja farmaceutyczna dotyczy nierakowych zaburzeń związanych z hiperproliferacją, takich jak, bez ograniczania, restenoza po zabiegu angioplastyki i łuszczyca.
Przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku mogą zostać włączone do kompozycji farmaceutycznych, odpowiednich do podawania pacjentom. W sytuacji typowej, kompozycja farmaceutyczna zawiera przeciwciało według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Stosowane tu określenie „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik” obejmuje każdy i wszystkie rozpuszczalniki, nośniki postaci rozproszonych, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe, środki izotoniczne i opóźniające absorpcję i podobne, które są zgodne fizjologicznie. Przykłady dopuszczalnych farmaceutyc znie nośników obejmują jeden lub więcej spośród wody, roztworu soli fizjologicznej, roztworu soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem, dekstrozy, glicerolu, etanolu i podobnych oraz ich kombinacji. W wielu przypadkach korzystne będzie włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol lub chlorku sodu. Akceptowalne farmaceutycznie substancje, takie jak zwilżające lub małe ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki konserwujące lub bufory, które poprawiają okres przechowywania lub skuteczność przeciwciała lub części przeciwciała.
Kompozycje według tego wynalazku mogą mieć różne formy. Obejmują one, na przykład, formy dawkowania płynne, półstałe i stałe, takie jak roztwory płynne (np. do zastrzyków i wlewów), postacie rozproszone lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna forma zależy od zamierzonego trybu dawkowania i zastosowania terapeutycznego. Typowe korzystne kompozycje mają formę roztworów do zastrzyków lub wlewów, takich jak kompozycje podobne do tych, których używa się do uodpornienia biernego ludzi za pomocą innych przeciwciał. Korzystnym sposobem podawania jest podawanie pozajelitowe (np. dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe). W wykonaniu korzystnym przeciwciało podaje się za pomocą wlewu lub zastrzyku dożylnego. W innym korzystnym wykonaniu przeciwciało podaje się za pomocą zastrzyku domięśniowego lub podskórnego.
PL 228 041 B1
Kompozycje terapeutyczne muszą zazwyczaj zachowywać jatowość i trwałość w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycja może zostać sporządzona w postaci roztworu, mikroemulsji, postaci rozproszonej, liposomu lub innej struktury uporządkowanej, dostosowanej do dużego stężenia leku. Jałowe roztwory do zastrzyków można sporządzić wprowadzając przeciwciało anty-IGF-IR w odpowiedniej ilości do właściwego rozpuszczalnika wraz z jednym lub kombinacją składników, wyl iczonych powyżej, wedle potrzeby, a następnie sterylizując przez filtrowanie. Ogólnie, postacie rozproszone sporządza się przez wprowadzenie związku aktywnego do jałowego nośnika, który zawiera zasadniczy nośnik postaci rozproszonej i inne wymagane składniki spośród tych, które wyliczono powyżej. W przypadku jałowych proszków dla przygotowywania jałowych roztworów do zastrzyków, sposobami korzystnymi sporządzania są suszenie pod próżnią i liofilizacja, za pomocą których otrzymuje się proszek składnika aktywnego, wraz z dodatkowymi pożądanymi składnikami, z ich roztworu, wysterylizowanego uprzednio poprzez filtrowanie. Odpowiednią płynność roztworu można uzyskać przez zastosowanie powłoki, na przykład z lecytyny, przez zachowanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku postaci rozproszonej i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. Przedłużona absorpcja kompozycji do zastrzyków może zostać uzyskana przez zawarcie w kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, na przykład soli mono stearynianów i żelatyny.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można podawać za pomocą różnych sposobów znanych w tej dziedzinie, choć dla wielu zastosowań terapeutycznych korzystną drogą/sposobem jest podawanie dootrzewnowe, podskórne, domięśniowe, dożylne lub wlew. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że droga i/lub sposób podawania będzie zmienny, w zależności od pożądanych wyn ików. W jednym z wykonań, przeciwciała według niniejszego wynalazku można podawać jako pojedynczą dawkę albo można podawać jako dawki wielokrotne.
W pewnych wykonaniach związek aktywny można przygotować wraz z nośnikiem, który zabezpieczy go przed szybkim uwolnieniem, takim jak kompozycja dla kontrolowanego uwalniania, w tym implanty, plastry przezskóme i układy podawania w postaci mikrokapsułek. Można użyć polimerów biodegrado walnych i zgodnych biologicznie, takich jak octan winylowo-etylenowy, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów wykonywania takich kompozycji zostało opatentowanych lub jest ogólnie znanych specjalistom w tej dziedzinie. Patrz np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, wyd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
W pewnych wykonaniach przeciwciało anty-IGF-IR według wynalazku może być podawane doustnie, na przykład z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przyswajalnym jadalnym nośnikiem. Związek (i inne składniki, jeśli to pożądane) można również zawrzeć w kapsułce żelatynowej o twardej lub miękkiej powłoce, sprasować w tabletki lub wprowadzić bezpośrednio do diety pacjenta. Dla podaw ania terapeutycznego doustnego, związek można połączyć z zaróbkami i zastosować w postaci tabletek do spożycia, tabletek podjęzykowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, wafli i tym podobnych. Dla podawania związku według wynalazku sposobem innym niż pozajelitowy może być konieczne pokrycie lub współpodawanie związku z materiałem zapobiegającym jego inaktywacji.
Do kompozycji można również włączyć dodatkowe związki aktywne. W pewnych wykonaniach anty-IGF-IR według wynalazku może być zmieszane i/lub podawane wspólnie z jednym lub większą liczbą czynników terapeutycznych, takich jak czynnik chemioterapeutyczny, czynnik przeciwnowotworowy lub czynnik antyrakowy. Przykładowo, przeciwciało anty-IGF-IR według wynalazku może być mieszane i/lub podawane wspólnie z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników terapeutycznych. Do tych czynników należą, między innymi, przeciwciała, które wiążą inne cząsteczki (np. przeciwciała, które wiążą jeden lub większą liczbę czynników wzrostu lub cytokin, ich receptorów na powierzchni komórki lub IGF-I), białka wiążące IGF, czynniki przeciwnowotworowe, czynniki chemioterapeutyczne, czynniki antyrakowe, oligonukleotydy antysensowne przeciw IGF-IR lub IGF-I, analogi peptydowe które blokują aktywację IGF-IR, rozpuszczalny IGF-IR i/lub jeden lub więcej czynników chemicznych, które hamują wytwarzanie lub aktywność IGF-I, które są znane w dziedzinie, np. oktreotyd. W kompozycji farmaceutycznej, zawierającej przeciwciało aktywujące, przeciwciało antyIGF-IR może zostać zmieszane z czynnikiem, który wzmaga proliferację komórek lub zapobiega apoptozie. Do takich czynników należą czynniki wzrostu, takie jak IGF-I i/lub analogi IGF-I, które aktywują IGF-IR. Takie terapie łączone mogą wymagać niższego dawkowania przeciwciała anty-IGF-IR, a także czynników podawanych jednocześnie, co umożliwia uniknięcie możliwej toksyczności lub komplikacji, związanych z różnymi mono terapiami. W jednym z wykonań przeciwciało i jeden lub większa liczba dodatkowych czynników terapeutycznych.
PL 228 041 B1
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać „ilość skuteczną terapeutycznie” lub „ilość skuteczną profilaktycznie” przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku. „Ilość skuteczna terapeutycznie” odnosi się do ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu leczn iczego w koniecznych dawkach i okresach czasu. Ilość skuteczna terapeutycznie przeciwciała lub części przeciwciała może się zmieniać w związku z takimi czynnikami, jak stan choroby, wiek, płeć i waga danego osobnika oraz zdolność przeciwciała lub części przeciwciała do wywołania pożądanej odpowiedzi u danego osobnika. Ilość skuteczna terapeutycznie to również taka, przy której efekty dobroczynne leczniczo przeważają nad wszelkimi efektami toksycznymi lub szkodliwymi przeciwciała lub części przeciwciała. „Ilość skuteczna profilaktycznie” przeciwciała lub części przeciwciała odnosi się do ilości skutecznej dla osiągnięcia pożądanego efektu profilaktycznego w koniecznych dawkach i okresach czasu. W sytuacji typowej, jako że dawka profilaktyczna jest stosowana u pacjentów przed pojawieniem się choroby lub w jej wczesnym stadium, ilość skuteczna profilaktycznie będzie mniejsza od ilości skutecznej terapeutycznie.
Tryby dawkowania można dostosować tak, by dostarczyć optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną lub profilaktyczną). Na przykład, można podać pojedynczą dużą dawkę, można podać w pewnym okresie kilka dawek podzielonych albo dawka może zostać proporcjonalnie obniżona lub podwyższona wedle wskazań sytuacji terapeutycznej. Kompozycję farmaceutyczną zawierającą przeciwciało lub zawierającą terapię łączoną, obejmującą przeciwciało i jeden lub większą liczbę dodatkowych czynników terapeutycznych można wytworzyć dla dawek pojedynczych lub wiel okrotnych. Szczególnie korzystne jest wytworzenie kompozycji pozajelitowej w formie jednostek dawkowania, dla ułatwienia podawania i jednolitości dawkowania.
Forma jednostki dawkowania, w znaczeniu tu użytym, odnosi się do odrębnych fizycznie jednostek, dostosowanych do roli dawek jednostkowych dla osobników - ssaków, które mają być poddane leczeniu; każda jednostka zawiera ustaloną z góry ilość związku aktywnego, wyliczoną tak, by wywołała pożądany efekt terapeutyczny w powiązaniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Specyfikacje dla form jednostek dawkowania według wynalazku są podyktowane przez i bezpośrednio zależne od (a) swoistych cech związku aktywnego i konkretnego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego, który ma zostać uzyskany i (b) ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takich związków aktywnych dla leczenia wrażliwości u danych osobników. Szczególnie przydatną kompozycję stanowi 5 mg/ml przeciwciała anty-IGF-IR w buforze 20 mM cytrynian sodu, pH 5,5, 140 mM NaCl i 0,2 mg/ml polisorban 80.
Przykładowym, nieograniczającym zakresem ilości przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku skutecznych terapeutycznie lub profilaktycznie jest 0,1-100 mg/kg, bardziej korzystnie 0,5-50 mg/kg, bardziej korzystnie 1 -20 mg/kg, a jeszcze bardziej korzystnie 1 -10 mg/kg. Należy zaznaczyć, że wartości dawkowania mogą zmieniać się wraz z rodzajem i nasileniem stanu, który ma być leczony. Jest ponadto zrozumiałe, że dla każdego konkretnego pacjenta winno się w trakcie l eczenia dobrać właściwy tryb dawkowania, zgodny z indywidualnymi potrzebami i profesjonalną oceną osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, a zakresy dawkowania podane tutaj są jedynie przykładowe i nie mają na celu ograniczania zakresu lub praktyki stosowania zastrzeganej kompozycji. W jednym z zastosowań ilość przeciwciała lub jego części wiążącej antygen skuteczna terapeutycznie lub profilaktycznie jest podawana wraz z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynn ików terapeutycznych.
W innym aspekcie ten wynalazek dotyczy podawania przeciwciała anty-IGF-IR przy leczeniu raka w dawce niższej niż 300 mg miesięcznie.
Inny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza zestawów, zawierających przeciwciała anty IGF-IR i kompozycji farmaceutycznych, zawierających te przeciwciała. Zestaw może zawierać, w dodatku do przeciwciała lub kompozycji farmaceutycznej, czynniki diagnostyczne lub terapeutyczne. Zestaw może również zawierać instrukcje dla zastosowania w sposobie diagnostycznym lub terapeutycznym. W korzystnym wykonaniu zestaw zawiera przeciwciało lub jego kompozycję farmaceutyczną i czynnik diagnostyczny, który można zastosować w sposobie opisanym poniżej. W innym korzystnym wykonaniu zestaw zawiera przeciwciało lub jego kompozycję farmaceutyczną i jeden lub większą liczbę czynników terapeutycznych, takich jak dodatkowy czynnik przeciwnowotworowy, czynnik antyrakowy lub czynnik chemioterapeutyczny, które można zastosować w sposobie opisanym poniżej.
Wynalazek ten dotyczy również kompozycji farmaceutycznych do hamowania nienormalnego wzrostu komórek u ssaka, które zawierają pewną ilość związku według wynalazku, w połączeniu z pewną ilością czynnika chemio terapeutycznego, gdzie ilości związku, soli, substancji rozpuszczanej
PL 228 041 B1 lub proleku oraz czynnika chemioterapeutycznego są razem skuteczne w hamowaniu nienormalnego wzrostu komórek. Obecnie w dziedzinie znanych jest wiele czynników chemio terapeutycznych. W jednym z wykonań czynniki chemioterapeutyczne wybiera się z grupy, składającej się z inhibitorów mitozy, czynników alkilujących, antymetabolitów, antybiotyków interkalujących, inhibitorów czynników wzrostu, inhibitorów cyklu komórkowego, enzymów, inhibitorów topoizomerazy, czynników przeciwprzeżyciowych, modyfikatorów odpowiedzi biologicznej, anty-hormonów, np. anty-androgenów i czynników przeciw angionenezie.
Czynniki przeciw angiogenezie, takie jak inhibitory MMP-2 (metaloproteinaza substancji międzykomórkowej 2), inhibitory MMP-9 (metaloproteinaza substancji międzykomórkowej 9) i inhibitory COX-II (cyklooksygenazy II) mogą zostać zastosowane w połączeniu ze związkiem według wynalazku. Przykłady użytecznych inhibitorów COX- II obejmują CELEBREX™ (alecoksib), waldecoksib, oraz rofecoksib. Przykłady użytecznych inhibitorów metaloproteinazy substancji międzykomórkowej są opisane w WO 96/33172 (opublikowanym 24 października 1996), WO 96/27583 (opublikowanym 7 marca 1996), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 97304971.1 (złożonym 8 lipca 1997), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 99308617.2 (złożonym 29 października 1999), WO 98/07697 (opublikowanym 26 lutego 1998), WO 98/03516 (opublikowanym 29 stycznia 1998), WO 98/34918 (opublikowanym 13 sierpnia 1998), WO 98/34915 (opublikowanym 13 sierpnia 1998), WO 98/33768 (opublikowanym 6 sierpnia 1998), WO 98/30566 (opublikowanym 16 lipca 1998), europejskiej publikacji patentowej 606046 (opublikowanej 13 lipca 1994), europejskiej publikacji patentowej 931788 (opublikowanej 28 lipca 1999), WO 90/05719 (opublikowanym 31 maja 1990), WO 99/52910 (opublikowanym 21 października 1999), WO 99/52889 (opublikowanym 21 października 1999), WO 99/29667 (opublikowanym 171ipca 1999), międzynarodowym zgłoszeniu PCT nr PCT/IB98/01113 (złożonym 21 lipca 1998), europejskim zgłoszeniu patentowym nr (złożonym 25 marca 1999), zgłoszeniu patentowym Wielkiej Brytanii numer (złożonym 3 czerwca 1999), zgłoszeniu tymczasowym USA nr 60/148,464 (złożonym 12 sierpnia 1999), patencie USA 5863949 (wydanym 26 stycznia 1999), patencie USA 5861510 (wydanym 19 stycznia 1999), oraz europejskiej publikacji patentowej 780386 (opublikowanej 25 czerwca 1997), wszystkie te patenty zostają tu włączone jako odniesienie. Korzystnymi inhibitorami MMP są te, które nie wywołują bólów stawów. Bardziej korzystne są te, które wybiórczo hamują MMP-2 i/lub MMP-9 w stosunku do innych metaloproteinaz substancji międzykomórkowej (to jest MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 oraz MMP-13).
Konkretnymi przykładami inhibitorów MMP, przydatnych dla niniejszego wynalazku są AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 i związki wymienione na następującej liście: kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)-benzenosufonylo]-(1-hydroksykarbamoilo-cyklopentylo)amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 3-egzo-3-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylamino]-8-oksa-bicyklo [3.2.1] oktano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (2R, 3R) 1-[4-(2-chloro-4-fluorobenzyloksy)-benzenosulfonylo]-3-hydroksy-3-metylo-piperydyno-2-karboksylowego; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylamino]tetrahydropirano-4-karboksylowego; kwas 3-[[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylo](1-hydroksykarbamoilo-cyklobutylo)-amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-chloro-fenoksy)-benzenosulfonyl-amino]tetrahydropirano-4-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (R) 3-[4(4-chloro-fenoksy)-benzenosulfonylamino]-tetrahydropirano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metylo-benzyloksy)-benzenosulfonylo]-3-hydroksy-3-metylo-piperydyno-2-karboksylowego; kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)benzenosulfonylo]-(1-hydroksykarbamoilo-1-metyloetylo)-amino]-propionowy; kwas3-[[4-(4-fluorofenoksy)-benzenosulfonylo]-(4-hydroksykarbamoilo-tetrahydropiran-4-ilo)-amino]-propionowy; hydroksyamino kwasu 3-egzo-3-[4-(4-chlorofenoksy)-benzenosulfonylamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego; hydroksyamin kwasu 3-endo-3-[4-(4-fluorofenoksy)-benzenosulfonylamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego i hydroksyamin kwasu (R)3-[4-(4-fluorofenoksy)-benzenosulfonylamino]-tetrahydrofurano-3-karboksylowego oraz akceptowalne farmaceutycznie sole i solwaty tych związków.
Związek według wynalazku może również być używany wraz z inhibitorami przekazywania sygnału, takimi jak czynniki, które mogą hamować odpowiedź EGF-R (receptora naskórkowego czynnika wzrostu), takimi jak przeciwciała EGF-R, przeciwciała EGF i cząsteczki, które są inhibitorami EGF-R; inhibitory VEGF (naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu), takimi jak receptory VEGF i cząsteczki, które mogą hamować VEGF oraz inhibitorami receptora erbB2, takimi jak cząsteczki organiczne lub przeciwciała, które wiążą się do receptora erbB2, na przykład HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Inhibitory EGF-R opisano na przykład w WO 95/19970 (opublikowanym 27 lipca 1995), WO 98/14451 (opublikowanym 9 kwietnia 1998), WO 98/02434 (opublikowanym 22 stycznia 1998) i patencie
PL 228 041 B1
USA 5747498 (wydanym 5 maja 1998) i takie substancje mogą zostać użyte w niniejszym wynalazku, tak jak tu opisano. Czynniki hamujące EGRF obejmują, między innymi przeciwciała monoklonalne, C225 i anty-EGFR 22 Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. i Merck KgaA) i związki ZD1834, ZD-1838 i ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomid (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC310 (Ventech Research), EGF fusion toxin (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) i EGF-R Vaccine (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Te i inne czynniki hamujące EGF można zastosować w niniejszym wynalazku.
Ze związkiem według niniejszego wynalazku można również połączyć inhibitory VEGF, na przykład SU-5416 i SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Sobering) i NX-1838 (NeXstar). Inhibitory VEGF opisano na przykład w WO 99/24440 (opublikowanym 20 maja 1999), zgłoszeniu międzynarodowym PCT PCT/IB99/00797 (złożonym 3 maja 1999), w WO 95/21613 (opublikowanym 17 sierpnia 1995), WO 99/61422 2 0 (opublikowanym 2 grudnia 1999), patencie USA 5834504 (wydanym 10 listopada 1998), WO 98/50356 (opublikowanym 12 listopada 1998), patencie USA 5883113 (wydanym 16 marca 1999), patencie USA 5886020 (wydanym 23 marca 1999), patencie USA 5792783 (wydanym 11 sierpnia 1998), WO 99/10349 (opublikowanym 4 marca 1999), WO 97/32856 (opublikowanym 12 września 1997),WO 97/22596 (opublikowanym 26 czerwca 1997), WO 98/54093 (opublikowanym 3 grudnia 1998), WO 98/02438 (opublikowanym 22 stycznia 1998), WO 99/16755 (opublikowanym 8 kwietnia 1999) i WO 98/02437 (opublikowanym 22 stycznia 1998), wszystkie spośród których zostają tu włączone w całości przez odniesienie. Inne przykłady niektórych swoistych inhibitorów VEGF, użytecznych dla niniejszego wynalazku, to IM862 (Cytran Inc.); przeciwciało monoklonalne anty-VEGF firmy Genentech, Inc. oraz angiozyme, rybozym syntetyczny z firm Ribozyme i Chiron. Te i inne inhibitory VEGF można zastosować w niniejszym wynalazku tak, jak to tu opisano.
