PT1399483E - Anticorpos contra o receptor do factor i de crescimento tipo insulina - Google Patents

Anticorpos contra o receptor do factor i de crescimento tipo insulina Download PDF

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Jose Ramon Corvalan
Bruce D Cohen
Jean Beebe
Penelope E Miller
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Description

1
DESCRIÇÃO
"ANTICORPOS CONTRA O RECEPTOR DO FACTOR DE CRESCIMENTO I TIPO INSULINA"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 factor de crescimento tipo insulina (IGF-I) é um polipeptídeo 7,5-kD que circula no plasma em concentrações elevadas e é detectável na maioria dos tecidos. 0 IGF-I estimula a diferenciação celular e proliferação celular e é requerido pela maioria dos tipos de células de mamíferos para uma proliferação sustentada. Estes tipos de células incluem, entre outros, fibroblastos diplóides humanos, células epiteliais, célula do músculo liso, linfócitos T, células neuronais, células mielóides, condrócitos, osteoblastos e células tronco da medula óssea. Para uma revisão da ampla variedade de tipos de células para as quais a interacção do receptor IGF-I/IGF-I medeia a proliferação celular, consulte Goldring et al., Eukar. Gene Express., 1:31-326 (1991). 0 primeiro passo na via de transdução que leva à proliferação ou diferenciação celular estimulada pelo IGF-I é a ligação do IGF-I ou IGF-II (ou insulina em concentrações suprafisiológicas) ao receptor IGF-I. 0 receptor IGF-I é composto por dois tipos de sub-unidades: uma subunidade alfa (uma proteína 130-135 kD que é totalmente extracelular e que funciona ligando-se a ligandos) e uma subunidade beta (uma proteína transmembranar de 95-kD, com domínios transmembranares e citoplasmáticos) O IGF-IR pertence à família dos receptores de factores de crescimento da tirosina quinase. (Ullrich et al., Cell: 203-212, 1990) e é estruturalmente similar ao 2 receptor da insulina (Ullrich et al., EMBO J. 5:2503-2512,1986) . O IGF-IR é inicialmente sintetizado como um polipeptideo pro-receptor de cadeia simples que é processado por meio de glicosilação, clivagem proteolitica e ligação covalente para se conseguir um heterotetrâmero de 460-kD maturo composto por duas subunidades alfa e duas subunidades beta. A(s) subunidade(s) beta possui(em) actividade tirosina quinase activada por ligando. Esta actividade está envolvida nas vias de sinalização que medeiam a acção do ligando, a qual envolve autofosforilação da subunidade beta e a fosforilação de substratos IGF-IR.
In vivo, os níveis séricos do IGF-I são dependentes da presença de hormona de crescimento pituitária (GH) . Embora o fígado seja o local principal onde se efectua a síntese do IGF-I dependente de GH, trabalhos recentes indicam que a maioria dos tecidos normais produz IGF-I. Uma variedade de tecidos neoplásicos pode também produzir IGF-I. Deste modo, o IGF-I pode actuar como um regulador de proliferação celular normal ou anormal por via autócrina ou parácrina, assim como por meio de mecanismos endócrinos. O IGF-I e o IGF-II ligam-se às proteínas que se ligam ao IGF (IGFBPs) in vivo. A disponibilidade do IGF livre para interagir com o IGF-IR é modulada pelas IGFBPs. Para um artigo de revisão sobre as IGFBPs e IGF-I, veja Grimberg et al., J. Cell. Physiol. 183 1-9, 2000.
Existe evidência considerável para uma função do IGF-I e/ou IGF-IR na manutenção de células tumorais in vitro e in vivo. Os níveis de IGF-IR são elevados nos tumores do pulmão (Kaiser et al., J. Câncer Res. Clin Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1173, 1993; Macauley et al., Câncer Res., 50: 2511 -2517, 1990), mama (Pollak et al., Câncer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens et 3 al., Câncer Res. 49: 7002-7009, 1989; Cullen et al., Câncer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), próstata e cólon (Remaole-Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, 1992; Guo et al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992). A expressão desregulada do IGF-I no epitélio da próstata gera neoplasia em ratinhos transgénicos (DiGiovanni et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 3455-60, 2000). Para além disso, o IGF-I parece ser um estimulador autócrino de gliomas humanos (Sandberg-Nordqvist et al., Câncer Res. 53:2475-2478, 1993), enquanto o IGF-I estimula o crescimento de fibrosarcomas que expressam em excesso o IGF-IR (Butler et al., Câncer Res. 58: 3021-27, 1998). Mais ainda, indivíduos com níveis "normais elevados" de IGF-I têm um risco aumentado de cancros comuns comparativamente a indivíduos com níveis na ordem de "normais baixos" (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10:136-41, 1999). Muitos destes tipos de células tumorais respondem ao IGF- -I com um sinal de proliferação em cultura (Nakanishi et al., J. Clin. Invest. 82: 354-359, 1988; Freed et al., J. Mol.
Endocrinol. 3: 509-514, 1989), sendo que foram propostos mecanismos de estimulação ("loops") autócrinos e parácrinos para a proliferação in vivo foram postulados (LeRoith et al., Endocrine Revs. 16: 143-163, 1995; Yee et al., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Para um artigo de revisão sobre o papel que a interaeção do IGF-I /receptor de IGF-I desempenha no crescimento de uma variedade de tumores humanos, consulte Macaulay, Br. J. Câncer, 65: 311 -320, 1992 .
Os níveis IGF-I aumentados estão também correlacionados com vários estados patológicos não cancerosos, incluindo acromegalia e gigantismo (Barkan, Cleveland Clin. J. Med. 4 65: 343, 347-349, 1998), enquanto a função anormal do IGF-I/receptor de IGF-I tem tido implicações na psoriase (Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000), aterosclerose e restenose do músculo liso nos vasos sanguíneos após angioplastia (Bayes-Genis et al., Cire. Res. 86: 125-130, 2000). Os níveis aumentados de IGF-I podem também ser um problema na diabetes ou em complicações da mesma, tais como proliferação microvascular (Smith et al., Nat. Med. 5: 1390-1395, 1999). Os níveis reduzidos de IGF-I, que ocorrem, inter alia, em casos em que os níveis séricos de GH são reduzidos ou quando se verifica uma insensibilidade ou resistência à GH, são associados a tais disfunções tal como a estatura baixa (Laron, Paediatr. Drugs 1: 155-159, 1999), neuropatia, redução da massa muscular e osteoporose (Rosen et al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-141, 1999).
Ao se utilizarem vectores de expressão antisense ou oligonucleótidos antisense para o ARN de IGF-IR, demonstrou-se que a interferência com IGF-IR leva à inibição do crescimento celular mediado por IGF-I ou IGF-II (ver, Wraight et al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). A estratégia antisense foi bem sucedida na inibição da proliferação celular em vários tipos de células normais e em linhas de células tumorais humanas. O crescimento pode igualmente ser inibido utilizando análogos peptídeos de IGF-I (Pietrz- kowski et al., Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 1992; e Pietrzkowski et al., Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992) ou um vector que expresse um ARN antisense para o ARN IGF-I (Trojan et al., Science 259: 94-97, 1992). Para além disso, os anticorpos para o IGF-IR (Arteaga et al., Breast Cane. Res. Treatm., 22:101-106, 1992; e Kalebic et al., Câncer Res. 54: 54: 5531-5534, 1994), e