Inhibitory receptora ErbB2, takie jak GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) i przeciwciała monoklonalne AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) i 2B-1 (Chiron), mogą być ponadto połączone ze związkiem według wynalazku, na przykład te, które wskazano w WO 98/02434 (opublikowanym 22 stycznia 1998), WO 99/35146 (opublikowanym 15 lipca 1999), WO 99/35132 (opublikowanym 15 lipca 1999), WO 98/02437 (opublikowanym 22 stycznia 1998), WO 97/13760 (opublikowanym 17 kwietnia 1997), WO 95/19970 (opublikowanym 27 lipca 1995), patencie USA 5587458 (wydanym 24 grudnia 1996) i patencie USA 5877305 (wydanym 2 marca 1999), wszystkie zostają tu włączone w całości jako odniesienie. Inhibitory receptora erbB2, użyteczne w niniejszym wynalazku, opisano również w zgłoszeniu tymczasowym USA nr 60/117341, złożonym 27 stycznia 1999 i w zgłoszeniu tymczasowym USA nr 60/117346, złożonym 27 stycznia 1999, obydwa włączone tu w całości jako odniesienie. Związki hamujące receptor erbB2 i substancje opisane we wspomnianych uprzednio zgłoszeniach PCT, patentach USA i zgłoszeniach tymczasowych USA, a także inne związki lub substancje, które hamują receptor erbB2, mogą zostać użyte wraz ze związkiem według niniejszego wynalazku, zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
Do związków przeciw-przeżyciowych należą przeciwciała anty-IGF-IR i czynniki antyintegrynowe, takie jak przeciwciała antyintegrynowe.
Diagnostyczne sposoby stosowania
Przeciwciała anty-IGF-IR można użyć do wykrywania IGF-IR w próbce biologicznej in vitro lub in vivo. Przeciwciała anty-IGF-IR można użyć w konwencjonalnym teście immunologicznym, włączając w to między innymi, EFISA, RIA, FACS, immunohistochemię tkankową, technikę Western lub immunoprecypitację. Przeciwciała anty-IGF-IR można użyć do wykrywania IGF-IR z człowieka. W innym wykonaniu przeciwciała anty-IGF-IR można użyć do wykrywania IGF-IR z naczelnych ze Starego Świata, takich jak makaki z gatunku Macaca fascicularis, rezusy, szympansy i małpy człekokształtne. Wynalazek dostarcza sposobu wykrywania anty-IGF-IR w próbce biologicznej, obejmującego doprowadzenie do kontaktu próbki biologicznej z przeciwciałem anty-IGF-IR według wynalazku i wykrycie związanego przeciwciała, związanego z anty-IGF-IR, by uzyskać wykrycie IGF-IR w próbce biologicznej. W jednym z wykonań przeciwciało anty-IGF-IR jest znakowane bezpośrednio za pomocą wykrywalnego znacznika.
PL 228 041 B1
W innym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR (pierwsze przeciwciało) jest nieznakowane, a drugie przeciwciało lub inna cząsteczka, która może wiązać przeciwciało anty-IGF-IR, jest znakowane. Jak dobrze wiadomo specjaliście w tej dziedzinie, dobiera się drugie przeciwciało, które jest zdolne do swoistego wiązania swoistego gatunku i klasy pierwszego przeciwciała. Na przykład, jeśli przeciwciałem anty- IGF-IR jest IgG człowieka, to drugim przeciwciałem może być anty-IgG człowieka. Do innych cząsteczek, które mogą wiązać się do przeciwciał, należą, bez ograniczania się, Białko A i Białko G, obydwa dostępne handlowo, np. z Pierce Chemical Co.
Znaczniki odpowiednie dla przeciwciała lub drugorzędowe ujawniono powyżej i obejmują one różne enzymy, grupy prostetyczne, substancje fluorescencyjne, substancje luminescencyjne, czynniki magnetyczne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują peroksydazę z chrzanu, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich substancji fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminofluoresceinę, chlorek dansylu lub fikoerytrynę; przykładem odpowiedniej substancji luminescencyjnej jest luminol; przykładem odpowiedniego czynnika magnetycznego jest gad oΊ OA dQd o lin, a przykłady odpowiednich materiałów radioaktywnych obejmują 125I, 131I, 35S lub 3H.
W wykonaniu alternatywnym IGF-IR można oznaczać w próbce biologicznej w kompetycyjnym teście immunologicznym, wykorzystującym standardy IGF-IR, znakowane substancjami wykrywalnymi i nieznakowane przeciwciało anty-IGF-IR. W tym teście próbkę biologiczną, znakowane standardy IGF-IR i przeciwciało anty-IGF-IR łączy się razem i ustala się ilość znakowanego standardu IGF-IR, związanego do niewyznakowanego przeciwciała. Ilość IGF-IR w próbce biologicznej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości znakowanego standardu IGF-IR, związanego do przeciwciała anty-IGF-IR.
Testy immunologiczne, ujawnione powyżej, można stosować do wielu celów. W jednym z wykonań przeciwciała anty-IGF-IR można zastosować do wykrywania IGF-IR w komórkach i hodowlach komórkowych. W wykonaniu korzystnym przeciwciała anty-IGF-IR można zastosować do określania stopnia fosforylacji tyrozyny, autofosforylacji tyrozyny IGF-IR l/lub ilości IGF-IR na powierzchni komórki po poddaniu komórek działaniu różnych związków. Ten sposób można zastosować do testowania związków, o które można użyć do aktywowania lub hamowania IGF-IR. W tym sposobie, jedna próbka komórek jest poddawana działaniu związku testowanego przez dany okres czasu, a druga próbka pozostawiona jest osobno. Jeśli celem jest pomiar autofosforylacji tyrozyny, to komórki poddaje się lizie, a fosforylację tyrozyny IGF-IR mierzy się za pomocą testu immunologicznego, opisanego powyżej lub według opisu w Przykładzie III, który stosuje test ELISA. Jeśli celem jest pomiar całkowitego poziomu IGF-IR, to komórki poddaje się lizie, a całkowity poziom IGF-IR mierzy się za pomocą jednego z testów immunologicznych, opisanych powyżej.
Korzystnym testem immunologicznym dla wyznaczania fosforylacji tyrozyny IGF-IR lub dla pomiaru całkowitego poziomu IGF-IR jest ELISA lub technika Western. Jeśli zmierzony ma być tylko poziom IGF-IR na powierzchni komórki, to komórek nie poddaje się lizie, a poziom IGF-IR na powierzchni komórki mierzy się za pomocą jednego z testów immunologicznych, opisanych powyżej. Korzystny test immunologiczny dla wyznaczania poziomu IGF-IR na powierzchni komórki zawiera etapy znakowania białek na powierzchni komórki za pomocą wykrywalnego znacznika, takiego jak biotyna lub I, immunoprecypitacji IGF-IR za pomocą przeciwciała anty-IGF-IR, a potem wykrywania znakowanego IGF-IR. Inny korzystny test immunologiczny dla wyznaczania lokalizacji IGF-IR, np. poziomu na powierzchni komórki, jest oparty na zastosowaniu immunohistochemii. Techniki takie jak ELISA, RIA, Western, immunohistochemia, znakowanie integralnych białek błonowych na powierzchni komórki i immunoprecypitacja są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Harlow i Lane, powyżej. W dodatku można zwiększyć skalę testu immunologicznego dla badań przesiewowych o dużej przepustowości, dla celu przebadania dużej liczby związków pod kątem aktywacji albo hamowania IGF-IR.
Przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku można również zastosować do wyznaczania poziomu IGF-IR w tkance lub w komórkach otrzymanych z tkanki. W korzystnym wykonaniu tkanką jest tkanka zaatakowana chorobą. W bardziej korzystnym wykonaniu tkanką jest nowotwór lub jego biopsja. W korzystnym wykonaniu sposobu tkanka lub jej biopsja pochodzi od pacjenta. Tkankę lub biopsję używa się następnie w teście immunologicznym by wyznaczyć np. poziom IGF-IR, poziom IGF-IR na powierzchni komórki, poziom fosforylacji tyrozyny IGF-IR lub lokalizację IGF-IR za pomocą dyskutowanych powyżej sposobów. Ten sposób można zastosować do ustalenia, czy nowotwór wykazuje ekspresję IGF-IR na wysokim poziomie.
PL 228 041 B1
Opisany powyżej sposób diagnostyczny można zastosować do ustalenia, czy nowotwór wyk azuje ekspresję IGF-IR na wysokim poziomie, co może być wskazaniem, czy nowotwór wykaże dobrą odpowiedź na leczenie za pomocą przeciwciała anty-IGF-IR. Sposób diagnostyczny można również zastosować do ustalenia, czy nowotwór jest potencjalnie złośliwy, jeśli wykazuje ekspresję IGF-IR na wysokim poziomie, lub łagodny, jeśli wykazuje ekspresję IGF-IR na niskim poziomie. Ponadto, ten sposób diagnostyczny 2 można również zastosować do ustalenia, czy leczenie za pomocą przeciwciała anty-IGF-IR (zobacz poniżej) sprawia, że nowotwór wykazuje ekspresję IGF-IR na niższym poziomie i/lub wykazuje niższy poziom autofosforylacji tyrozyny, a zatem można zastosować do ustalenia, czy leczenie jest skuteczne. Ogólnie, sposób ustalenia, czy przeciwciało anty-IGF-IR obniża fosforylację tyrozyny, obejmuje etapy pomiaru poziomu fosforylacji tyrozyny w komórce lub tkance będącej przedmiotem zainteresowania, inkubacji komórki lub tkanki z przeciwciałem anty-IGF-IR lub jego częścią wiążącą antygen, następnie ponownego pomiaru poziomu fosforylacji tyrozyny w komórce lub tkance. Można mierzyć fosforylację IGF-IR lub innego białka(ek). Ten sposób diagnostyczny można również zastosować do ustalenia, czy tkanka lub komórka nie wykazuje ekspresji IGF-IR na dostatecznie wysokim poziomie, co może mieć miejsce u osób dotkniętych karłowatością, osteoporozą lub cukrzycą. Diagnoza, że poziom IGF-IR lub aktywnego IGF-IR są zbyt niskie, mogłaby zostać użyta w leczeniu za pomocą aktywujących przeciwciał anty-IGF-IR, IGF-I lub innych czynników leczniczych, służących zwiększeniu poziomu lub aktywności IGF-IR.
Przeciwciał według niniejszego wynalazku można również użyć in vivo do lokalizacji tkanek i narządów, które wykazują ekspresję IGF-IR. W korzystnym wykonaniu przeciwciała anty-IGF-IR można zastosować do zlokalizowania nowotworów wykazujących ekspresję IGF-IR. Zaletą przeciwciał antyIGF-IR według niniejszego wynalazku jest to, że przy podaniu nie wywołują odpowiedzi immunologicznej. Ten sposób obejmuje etapy podawania przeciwciała anty-IGF-IR lub jego kompozycji farmaceutycznej pacjentowi, który wykazuje potrzebę takiego testu diagnostycznego i poddawania pacjenta badaniu obrazowemu, określającemu położenie tkanek wykazujących ekspresję IGF-IR. Badania obrazowe są dobrze znane w dziedzinie i obejmują, bez ograniczania, badania rentgenowskie, obrazowanie przy zastosowaniu rezonansu magnetycznego (MRI) lub tomografię komputerową (CE). W innym wykonaniu tego sposobu, od pacjenta pozyskuje się biopsję, by ustalić, czy tkanka będąca przedmiotem zainteresowania wykazuje ekspresję IGF-IR, zamiast poddawania pacjenta badaniu obrazowemu. W korzystnym wykonaniu przeciwciała anty-IGF-IR można znakować za pomocą wykrywalnego czynnika, który można zobrazować u pacjenta. Na przykład przeciwciało można znakować czynnikiem kontrastowym, takim jak bar, który można zastosować w badaniu rentgenowskim lub magnetycznym czynnikiem kontrastowym, takim jak gadolin, który można zastosować w badaniu MRI lub CE. Do innych czynników znakujących należą, bez ograniczania, radioizotopy, takie jak 99Tc. W innym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR pozostanie nie wyznakowane i zostanie zobrazowane przez podanie drugiego przeciwciała lub innej cząsteczki, która jest wykrywalna i która może wiązać przeciwciało anty-IGF-IR.
Terapeutyczne sposoby stosowania
Przeciwciało według wynalazku może być stosowane do hamowania aktywności IGF-IR przez podawanie przeciwciała anty-IGF-IR pacjentowi tego potrzebującemu. Każdy z opisanych tutaj typów przeciwciał można zastosować terapeutycznie. W innym korzystnym wykonaniu, IGF-IR jest ludzki, a pacjentem jest człowiek. Alternatywnie pacjentem może być ssak, który wykazuje ekspresję takiego IGF-IR, z którym przeciwciało anty-IGF-IR reaguje krzyżowo. Przeciwciało może być podawane ssakowi, innemu niż człowiek, który wykazuje ekspresję IGF-IR, z którym przeciwciało anty-IGF-IR reaguje krzyżowo (tj. małpie naczelnej, makakowi z gatunku Macaca fascicularis lub rezusowi), dla celów weterynaryjnych lub w zwierzęcym modelu ludzkiej choroby. Takie modele zwierzęce mogą być przydatne dla oceny skuteczności terapeutycznej przeciwciał według tego wynalazku.
Stosowany tu termin „zaburzenie, w którym aktywność IGF-IR jest szkodliwa” ma obejmować choroby i inne zaburzenia, w których wykazano lub podejrzewa się, że obecność wysokich poziomu IGF-IR u pacjenta, cierpiącego na dane schorzenie, jest odpowiedzialna za patofizjologię zaburzenia albo jest czynnikiem przyczyniającym się do zaostrzenia zaburzenia. A zatem, zaburzenie, w którym aktywność IGF-IR jest szkodliwa, jest zaburzeniem, dla którego można oczekiwać, że hamowanie aktywności IGF-IR złagodzi objawy i/lub postęp zaburzenia. Takie zaburzenia mogą się objawiać, na przykład, podwyższeniem poziomu IGF-IR na powierzchni komórki lub podwyższoną autofosforylacją tyrozyny IGF-IR w zaatakowanych komórkach lub tkankach pacjenta cierpiącego na dane zaburzenie.
PL 228 041 B1
Podwyższenie poziomu IGF-IR można wykryć, na przykład, stosując przeciwciało anty-IGF-IR jak opisano powyżej.
W korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi, który ma nowotwór wykazujący ekspresję IGF-IR. Nowotwór może być guzem litym lub guzem nie litym, takim jak chłoniak. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi, który ma nowotwór wykazujący ekspresję IGF-IR, który jest złośliwy. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi, który ma nowotwór płuc, sutka, prostaty lub okrężnicy. W wysoce korzystnym wykonaniu sposób sprawia, że nowotwór nie zwiększa wagi lub objętości lub zmniejsza wagę bądź objętość. W innym wykonaniu, ten sposób sprawia, że IGF-IR na powierzchni nowotworu ulega internalizacji. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało stanowi przeciwciało 2.14.3, lub zawiera jego łańcuch ciężki, łańcuch lekki lub jego region wiążący antygen.
W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi, który wykazuje ekspresję niewłaściwie wysokiego poziomu IGF-I. Wiadomo w tej dziedzinie, że wysoki poziom ekspresji IGF-I może prowadzić do rozmaitych powszechnie spotykanych nowotworów. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane pacjentowi z rakiem prostaty, glejakiem lub włókniakomięsakiem. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu sposób sprawia, że rak zaprzestaje anormalnej proliferacji, albo nie zwiększa wagi lub objętości lub zmniejsza wagę bądź objętość. W jednym z wykonań, ten sposób odnosi się do leczenia raka, takiego jak rak mózgu, płaskokomórkowy, pęcherza, żołądka, trzustki, sutka, głowy, szyi, przełyku, prostaty, jelita grubego, płuca, nerki, jajnika, ginekologicznego lub tarczycy. Do pacjentów, których można leczyć za pomocą związków według wynalazku, zgodnie ze sposobami według tego wynalazku, zalicza się na przykład pacjentów, których zdiagnozowano jako mających raka płuca, raka kości, raka trzustki, raka skóry, raka głowy i szyi, czerniaka skóry lub wewnątrzgałkowego, raka macicy, raka jajnika, raka odbytu, raka odbytu, raka okolic odbytu, raka żołądka, raka okrężnicy, raka sutka, guzów ginekologicznych (np. mięsaki macicy, rak jajowodów, rak trzonu macicy, rak szyjki, rak pochwy lub rak sromu), chorobę Hodgkina, raka przełyku, raka jelita cienkiego, raka układu wydzielania wewnętrznego (np. rak tarczycy, przytarczyc lub nadnerczy), mięsaki tkanek miękkich, raka cewki moczowej, raka penisa, raka prostaty, białaczkę przewlekłą lub ostrą, guzy lite dziecięce, chłoniaki limfocytyczne, raka pęcherza, raka nerki lub moczowodu (np. rak komórek nerkowych, rak miedniczki nerkowej) lub nowotwór centralnego układu nerwowego (np. chłoniak pierwotny OUN, guzy kręgosłupa, glejaki pnia mózgu lub gruczolaki przysadki).
Przeciwciało może zostać podane raz, ale bardziej korzystne jest podawanie go wiele razy. Przeciwciało można podawać od trzech razy dziennie do jednej dawki co sześć miesięcy. Podawanie może być w trybie takim jak trzy razy dziennie, dwa razy dziennie, raz dziennie, raz na dwa dni, raz na trzy dni, raz na tydzień, raz na dwa tygodnie, raz na miesiąc, raz na dwa miesiące, raz na trzy miesiące i raz na sześć miesięcy. Przeciwciało można podawać drogą doustną, przez błonę śluzową, podjęzykową, donosową, wziewną, dożylną, podskórną, domięśniową, pozajelitową, do wnętrza guza lub domiejscowo. Przeciwciało można podawać w miejscu odległym od lokalizacji nowotworu. Przeciwciało można również podawać w sposób ciągły za pomocą minipompy. Przeciwciało można podawać raz, przynajmniej dwa razy lub przynajmniej co dany okres czasu, aż choroba zostanie zaleczona, złagodzona lub wyleczona. Ogólnie, przeciwciało będzie podawane tak długo, jak długo obecny jest nowotwór, o ile przeciwciało sprawia, że guz lub rak przestaje rosnąć lub zmniejsza wagę lub objętość. Ogólnie, przeciwciało będzie podawane jako część kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej. Dawkowanie przeciwciała będzie ogólnie zawarte w zakresie 0,1-100 mg/kg, bardziej korzystnie 0,5-50 mg/kg, bardziej korzystnie 1-20 mg/kg, a jeszcze bardziej korzystnie 1-10 mg/kg. Stężenie przeciwciała w osoczu można zmierzyć za pomocą sposobu znanego w dziedzinie. Zobacz, np. przykład XVII poniżej. Przeciwciało można również podawać profilaktycznie w celu zapobieżenia wystąpieniu raka lub nowotworu. Może to być szczególnie użyteczne u pacjentów, którzy mają „wysoki no rmalny” poziom IGF-I, gdyż wykazano, że ci pacjenci mają wyższe ryzyko zapadnięcia na typowe nowotwory. Patrz Rosen i wsp., jak wyżej.
W innym aspekcie przeciwciało anty-IGF-IR można podawać pacjentowi, który ma zaburzenie rozrostowe, takie jak rak lub nowotwór, jednocześnie z innymi czynnikami terapeutycznymi, takimi jak leki lub cząsteczki przeciwnowotworowe. W jednym z aspektów wynalazek odnosi się do sposobu leczenia zaburzenia związanego z hiperproliferacją u ssaka, obejmującego podawanie temu ssakowi skutecznej terapeutycznie ilości związku według wynalazku, w połączeniu z czynnikiem przeciwrako40
PL 228 041 B1 wym, wybranym z grupy składającej się między innymi z inhibitorów mitozy, czynników alkilujących, antymetabolitów, czynników interkalujących, inhibitorów czynników wzrostu, inhibitorów cyklu komórkowego, enzymów, inhibitorów topoizomerazy, modyfikatorów odpowiedzi biologicznej, anty-hormonów, inhibitorów kinaz, inhibitorów metaloproteinazy substancji międzykomórkowej, czynników terapii genowych i antyandrogenów. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało można podawać razem z czynnikiem przeciwnowotworowym, takim jak adriamycyna lub taksol. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało lub terapia łączona są podawane równolegle z radioterapią, chemioterapią, terapią fotodynamiczną, interwencją chirurgiczną lub inną immunoterapią. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu przeciwciało będzie podawane wraz z innym przeciwciałem. Na przykład, przeciwciało anty-IGF-IR może być podawane wraz z przeciwciałem lub innym czynnikiem, o którym wiadomo, że hamuje nowotwór lub proliferację komórek rakowych, np. przeciwciałem lub czynnikiem, który hamuje receptor erbB2, EGF-R, CD20 lub VEGF.
Jednoczesne podawanie przeciwciała z dodatkowym czynnikiem terapeutycznym (terapia łączona) obejmuje podawanie kompozycji farmaceutycznej, zawierającej przeciwciało anty-IGF-IR i dodatkowy czynnik terapeutyczny oraz podawanie dwóch lub większej liczby odrębnych kompozycji farmaceutycznych, jednej zawierającej przeciwciało anty-IGF-IR i innej (innych), zawierającej dodatkowy czynnik(i) terapeutyczny. Ponadto, choć jednoczesne podawanie lub terapia łączona oznacza ogólnie, że przeciwciało i dodatkowe czynniki terapeutyczne są podawane jednocześnie, to uwzględnia się również przypadki, w których przeciwciało i dodatkowe czynniki terapeutyczne są podawane w różnym czasie. Na przykład przeciwciało może być podawane raz na trzy dni, gdy dodatkowy czynnik terapeutyczny jest podawany raz dziennie. Alternatywnie, przeciwciało może być podawane przed lub po leczeniu zaburzenia za pomocą dodatkowego czynnika terapeutycznego. Podobnie, podawanie przeciwciała anty-IGF-IR może być stosowane przed lub po innym leczeniu, takim jak radioterapia, chemioterapia, terapia fotodynamiczna, interwencja chirurgiczna lub inna immunoterapia.