mutantes 5 dominantes negativos de IGF-IR (Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91: 2181-2185, 1994; Li et al., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 e Jiang et al., Oncogene 18:6071 -77, 1999), podem inverter o fenótipo transformado, inibir a tumorigénese e induzir perda de fenótipo metastático IGF-I é igualmente importante na regulação da apoptose. Apoptose, que é a morte celular programada, encontra-se envolvida numa série de processos do desenvolvimento, incluindo maturação do sistema nervoso e imune. Para além do seu papel ao nível do desenvolvimento, a apoptose também tem sido implicada como uma salvaguarda celular importante contra a tumorigénese (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991; Lane, Nature 362: 786-787, 1993). A supressão do programa apoptótico, por uma variedade de lesões genéticas, pode contribuir para o desenvolvimento e progressão de malignidades. IGF—I protege da apoptose induzida por eliminação de citoquina em células hematopoiéticas dependentes de IL-3 (Rodriguez- Tarduchy, G. et al., J. Immunol. 149:535-540, 1992) , e eliminação de soro em células 1/mycER de ratos (Harrington, E., et al., EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). A função anti-apoptótica do IGF-I é importante na fase pós cumprimento do ciclo celular e também nas células bloqueadas no progresso do ciclo celular por etoposida ou timidina. A demonstração que os fibroblastos conduzidos por c-myc são dependentes do IGF-I para a sua sobrevivência sugere que o IGF-IR desempenha uma função importante na manutenção de células tumorais ao especificamente inibir a apoptose, função essa distinta dos efeitos de proliferação do IGF-I ou IGF-II. Esta função poderia equiparar-se a uma função que poderia ser desempenhada por outros genes anti- 6 apoptópicos tais como bcl-2 na promoção da sobrevivência do tumor (McDonnell et al., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry et al., Nature 348: 334-336, 1990).
Os efeitos protectores do IGF-I na apoptose são dependentes da existência de IGF-IR em células para interagir com o IGF-I (Resnicoff et al. , Câncer Res. 55: 3739-3741, 1995). Foi igualmente facultada, por um estudo, uma função anti -apoptótica de IGF-IR na manutenção de células tumorais, utilizando oligonucleótidos antisense para o IGF-IR que identificou uma relação quantitativa entre níveis IGF-IR, a dimensão de apoptose e o potencial tumorigénico de um tumor isogénico de um ratinho (Rescinoff et al., Câncer Res. 55: 3739-3741, 1995). Foi encontrado um IGF-IR com expressão excessiva para proteger células tumorais in vitro da apoptose induzida por etopisode (Sell et al., Câncer Res. 55:303-306, 1995) e, ainda mais dramática, que uma diminuição dos níveis de IGF-IR abaixo dos níveis do tipo selvagem causou apoptose maciça de células tumorais in vivo, (Resnicoff et al., Câncer Res. 55: 2463-2469, 1995).
Possíveis estratégias para induzir a apoptose ou para inibir a proliferação celular associada ao aumento da IGF-I, o aumento da IGF-II e / ou aumento dos receptores de IGF-IR incluem suprimir os níveis de IGF-I ou os níveis de IGF-II ou impedem a ligação do IGF-I ao IGF-IR. Por exemplo, a octreótida análoga de longa acção da somatostatina tem sido utilizada para reduzir a síntese de IGF e / ou secreção. O IGF-IR solúvel tem sido utilizado para induzir a apoptose de células tumorais in vivo e inibem a tumorigénese em um sistema experimental animal (D'Ambrosio et al. Câncer Res. 56: 4013-20, 1996) . Além disso, oligonucleotido antisense do IGF-IR, análogos do 7 peptídeo IGF-I e anticorpos anti-IGF-IR têm sido utilizados para diminuir a expressão IGF-I ou IGF-IR (Vide supra). No entanto, nenhum destes compostos demonstrou ser adequado para a administração a longo prazo em doentes humanos. Para além disso, embora o IGF-I tenha sido administrado a doentes para tratamento de estatura baixa, osteoporose, redução de massa muscular, neuropatia ou diabetes, a ligação do IGF-I ao IGFBPs tem frequentemente tornado o tratamento com IGF-I difícil ou ineficaz.
Consequentemente, tendo em conta o papel que o IGF-I e IGF-IR têm em tais doenças como o cancro e outras condições proliferativas quando o IGF-I e/ou IGF-IR são expressos em excesso e o papel pouco importante que o IGF-I e IGF-IR desempenha em condições como estatura baixa e fragilidade, quando o IGF-I e/ou IGF-IR são pouco expressos, seria desejável gerar anticorpos contra o IGF-IR que pudessem ser utilizados para inibir ou estimular o IGF-IR. Embora se tenha afirmado que os anticorpos anti-IGF-IR tenham sido encontrados em alguns doentes com doenças auto-imunes, nenhum destes anticorpos tem sido purificado e nenhum mostrou ser apropriado para inibir a actividade de IGF-I em termos de diagnóstico ou procedimentos clínicos. Ver, por exemplo, Thompson et al., Pediat. Res. 32: 455-459, 1988; Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; Weightman et al., Autoimmunity 16:251 -257, 1993; Drexhage et al., Nether. J. of Med. 45:285-293, 1994. Deste modo, seria desejável obter anticorpos anti-IGF-IR humanos de alta afinidade que pudessem ser utilizados para tratar doenças em humanos.
Li et al., Câncer Immunology and Immunotherapy, 49(4/5):243-252, 2000 refere a produção de cadeias simples de anticorpos (scFv) contra IGF-IR e construções 8 quiméricas, nas quais o scFv é fundido em uma região humana Fc para se obter uma scFv-Fc. De acordo com Li e tal., o anticorpo scFc-Fc liga-se ai IGF-IR, bloqueia a sua interacção com os ligandos IGF-I e IGF-II, estimula a auto-fosforilação e inibe o crescimento de células tumorais in vitro e in vivo. Os autores concluem que o scFc-Fc se apresenta como uma ferramenta útil de primeira geração para o possível desenvolvimento de terapêuticas IGF-IR futuras. Kaliman et al. , J. Biol. Chem., 267(15): 10645-10651, 1992 refere-se a anticorpos de coelhos direccionados para uma sequência terminal carboxi (aa 1232-1246 ou aa 985-998) de IGF-IR. De acordo com Kaliman et al., não existe anticorpo que iniba a ligação de IGF-I ao IGF-IR. Kaliman et al. afirma ainda que o anticorpo direccionado para a sequência IGF-IR aa 1232-1246 inibe a auto-fosforilação de IGF-IR e a fosforilação de substratos exógenos, enquanto o anticorpo direccionado para a sequência IGF- IR aa 985-998 não apresenta estes efeitos. Xiong et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 89(1):5356-5360, 1992 refere-se à produção de anticorpos anti-IGF-IR de ratinhos (designados como 3B7, ID4, 2D1). De acordo com Xiong et al., estes anticorpos estimulam a ligação de IGF-I e de IGF-II ao IGF-IR, em contrate ao anticorpo anti-IGF-IR cxlR-3, o qual inibe a ligação do ligando ao IGF-IR. Xiong et al. afirmam ainda que o anticorpo 3B7 estimula a inclusão de ADN, enquanto o anticorpo alR-3 inibe a inclusão de ADN e divisão de células tumorais. Finalmente, Xiong et al. afirmam que tanto o anticorpo 3B7 como o alR-3 aumentam a auto-fosforilação de IGF-IR..
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figuras 1A-1C apresentam alinhamentos de sequências nucleótidas das regiões variáveis de cadeia leve de seis 9 anticorpos IGF-IR humanos para cada uma e para sequências de linhas germinativas. A Fig. IA apresenta o alinhamento das sequências nucleótidas da região variável de cadeia leve (VL) de anticorpos 2.12.1 (SEQ ID No: 2.13.2 (SEQ ID NO: 5), 2.14.3 (SEQ ID NO: 9) e 4.9.2 (SEQ ID N° : 13) próprias e para a sequência de linha germinal VkA30 (SEQ ID NO: 39). A Fig. 1B apresenta o alinhamento da sequência nucleótida de VL do anticorpo 4.17.3 (SEQ ID N°: 17) para a sequência de linha germinal Vk 012 (SEQ ID N°: 41). A Fig. 1C apresenta o alinhamento da sequência nucleótida de VL do anticorpo 6.1.1 (SEQ ID N° : 21) para a sequência de linha germinal Vk A27 (SEQ ID N° : 37) . Os alinhamentos mostram igualmente as regiões CDR da VL de cada anticorpo. As sequências de consenso para as Figuras 1A-1C são apresentadas na SEQ ID N°s: 53-55, respectivamente.