Przeciwciało i jeden lub większą liczbę dodatkowych czynników terapeutycznych (terapia łączona) można podawać raz, przynajmniej dwa razy lub przynajmniej co dany okres czasu, aż choroba zostanie zaleczona, złagodzona lub wyleczona. Korzystne jest, gdy terapię łączoną podaje się wiele razy. Terapię łączoną można podawać od trzech razy dziennie do jednej dawki co sześć miesięcy. Podawanie może być w trybie takim jak trzy razy dziennie, dwa razy dziennie, raz dziennie, raz na dwa dni, raz na trzy dni, raz na tydzień, raz na dwa tygodnie, raz na miesiąc, raz na dwa miesiące, raz na trzy miesiące i raz na sześć miesięcy lub w sposób ciągły za pomocą minipompy. Terapię łączoną można podawać drogą doustną, przez błonę śluzową, podjęzykową, donosową, wziewną, dożylną, podskórną, domięśniową, pozajelitową, do wnętrza guza lub miejscowo. Terapię łączoną można podawać w miejscu odległym od lokalizacji nowotworu. Ogólnie, terapia łączona będzie podawana tak długo, jak długo obecny jest nowotwór, o ile terapia łączona sprawia, że nowotwór lub rak przestaje rosnąć lub zmniejsza wagę lub objętość.
W jeszcze innym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR jest znakowane radioizotopowo, za pomocą immunotoksyny lub toksyny lub jest fuzją białkową, zawierającą peptyd toksyczny. Przeciwciało anty-IGF-IR lub fuzja białkowa przeciwciała anty-IGF-IR kieruje radioizotop, immunotoksynę, toksynę lub peptyd toksyczny do komórki nowotworowej lub rakowej, wykazującej ekspresję IGF-IR. W korzystnym wykonaniu radioizotop, immunotoksyna, toksyna lub peptyd toksyczny ulega internalizacji po związaniu przeciwciała anty-IGF-IR z IGF-IR na powierzchni komórki nowotworowej lub rakowej.
W innym aspekcie przeciwciało anty-IGF-IR można użyć terapeutycznie do wywołania apoptozy w odpowiednich komórkach u pacjenta tego potrzebującego. W wielu przypadkach komórki, w których ma zajść apoptoza, są komórkami rakowymi lub nowotworowymi. Zatem, w korzystnym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu wywoływania apoptozy przez podawanie skutecznej terapeutycznie ilości przeciwciała anty-IGF-IR pacjentowi tego potrzebującemu. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 lub 6.1.1 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki lub jego region wiążący antygen.
W innym aspekcie przeciwciało anty-IGF-IR można użyć do leczenia stanów nienowotworowych, w których wysokie poziomy IGF-I i/lub IGF-IR są związane ze stanem lub chorobą nienowotworową. W jednym z wykonań sposób obejmuje etap podawania przeciwciała anty-IGF-IR pacjentowi, który ma nienowotworowy stan patologiczny, wywołany lub zaostrzony przez wysoki poziom lub aktywność IGF-I i/lub IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, nienowotworowym stanem patologicznym jest akromegalia, gigantyzm, łuszczyca, miażdżyca tętnic, restoenoza mięśni gładkich naczyń krwion ośnych lub nieodpowiednia proliferacja naczyń włosowatych, taka jak wykrywana jako powikłanie cuPL 228 041 B1 krzycy, szczególnie w oku. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR spowalnia postęp nienowotworowego stanu patologicznego. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało anty-IGF-IR zatrzymuje lub odwraca, przynajmniej częściowo, nienowotworowy stan patologiczny.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobu podawania przeciwciała aktywującego antyIGF-IR pacjentowi tego potrzebującemu. W jednym z wykonań przeciwciało aktywujące albo kompozycję farmaceutyczną podaje się pacjentowi tego potrzebującemu w ilości skutecznej dla podniesienia aktywności IGF-IR. W bardziej korzystnym wykonaniu przeciwciało aktywujące jest zdolne do przywrócenia normalnej aktywności IGF-IR. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało aktywujące może być podawane pacjentowi, który ma niski wzrost, neuropatię, obniżenie masy mięśniowej lub osteoporozę. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało aktywujące może być podawane razem z jednym lub większą liczbą innych czynników, które podnoszą proliferację komórek, zapobiegają apoptozie lub podnoszą aktywność IGF-IR. Do takich czynników należą czynniki wzrostu, takie jak IGF-I i/lub analogi IGF-I, które aktywują IGF-IR. W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest wybrane spośród 4.17.3 albo zawiera łańcuch ciężki, łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen.
Terapia genowa
Cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku można podawać pacjentowi tego potrzebującemu za pośrednictwem terapii genowej. Terapia może być albo typu in vivo albo ex vivo. W korzystnym wykonaniu, cząsteczki kwasu nukleinowego, kodujące zarówno łańcuch ciężki, jak i łańcuch lekki są podawane pacjentowi. W bardziej korzystnym wykonaniu podawane są takie cząsteczki kwasu nukleinowego, które ulegają trwałej integracji do chromosomu komórek B, ponieważ te komórki są wyspecjalizowane w produkcji przeciwciał. W korzystnym wykonaniu, prekursorowe komórki B poddaje się transfekcji lub infekcji ex vivo i przeszczepia spowrotem pacjentowi tego potrzebującemu. W innym wykonaniu, prekursorowe komórki B lub inne komórki są poddawane infekcji in vivo z użyciem wirusa, o którym wiadomo, że zakaża typ komórek będący przedmiotem zainteresowania. Do typowych wektorów używanych w terapii genowej należą liposomy, plazmidy lub wektory wirusowe, takie jak retrowirusy, adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom. Po infekcji in vivo albo ex vivo, poziom ekspresji przeciwciał można monitorować pobierając próbkę od leczonego pacjenta i stosując test immunologiczny znany w tej dziedzinie i dyskutowany tutaj.
W korzystnym wykonaniu, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania skutecznej ilości wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującej łańcuch ciężki lub łańcuch lekki lub jego część v 92-119 iwciała ludzkiego lub jego części i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. W innym wykonaniu, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania skutecznej ilości wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała ludzkiego lub jego części oraz ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. W bardziej korzystnym sp osobie, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania skutecznej ilości wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała ludzkiego lub jego części oraz ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego oraz skutecznej ilości izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała ludzkiego lub jego części oraz ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego. Sposób terapii genowej może również obejmować etap podawania innego czynnika antyrakowego, takiego jak taksol, tamoksifen, 5-FU, adriamycyna lub CP-358,774.
Aby wynalazek ten mógł zostać lepiej zrozumiany, podaje się następujące przykłady. Te przykłady służą jedynie celom ilustracji i nie można ich traktować jako ograniczających w jakikolwiek sposób zakres wynalazku.
P r z y k ł a d I: Otrzymywanie hybrydom wytwarzających przeciwciała anty-IGF-IR
Przeciwciała będące przedmiotem wynalazku otrzymano, wyselekcjonowano i testowano jak następuje:
Immunizacja i otrzymywanie hybrydom
Immunizowano myszy XENOMICE™ w wieku ośmiu do dziesięciu tygodni przez dootrzewnowe podanie lub do poduszek tylnych łap zarówno zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego IGF-IR (10 pg/dawka/mysz) lub komórek 3T3-IGF-IR lub 300.19-IGF-IR, które to są dwiema liniami transfekowanych komórek z ekspresją ludzkiego IGF-IR na powierzchni błony komórkowej (10 x 106 komórek/dawka/mysz). Dawka taka była ponownie podawana pięć do siedmiu razy przez trzy do ośmiu tygodni. Cztery dni przed fuzją myszy otrzymywały ostateczny zastrzyk z preparatu zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego IGF-IR w PBS. Węzłowe limfocyty ze śledziony i limfy immunizowanych m yszy poddawano fuzji z nie wydzielającą linią komórkową szpiczaka P3-X63-Ag9.653 i poddano selek42
PL 228 041 B1 cji typu HAT tak jak zostało to wcześniej opisane (Galfre i Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Uzyskano szereg hybrydom, wszystkie wydzielały ludzkie przeciwciała IgG2K specyficzne dla IGF-IR. Siedem hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne swoiste wobec IGF-IR wybrano do dalszych badań i oznaczono 2.12.1,2.13.2, 2.14.2, 3.1.1,4.9.2, 4.17.3 i 6.1.1.
Hybrydomy 2.12.1,2.13.2, 2.14.3, 3.1.1,4.9.2 i 4.17.3 zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassa, VA 20110-2209, 12 grudnia 2000 r. pod następującymi numerami depozytów:
Hybrydoma Nr depozytu
2.12.1 PTA-2792
2.13.2 PTA-2788
2.14.3 PTA-2790
3.1.1 PTA-2791
4.9.2 PTA-2789
4.17.3 PTA-2793
P r z y k ł a d II: Wyznaczenie stałych powinowactwa (Kd) dla całkowicie ludzkich przeciwciał monoklonalnych anty-IGF-IR przy zastosowaniu BIAcore
Wykonano pomiary powinowactwa oczyszczonych przeciwciał przy zastosowaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (ang. surface plasmon resonance) z wykorzystaniem urządzenia BIAcore 3000, zgodnie z zaleceniami producenta.
Protokół 1
Aby przeprowadzić analizy kinetyczne, umieruchamiano białko A na powierzchni mikromacierzy urządzenia BIAcore. Mikromacierz użyto następnie do wyłapywania przeciwciał anty-IGF-IR będących przedmiotem obecnego wynalazku. Na mikromacierz nałożono w różnych stężeniach preparaty zewnątrzkomórkowej domeny IGF-IR i analizowano kinetykę wiązania i dysocjacji dla oddziaływań pomiędzy przeciwciałami anty-IGF-IR a zewnątrzkomórkową domeną IGF-IR. Wyniki otrzymano po analizie danych metodą globalnego dopasowania Langmuir 1:1 z wykorzystaniem modeli dryfu wykresu bazowego dostępnych w oprogramowaniu BIAevaluation dostarczonego z BIAcore.
Protokół 2
Pomiary urządzeniem BIAcore wykonano dokładnie jak opisano przez Fagerstam i wsp., „Detection of antigen-antibody interaction by surface plasmon resonnance. Applications to epitope mapping.” J. Mol. Recog. 3:208-214. (1990).
Tabela I przedstawia pomiary powinowactwa dla reprezentatywnych przeciwciał anty-IGF-IR według niniejszego wynalazku.
T a b e l a I
Przeciwciało monoklonalne Kd(M) Protokół 1 Kd(M) Protokół 2
2.12.1 7,37 x 10'9
2.13.2 3,5 x 10'9 1,53 x 10'9
2.14.3 6,41 x 10'10
3.1.1 1,15 x 10'9
4.9.2 6,84 x 10'10 4,27 x 10'10
4.17.3 1,3 x 10'8
6.1.1 5,65 x 10'10
Analizy kinetyczne wskazują, że przeciwciała otrzymane zgodnie z wynalazkiem posiadają wysokie powinowactwa i duże stałe wiązania do zewnątrzkomórkowej domeny IGF-IR.
P r z y k ł a d III: hamowanie za pośrednictwem przeciwciał fosforylacji IGF-IR indukowanej przez IGF-I
Wykonano doświadczenia z testami ELISA w celu określenia, czy przeciwciała według wynala zku są zdolne blokować aktywację IGF-IR wywoływaną przez IGF-I. Aktywacja IGF-IR wywolywana przez IGF-I była wykrywana przez zwiększenie związanej z receptorem fosforylacji tyrozyny.
PL 228 041 B1
Przygotowanie płytek ELISA
Przygotowano wiążące płytkli ELISA przez dodanie 100 pl buforu blokującego (3% alumina surowicy wołowej [BSA] w soli fizjologicznej buforowanej Tris [TBS]) do każdej studzienki 96-studzienkowych płytek ReactBind pokrytych białkiem G (Pierce) i inkubację płytek z wytrząsaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczono królicze, wielospecyficzne przeciwciała anty-IGF-IR (Santa Cruz) w buforze blokującym w stężeniu 5 pg/ml i do każdej studzienki dodano 100 pl rozcieńczonych przeciwciał. Inkubowano płytki z wytrząsaniem przez 60-90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przepłukano płytki pięciokrotnie buforem do płukania (TBS + 0,1% Tween 20) i delikatnie odciśnięto pozostały bufor na papierowych ręcznikach. Przed dodaniem lizatu nie pozwolono płytkom wyschnąć.
Przygotowanie lizatów z komórek z ekspresją IGF-I
Komórki NIH-3T3 umieszczono w 100 pl (5x104/ml) pożywki hodowlanej na 96-studzienkowej płytce o „U” kształtnym dnie (pożywka DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełniona L-glutaminą (0,29 mg/ml), 10% FBS inaktywowaną termicznie oraz genetycyną, penicyliną i streptomycyną wszystkie w stężeniu 500 pg/ml). Płytki inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez noc, tak aby komórki mogły się przyczepić. Zlano pożywkę z płytek i wymieniono ją na świeżą pożywkę po 100 pl na studzienkę. Do testowania rozcieńczono potencjalne przeciwciała anty-IGF-IR w pożywce, pięciokrotnie w stosunku do pożądanego, końcowego stężenia i dodano po 25 pl do studzienek. Wszystkie próby były powtarzane trzykrotnie. Następnie inkubowano płytki w 37°C przez 1 h. Komórki stymulowano IGF1 w stężeniu 600 ng/ml (przygotowanym w pożywce hodowlanej) dodając po 25 pl na studzienkę i inkubowano płytki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie zlano pożywkę przez odwrócenie płytek i delikatnie odciśnięto na ręcznikach papierowych i lizowano przyczepione komórki przez dodanie 50 pl buforu lizującego (50 mM HEPES pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 1,6 mM NaVO4, 1% Triton X-100, 1% glicerol, uzupełnionego tuż przed użyciem tabletką/50 ml proteazy wolnej od EDTA [Roche Molecular Sciences]) i wytrząsano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodano po 200 pl buforu do rozcieńczania (50 mM HEPES pH 7,4, 1,6 mM NaVO4) do każdej ze studzienek, zmieszano przez delikatne pipetowanie. Przeniesiono 100 pl lizatów z każdej ze studzienek do studzienek płytek ELISA przygotowanych tak jak opisano powyżej i inkubowano przy delikatnym wytrząsaniu w temperaturze pokojowej.
Test ELISA z przeciwciałami anty-tyrozynofosforan (pTYR)
Usunięto lizaty komórkowe przez odwrócenie płytek, płukano płytki pięciokrotnie buforem do płukania i odciśnięto na ręcznikach papierowych. Dodano po 100 pl na studzienkę przeciwciał swoistych wobec pTYR (HRP-PY54) rozcieńczonych w buforze do blokowania w stężeniu 0,2 pg/ml i inkubowano płytki z wytrząsaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płukano płytki pięciokrotnie buforem do płukania i odciśnięto na ręcznikach papierowych.
Wiązanie się przeciwciał HRP-PY54 wykrywano przez dodanie roztworu TBM substratu peroksydazy (Kirkegaard & Perry) po 100 pl na studzienkę i inkubowano do wytworzenia się koloru (w przybliżeniu 2-10 minut). Reakcję barwną zatrzymano przez dodanie 100 pl na studzienkę roztworu zatrzymującego reakcję TBM (Kirkegaard & Perry). Następnie wytrząsano płytki przez 10 sekund w temperaturze pokojowej tak, aby wymieszać roztwór i dokonano pomiarów przy OD450nm.
Tab. II i fig. 4 pokazują wyniki tego eksperymentu wykonanego dla kilku przeciwciał według wynalazku. Wyniki tego eksperymentu wykazują zdolność przeciwciał według tego wynalazku do blokowania aktywacji IGF-IR wywoływanej przez IGF-IR, wykrywanej przez zwiększenie związanej z receptorem fosforylacji tyrozyny. Następnie wyniki te mogą być wykorzystane do obliczania potencjalnej wartości przeciwciał według tego wynalazku.
T a b e l a II
Przeciwciało monoklonalne IC50 (pg/ml)
2.12.1 0,172
2.13.2 0,0812
2.14.3 0,325
4.9.2 0,0324
PL 228 041 B1
P r z y k ł a d IV: Blokowanie przeciwciałami wiązania IGF-I/IGF-IR
Wykonano eksperymenty ELISA, aby określić ilościowo zdolność przeciwciał według wynalazku do hamowania wiązania IGF-I do IGF-IR w testach komórkowych. Komórki NIH-3T3 transfekowane IGF-IR umieszczono w 100 pl (5 x 104/ml) pożywki hodowlanej na 96-studzienkowej płytce o „U” kształtnym dnie (pożywka DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełniona L-glutaminą (0,29 mg/ml), 10% FBS inaktywowaną termicznie oraz genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 pg/ml). Płytki inkubowano w 37°C przy 5% CO2 przez noc tak aby komórki mogły się przyczepić. Zlano pożywkę z płytek i wymieniono ją na świeżą pożywkę po 100 pl na studzienkę. Do testowania rozcieńczono przeciwciała w pożywce do testów (pożywka DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełniona L-glutaminą, 10% FBS inaktywowaną termicznie, 200 pg/ml BSA i genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 pg/ml) do pożądanego, końcowego stężenia i dodano po 50 pl do studzienek. Wszystkie próby były powtarzane trzykrotnie. Następnie inkubowano płytki w 37°C przez 10 minut. Rozcieńczono [ I]-IGF-I do stężenia 1 pC/ml w pożywce do testów i dodano po 50 pl do studzienek. Jako kontrolę radioaktywności tła dodano zimnego IGF-I w stężeniu końcowym 100 ng/ml. Inkubowano płytki w 37°C przez 10 minut, zlano pożywkę przez delikatne odciśnięcie na ręcznikach papierowych i płukano dwukrotnie pożywką do testów. Lizowano komórki przez dodanie 50 pl buforu 0,1 M NaOH, 0,1% SDS i wytrząsano płytki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przeniesiono próbki na płytkę scyntylacyjną, dodano 150 pl OptiPhase Supermix i odczytano sygnał przy pomocy licznika Wallac Micro-Beta.
Tab. III i fig. 3 przedstawiają wyniki tego eksperymentu wykonanego dla trzech reprezentatywnych przeciwciał według wynalazku. Eksperyment wykazał, że przeciwciała według wynalazku specy125 ficznie hamują wiązanie się [ I]-IGF-I do komórek z ekspresją IGF-IR.
T a b e l a III
Przeciwciało monoklonalne IC50
2.12.1 0,45 pg/ml
2.13.2 0,18 pg/ml
4.9.2 0,1 pg/ml
P r z y k ł a d V: Badania mapowania epitopu
Wiedząc już, że przeciwciała według wynalazku rozpoznają IGF-IR wykonano badania mapowania epitopu dla kilku przeciwciał według wynalazku. Skupiono się w tych eksperymentach na przeciwciałach 2.12.1,2.13.2, 2.14.3 i 4.9.2.
Wykonano badania współzawodnictwa z wykorzystaniem BIAcore, aby wyznaczyć czy przeciwciała według tego wynalazku wiążą się do tego samego lub do różnych miejsc na cząsteczce IGF-IR. Związano zewnątrzkomórkową domenę (ECD) z IGF-IR na mikromacierzy BIAcore, tak jak opisano w Przykładzie II. Związano pierwsze przeciwciało wynalazku ze związanym na mikromacierzy IGF-IR w warunkach saturacji. Zmierzono zdolność następnych drugorzędowych przeciwciał według wynalazku do konkurowania z pierwszorzędnym przeciwciałem o wiązanie do IGF-IR. Technika ta pozwala przypisać przeciwciała według wynalazku do różnych grup wiązania.
Wykonano ten eksperyment z przeciwciałami 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3 i 4.9.2. Zauważono, że przeciwciała 2.13.2 i 4.9.2 konkurują o to samo miejsce na zewnątrzkomórkowej domenie IGF-IR. Pozostałe przeciwciała, 3.12.1 i 2.14.3 wiążą się do różnych miejsc na IGF-IR, innych niż miejsce wiązania 2.13.2 i 4.9.2.
P r z y k ł a d VI: Reaktywność międzygatunkowa przeciwciał według wynalazku
Wykonano kilka doświadczeń w celu wyznaczenia reaktywności międzygatunkowej przeciwciał według wynalazku, w tym immunoprecypitację, blokowanie przeciwciałami fosforylacji IGF-IR indukowanej IGF-I i analizę FACS.
W celu wykonania doświadczeń z immunoprecypitacją hodowano komórki na szalkach z pożywką DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełnioną L-glutaminą (0,29 mg/ml), 10% FBS inaktywowanym cieplnie i genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 pg/ml, w butelkach T25 do czasu osiągnięcia 50% konfluencji. Następnie dodawano 100 pl przeciwciał według wynalazku w buforowanym roztworze Hank'a soli fizjologicznej (HBSS; Gibco BRL) w stężeniu 1 pg/ml. Inkubowano płytki przez 30 minut w 37°C w inkubatorze i stymulowano komórki przy pomocy IGF-I w stężeniu 100 ng/ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki lizowano w buforze RIPA
PL 228 041 B1 (Harlow i Lane, jak wyżej) i immunoprecypitowano IGF-IR przy pomocy 2 pg wielospecyficznych przeciwciał anty-IGF-IR SC-713 (Santa Cruz) z dodatkiem kulek agarozy z białkiem A przez 1 godzinę w 4°C. Kulki rozłożono na płytkach i płukano trzykrotnie PB S/T (PBS + 0,1% Tween-20) i zagotowano kulki w 40 pl buforu Laemmliego zawierającego 5% 3ME.
Próbki przygotowane tak, jak opisano powyżej były następnie poddane analizie typu Western. Naniesiono po 12 pl próbek do studzienek 4-10% gradientowych żeli Novex™, elektroforeza była prowadzona w buforze IX MES (Novex™). Żele rozwijano przy 150 V przez 1 godzinę lub przy 200 V przez około 30 minut. Materiał z rozwiniętych żeli przeniesiono na membranę w buforze do transferu Novex™ z 10% metanolem przez noc przy 100 mA lub przez 1-1,5 godziny przy 250 mA. Po kompletnym wyschnięciu membrany i zablokowaniu w temperaturze pokojowej przez TBS (sól fizjologiczna buforowana Tris pH 8,0) zawierającym Superblock (Pierce Chemical Co.). Dodano następnie przeciwciał dla IGF-IR, SC713 (Santa Cruz), żeby wykryć wytrącony immunologicznie IGF-IR.
Doświadczenie to wykonano dla przeciwciał według wynalazku, konkretnie dla 2.12.1, 2.13.2,
4.17.3 i 4.9.2, na komórkach z różnych zwierząt. Okazało się, że przeciwciała 2.12.1, 2.13.2 i 4.9.2 były zdolne do wiązania ludzkiego IGFI-R, ale nie zdolne do wiązania psich, świnki morskiej i króliczych IGF-IR. Następnie, przeciwciała te były zdolne do wiązania IGF-IR z komórek COS7 i rezusa, pochodzących od małp Starego Świata, ale nie IGF-IR marmozety będącej małpą z Nowego Świata. Eksperymenty te wykazują że, przeciwciała są wysoko specyficzne.
Blokowanie przeciwciałami wiązania IGF-I/IGF-IR u naczelnych innych niż człowiek
Po stwierdzeniu, że przeciwciała według wynalazku rozpoznają IGF-IR małp Starego Świata testowano także ich zdolność blokowania wiązania IGF-I/IGF-IR dla komórek pochodzących od tych małp Starego Świata. Komórki hodowano na szalkach z pożywką DMEM o wysokim stężeniu glukozy uzupełnioną F-glutaminą, 10% FBS inaktywowaną termicznie i genetycyną, penicyliną i streptomycyną - wszystkie w stężeniu 500 pg/ml, w butelkach T25 do czasu osiągnięcia 50% konfluencji. Następnie dodawano 100 pl przeciwciał według wynalazku lub pożywki bez przeciwciał jako kontrolę i stymulowano komórki przy pomocy IGF-I w stężeniu 100 ng/ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po stymulacji komórki lizowano i immunoprecypitowano IGF-IR przy pomocy wielo specyficznych przeciwciał SC-713 anty-IGF-IR, tak jak opisano to powyżej. Następnie wykonano analizy typu Western tak jak opisano to powyżej, z wykorzystaniem przeciwciał HRP-PY54 tak, aby wykryć fosforylowaną tyrozynę w aktywowanym IGF-IR.
Zaobserwowano, że przeciwciała według wynalazku, w szczególności 2.13.2 i 4.9.2 mogą blokować indukowaną IGF-I fosforylację IGF-IR zarówno w komórkach COS7 jak i rezusa. Dla obserwowanego hamowania IC50 wynosiło 0,02 pg/ml i 0,005 pg/ml odpowiednio dla IGF-IR z komórek COS7 i rezusa. Wyznaczenie między-gatunkowego powinowactwa przeciwciał według wynalazku.
Wykonano analizę FACS, aby wyznaczyć powinowactwo przeciwciał według wynalazku do IGF-IR z innych zwierząt, w szczególności z małp Starego Świata opisanych powyżej. Inkubowano równe ilości ludzkich i małpich komórek (5 x 10 ) przez 1 godzinę na lodzie przy rosnących stężeniach biotynylowanych przeciwciał antyhemocjanina skałoczepa (KLH, Abgenix), użytych jako kontrola negatywna. Następnie inkubowano próbki przez 30 minut na lodzie z przeciwciałami RPE (fikoerytryna) połączonymi ze streptawidyną. Wiązanie mierzono przy pomocy cytometri przepływowej i analizowano histogramy intensywności fluorescencji (F12-H) względem ilości komórek (Counts) z wykorzystaniem oprogramowania CellQuest. Wyliczono wiązanie (Kd) dla każdego z przeciwciał z wykresów wartości intensywności fluorescencji względem stężenia przeciwciał. W większości eksperymentów mierzono wiązanie dla hodowanych komórek ludzkich MCF-7 i komórek hodowli tkankowych rezeusa lub makaka z gatunku Macaca fascicularis. Kontrolowano obniżenie poziomu przeciwciał pomiarami wiązania przy różnych stężeniach komórek.
Wykonano wspomniane analizy FACS, aby sprawdzić zdolność przeciwciał według wynalazku, w szczególności 2.13.2 i 4.9.2 do wiązania komórek ludzkich, rezusa lub makaka z gatunku Macaca fascicularis. Zaobserwowano, że połowa maksymalnego wiązania (Kd) jest przy 0,1 pg/ml dla wszystkich badanych linii komórkowych.
P r z y k ł a d VII: Zmniejszenie działania receptora IGF-I
Wykonano eksperymenty z blokowaniem, tak jak dokładnie opisano powyżej w przykładzie IV do momentu dodania znakowanego [ I] IGF-I. W tym punkcie zagotowano komórki w 40 pl buforu Laemmliego zawierającego 50% me. Następnie analizowano próbki przez analizę typu Western, tak jak opisano powyżej w przykładzie VI i filtry poddano działaniu zarówno wielospecyficznych przeciw46
PL 228 041 B1 ciał dla IGF-IR, SC713, aby wyznaczyć poziomy IGF-IR, jak i przeciwciał HRP-PY54 aby skontrolować poziomy fosforylowanych tyrozyn w aktywowanych IGF-IR.
Tak jak zaobserwowano poprzednio (przykład III), zaobserwowano blokowanie indukowanej przez IGF-I fosforylacji IGF-IR zgodnie z traktowaniem komórek przeciwciałami wynalazku (fig. 4). Następnie zaobserwowano, że po blokowaniu fosforylacji indukowanej IGF-I następuje zmniejszenie działania IGF-IR w tych komórkach. Patrz np. fig. 4. Poziomy IGF-IR były maksymalnie obniżone po 16 godz. po stymulacji przez IGF-I w obecności przeciwciał według wynalazku.
P r z y k ł a d VIII: Wpływ przeciwciał według wynalazku na IGF-IR in vivo
Określono, czy wpływ przeciwciał według wynalazku na IGF-IR opisany w poprzednich przykładach będzie też miał miejsce in vivo. Indukowano powstawanie guzów u myszy pozbawionych grasicy według opublikowanych metod (V.A Pollack i wsp., „Inhibition of epidermal growth factor receptorassociated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymie mice.” J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739-748 (1999). Pokrótce, wstrzyknięto komórki NIH-3T3 (5 x 106) transfekowane IGF-IR podskórnie 4 tygodniowym, pozbawionym grasicy (nu/nu) myszom z 0,2 ml preparatu Martigel. Następnie, gdy uformowały się guzy (m.in. około 400 mm ), nastrzyknięto myszy dootrzewnowo przeciwciałami według wynalazku.
Po 24 godzinach wycięto guzy, homogenizowano je i oznaczono poziom IGF-IR. Aby wyznaczyć poziomy IGF-IR rozcieńczono przeciwciała SC-713 w buforze do blokowania w końcowym stężeniu pg/ml i dodano po 100 pl do każdej studzienki płytki (Pierce) pokrytej kozim przeciw-króliczym Reacti-Bind (GAR). Inkubowano płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem, a następnie płytki płukano pięciokrotnie buforem do płukania. Następnie zważono próbki guzów przygotowane tak jak opisano powyżej i homogenizowano je w buforze do lizy (1 ml/100 mg). Rozcieńczono 12,5 pl ekstraktu guzów buforem do lizy do końcowej objętości 100 pl i dodano do każdej ze studzienek 96-studzienkowej płytki. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 1 -2 godziny a następnie płukano pięciokrotnie buforem do płukania. Następnie do każdej ze studzienek dodano 100 pl przeciwciał HRP-PY54 lub biotynylowanych anty-IGF-IR w buforze blokującym i inkubowano w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 30 minut. Następnie płytki płukano pięciokrotnie 10 buforem do płukania i wywoływano. Płytki znakowane HRP-PY54 wywoływano przez dodanie 100 pl substratu mikro studzienek TBM na studzienkę i zatrzymywano reakcję barwną przez dodanie 100 pl 0,9 M H2SO4. Następnie zliczono sygnał przy OD450nm po wytrząsaniu przez 10 sekund. Sygnał był normalizowany w stosunku do całości białka. Płytki znakowane przeciwciałem antyIGF-IR wywoływano przez dodanie do każdej ze studzienek 100 pl przeciwciał streptoawidyna-HRP rozcieńczonych w buforze do blokowania i inkubację w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 30 minut, a następnie postępowano tak jak opisano dla HRP-PY54.
Zaobserwowano, że dootrzewnowy zastrzyk przeciwciał według tego wynalazku, w szczególności 2.13.2 i 4.9.2, wywoływał inhibicję aktywności IGF-IR, mierzoną jako spadek [zarówno fosfotyrozyny IGF-IR (ufosforylowany IGF-IR) jak i] całości białka IGF-IR (fig. 6). W dodatku, zaobserwowano także spadek fosfotyrozyny IGF-IR (ufosforylowanego IGF-IR) (fig. 5). Bez ograniczania się do żadnej innej teorii, obniżenie poziomów fosfotyrozyny IGF-IR może być wywołane obniżeniem poziomów białka IGF-IR in vivo po kuracji przeciwciałem lub może być wywoływane połączeniem obniżenia poziomów białka IGF-IR z obniżeniem fosforylacji tyrozyny na IGF-IR, co powodowane jest przez blokowanie aktywacji ligandem (np. IGF-I lub IGF-II). Następnie, inhibicja ta była zależna od dawki podawanych przeciwciał (fig. 6). Dane te pokazują, że przeciwciała według wynalazku są zdolne do działania na IGF-IR in vivo w sposób analogiczny do tego co obserwowano in vitro.
P r z y k ł a d IX: Hamowanie wzrostu (TGI) komórek guza 3T3/IGF-IR
Sprawdzono, czy przeciwciała anty-IGF-IR według wynalazku będą działać hamująco na wzrost guza. Indukowano guzy w sposób opisany powyżej (przykład VIII) i gdy rozwinęły się uformowane, wi3 doczne guzy (m.in. 250 mm , w ciągu 6-9 dni) myszy poddano kuracji pojedynczym zastrzykiem dootrzewnowym przeciwciał w dawce 0,20 ml. Rozmiar guza mierzono przyrządem Vemiera, mierząc przez dwie średnice, co trzeci dzień i obliczano objętość z wykorzystaniem wzoru (długość x [szero2 kość] )/2 wg metod ustalonych przez Geran i wsp., „Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.” Cancer Chemother. Rep. 3:1-104.
Gdy wykonano tą analizę dla przeciwciał według wynalazku, okazało się, że pojedyncza kuracja przeciwciałem 2.13.2 sama hamuje wzrost guzów indukowanych komórkami NIH-3T3 transfekowanymi IGF-IR (fig. 7, część lewa). Następnie, w badaniach terapii łączonych, gdzie podawano pojedynczą dawkę adriamycyny, zaobserwowano że podanie pojedynczej dawki 2.13.2 wzmacnia efektywność
PL 228 041 B1 adriamycyny, znanego inhibitora wzrostu nowotworów. Połączenie adriamycyny z przeciwciałem według wynalazku 2.13.2 wykazuje opóźnienie wzrostu o 7 dni w stosunku do leczenia samym przeciwciałem lub samą adriamycyną (fig. 7, część prawa).
P r z y k ł a d X: Powiązanie pomiędzy poziomami przeciwciał a obniżeniem IGF-IR
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w przykładzie VIII. Myszy były następnie traktowane 125 pg 2.13.2 podawanym przez wlew dootrzewnowy, tak jak opisano w przykładzie VIII. Guzy wycinano i mierzono poziomy IGF-IR w teście ELISA, tak jak opisano w przykładzie VIII. Fig. 8 pokazuje poziomy przeciwciał 2.13.2 w surowicy i poziomy receptora IGF-IR w czasie. Doświadczenie wykazało, że przeciwciało obniża poziom IGF-IR i że stopień inhibicji IGF-IR jest proporcjonalny w stosunku do dawki, mierzonej jako stężenia przeciwciał w surowicy.
P r z y k ł a d XI: Hamowanie wzrostu guzów 3T3/IGF-IR różnymi dawkami przeciwciał w połączeniu z adriamycyną
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w Przykładzie IX. Myszom, u których wytworzyły się podskórne guzy o wielkości około 250 mm podawano w dniach 1, 8, 15 i 22 różne ilości przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub 7,5 mg/kg adriamycyny (i.v.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w przykładzie IX. Fig. 9 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co siedem dni hamuje wzrost komórek guza i rozszerza hamowanie wzrostu komórek w połączeniu z adriamycyną, znanym inhibitorem guzów.
P r z y k ł a d XII: Hamowanie wzrostu dużych guzów
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w Przykładzie IX. Myszom, u których wytw o3 rzyły się duże podskórne guzy o wielkości około 2000 mm3 podawano w dniach 1 i 8 różne ilości przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub 7,5 mg/kg adriamycyny (i.v.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w Przykładzie DC. Fig. 10 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Dla grup kontrolnych, gdzie podawano samo przeciwciało lub samą adriamycynę, doświadczenie kończono 3 dnia, gdy guzy przekraczały wielkość 2000 mm3. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym w połączeniu z adriamycyną jest wysoce skuteczne w leczeniu dużych guzów, przy podawaniu różnych dawek.
P r z y k ł a d XIII: Hamowanie wzrostu komórek gruczolakoraka okrężnicy i odbytu
Guzy indukowano u nagich myszy tak jak opisano w przykładzie IX, z wyjątkiem tego, że użyto komórek Colo 205 (ATCC CCL 222). Komórki Colo 205 są ludzkimi komórkami gruczolakoraka okręż3 nicy i odbytu. Myszom, u których wytworzyły się podskórne guzy o wielkości około 250 mm3 podawano różne ilości przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub 100 mg/kg 5-fluorodeoksyurydyny (5-FU, i.v.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w przykładzie IX. Fig. 11 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podanym jednokrotnie hamuje wzrost ludzkich komórek gruczolakoraka okrężnicy i odbytu i wzmacnia efektywność 5-FU, znanego inhibitora guzów.
Myszom, u których wytworzyły się guzy Colo 205 podawano w dniach 1, 8, 15 i 22 po 500 pg przeciwciała 2.13.2 (i.p.), 100 mg/kg adriamycyny (i.v.) lub ich kombinacje. Fig. 12 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co siedem dni hamuje wzrost ludzkich komórek raka okrężnicy i odbytu oraz wzmacnia efektywność 5-FU.
P r z y k ł a d XIV: Hamowanie wzrostu guzów pochodzących od komórek raka piersi
Nagim myszom, tak jak opisano w Przykładzie VIII, implantowano biodegradowalną pastylkę estrogenu (0,72 mg 17-3-estradiolu/pastylkę, dawka uwalniana przez 60 dni; Innovative Research of America). Po 48 godzinach indukowano guzy u nagich myszy tak jak opisano w przykładzie IX, poza tym, że wykorzystano komórki MCF-7 (ATCC HTB-22). Myszom, u których wytworzyły się podskórne 3 guzy o wielkości około 250 mm podawano po 50 pg przeciwciała 2.13.2 (i.p.) w dniach 1,4, 7, 10, 13, 16, 19 i 22 (q3dx7) lub 6,25 mg/kg taksolu (i.v.) w dniach 1,2, 3, 4, 5 (qldx5), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w przykładzie IX. Fig. 13 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co trzeci dzień, hamuje wzrost ludzkich komórek raka sutka, a także, gdy stosowane w połączeniu, rozszerza efektywność taksolu, znanego inhibitora raka piersi.
Myszom, u których wytworzyły się guzy MCF-7, tak jak to opisano tuż powyżej, podawano w dniu 1 różne ilości samego przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub z 3,75 mg/kg adriamycyny (i.v.), tak jak opisano w przykładzie IX. Fig. 14 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadcze48
PL 228 041 B1 nie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym pojedynczo, samo hamuje wzrost ludzkich komórek raka sutka i gdy stosowane w połączeniu, rozszerza efektywność adriamycyny, znanego inhibitora nowotworów.
Myszom, u których wytworzyły się guzy MCF-7, tak jak to opisano tuż powyżej podawano w dniach 1, 8, 15 i 23 po 250 μg samego przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub biodegradowalną pastylkę tamoksifenu (25 mg/pastylkę, wolna zasada, dawka uwalniana przez 60 dni; Innovative Research of America), osobno lub w połączeniu, tak jak opisano w przykładzie IX. Fig. 15 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR podawanym co siedem dni hamuje wzrost ludzkich komórek raka sutka, a także, gdy stosowane w połączeniu, rozszerza efektywność tamoksifenu, znanego inhibitora nowotworów.
P r z y k ł a d XVI: Hamowanie wzrostu komórek guzów nowotworu skóry
Guzy indukowano u nagich myszy, tak jak opisano w przykładzie IX, z wyjątkiem tego, że użyto komórek A431 (ATCC CRL 1555). Komórki A431 są ludzkimi komórkami nowotworu skóry z nadeks3 presją EGFR. Myszom, u których wytworzyły się podskórne guzy o wielkości około 250 mm podawano w dniach 1, 8, 15, 22 i 29 po 500 pg przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub podawano raz dziennie przez 27 dni 10 mg/kg CP-358,774 doustnie (p.o.), zarówno oddzielnie lub w połączeniu, tak jak opisano w przykładzie IX. CP-358,774 jest opisane w patencie USA nr 5747498 i w Moyer i wsp., Cancer Research 10 57:4838-4848 (1997), w całości tutaj dołączonych jako odniesienie. Fig. 16 pokazuje rozmiar guzów w czasie dla różnych kuracji. Doświadczenie wykazało, że leczenie przeciwciałem anty-IGF-IR wzmacnia efektywność CP-358,774, znanego inhibitora kinazy tyrozynowej EGF-R, w hamowaniu wzrostu ludzkiego nowotworu skóry.
P r z y k ł a d XVII: Farmakokinetyka przeciwciał anty-IGF-IR in vivo
W celu oceny farmakokinetyki przeciwciał anty-IGF-IR podano dożylnie makakom z gatunku Macaca fascicularis 3, 30 lub 100 mg/kg przeciwciała 2.13.2 w buforze octanowym. Pobierano surowicę od małp w różnych punktach czasowych i oznaczono stężenie przeciwciał anty-IGF-IR w surowicy małp w okresie 10 tygodni. W celu określenia poziomów czynnego przeciwciała w surowicy, zewnątrzkomórkowa domena ludzkiego IGF-IR (IGF-I-sR, R&D Systems, nr katalogowy 391GR) została związana na powierzchni 96-studzienkowych płytek. Dodano surowice małp (rozcieńczone pomiędzy 1:100 a 1:15000) do płytek tak, aby każda z próbek była w liniowym zakresie krzywej standardowej i inkubowano w warunkach, w których każde z przeciwciał anty-IGF-IR związało się z IGF-I-sR. Po przepłukaniu płytek dodano znakowane przeciwciało przeciw ludzkiemu IgG i inkubowano płytki w warunkach, w których przeciwciało przeciw ludzkiej IgG mogło związać się z przeciwciałem anty-IGF-IR. Płytki następnie płukano i rozwijano, a kontrolne krzywe standardowe i dopasowania regresji liniowej zostały użyte do obliczenia ilości przeciwciał anty-IGF-IR. Fig. 17 pokazuje stężenie 2.13.2 w surowicy w czasie. Doświadczenie pokazało, że czas półtrwania przeciwciała anty-IGF-IR wynosi od 4,6 do 7,7 dni, a dystrybucja względem objętość wynosi 44-105 ml/kg. Następnie, doświadczenie wykazało, że otrzymane wartości są u małp proporcjonalne do dawki, co wskazuje, że przeciwciało anty-IGF-IR wysyciło każde dostępne miejsce wiązania na IGF-IR w ciele nawet przy niższej dawce 3 mg/kg.
P r z y k ł a d XVIII: Terapia łączona przeciwciałem anty-IGF-IR i adriamycyną obniża działanie IGF-IR in vivo
Guzy indukowano u nagich myszy, tak jak opisano w przykładzie IX. Myszom, u których wytwo3 rzyły się podskórne guzy o wielkości około 400 mm podawano w pojedynczym zastrzyku 250 μg przeciwciała 2.13.2 (i.p.) lub podawano 7,5 mg/kg adriamycyny (i.v.), tak jak opisano w przykładzie IX. Po 72 godz. od podania czynników, guzy były wycinane, tak jak opisano w przykładzie VIII i równe ilości ekstraktów guzowych poddano elektroforezie w żelach poliakryloamidowych w obecności SDS (SDS-PAGE) i analizie typu Western z wykorzystaniem przeciwciała anty-IGF-IR SC-713 (Santa Cruz). Fig. 18 pokazuje ilość IGF-IR w komórkach guzów ze zwierząt kontrolnych (pierwsze trzy studzienki każdej części), u zwierząt leczonych samą adriamycyną (część środkowa) i u zwierząt leczonych przeciwciałem i adriamycyną (część niższa). Każda studzienka przedstawia równe ilości białka z pojedynczych guzów z pojedynczych myszy. Doświadczenie wykazało, że leczenie samą adriamycyną ma mały wpływ na poziomy IGF-IR, a leczenie samym przeciwciałem daje pewne obniżenie poziomów IGF-IR. Co zaskakujące, leczenie adriamycyną i przeciwciałem razem pokazuje dramatyczne obniżenie poziomów IGF-IR, co pokazuje że adriamycyna i przeciwciało bardzo obniżają poziomy IGF-IR.
Wszystkie publikacje i zgłoszenia patentowe zacytowane w tym opisie są tu włączone jako odniesienie, tak jak gdyby każda pojedyncza publikacja albo zgłoszenie patentowe było konkretnie i indywiduPL 228 041 B1 alnie wskazane, aby być włączone jako odniesienie. Mimo, że niniejszy wynalazek został opisany szczegółowo jako ilustracja i przykład dla celów jasności i zrozumienia, będzie łatwo dostrzeżone przez specjalistę w tej dziedzinie w świetle nauk z tego wynalazku, że można dokonać pewnych zmian i modyfikacji nie odbiegając od ducha i zakresu dołączonych zastrzeżeń.
PL 228 041 Β1
Lista sekwencji <110> ABGENIX, INC.
PFIZER, INC.
<120> Przeciwciała przeciw receptorowi podobnego do insuliny czynnika wzrostu <13 0> ABX-PF2 <140>
<141>
<150> 60/259,927 <151> 2001-01-05 <160> 60 <170> Patentln wer. 2.1 <210> 1 <211> 291 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgcatctgta ggagacagag tcaccttcac ttgccgggca agtcaggaca ttagacgtga 60 tttaggctgg tatcagcaga aaccagggaa agctcctaag cgcctgatct atgctgcatc 120 ccgtttacaa agtggggtcc catcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagaattcac 180 tctcacaatc agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact tattactgtc tacagcataa 240 taattatcct cggacgttcg gccaagggac cgaggtggaa atcatacgaa c 291 <210> 2 <211> 136 <212> PRT
<213> Homo ; sapiens
<400> 2
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp
1 5 10 15
Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro
20 25 30
Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser
35 40 45
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
50 55 60
Ser leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn
65 70 75 80
Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val Glu Ile Ile Arg
90 95
Thr Vai Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105 110
PL 228 041 Β1
Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115
Ser Val Val Cys Leu 120
Leu Asn Asn Phe Tyr 125
Pro Arg Glu Ala Lys Val 130
Gin Trp 135 <210> 3 <211> 352 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gggaggcttg ttcagtgact tcatacatta accatctcca gaggacacgg tactacggta gtcaagcctg actatatgag gtagtagtgg gggacaacgc ccgtgtatta tggacgtctg gaggtccctg ctggatccgc tagtaccaga caagaactca ctgtgtgaga gggccaaggg agactctcct caggctccag gactacgcag ctgtatctgc gatggagtgg accacggtca gtgcagcctc ggaaggggct actctgtgaa aaatgaacag aaactacttt ccgtctcctc tggattcact ggaatgggtt gggccgattc cctgagagcc ttactactac ag
120
180
240
300
352 <210> 4 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Gly 1 Arg Leu Gly Gin 5 Ala Trp Arg Ser Leu 10 Arg Leu Ser Cys Ala 15 Ala
Ser Gly Phe Thr 20 Phe Ser Asp Tyr Tyr 25 Met Ser Trp Ile Arg 30 Gin Ala
Pro Gly Lys 35 Gly Leu Glu Trp Val 40 Ser Tyr Ile Ser Ser 45 Ser Gly Ser
Thr Arg 50 Asp Tyr Ala Asp Ser 55 Val Lys Gly Arg Phe 60 Thr Ile Ser Arg
Asp 65 Asn Ala Lys Asn Ser 70 Leu Tyr Leu Gin Met 75 Asn Ser Leu Arg Ala 80
Glu Asp Thr Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Val Arg 90 Asp Gly Val Glu Thr 95 Thr
Phe Tyr Tyr Tyr 100 Tyr Tyr Gly Met Asp 105 Val Trp Gly Gin Gly 110 Thr Thr
Val Thr Val 115 Ser Ser Ala Ser Thr 120 Lys Gly Pro Ser Val 125 Phe Pro Leu
Ala Pro 130 Cys Ser Arg Ser Thr 135 Ser Glu Ser Thr Ala 140 Ala Leu Gly Cys
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Cys Ala 165 170
PL 228 041 Β1 <210> 5 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc aggttcagcg gaagattttg gggaccaagc tgacccagtt gggcaagtca ctaagcgcct gcagtggatc caacttatta tggagatcaa tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gatctatgct gcatcccgtt tgcacagagg ggtcccatca 180 tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 ctgtttacaa cataatagtt acccgtgcag ttttggccag 300 ac 322 <210> 6 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo : sapiens
<400> 6
Asp Ile Gin Met Thr Gin Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser siy Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Cys
85 90 95
Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210> 7 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct 60 cctgtacagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gaactgggtc cgccaggctc 120 cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtacc acattctacg 180 cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaggacc acgctgtatc 240 tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagatcttg 300 gctggtccga ctcttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg 360 tcaccgtctc ctcag 375 <210> 8 <211> 124 <212> PRT
PL 228 041 Β1 <213> Homo <400> 8 Val Gin Leu
Leu Arg Leu sapiens
Met Asn Trp 35
Ala Ile Ser 50
Gly Arg Phe 65
Gin Met Asn
Lys Asp Leu
Val Trp Gly 115
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
10
Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 20 25
Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 40
Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr 55
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg 70 75
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90
Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr 100 105
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 120
Gin Pro Gly Gly Ser
Phe Ser Ser Tyr Ala 30
Leu Glu Trp Val Ser 45
Ala Asp Ser Val Lys 60
Thr Thr Leu Tyr Leu 80
Val Tyr Tyr Cys Ala 95
Tyr Tyr Gly Met Asp 110
Ser <210> 9 <211> 302 <212> DNA <213> Homo <400> 9 tcctccctgt attagacgtg tatgctgcat acagaattca ctacagcata sapiens ctgcatctgt atttaggctg cccgtttaca ctctcacaat ataattatcc aggagacaga gtatcagcag aagtggggtc cagcagcctg tcggacgttc gtcaccttca aaaccaggga ccatcaaggt cagcctgaag ggccaaggga cttgccgggc aagctcctaa tcagcggcag attttgcaac ccgaggtgga aagtcaggac gcgcctgatc tggatctggg ttattactgt aatcatacga
ac
<210> 10
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo
<400> 10
Ser Ser Leu
1
120
180
240
300
302
Ala Ser Gin
Gly Lys Ala 35
Gly Val Pro 50
Leu Thr Ile 65 sapiens
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 5 10
Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp 20 25
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala 40
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 55
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 70 75
Thr Phe Thr Cys Arg 15
Tyr Gin Gin Lys Pro 30
Ser Arg Leu Gin Ser 45
Gly Thr Glu Phe Thr 60
Ala Thr Tyr Tyr Cys SO
PL 228 041 Β1
Leu Gin His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val 85 90 95
Gin Ile Ile Arg 100 <210> 11 <211> 338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gggcccagga ctccatcagt gattgggcgt caccatgtca cgcggacacg ctactggggc ctggtgaagc aattactact atctatacca gtagacacgt gccgtgtatt cagggaaccc cttcggagac ggagctggat gtgggagccc ccaagaacca actgtgcggt tggtcaccgt cctgtccctc ccggcagccc caactacaac gttctccctg aacgattttt ctcctcag acctgcactg gccgggaagg ccctccctca aagctgaact ggagtggtta tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc ttatctttga
120
180
240
300
338 <210> 12 <211> 112 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr
1 5 10 15
Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin
20 25 30
Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly
35 40 45
Ser Pro Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val
50 55 60
Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala
65 70 75 80
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Thr Ile Phe Gly Val Val
85 90 95
Ile Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110 <210> 13 <211> 322 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc aggttcagcg gaagattttg tgacccagtc gggcaagtca ctaagcgcct gcagtggatc caacttatta tccatcctcc gggcattaga gatctatgct tgggacagaa ctgtctacag ctgtctgcat agtgatttag gcatccaaat ttcactctca cataatagtt ctgtaggaga gctggtttca tacaccgtgg caatcagccg accctctcac cagagtcacc gcagaaacca ggtcccatca cctgcagcct tttcggcgga
120
180
240
300
PL 228 041 Β1 gggaccaagg tggagatcaa ac
322
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Ser Asp
Leu Gly Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
Tyr Ala Ala Ser Lys Leu His Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gin Pro
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Leu
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100
105 <210> 15 <211> 376 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gaggtgcagc tcctgtgcag ecagggaagg gcagactccg ctgcaaatga ggctacggtg gtcaccgtct tgttggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag acttttacta cctcag tgggggaggc cacctttagc ggtctcagct gttcaccatc agccgaggac ctactactac ttggtacagc agctatgcca attagtggta tccagagaca acggccgtat ggtatggacg ctggggggtc tgagctgggt gtggtggtat attccaagaa attactgtgc tctggggcca cctgagactc ccgccaggct cacatactac cacgctgtat gaaagatctg agggaccacg
120
180
240
300
360
376
<210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 16 Glu Val Gin Leu 1 Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Ala Met Ser Trp 35 Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
PL 228 041 Β1
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Leu Gly Tyr Gly Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 17 <211> 279 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 caggagacag ggtatcagca aaggtggggt tcagcagtct cactcacttt agtcaccatc gaaaccaggg cccatcaagg gcaacctgaa cggcggaggg acttgccggg caagtcagag cattagtacc tttttaaatt 60 aaagccccta aactcctgat ccatgttgca tccagtttac 120 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca 160 gattttgcaa cttactactg tcaacagagt tacaatgccc 240 accaaggtgg agatcaaac 279 <210> 18 <211> 92 <212> PRT
<213> Homo : sapiens
<400> 18
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Thr
1 5 10 15
Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
20 25 30
Ile His Val Ala Ser Ser Leu Gin Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin
50 55 60
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asn Ala Pro
65 70 75 80
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
90 <210> 19 <211> 341 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc 60
PL 228 041 Β1 catcagtagt tgggtatatc catatcagta ggacacggcc ggacgtctgg tactactgga tattacagtg gacacgtcca gtgtattact ggccaaggga gttggatccg ggagcaccaa agaaccagtt gtgccaggac ccacggtcac gcagccccca ctacaacccc ctccctgaag gtatagcagt cgtctcctca gggaagggac tccctcaaga ctgagttctg tcgttctact g
tggagtggat gtcgagtcac tgaccgctgc actacggtat
120
180
240
300
341 <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Horno sapiens <400> 20
Pro 1 Gly Leu Val Lys 5 Pro Ser Glu Thr Leu 10 Ser Leu Thr Cys Thr 15 Val
Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro
20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser
35 40 45
Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
50 55 60
Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
65 70 75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Tyr Ser Ser Ser Phe Tyr
85 90 95
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser <210> 21 <211> 274 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> modified_base <222> (240) <223> a, c, t, g, other or unknown <400> 21 agagccaccc cagcagaaac ggcatcccag agactggagc acgttcggcc tctcctgtag ctggccaggc acaggttcag ctgaagattt aagggaccaa ggccagtcag tcccaggctc tggcagtggg tgcagtgttt ggtggaaatc agtgttcgcg ctcatctatg tctgggacag tactgtcagc aaac gcaggtactt gtgcatccag acttcactct agtatggtag agcctggtac cagggccact caccatcagc ttcacctcgn
120
180
240
274
<210> 22
<211> 91
<212> PRT
<213> Homo
sapiens <400> 22
PL 228 041 Β1
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 1 5
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 20
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 35 40
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55
Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys 65 70
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val
Ser Gin 10
Gly Gin 25
Gly Ile
Leu Thr
Gin Gin
Glu Ile 90
Ser Val Arg
Ala Pro Arg
Pro Asp Arg 45
Ile Ser Arg 60
Tyr Gly Ser
Lys
Gly Arg Tyr 15
Leu Leu Ile
Phe Ser Gly
Leu Glu Pro
Ser Pro Arg 80 <210> 23 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga gggactacgg tcctcag tgttggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag tgattatgag tgggggaggc cacctttagc ggtctcaggt gttcaccatc agccgaggac ttggttcgac ttggtacagc agctatgcca attactggga tccagagaca acggccgtat ccctggggcc ctggggggtc tgagctgggt gtggtggtag attccaagaa attactgtgc agggaaccct cctgagactc ccgccaggct tacatactac cacgctgtat gaaagatcca ggtcaccgtc
120
180
240
300
360
367
<210> 24
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Glu Val Gin Leu Leu
1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys 20
Ala Met Ser Trp Val Arg 35
Ser Gly Ile Thr Gly Ser 50
Lys Gly Arg Ehe Thr Ile 65 70
Leu Gin Met Asn Ser Leu 85
Ser Gly Gly Gly Leu 10
Ala Ala Ser Gly Phe 25
Gin Ala Pro Gly Lys 40
Gly Gly Ser Thr Tyr 55
Ser Arg Asp Asn Ser 75
Arg Ala Glu Asp Thr 90
Val Gin Pro Gly Gly 15
Thr Phe Ser Ser Tyr 30
Gly Leu Glu Trp Val 45
Tyr Ala Asp Ser Val 60
Lys Asn Thr Leu Tyr 80
Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110
PL 228 041 Β1
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210 25 <211> 320 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 25 gaactgtggc gaactgcctc ggaaggtgga gcaaggacag aacacaaagt gcttcaacag tgcaccatct tgttgtgtgc taacgccctc cacctacagc ctacgcctgc gggagagtgt gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg 60 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 180 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300
320
<210> 26 <211> 106 <212> PRT <213> Homo : sapiens
<400> 26 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 <210> 27 <211> 978 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 27 gcctccacca agcacagcgg tggaactcag ggactctact tacacctgca aaatgttgtg ctcttccccc gtggtggtgg gtggaggtgc agggcccatc ccctgggctg gcgctctgac ccctcagcag acgtagatca tcgagtgccc caaaacccaa acgtgagcca ataatgccaa ggtcttcccc cctggtcaag cagcggcgtg cgtggtgacc caagcccagc accgtgccca ggacaccctc cgaagacccc gacaaagcca ctggcgccct gactacttcc cacaccttcc gtgccctcca aacaccaagg gcaccacctg atgatctccc gaggtccagt cgggaggagc gctccaggag ccgaaccggt cagctgtcct gcaacttcgg tggacaagac tggcaggacc ggacccctga tcaactggta agttcaacag cacctccgag gacggtgtcg acagtcctca cacccagacc agttgagcgc gtcagtcttc ggtcacgtgc cgtggacggc cacgttccgt
120
180
240
300
360
420
480
540
PL 228 041 Β1 gtggtcagcg aaggtctcca cagccccgag caggtcagcc gagagcaatg ggctccttct gtcttctcat tccctgtctc tcctcaccgt acaaaggcct aaccacaggt tgacctgcct ggcagccgga tcctctacag gctccgtgat cgggtaaa tgtgcaccag cccagccccc gtacaccctg ggtcaaaggc gaacaactac caagctcacc gcatgaggct gactggctga atcgagaaaa cccccatccc ttctacccca aagaccacac gtggacaaga ctgcacaacc acggcaagga ccatctccaa gggaggagat gcgacatcgc ctcccatgct gcaggtggca actacacgca gtacaagtgc aaccaaaggg gaccaagaac cgtggagtgg ggactccgac gcaggggaac gaagagcctc
600
660
720
780
840
900
960
978
<210 28 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 12 5
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
PL 228 041 Β1
Gin Val Ser Leu Thr Cys 245
Ala Val Glu Trp Glu Ser 260
Thr Pro Pro Met Leu Asp 275
Leu Thr Val Asp Lys Ser 290
Ser Val Met Kis Glu Ala 305 310
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
Leu Val Lys Gly Phe 250
Asn Gly Gin Pro Glu 265
Ser Asp Gly Ser Phe 280
Arg Trp Gin Gin Gly 295
Leu His Asn His Tyr 315
Tyr Pro Ser Asp Ile 255
Asn Asn Tyr Lys Thr 270
Phe Leu Tyr Ser Lys 285
Asn Val Phe Ser Cys 300
Thr Gin Lys Ser Leu 320 <210> 29 <211> 296 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 caggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactctg ctgcaaatga tggtggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag tgggggaggc caccttcagt ggtttcatac attcaccatc agccgaggac ttggtcaagc gactactaca attagtagta tccagggaca acggccgtgt ctggagggtc tgagctggat gtggtagtac acgccaagaa attactgtgc cctgagactc ccgccaggct catatactac ctcactgtat gagaga
120
180
240
296 <210> 30 <211> 98 <212> PRT
<213> Homo i <400> 30 sapiens
Gin 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Asp Tyr
Tyr Met Ser 35 Trp Ile Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Tyr 50 Ile Ser Ser Ser Gly 55 Ser Thr Ile Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val
Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg <210> 31 <211> 296
PL 228 041 Β1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga tgttggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaagggccg acagcctgag tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaga 296 <210> 32 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Glu 1 Val Gin Leu Leu 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Lys <210> 33 <211> 296 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 caggtgcagc acctgcgctg cccccaggga aacccgtccc ctgaagctga tgcaggagtc tctctggtgg aggggctgga tcaagagtcg gctctgtgac gggcccagga ctccatcagc gtggattggg agtcaccata cgccgcggac ctggtgaagc agtagtaact gaaatctatc tcagtagaca acggccgtgt cttcggggac ggtggagttg atagtgggag agtccaagaa attactgtgc cctgtccctc 60 ggtccgccag 120 caccaactac 180 ccagttctcc 240 gagaga 296 <210> 34 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
PL 228 041 Β1
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gin Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Arg <210> 35 <211> 293 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 caggtgcagc acctgcactg ccagggaagg ccctccctca aagctgagct tgcaggagtc tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc gggcccagga ctccatcagt gattgggtat caccatatca tgcggacacg ctggtgaagc agttactact atctattaca gtagacacgt gccgtgtatt cttcggagac ggagctggat gtgggagcac ccaagaacca actgtgcgag cctgtccctc ccggcagccc caactacaac gttctccctg aga
120
180
240
293 <210> 36 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg <210> 37 <211> 290 <212> DNA <213> Homo sapiens
PL 228 041 Β1 <400> 37 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca ISO gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc 290 <210> 38 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Glu 1 Ile Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Ser Ser
Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala Pro 45 Arg Leu Leu
Ile Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly Ile Pro 60 Asp Arg Phe Ser
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 Ile Ser Arg Leu Glu 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro
90 95 <210> 39 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> modified_base <222> (288) <223> a, c, t, g, other or unknown <400> 39 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctccn 288 <210> 40 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
PL 228 041 Β1
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Pro
90 95 <210> 41 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcch 288 <210> 42 <211> 96 <212> PRT
<213> Homo ; sapiens
<400> 42
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
90 95 <210> 43 <211> 293 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
PL 228 041 Β1 acctgcactg gccgggaagg ccctccctca aagctgagct tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc ctccatcagt gattgggcgt caccatgtca cgcggacacg agttactact atctatacca gtagacacgt gccgtgtatt ggagctggat gtgggagcac ccaagaacca actgtgcgag ccggcagccc caactacaac gttctccctg aga
120
180
240
293
<210> 44
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Gin Val Gin Leu Gin
1 5
Thr Leu Ser Leu Thr 20
Tyr Trp Ser Trp Ile 35
Gly Arg Ile Tyr Thr 50
Ser Arg Val Thr Met 65
Lys Leu Ser Ser Val 85
Arg
Glu Ser Gly
Cys Thr Val
Arg Gin Pro 40
Ser Gly Ser 55
Ser Val Asp 70
Thr Ala Ala
Pro Gly Leu 10
Ser Gly Gly 25
Ala Gly Lys
Thr Asn Tyr
Thr Ser Lys 75
Asp Thr Ala 90
Val Lys Pro Ser Glu 15
Ser Ile Ser Ser Tyr 30
Gly Leu Glu Trp Ile 45
Asn Pro Ser Leu Lys 60
Asn Gin Phe Ser Leu 80
Val Tyr Tyr Cys Ala 95 <210> 45 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45
Met Glu Phe Gly Leu 1 5
Val Gin Cys Glu Val 20
Pro Gly Gly Ser Leu 35
Ser Ser Tyr Ala Met 50
Glu Trp Val Ser Ala 65
Asp Ser Val Lys Gly 85
Thr Leu Tyr Leu Gin 100
Ser Trp Leu
Gin Leu Leu
Arg Leu Ser 40
Asn Trp Val 55
Ile Ser Gly 70
Arg Phe Thr
Met Asn Ser
Phe Leu Val 10
Glu Ser Gly 25
Cys Thr Ala
Arg Gin Ala
Ser Gly Gly 75
Ile Ser Arg 90
Leu Arg Ala 105
Ala Ile Leu Lys Gly 15
Gly Gly Leu Val Gin 30
Ser Gly Phe Thr Phe 45
Pro Gly Lys Gly Leu 60
Thr Thr Phe Tyr Ala 80
Asp Asn Ser Arg Thr 95
Glu Asp Thr Ala Val 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr
PL 228 041 Β1
115
Tyr Gly Met Asp 130
Ala Ser Thr Lys 145
Ser Thr Ser Glu
Phe Pro Glu Pro 180
Gly Val His Thr 195
Leu Ser Ser Val 210
Tyr Thr Cys Asn 225
Thr Val Glu Arg
Pro Val Ala Gly 260
Thr Leu Met Ile 275
Val Ser His Glu 290
Val Glu Val His 305
Ser Thr Phe Arg
Leu Asn Gly Lys 340
Ala Pro Ile Glu 355
Pro Gin Val Tyr 370
Gin Val Ser Leu 385
Ala Val Glu Trp
Thr Pro Pro Met 420
Leu Thr Val Asp 435
Val Trp
Gly Pro 150
Ser Thr 165
Val Thr
Phe Pro
Val Thr
Val Asp
230
Lys Cys 245
Pro Ser
Ser Arg
Asp Pro
Asn Ala 310
Val Val 325
Glu Tyr
Lys Thr
Thr Leu
Thr Cys 390
Glu Ser 405
Leu Asp
Lys Ser
120
Gly Gin 135
Ser Val
Ala Ala
Val Ser
Ala Val
200
Val Pro 215
His Lys
Cys Val
Val Phe
Thr Pro 280
Glu Val 295
Lys Thr
Ser Val
Lys Cys
Ile Ser 360
Pro Pro 375
Leu Val
Asn Gly
Ser Asp
Arg Trp 440
125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 140
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 185 190
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 205
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 235 240
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 250 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 285
Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 315 320
Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 330 335
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 345 350
Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 365
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 395 400
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 410 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 425 430
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 445
PL 228 041 Β1
Ser Val Met His Glu Ala 450
Ser Len Ser Pro Gly Lys 465 470
Leu His Asn His 455
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 460 <210> 46 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Met Glu Phe Gly Leu Ser 1 5
Val Gin Cys Glu Val Gin 20
Pro Gly Gly Ser Leu Arg 35
Ser Ser Tyr Ala Met Ser 50
Glu Trp Val Ser Ala Ile 65 70
Asp Ser Val Lys Gly Arg 85
Thr Leu Tyr Leu Gin Met
100
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly 115
Tyr Gly Met Asp Val Trp 130
Ala Ser Thr Lys Gly Pro 145 150
Ser Thr Ser Glu Ser Thr 165
Phe Pro Glu Pro Val Thr 180
Gly Val His Thr Phe Pro 195
Leu Ser Ser Val Val Thr 210
Tyr Thr Cys Asn Val Asp 225 230
Thr Val Glu Arg Lys Cys 245
Trp Leu Phe Leu 10
Leu Leu Glu Ser 25
Leu Ser Cys Ala 40
Trp Val Arg Gin 55
Ser Gly Ser Gly
Cys Val Glu Cys
250
Phe Thr Ile Ser
Asn Ser Leu Arg 105
Tyr Ser Ser Gly 120
Gly Gin Gly Thr 135
Ser Val Phe Pro
Ala Ala Leu Gly
170
Val Ser Trp Asn 185
Ala Val Leu Gin 200
Val Pro Ser Ser 215
His Lys Pro Ser
Val Ala Ile Leu Lys Gly 15
Gly Gly Gly Leu Val Gin 30
Ala Ser Gly Phe Thr Phe 45
Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60
Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 75 80
Arg Asp Asn Ser Lys Asn 95
Ala Glu Asp Thr Ala Val 110
Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 125
Thr Val Thr Val Ser Ser 140
Leu Ala Pro Cys Ser Arg 155 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 205
Asn Phe Gly Thr Gin Thr 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys 235 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro 255
PL 228 041 Β1
Pro Val Ala Gly 260 Pro Ser Val Phe Leu 265 Phe Pro Pro Lys Pro 270 Lys Asp
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 47 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47
Met 1 Asp Met Arg Val 5 Pro Ala Gin Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp Ile Gin 25 Met Thr Gin Phe Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Ile Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Gly 50 Ile Arg Asn Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
PL 228 041 Β1
Ala Pro Lys Arg Leu 65
Pro Ser Arg Phe Ser 85
Ile Ser Ser Leu Gin 100
His Asn Ser Tyr Pro 115
Lys Arg Thr Val Ala 130
Glu Gin Leu Lys Ser 145
Phe Tyr Pro Arg Glu 155
Gin Ser Gly Asn Ser 180
Ser Thr Tyr Ser Leu 195
Glu Lys His Lys Val 210
Ser Pro Val Thr Lys
225
Ile Tyr 70
Gly Ser
Pro Glu
Cys Ser
Ala Pro 135
Gly Thr 150
Ala Lys
Gin Glu
Ser Ser
Tyr Ala 215
Ser Phe 230
Ala
Gly
Asp
Phe
120
Ser
Ala
Val
Ser
Thr
200
Cys
Asn
Ala Ser Arg Leu 75
Ser Gly Thr Glu 90
Phe Ala Thr Tyr 105
Gly Gin Gly Thr
Val Phe Ile Phe 140
Ser Val Val Cys
155
Gin Trp Lys Val 170
Val Thr Glu Gin
185
Leu Thr Leu Ser
Glu Val Thr His
220
Arg Gly Glu Cys 235
His
Phe
Tyr
Lys
125
Pro
Leu
Asp
Asp
Lys
205
Gin
Arg Gly Val
Thr Leu Thr 95
Cys Leu Gin
110
Leu Glu Ile
Pro Ser Asp
Leu Asn Asn 160
Asn Ala Leu 175
Ser Lys Asp 190
Ala Asp Tyr
Gly Leu Ser <210> 48 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48
Met Asp Met Arg Val 1 5
Phe Pro Gly Ala Arg 20
Leu Ser Ala Ser Val 35
Gin Gly Ile Arg Asn 50
Ala Pro Lys Arg Leu 65
Pro Ser Arg Phe Ser 85
Ile Ser Ser Leu Gin 100
Pro Ala
Cys Asp
Gly Asp
Asp Leu
Ile Tyr 70
Gly Ser
Pro Glu
Gin
Ile
Arg
Gly
Ala
Gly
Asp
Leu Leu Gly Leu 10
Gin Met Thr Gin 25
Val Thr Ile Thr
Trp Tyr Gin Gin 60
Ala Ser Ser Leu 75
Ser Gly Thr Glu 90
Phe Ala Thr Tyr 105
Leu
Ser
Cys
Lys
Gin
Phe
Tyr
Leu Leu Trp 15
Pro Ser Ser 30
Arg Ala Ser
Pro Gly Lys
Ser Gly Val 80
Thr Leu Thr 95
Cys Leu Gin 110
PL 228 041 Β1
His Asn Ser 115 Tyr Pro Tyr Thr Phe 120 Gly Gin Gly Thr Lys 125 Leu Glu Ile
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210> 49 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49
Met 1 Glu Phe Gly Leu 5 Ser Trp Val Phe Leu 10 Val Ala Ile Ile Lys 15 Gly
Val Gin Cys Gin 20 Ala Gin Leu Val Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Val Lys
Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe
Ser Asp 50 Tyr Tyr Met Ser Trp 55 Ile Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu
Glu 65 Trp Val Ser Tyr Ile 70 Ser Ser Ser Gly Ser 75 Thr Arg Asp Tyr Ala 80
Asp Ser Val Lys Gly 85 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ala Lys 95 Asn
Ser Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Val
Tyr Tyr Cys 115 Val Arg Asp Gly Val 120 Glu Thr Thr Phe Tyr 125 Tyr Tyr Tyr
Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly 135 Gin Gly Thr Thr Val 140 Thr Val Ser Ser
Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Phe Pro Leu 155 Ala Pro Cys Ser Arg 160
PL 228 041 Β1
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205
Leu Ser Ser VaL Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn
305 310 315 320
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
PL 228 041 Β1 <210> 50 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 15 10 15
Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
90 95
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr 115 120 125
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly 195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 210 215 220
Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Ero Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285
PL 228 041 Β1
Val Val 290 Asp Val Ser His Glu 295 Asp Pro Glu Val Gin 300 Phe Asn Trp Tyr
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305 310 315 320
Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
325 330 335
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
340 345 350
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin
355 360 365
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
370 375 380
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385 390 395 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
405 410 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
420 425 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
450 455 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 <210> 51 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51
Met 1 Asp Met Arg Val 5 Pro Ala Gin Leu Leu 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Trp
Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp Ile Gin 25 Met Thr Gin Ser Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala 35 Ser Val Gly Asp Arg 40 Val Thr Phe Thr Cys 45 Arg Ala Ser
Gin Asp 50 Ile Arg Arg Asp Leu 55 Gly Trp Tyr Gin Gin 60 Lys Pro Gly Lys
Ala 65 Pro Lys Arg Leu Ile 70 Tyr Ala Ala Ser Arg 75 Leu Gin Ser Gly Val 80
Pro Ser Arg Phe Ser 85 Gly Ser Gly Ser Gly 90 Thr Glu Phe Thr Leu 95 Thr
PL 228 041 Β1
Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 100 105
His Asn Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr
115 120
Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 165 170
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 180 185
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210> 52 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu
10
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin 20 25
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
40
Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin 50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu 65 70 75
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu 85 90
Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
100 105
His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr
115 120
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140
Tyr Cys Leu Gin 110
Glu Val Glu Ile 125
Pro Pro Ser Asp
Leu Leu Asn Asn 160
Asp Asn Ala Leu 175
Asp Ser Lys Asp 190
Lys Ala Asp Tyr 205
Gin Gly Leu Ser
Leu Leu Leu Trp 15
Ser Pro Ser Ser 30
Cys Arg Ala Ser 45
Lys Pro Gly Lys
Gin Ser Gly Val 80
Phe Thr Leu Thr 95
Tyr Cys Leu Gin 110
Lys Val Glu Ile 125
Pro Pro Ser Asp
PL 228 041 Β1
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 <210 53 <211> 326 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <220 <221> modyfikowana_zasada <222> (289) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <400 53 gacatccaga wtcacttgcc gggaaagcyc aggttcagcg gaagattttg gggaccrags tgacccagty gggcaagtca ctaagcgcct gcagtggatc caacttatta tggaratcaw tccatcctcc ggrcattaga gatctatgct tgggacagaa ctgtytacar acgaac ctgtctgcat mrtgatttag gcatccmrwt ttcactctca cataatartt ctgtaggaga gctggtwtca trcammgwgg caatcagcmg aycckybsns cagagtcacc gcagaaacca ggtcccatca cctgcagcct kttyggcs rr
120
180
240
300
326 <210 54 <211> 322 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400 54 gacatccaga atcacttgcc gggaaagccc aggttcagtg gaagattttg gggaccaagg tgacccagtc gggcaagtca ctaarctcct gcagtggatc caacttacta tggagatcaa tccatcctcc gagcattagy gatcyatgyt tgggacagat ctgtcaacag ac ctgtctgcat asctwtttaa gcatccagtt ttcactctca agttacartr ctgyaggaga attggtatca trcaargtgg ccatcagcag ccccayychc cagagtcacc gcagaaacca ggtcccatca tctgcaacct tttcggcgga
120
180
240
300
322 <210 55 <211> 325 <212> DNA
PL 228 041 Β1 <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <220>
<221> modyfikowana_zasada <222> (291) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <400> 55 gaaattgtgt ctctcctgya cctggccagg gacaggttca cctgaagatt caagggacca tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa 120 ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctcs nacgttcggc 300 aggtggaaat caaac 325 <210> 56 <211> 376 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400> 56 caggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactctg ctgcaaatga gtggaaacta gtcaccgtct tggtggagtc cctctggatt ggctggartg tgaagggccc acagcctgag ctttttacta cctcag tgggggaggc cacyttcagt ggtttcatac attcaccatc agccgaggac ctactactac ttggtcaagc gactactaya attagtagta tccagggaca acggccgtgt ggtatggacg ctggagggtc tgagctggat gtggtagtac acgccaagaa attactgtgy tctggggcca cctgagactc ccgccaggct cakakactac ctcactgtat gagagatgga agggaccacg
120
180
240
300
360
376 <210> 57 <211> 358 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <220>
<221> modyfikaowana_zasada <222> (337) <223> a, c, t, g, inna lub nieznana <400> 57 caggtgcagc acctgcactg gccgggaagg ccctccctca aagctgarct ggagtggtta tgcaggagtc tctctggtgg gactggagtg agagtcgagt ctgtgaccgc ttatctttga gggcccagga ctccatcagt gattgggcgt caccatgtca cgcggacacg ctactggggc ctggtgaagc arttactact atctatacca gtagacacgt gccgtgtatt cagrganccc cttcggagac ggagctggat gtgggagcmc ccaagaacca actgtgcggt tggtcaccgt cctgtccctc ccggcagccc caactacaac gttctccctg aacgattttt ctcctcag
120
180
240
300
358 <210> 58 <211> 418
PL 228 041 Β1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400 58 caggtgcagc tcctgtrcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga ggctrsksyg gtgattatga tgttggagtc cctctggatt ggctggagtg tgaagggccc acagcctgag actyttacta gttggttcga tgggggaggc cacctttagc ggtctcagst gttcaccatc agccgaggac ctactactac cccctggggc ttggtacagc agctatgcca attastggka tccagagaca acggccgtat ggtatggacg cagggaaccc ctggggggtc tgarctgggt gtggtggtab attccargam attactgtgc tctggggcca tggtcaccgt cctgagactc ccgccaggct yacatwctac cacgctgtat gaaagatctk agggacyacg ctcctcag
120
180
240
300
360
418 <210 59 <211> 364 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja najwyższego dopasowania <400 59 caggtgcagc acctgcactg ccagggaagg ccctccctca aagctgagyt agttcgttct tcag tgcaggagtc tctctggtgg gactggagtg agagtcgact ctgtgaccgc actactacgg gggcccagga ctccatcagt gattgggtat caccatatca tgcggacacg tatggacgtc ctggtgaagc agttactact atctattaca gtagacacgt gccgtgtatt tggggccaag cttcggagac ggagytggat gtgggagcac ccaagaacca actgtgccag ggaccacggt cctgtccctc ccggcagccc caactacaac gttctccctg gacgtatagc caccgtctcc
120
180
240
300
360
364 <210 60 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: łącznik Gly-Ser <400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15

Claims (38)

1. Ludzkie przeciwciało monoklonalne albo jego część wiążąca antygen, które swoiście wiąże się z receptorem insulinopodobnego czynnika wzrostu I (IGF-IR), przy czym przeciwciało zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki, a sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego i sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego są odpowiednio wybrane z grupy składającej się z:
a) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790); oraz
b) sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 12 oraz sekwencji aminokwasowych CDR1, CDR2 i CDR3 w SEK NR ID: 10.
2. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera domenę zmienną łańcucha lekkiego, której sekwencja obejmuje nie więcej niż dziesięć zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen Vk A30, A27, lub O12 linii zarodkowej.
3. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10 albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej.
4. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch lekki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID 10.
5. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera domenę zmienną łańcucha ciężkiego, której sekwencja zawiera nie więcej niż osiem zmian aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen VH DP47, DP35, DP71 lub VIV-4 linii zarodkowej.
6. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 albo sekwencję aminokwasową o 1-10 insercjach, delecjach albo substytucjach aminokwasowych w porównaniu do niej.
7. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12.
8. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki i łańcuch lekki obejmują odpowiednio sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha ciężkiego i sekwencję aminokwasową domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790).
9. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1-8, znamienne tym, że jest:
a) cząsteczką immunoglobuliny G (IgG), IgM, IgE, IgA lub IgD albo jest z niej otrzymane; lub
b) fragmentem Fab, fragmentem F(ab')2, fragmentem Fv, przeciwciałem jednołańcuchowym lub przeciwciałem bispecyficznym.
10. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790), lub przeciwciałem o takich samych sekwencjach aminokwasowych, jak wybrane przeciwciało.
11. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 oraz CDR3 z SEK NR ID: 12 przy czym przeciwciało obejmuje ponadto sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego zawierającą sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEK NR ID: 10.
12. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 11, znamienne tym, że sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego zawiera SEK NR ID: 12 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 konserwatywnymi substytucjami aminokwasowymi, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 10 albo tę sekwencję z co najwyżej 5 substytucjami aminokwasowymi.
13. Przeciwciało monoklonalne według zastrz. 12, znamienne tym, że sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego zawiera SEK NR ID: 12, a sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego zawiera SEK NR ID: 10.
PL 228 041 B1
14. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1-13, znamienne tym, że ma co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) współzawodniczy o wiązanie z IGF-IR z przeciwciałem 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA2790);
b) wiąże się z tym samym epitopem IGF-IR, co przeciwciało 2.14.3;
c) wiąże się z tym samym antygenem, jak ten wiązany przez przeciwciało 2.14.3;
d) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą Kd jak przeciwciało 2.14.3;
e) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą szybkością dysocjacji jak przeciwciało 2.14.3;
f) współzawodniczy o wiązanie z IGF-IR z przeciwciałem, którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio;
g) wiąże się z tym samym epitopem IGF-IR, co przeciwciało którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio
h) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą KD, co przeciwciało którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio;
i) wiąże się z IGF-IR z zasadniczo taką samą szybkością dysocjacji jak przeciwciało, którego sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego oraz lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12 oraz sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10, odpowiednio.
15. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 14, znamienne tym, że wykazują wszystkie te właściwości.
16. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1-15, znamienne tym, że ma co najmniej jedną właściwość wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) nie wiąże się z IGF-IR myszy, szczura, psa lub królika;
b) wiąże się z IGF-IR makaka z gatunku Macaca fascicularis albo rezusa, ale nie z IGF-IR marmozety;
c) hamuje wiązanie IGF-I albo IGF-II z IGF-IR;
d) wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny;
e) hamuje wzrost nowotworu in vivo;
f) powoduje zniknięcie IGF-IR z powierzchni komórki, podczas inkubacji z komórką wyrażającą IGF-IR;
g) hamuje indukowaną przez IGF-IR fosforylację tyrozyny;
h) wiąże się z IGF-IR z KD wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej; oraz
i) wykazuje Koff dla IGF-IR wynoszącą 10- s- lub mniejszą.
17. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 16, znamienne tym, że wykazują wszystkie te właściwości.
18. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według zastrz. 16, znamienne tym, że przeciwciało albo jego część hamuje wiązanie IGF-I lub IGF-II do IGF-IR, wiąże się do IGF-IR z KD wynoszącą 8 x 10-9 M lub mniej i wykazuje selektywność wobec IGF-IR, która jest co najmniej 50 razy większa niż selektywność wobec receptora insuliny.
19. Przeciwciało albo jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1 -18, znamienne tym, że przeciwciało albo jego część hamuje wiązanie IGF-IR z IGF-I lub IGF-II z IC50 wynoszącą 100 nM lub mniej.
20. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera przeciwciało albo jego część określone w jednym z zastrz. 1 do 19 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
21. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 20, znamienna tym, że zawiera ponadto czynnik przeciwnowotworowy, chemioterapeutyczny, antyangiogenny albo anty-rakowy.
22. Sposób wytwarzania przeciwciała określonego w jednym zastrz. 1 do 19, znamienny tym, że obejmuje etapy:
a) immunizowania ssaka innego niż człowiek immunogenem zawierającym IGF-IR, przy czym ssak ma zdolność wyrażania ludzkich przeciwciał w swoich komórkach B;
b) izolowania komórek B ze ssaka;
PL 228 041 B1
c) przeszukiwania takich komórek B albo linii komórkowych od nich pochodzących w celu zidentyfikowania linii komórkowej, która wytwarza przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR;
d) hodowania linii komórkowej, która wyraża przeciwciała, które wiążą się z IGF-IR; oraz
e) izolowania przeciwciał, które wiążą się z IGF-IR z linii komórkowej.
23. Wyizolowana linia komórkowa, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało określone w jednym z zastrz. 1 -19.
24. Linia komórkowa według zastrz. 23, znamienna tym, że wytwarza przeciwciało 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790), albo przeciwciało o takiej samej sekwencji aminokwasowej jak wybrane przeciwciało.
25. Zastosowanie przeciwciała albo jego części wiążącej antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 -19 do wytwarzania leku do diagnozowania obecności albo umiejscowienia nowotworu wyrażającego IGF-IR u osobnika potrzebującego takiej diagnostyki.
26. Zastosowanie przeciwciała albo jego części wiążącej antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 -19 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu u człowieka.
27. Zastosowanie przeciwciała albo jego części wiążącej antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 -19 do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia hiperproliferacyjnego u pacjenta.
28. Zastosowanie według zastrz. 26 albo 27, znamienne tym, że leczenie obejmuje ponadto etap podawania środka przeciwnowotworowego, anty-rakowego, antyangiogennego albo chemio terapeutycznego.
29. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1-19.
30. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha ciężkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen przeciwciała 2.14.3;
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego, która zawiera sekwencje aminokwasową trzech CDR z SEK NR ID: 12;
d) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 12; oraz
e) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 11;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 28.
31. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen i jest wybrana z grupy składającej się z:
a) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen obejmującą trzy sekwencje aminokwasowe CDR łańcucha lekkiego przeciwciała 2.14.3 (nr dostępu ATCC PTA-2790);
b) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen przeciwciała 2.14.3;
c) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego, która zawiera sekwencje aminokwasową trzech CDR z SEK NR ID: 10;
d) sekwencji kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 10; oraz
e) sekwencji kwasu nukleinowego z SEK NR ID: 9;
przy czym taka cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera ewentualnie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 26.
32. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w jednym z zastrz. 29 do 31, przy czym zawiera ewentualnie sekwencję kontrolującą ekspresję połączoną funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego.
33. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego,
PL 228 041 B1 która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 19.
34. Sposób wytwarzania przeciwciała anty-IGF-IR albo jego części wiążącej antygen, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 33 albo linii k omórkowej określonej w zastrz. 23 w odpowiednich warunkach i odzyskiwanie takiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen.
35. Zwierzę transgeniczne inne niż człowiek, znamienne tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen albo sekwencję kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, albo obie, przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 19, przy czym zwierzę to wyraża ten kwas nukleinowy.
36. Zastosowanie jednej lub więcej izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego do wytwarzania leku do leczenia osobnika, przy czym cząsteczka lub cząsteczki izolowanego kwas nukleinowego są wybrane z grupy składającej się z:
a) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 19;
b) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 19; oraz
c) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen oraz łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen przeciwciała określonego w jednym z zastrz. 1 do 19;
d) izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego z obu (a) i (b).
37. Przeciwciało albo jego część wiążącej antygen jak określono w jednym z zastrz. 1-19 do zastosowania jako lek.
38. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, lub wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zarówno łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen jak i łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, przeciwciała lub jego części, jak określono w jednym z zastrz. 1-19, do zastosowania jako lek.
PL413188A 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierze transgeniczne. PL228041B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25992701P 2001-01-05 2001-01-05
US60/259,927 2001-01-05
PCT/US2001/051113 WO2002053596A2 (en) 2001-01-05 2001-12-20 Antibodies to insulin-like growth factor i receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL413188A1 PL413188A1 (pl) 2016-01-18
PL228041B1 true PL228041B1 (pl) 2018-02-28

Family

ID=22987016

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL413188A PL228041B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierze transgeniczne.
PL407889A PL224873B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne
PL366340A PL217921B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL407889A PL224873B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciwko receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne
PL366340A PL217921B1 (pl) 2001-01-05 2001-12-20 Przeciwciało przeciw receptorowi insulinopodobnego czynnika wzrostu I, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna, sposób jego wytwarzania, zastosowania, linia komórkowa, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza oraz zwierzę transgeniczne

Country Status (52)

Country Link
US (7) US7037498B2 (pl)
EP (4) EP2194067B1 (pl)
JP (4) JP2004531217A (pl)
KR (1) KR100830082B1 (pl)
CN (2) CN1854157B (pl)
AP (1) AP2072A (pl)
AR (1) AR032028A1 (pl)
AT (1) ATE464322T1 (pl)
AU (1) AU2002231368C1 (pl)
BG (3) BG66460B1 (pl)
BR (2) BR0116728A (pl)
CA (1) CA2433800C (pl)
CR (4) CR7045A (pl)
CU (1) CU23447B7 (pl)
CZ (1) CZ301712B6 (pl)
DE (1) DE60141855D1 (pl)
DK (1) DK1399483T3 (pl)
DZ (1) DZ3494A1 (pl)
EA (1) EA012079B3 (pl)
EC (1) ECSP034711A (pl)
EE (2) EE05715B1 (pl)
ES (1) ES2344592T3 (pl)
GE (1) GEP20084484B (pl)
GT (1) GT200100257A (pl)
HK (1) HK1203521A1 (pl)
HN (1) HN2001000283A (pl)
HR (2) HRP20130659A2 (pl)
HU (1) HUP0302525A2 (pl)
IL (2) IL156661A0 (pl)
IS (1) IS2790B (pl)
MA (1) MA26040A1 (pl)
ME (1) ME00502B (pl)
MX (2) MX349009B (pl)
MY (1) MY143465A (pl)
NO (1) NO339789B1 (pl)
NZ (2) NZ527302A (pl)
OA (1) OA12589A (pl)
PA (1) PA8535501A1 (pl)
PE (1) PE20020801A1 (pl)
PL (3) PL228041B1 (pl)
PT (1) PT1399483E (pl)
PY (1) PY0132240A (pl)
RS (1) RS51373B (pl)
SG (1) SG138469A1 (pl)
SK (1) SK287954B6 (pl)
SV (1) SV2007000775A (pl)
TN (1) TNSN01177A1 (pl)
TW (1) TWI324609B (pl)
UA (1) UA87804C2 (pl)
UY (2) UY27087A1 (pl)
WO (1) WO2002053596A2 (pl)
ZA (1) ZA200305995B (pl)

Families Citing this family (307)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ527302A (en) 2001-01-05 2006-10-27 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
NZ530765A (en) 2001-06-26 2006-11-30 Amgen Fremont Inc Antibodies that bind OPGL and compositions and methods for the treatment of bone diseases
AU2013204100A1 (en) * 2001-06-26 2013-05-09 Amgen Fremont Inc. Antibodies to OPGL
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
FR2834900B1 (fr) * 2002-01-18 2005-07-01 Pf Medicament Nouvelles compositions a activite anti-igf-ir et anti-egfr et leurs applications
FR2834990A1 (fr) * 2002-01-18 2003-07-25 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US20080063639A1 (en) * 2002-01-18 2008-03-13 Pierre Fabre Medicament Method for the treatment of psoriasis comprising novel anti-IGF-IR antibodies
US7241444B2 (en) 2002-01-18 2007-07-10 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
US7553485B2 (en) 2002-01-18 2009-06-30 Pierre Fabre Medicament Anti-IGF-IR and/or anti-insulin/IGF-I hybrid receptors antibodies and uses thereof
EP1461359B1 (fr) * 2002-01-18 2007-03-21 Pierre Fabre Medicament Anticorps anti-igf-ir et leurs applications
FR2834991B1 (fr) * 2002-01-18 2004-12-31 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
US6936427B2 (en) * 2002-02-08 2005-08-30 Trellis Bioscience, Inc. Real time detection of intermolecular interaction
US8658773B2 (en) 2011-05-02 2014-02-25 Immunomedics, Inc. Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration
US8496961B2 (en) 2002-05-15 2013-07-30 Sutter West Bay Hospital Delivery of nucleic acid-like compounds
PL210412B1 (pl) 2002-05-24 2012-01-31 Schering Corp Izolowane przeciwciało anty-IGFR lub jego fragment, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie, kwas nukleinowy, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, kompleks, polipeptyd i sposób jego wytwarzania
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US8034904B2 (en) 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
US7456260B2 (en) 2002-06-17 2008-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Humanized antibody
WO2004031347A2 (en) * 2002-09-24 2004-04-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for soluble cpg15
NZ582210A (en) * 2003-02-13 2011-04-29 Pfizer Prod Inc Uses of anti-insulin-like growth factor I receptor antibodies
EP1603948A1 (en) * 2003-03-14 2005-12-14 Pharmacia Corporation Antibodies to igf-i receptor for the treatment of cancers
CN100378127C (zh) * 2003-04-02 2008-04-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 针对胰岛素样生长因子i受体的抗体及其应用
JP4473257B2 (ja) * 2003-04-02 2010-06-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー インスリン様成長因子ｉ受容体に対する抗体及びその使用
US7310537B2 (en) * 2003-04-25 2007-12-18 Nokia Corporation Communication on multiple beams between stations
ES2527871T3 (es) * 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
ES2338105T3 (es) * 2003-05-14 2010-05-04 Kenta Biotech Ag Anticuerpo monoclonal humano especifico para lipopolisacaridos (lps) de serotipo iats 06 pseudomonas aeruginosa.
AR046071A1 (es) * 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
US7902338B2 (en) 2003-07-31 2011-03-08 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
ES2351395T3 (es) * 2003-08-13 2011-02-04 Pfizer Products Inc. Anticuerpos humanos modificados anti-igf-1r.
US7498415B2 (en) * 2003-09-24 2009-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Recombinant antibody against human insulin-like growth factor
WO2005032476A2 (en) * 2003-09-30 2005-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for cpg15-2
US9011880B2 (en) * 2003-10-21 2015-04-21 Igf Oncology, Llc Compounds and methods for treating cancer
WO2005047512A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Shering Corporation Plasmid system for multigene expression
AR046639A1 (es) * 2003-11-21 2005-12-14 Schering Corp Combinaciones terapeuticas de anticuerpo anti- igfr1
EA009807B1 (ru) * 2003-12-08 2008-04-28 Иммьюноджен, Инк. Антитело против igf-i-рецептора
JP2007536254A (ja) * 2004-05-05 2007-12-13 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 生物活性を調節するための二重特異性結合剤
NZ552091A (en) 2004-07-16 2009-09-25 Pfizer Prod Inc Combination treatment for non-hematologic malignancies using an anti-IGF-1R antibody
FR2873699B1 (fr) * 2004-07-29 2009-08-21 Pierre Fabre Medicament Sa Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations
MX2007006640A (es) * 2004-12-03 2007-06-19 Schering Corp Biomarcadores para la preseleccion de pacientes para la terapia con anti-receptor 1 del factor de crecimiento similar a la insulina.
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
EP2444099A1 (en) 2005-03-31 2012-04-25 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161P2F10B proteins
AU2006236637B2 (en) * 2005-04-15 2012-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods and compositions for treating or preventing cancer
KR100990027B1 (ko) 2005-04-26 2010-10-26 화이자 인코포레이티드 Ｐ-카드헤린 항체
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
SG162788A1 (en) * 2005-06-14 2010-07-29 Amgen Inc Self-buffering protein formulations
WO2006138315A2 (en) * 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
JP2009501141A (ja) 2005-06-17 2009-01-15 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 転移性骨癌の治療のための受容体アンタゴニスト
WO2007000328A1 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa Antibodies that bind to an epitope on insulin-like growth factor 1 receptor and uses thereof
FR2888850B1 (fr) 2005-07-22 2013-01-11 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-igf-ir et leurs applications
EP2960253B1 (en) 2005-09-07 2018-06-06 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies to activin receptor-like kinase-1
CN100445300C (zh) * 2005-09-30 2008-12-24 李玉新 Glp-1融合蛋白及其制备方法和医药用途
CA2627446A1 (en) 2005-11-21 2007-05-31 Laboratoires Serono S.A. Compositions and methods of producing hybrid antigen binding molecules and uses thereof
DK1979001T3 (da) 2005-12-13 2012-07-16 Medimmune Ltd Bindingsproteiner, der er specifikke for insulinlignende vækstfaktorer og anvendelser deraf
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
EP2671954B1 (en) 2006-01-20 2018-05-16 Cell Signaling Technology, Inc. Translocation and mutant ROS kinase in human non-small cell lung carcinoma
US20120208824A1 (en) 2006-01-20 2012-08-16 Cell Signaling Technology, Inc. ROS Kinase in Lung Cancer
EA017265B1 (ru) 2006-02-03 2012-11-30 Имклоун Элэлси Применение антитела imc-a12, которое является ингибитором igf-ir, для лечения рака предстательной железы
US7884078B2 (en) * 2006-02-10 2011-02-08 Massachusetts Institute Of Technology CPG15 compounds as insulin receptor and insulin-like growth factor receptor agonists
AU2007245164A1 (en) * 2006-03-28 2007-11-08 Biogen Idec Ma Inc. Anti-IGF-IR antibodies and uses thereof
EP1998806A1 (en) * 2006-03-28 2008-12-10 F. Hoffmann-Roche AG Anti-igf-1r human monoclonal antibody formulation
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
DK2450437T3 (en) 2006-04-14 2017-09-11 Cell Signaling Technology Inc Gene defects and mutant ALK kinase in human solid tumors
UA91129C2 (ru) 2006-05-09 2010-06-25 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и фармацевтическая композиция, которая их содержит
EP2032989B2 (en) 2006-06-30 2015-10-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Igfbp2 biomarker
CN102123712B (zh) 2006-12-13 2014-03-19 默沙东公司 使用igf1r抑制剂治疗癌症的方法
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
GB0702888D0 (en) * 2007-02-14 2007-03-28 Glaxo Group Ltd Novel Antibodies
EA200900991A1 (ru) * 2007-02-14 2010-02-26 Глаксо Груп Лимитед Новые антитела против igf-1r
ATE530907T1 (de) * 2007-02-27 2011-11-15 Hoffmann La Roche Verfahren zur beurteilung der hemmungsaktivität von antikörpern gegen insulinartigen wachstumsfaktor-1-rezeptor
US20100166747A1 (en) * 2007-03-02 2010-07-01 Beltran Pedro J Methods and compositions for treating tumor diseases
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
AU2008239594B2 (en) 2007-04-13 2013-10-24 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
EP2559771A3 (en) 2007-05-17 2013-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to insulin growth factor-1 receptor modulators
PE20090368A1 (es) 2007-06-19 2009-04-28 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-igf
US20090092614A1 (en) * 2007-08-28 2009-04-09 Biogen Idec Ma Inc. Anti-IGF-1R Antibodies and Uses Thereof
US20090130105A1 (en) * 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
WO2009029795A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Amgen Inc. Solid-state protein formulation
WO2009043049A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
ES2576650T3 (es) 2007-10-18 2016-07-08 Cell Signaling Technology, Inc. Translocación y ROS quinasa mutante en el carcinoma pulmonar no microcítico humano
ES2962777T3 (es) 2007-11-15 2024-03-21 Amgen Inc Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral
CA2707773C (en) 2007-12-14 2017-01-10 Pfizer Inc. Binding molecules to the human ox40 receptor
US20100261216A1 (en) 2007-12-21 2010-10-14 Bianca Eser Stability testing of antibodies
WO2009142810A2 (en) * 2008-03-25 2009-11-26 Schering Corporation Methods for treating or preventing colorectal cancer
AU2009241589B2 (en) 2008-04-29 2013-10-10 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY31861A (es) 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
WO2010006060A2 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2328890B1 (en) 2008-08-06 2012-01-25 Pfizer Inc. 6 substituted 2-heterocyclylamino pyrazine compounds as chk-1 inhibitors
AU2009324296B2 (en) 2008-12-12 2016-07-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
AU2010213578B2 (en) 2009-02-12 2015-01-29 Cell Signaling Technology, Inc. Mutant ROS expression in human cancer
PT3903829T (pt) 2009-02-13 2023-06-02 Immunomedics Inc Imunoconjugados com uma ligação intracelular clivável
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
EP2236139A1 (en) 2009-03-31 2010-10-06 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of erlotinib with an anti-IGF-1R antibody, which does not inhibit binding of insulin to the insulin receptor
JP5719347B2 (ja) 2009-04-16 2015-05-20 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． 癌治療のための組成物及び方法
RS56661B1 (sr) * 2009-04-27 2018-03-30 Novartis Ag Kompozicije i postupci za povećanje rasta mišića
WO2010146059A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK3028565T3 (da) 2009-07-08 2017-11-13 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
SG178602A1 (en) 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2011034660A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
KR20140015139A (ko) 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
HUE067718T2 (hu) 2009-10-26 2024-11-28 Hoffmann La Roche Eljárás glikozilált immunglobulin elõállítására
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
US20120220594A1 (en) 2009-10-30 2012-08-30 Bristol-Meyers Squibb Company Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance
ES2978177T3 (es) 2009-12-02 2024-09-06 Immunomedics Inc Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
MX2012009168A (es) 2010-02-08 2012-08-31 Regeneron Pharma Raton de cadena ligera comun.
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US20110200595A1 (en) 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
US9238080B2 (en) * 2010-05-21 2016-01-19 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
PT2575935E (pt) 2010-06-07 2015-10-20 Amgen Inc Dispositivo de administração de medicamento
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
ES2704223T3 (es) 2010-07-12 2019-03-15 Pfizer Healthcare Ireland Conjugados de anticuerpos multifuncionales
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012019132A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Cell Signaling Technology, Inc. Anaplastic lymphoma kinase in kidney cancer
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BR112013005699B1 (pt) 2010-09-09 2021-08-17 Pfizer Inc Anticorpo isolado ou porção de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao 4-1bb humano, combinação, usos dos mesmos, bem como composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico isolada e vetor
SG189104A1 (en) * 2010-09-28 2013-05-31 Nono Inc Nd2 peptides and methods of treating neurological disease
US20130273055A1 (en) * 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
WO2012071557A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Litron Laboratories, Ltd Rapid in vivo gene mutation assay based on the pig-a gene
US20140037642A1 (en) 2011-02-02 2014-02-06 Amgen Inc. Methods and compositions relating to inhibition of igf-1r
MX2013009151A (es) 2011-02-10 2013-08-29 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada.
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
KR20230128583A (ko) 2011-03-29 2023-09-05 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
MY171008A (en) 2011-03-29 2019-09-23 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
EP2691065B1 (en) 2011-03-31 2017-03-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
TWI631136B (zh) * 2011-04-19 2018-08-01 莫瑞麥克製藥公司 單特異性及雙特異性抗ｉｇｆ－１ｒ及抗ｅｒｂｂ３抗體
TR201905909T4 (tr) 2011-04-19 2019-05-21 Pfizer Kanser tedavisi için anti-4-1bb antikorlarının ve adcc indükleyici antikorların kombinasyonları.
US10092706B2 (en) 2011-04-20 2018-10-09 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
HRP20241480T1 (hr) 2011-08-05 2025-01-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi univerzalnog lakog lanca
JP2015527869A (ja) 2011-08-26 2015-09-24 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド タンデムＦｃ二重特異性抗体
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
WO2013056069A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods for selecting and treating cancer in patients with igf-1r/ir inhibitors
PL3045187T3 (pl) 2011-10-14 2019-09-30 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
US20130122005A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-16 Paul Adam Anticancer combination therapy
SG11201401518TA (en) 2011-10-28 2014-05-29 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
EP2776042B1 (en) 2011-11-11 2019-03-20 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
KR101470700B1 (ko) * 2011-11-25 2014-12-12 서울대학교산학협력단 표적 항암제의 내성 극복 방법
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9997847B2 (en) 2011-12-27 2018-06-12 Perfectvision Manufacturing, Inc. Coaxial Connector with grommet biasing for enhanced continuity
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
EP2631653A1 (en) 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
HUE037856T2 (hu) 2012-04-18 2018-09-28 Cell Signaling Technology Inc EGFR és ROS1 rákban
PL2844282T3 (pl) 2012-05-04 2019-11-29 Pfizer Antygeny związane z gruczołem krokowym i schematy immunoterapii oparte na szczepionce
US10519245B2 (en) 2012-06-21 2019-12-31 Sorrento Therapeutics Inc. Antibodies which bind insulin-like growth factor receptor-1 (IGF1R) and methods of use thereof to treat cancer
JP6578206B2 (ja) 2012-07-19 2019-09-18 レッドウッド バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｃｄ２２に特異的な抗体およびその使用方法
US8980259B2 (en) 2012-07-20 2015-03-17 Novartis Ag Combination therapy
AR092044A1 (es) 2012-08-07 2015-03-18 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
AU2013302696B9 (en) 2012-08-14 2018-08-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
SG10201702737TA (en) 2012-10-04 2017-05-30 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
PE20151179A1 (es) 2012-11-01 2015-09-12 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
SI3081249T1 (sl) 2012-11-21 2021-03-31 Amgen Inc. Naprava za dajanje zdravila
DK2925745T3 (en) 2012-11-29 2018-07-23 Chemocentryx Inc CXCR7 antagonists
CA3177936A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Immunomedics, Inc. Dosages of immunoconjugates of antibodies and sn-38 for improved efficacy and decreased toxicity
KR20150143458A (ko) 2013-03-06 2015-12-23 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 항-C-MET 탠덤 Fc 이중특이적 항체
US20140255413A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
SG11201507417RA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Body contour adaptable autoinjector device
US9062108B2 (en) 2013-03-15 2015-06-23 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 and/or IL-17
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
CA2904661C (en) 2013-03-15 2022-03-15 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
TWI580451B (zh) 2013-03-15 2017-05-01 安美基公司 用於注射器之匣盒及使用具有自動注射器及匣盒之自動注射器設備之方法
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP2976117B1 (en) 2013-03-22 2020-12-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
FI3677591T3 (fi) 2013-04-29 2023-04-03 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38-vasta-aineet ja fuusiot heikennetylle interferonille alfa-2b
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
DK3007704T3 (da) * 2013-06-13 2021-03-29 Antisense Therapeutics Ltd Kombinationsterapi til akromegali
TW201605896A (zh) * 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
CA2923145C (en) 2013-09-05 2025-09-16 Amgen Inc. MOLECULES CONTAINING FCS AND EXHIBITING PREDICTABLE, UNIFORM AND REPRODUCIBLE GLYCOFORM PROFILES
SG11201602236SA (en) 2013-10-01 2016-04-28 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
AU2014340174B2 (en) 2013-10-24 2019-09-12 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3060275B1 (en) 2013-10-24 2019-07-03 Amgen Inc. Injector and method of assembly
CA2936675C (en) 2014-01-12 2023-06-27 Igf Oncology, Llc Fusion proteins containing insulin-like growth factor-1 and epidermal growth factor and variants thereof and uses thereof
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
WO2015126548A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells
CN106029098A (zh) 2014-02-25 2016-10-12 免疫医疗公司 人源化rfb4抗cd22抗体
RU2016141307A (ru) 2014-03-21 2018-04-24 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Отличные от человека животные, которые вырабатывают однодоменные связывающие белки
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
EP3785749B1 (en) 2014-05-07 2026-04-01 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
WO2015175861A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
EP4036924A1 (en) 2014-06-03 2022-08-03 Amgen, Inc Devices and methods for assisting a user of a drug delivery device
US9580495B2 (en) 2014-06-24 2017-02-28 Immunomedics, Inc. Anti-histone therapy for vascular necrosis in severe glomerulonephritis
SI3204018T1 (sl) 2014-10-07 2021-11-30 Immunomedics, Inc. Neoadjuvantna uporaba konjugatov protitelo-zdravilo
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
KR102639037B1 (ko) 2014-10-29 2024-02-20 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 인터페론 α2b 변이체
EP3220959A1 (en) 2014-11-19 2017-09-27 ImmunoGen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP3689394A1 (en) 2014-12-19 2020-08-05 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
WO2016133947A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
TW201632559A (zh) * 2015-02-22 2016-09-16 索倫多醫療公司 結合ｃｄ１３７之抗體治療劑
EP3981450A1 (en) 2015-02-27 2022-04-13 Amgen, Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
HK1250038A1 (zh) 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
WO2016172427A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3313443B9 (en) 2015-06-25 2023-10-04 Immunomedics, Inc. Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
SI3316885T1 (sl) 2015-07-01 2021-09-30 Immunomedics, Inc. Imunokonjugati protitelo-SN-38 z linkerjem CL2A
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3355907B1 (en) 2015-10-02 2021-01-20 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
IL259186B2 (en) 2015-11-09 2023-03-01 Scherer Technologies Llc R P Anti-cd22-maytensin antibody conjugates and methods of using them
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
AU2017213858A1 (en) 2016-02-05 2018-08-16 Immunogen, Inc. Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
KR102457751B1 (ko) 2016-03-10 2022-10-21 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈 타입 2 수용체 결합 단백질 및 이의 용도
EP3721922B1 (en) 2016-03-15 2022-05-04 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
MX2019004580A (es) 2016-10-21 2019-08-12 Amgen Inc Formulaciones farmaceuticas y metodos para prepararlas.
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
CN108084262A (zh) * 2016-11-23 2018-05-29 复旦大学 针对寨卡病毒的全人源单域抗体或抗原结合片段及应用
JP6908709B2 (ja) 2017-01-06 2021-07-28 エービーエル バイオ インコーポレイテッド 抗α−ｓｙｎ抗体およびその使用
CA3049780A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
EP3582825A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
JP7280189B2 (ja) 2017-02-17 2023-05-23 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置用の挿入機構
MX2019010544A (es) 2017-03-06 2019-10-21 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con caracteristica de prevencion de la activacion.
KR102627069B1 (ko) 2017-03-07 2024-01-18 암겐 인코포레이티드 과압에 의한 바늘 삽입
KR102893480B1 (ko) 2017-03-09 2025-11-28 암겐 인코포레이티드 약물 전달 장치용 삽입 메커니즘
US12503700B2 (en) 2017-03-14 2025-12-23 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
BR112019020053B1 (pt) 2017-03-28 2023-10-10 Amgen Inc Máquina para acoplar uma haste de êmbolo a um conjunto de seringa e método de utilização da referida máquina
CN117442747A (zh) 2017-05-21 2024-01-26 Igf肿瘤公司 胰岛素样生长因子——用于治疗骨髓增生异常综合症的化学治疗缀合物
MX2019014615A (es) 2017-06-08 2020-02-07 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos accionado por par de torsion.
WO2018226515A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
AU2018290302B2 (en) 2017-06-23 2024-02-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
EP4292576A3 (en) 2017-07-21 2024-01-17 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
WO2019022951A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH GEAR MODULE AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
WO2019022950A1 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE WITH CONTAINER ACCESS SYSTEM AND ASSEMBLY METHOD THEREOF
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
CN111511762B (zh) 2017-08-21 2025-05-06 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
WO2019046600A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Amgen Inc. INSULIN-RELATED GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR BINDING PROTEINS (IGF-1R) AND METHODS OF USE
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
US11459293B2 (en) * 2017-10-27 2022-10-04 Immunebridge Inc. Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using derivatives of fluorene
EP3703779B1 (en) 2017-11-03 2026-01-28 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
US12053618B2 (en) 2017-11-06 2024-08-06 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50553A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec détection de positionnement et de débit
IL273637B2 (en) 2017-11-10 2025-09-01 Amgen Inc Pistons for drug delivery devices
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
CN111263651B (zh) 2017-11-16 2022-06-17 安进公司 具有停顿和终点检测的自动注射器
EP3725806A4 (en) 2017-12-14 2022-03-30 ABL Bio Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST A-SYN/IGF1R AND ASSOCIATED USE
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
JP2021519068A (ja) 2018-03-26 2021-08-10 アムジェン インコーポレイテッド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォーム
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
WO2020023444A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
CA3103105A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
JP2022500095A (ja) 2018-09-24 2022-01-04 アムジエン・インコーポレーテツド インターベンション投薬システム及び方法
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
MA53815A (fr) 2018-10-02 2022-01-05 Amgen Inc Systèmes d'injection pour administration de médicament avec transmission de force interne
AU2019355979B2 (en) 2018-10-05 2024-12-05 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
JP7719714B2 (ja) 2018-10-15 2025-08-06 アムジエン・インコーポレーテツド ダンピング機構を有する薬物送達装置
TWI846741B (zh) 2018-10-15 2024-07-01 美商安進公司 用於藥物遞送裝置之平台組裝方法
ES3010833T3 (en) 2018-11-01 2025-04-04 Amgen Inc Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CA3113076A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
EP3895732A4 (en) 2018-12-03 2022-09-14 Teijin Pharma Limited HUMANIZED ANTI-IGF-I RECEPTOR ANTIBODY
MX2021006915A (es) 2018-12-12 2021-08-24 Chemocentryx Inc Inhibidores de cxcr7 para el tratamiento de cancer.
US11702482B2 (en) 2018-12-17 2023-07-18 Revitope Limited Twin immune cell engager
JP7510952B2 (ja) 2019-04-24 2024-07-04 アムジエン・インコーポレーテツド シリンジ滅菌確認アセンブリ及び方法
BR112021022789A2 (pt) 2019-05-14 2022-04-19 Cedars Sinai Medical Center Métodos, sistemas e dispositivos para a seleção de pacientes para tl1a
CA3148261A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
KR20220069982A (ko) 2019-09-26 2022-05-27 암젠 인크 항체 조성물의 생산 방법
WO2021228178A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
WO2022081804A1 (en) 2020-10-14 2022-04-21 Viridian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of thyroid eye disease
EP4229080A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
AU2022213913B2 (en) 2021-01-27 2026-01-08 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Single-domain antibody against cd16a and use thereof
US20240166760A1 (en) * 2021-03-08 2024-05-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66e POLYPEPTIDES
CN112794912B (zh) * 2021-04-14 2021-07-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗igf-1r抗体及其应用
WO2022239720A1 (ja) 2021-05-10 2022-11-17 公益財団法人川崎市産業振興財団 抗原への結合親和性を低減させた抗体
US20240208680A1 (en) 2021-05-21 2024-06-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas
WO2023019171A1 (en) 2021-08-10 2023-02-16 Viridian Therapeutics, Inc. Compositions, doses, and methods for treatment of thyroid eye disease
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
CN118613506A (zh) * 2022-01-29 2024-09-06 明慧医药（杭州）有限公司 一种抗原结合蛋白及其用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
TW202506724A (zh) * 2023-04-04 2025-02-16 大陸商南京正大天晴製藥有限公司 抗igf1r抗體及其用途
WO2024220916A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025014773A1 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Viridian Therapeutics, Inc. Methods of treating chronic thyroid eye disease
AU2024325342A1 (en) 2023-08-14 2026-02-26 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
CN117079823B (zh) * 2023-10-17 2024-01-02 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 早期预测选择性胎儿生长受限发病风险筛查的系统和方法
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2026030152A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Amgen Inc. System and method for assessing transferability of a fill recipe

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US586510A (en) * 1897-07-13 Coal-grading machine
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US4968516A (en) * 1989-07-24 1990-11-06 Thompson Neal W Method and apparatus for cooking foodstuffs using auxiliary steam
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546091B1 (en) 1990-08-29 2007-01-24 Pharming Intellectual Property BV Homologous recombination in mammalian cells
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK1820858T3 (da) 1991-03-01 2009-11-02 Dyax Corp Kimært protein omfatende mikroprotein med to eller flere disulfidbindinger og udförelsesformer deraf
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
FI934588A7 (fi) 1991-04-19 1993-10-18 Roche Diagnostics Gmbh Ihmisen luusta johdettu insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova prote iini
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
IT1270882B (it) * 1993-10-05 1997-05-13 Isagro Srl Oligopeptidi ad attivita' fungicida
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
JPH08140528A (ja) 1993-12-03 1996-06-04 Genpharm Internatl Inc 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
JP3053222B2 (ja) 1995-04-20 2000-06-19 ファイザー・インコーポレーテッド Ｍｍｐおよびｔｎｆ抑制剤としてのアリールスルホニルヒドロキサム酸誘導体
CA2218489A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Aya Jakobovits Generation of large genomic dna deletions
DE69637481T2 (de) * 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
WO1997018241A1 (en) * 1995-11-14 1997-05-22 Thomas Jefferson University Inducing resistance to tumor growth with soluble igf-1 receptor
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ES2183905T3 (es) 1995-12-20 2003-04-01 Hoffmann La Roche Inhibidores de metaloproteasa de matriz.
CN1116286C (zh) 1996-03-05 2003-07-30 曾尼卡有限公司 4－苯胺基喹唑啉衍生物
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
IL118626A0 (en) * 1996-06-11 1996-10-16 Xtl Biopharmaceuticals Limited Anti HBV antibody
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
ATE227283T1 (de) 1996-07-13 2002-11-15 Glaxo Group Ltd Kondensierte heterozyklische verbindungen als protein kinase inhibitoren
PL331154A1 (en) 1996-07-13 1999-06-21 Glaxo Group Ltd Bicyclic heteroaromatic compounds as inhibitors of proteinous tyrosine kinase
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
DK0923585T3 (da) 1996-07-18 2002-07-01 Pfizer Phosphinatbaserede inhibitorer af matrixmetalloproteinaser
WO1998007697A1 (en) 1996-08-23 1998-02-26 Pfizer Inc. Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
DK0950059T3 (da) 1997-01-06 2004-11-01 Pfizer Cycliske sulfonderivater
DK0977733T3 (da) 1997-02-03 2003-11-24 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylaminohydroxamsyrederivater
AU5493598A (en) 1997-02-07 1998-08-26 Pfizer Inc. N-hydroxy-beta-sulfonyl-propionamide derivatives and their use as inhibitors of matrix metalloproteinases
TR199901926T2 (xx) 1997-02-11 1999-12-21 Pfizer Inc. Arils�lfonil hidroksamik asit t�revleri
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP0984930B1 (en) 1997-05-07 2005-04-06 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
JP2002501532A (ja) 1997-05-30 2002-01-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 新規血管形成阻害薬
PL338633A1 (en) 1997-08-08 2000-11-06 Pfizer Prod Inc Derivatives of aryloxyarylsuphonylamino hydroxamic acid
ATE368665T1 (de) 1997-08-22 2007-08-15 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
JP2001518470A (ja) 1997-09-26 2001-10-16 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 新規な血管形成阻害剤
CN101328186A (zh) 1997-11-11 2008-12-24 辉瑞产品公司 用作抗癌药的噻吩并嘧啶和噻吩并吡啶衍生物
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
WO1999061422A1 (en) 1998-05-29 1999-12-02 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7173005B2 (en) * 1998-09-02 2007-02-06 Antyra Inc. Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
US6114361A (en) 1998-11-05 2000-09-05 Pfizer Inc. 5-oxo-pyrrolidine-2-carboxylic acid hydroxamide derivatives
SG156547A1 (en) 1998-12-23 2009-11-26 Pfizer Human monoclonal antibodies to ctla-4
AU3579200A (en) 1999-02-26 2000-09-14 Saltech I Goteborg Ab Method and composition for the regulation of hepatic and extrahepatic productionof insulin-like growth factor-1
HUP0200575A3 (en) 1999-03-25 2004-11-29 Abbott Gmbh & Co Kg Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
JP4224894B2 (ja) * 1999-06-04 2009-02-18 チッソ株式会社 複合強化ポリオレフィン樹脂組成物の製造方法及びその製造装置
US7329745B2 (en) * 2000-06-13 2008-02-12 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
US20030165502A1 (en) * 2000-06-13 2003-09-04 City Of Hope Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth
NZ527302A (en) 2001-01-05 2006-10-27 Abgenix Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
NZ530765A (en) 2001-06-26 2006-11-30 Amgen Fremont Inc Antibodies that bind OPGL and compositions and methods for the treatment of bone diseases
US7538195B2 (en) * 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
ES2527871T3 (es) 2003-05-01 2015-02-02 Imclone Llc Anticuerpos completamente humanos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina humana
ES2351395T3 (es) * 2003-08-13 2011-02-04 Pfizer Products Inc. Anticuerpos humanos modificados anti-igf-1r.
OA13358A (en) * 2004-01-09 2007-04-13 Amgen Fremont Inc Antibodies to MAdCAM.
US10181126B2 (en) 2012-03-13 2019-01-15 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
CZ301712B6 (cs) 2010-06-02
EE05715B1 (et) 2014-06-16
EA012079B3 (ru) 2018-07-31
HN2001000283A (es) 2002-05-09
IS2790B (is) 2012-06-15
EP2194067B1 (en) 2017-12-06
UY27087A1 (es) 2002-06-20
ME00502B (me) 2011-10-10
KR20040030481A (ko) 2004-04-09
JP2009297037A (ja) 2009-12-24
NZ527302A (en) 2006-10-27
AU2002231368B2 (en) 2006-11-23
IL156661A0 (en) 2004-01-04
EP2796468A2 (en) 2014-10-29
ZA200305995B (en) 2004-08-04
CN1854157B (zh) 2013-01-02
CN1330668C (zh) 2007-08-08
US20140120089A1 (en) 2014-05-01
US20050281812A1 (en) 2005-12-22
ECSP034711A (es) 2003-10-28
BG111652A (en) 2014-03-31
CA2433800C (en) 2016-09-13
BG108037A (bg) 2005-04-30
US20100255538A1 (en) 2010-10-07
CA2433800A1 (en) 2002-07-11
BG66460B1 (bg) 2014-10-31
PY0132240A (es) 2004-06-01
US7815907B2 (en) 2010-10-19
EA200300766A1 (ru) 2004-06-24
SK9932003A3 (en) 2004-06-08
AP2001002365A0 (en) 2001-12-31
EP2275446A2 (en) 2011-01-19
JP5697862B2 (ja) 2015-04-08
OA12589A (en) 2006-06-08
BR0116728A (pt) 2005-04-12
NO339789B1 (no) 2017-01-30
EP2275446A3 (en) 2012-08-15
GEP20084484B (en) 2008-09-25
DZ3494A1 (fr) 2002-07-11
DK1399483T3 (da) 2010-08-02
US20160096894A1 (en) 2016-04-07
GT200100257A (es) 2002-09-02
EE05724B1 (et) 2014-10-15
HUP0302525A2 (hu) 2003-10-28
TWI324609B (en) 2010-05-11
US20040086503A1 (en) 2004-05-06
AR032028A1 (es) 2003-10-22
WO2002053596A3 (en) 2004-01-08
MX349009B (es) 2017-07-06
EE200300318A (et) 2003-10-15
HK1098162A1 (en) 2007-07-13
UA87804C2 (ru) 2009-08-25
US9234041B2 (en) 2016-01-12
HK1203521A1 (en) 2015-10-30
PL366340A1 (pl) 2005-01-24
NZ569856A (en) 2010-03-26
IL156661A (en) 2008-11-26
PE20020801A1 (es) 2002-09-06
BG112197A (bg) 2016-05-31
US20120005767A1 (en) 2012-01-05
AP2072A (en) 2009-12-10
PL413188A1 (pl) 2016-01-18
JP6166243B2 (ja) 2017-07-19
JP2009108055A (ja) 2009-05-21
CN1854157A (zh) 2006-11-01
US8642037B2 (en) 2014-02-04
DE60141855D1 (de) 2010-05-27
PL224873B1 (pl) 2017-02-28
CR10134A (es) 2010-09-14
ATE464322T1 (de) 2010-04-15
HK1072059A1 (en) 2005-08-12
CR7045A (es) 2005-09-02
JP2015057428A (ja) 2015-03-26
NO20033074D0 (no) 2003-07-04
CR20140001A (es) 2014-02-05
NO20033074L (no) 2003-07-04
KR100830082B1 (ko) 2008-05-20
CZ20032131A3 (cs) 2004-01-14
RS51373B (sr) 2011-02-28
MXPA03006034A (es) 2005-07-01
UY35948A (es) 2016-08-31
EA012079B1 (ru) 2009-08-28
BRPI0116728B1 (pt) 2018-10-30
US7037498B2 (en) 2006-05-02
EE201300037A (et) 2014-04-15
PA8535501A1 (es) 2003-07-28
EP2194067A3 (en) 2012-08-15
PL217921B1 (pl) 2014-09-30
CU23447B7 (es) 2009-10-16
US7700742B2 (en) 2010-04-20
IS6866A (is) 2003-07-04
YU54203A (sr) 2006-03-03
TNSN01177A1 (fr) 2005-11-10
SG138469A1 (en) 2008-01-28
MX337162B (es) 2016-02-15
SV2007000775A (es) 2007-03-15
WO2002053596A2 (en) 2002-07-11
PT1399483E (pt) 2010-07-20
CN1564829A (zh) 2005-01-12
US7982024B2 (en) 2011-07-19
JP2004531217A (ja) 2004-10-14
EP1399483B1 (en) 2010-04-14
CR10786A (es) 2009-06-04
ES2344592T3 (es) 2010-09-01
AU2002231368C1 (en) 2018-08-16
PL407889A1 (pl) 2014-10-13
HRP20030627A2 (en) 2005-06-30
JP4456166B2 (ja) 2010-04-28
SK287954B6 (sk) 2012-07-03
EP2194067A2 (en) 2010-06-09
MY143465A (en) 2011-05-13
HRP20130659A2 (hr) 2013-09-30
US20050244408A1 (en) 2005-11-03
MA26040A1 (fr) 2004-04-01
EP1399483A2 (en) 2004-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002231368C1 (en) Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
HK1098162B (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
HK1072059B (en) Antibodies to insulin-like growth factor i receptor
AU2007200793A1 (en) Antibodies to Insulin-like Growth Factor I Receptor