Figuras 2A-2D apresentam alinhamentos das sequências nucleótidas das regiões variáveis de cadeia pesada de seis anticorpos anti-IGF-IR humanos para cada uma e para sequências de linhas germinativas. A Fig. 2A apresenta o alinhamento da sequência nucleótida da região variável da VH do anticorpo 2.12.1 (SEQ ID N°: 3) para a sequência de linha germinal VH DP-35 (SEQ ID N°: 29). A Fig. 2B apresenta o alinhamento da sequência nucleótida de VH do anticorpo 2.14.3 (SEQ ID N°: 11) para a sequência de linha germinal VIV-4/4.35 (SEQ ID N°: 43). Figuras 2C-1 e 2C-s apresentam os alinhamentos das sequências nucleótidas de VH de anticorpos 2.13.2 (SEQ ID N° : 7), 4.9.2 (SEQ ID N° : 15) e 6.1.1 (SEQ ID N°: 23) para cada uma e para a sequência de linha germinal VH DP-47 (SEQ ID N°: 31). A Fig. 2D apresenta o alinhamento da sequência nucleótida de VH do anticorpo 4.17.3 (SEQ ID N°: 19) para a sequência de linha germinal VH DP-71 (SEQ ID N°: 35). O alinhamento apresenta 10 igualmente as regiões DCR dos anticorpos. As sequências de consenso para as Figuras 2A-2D são apresentadas na SEQ ID N°s: 56-59, respectivamente. A Fig. 3 mostra que os anticorpos anti IGF-IR 2.13.2, 4.9.2 e 2.12.1 inibem a ligação IGF-I às células 3T3-IGF-IR. A Fig. 4 mostra que o anticorpo anti-IGF-IR 4.9.2 inibe o receptor tirosina fosforilação induzido por IGF-1. E induz a subregulação na superfície da célula (painel inferior). A Fig. 5 mostra que os anticorpos anti-IGF-IR 2.13.2 e 4.9.2 reduzem o sinal fosforitosina IGF-IR em tumores 3T3-IGF-IR. A Fig. 6 mostra que os anticorpos anti-IGF-IR 2.13.2 e 4.9.2 reduzem o IGF-IR em tumores 3T3-IGF-IR. A Fig. 7 mostra que o anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento do tumor 3T3-IGF-IR in vivo sozinho (painel esquerdo) ou em
Combinação com adriamicina (painel direito). A Fig. 8 mostra as relações existentes entre os níveis de soro do anticorpo 2.13.2 e a subregulação IGF-IR em tumores 3T3-IGF-IR. A Fig. 9 mostra que doses múltiplas do anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibem o crescimento do tumor 3T3-IGF-IR in vivo sozinho ou em combinação com adriamicina. A Fig.10 mostra que o anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento de tumores grandes in vivo em combinação com adriamicina. A Fig. 11 mostra que o anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento do tumor 11 205 do Colo in vivo sozinho ou em combinação com 5-deoxiuridina (5-FU). A Fig. 12 mostra que doses múltiplas do anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento do tumor 205 do colo in vivo sozinho ou em combinação com 5-FU. A Fig. 13 mostra que doses múltiplas do anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento do tumor MCF-7 in vivo sozinho ou em combinação com taxol. A Fig. 14 mostra que o anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento do tumor MCF-7 in vivo sozinho (painel esquerdo) ou em combinação com adriamicina (painel direito). A Fig. 15 mostra que doses múltiplas do anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento do tumor MCF-7 in vivo sozinho ou em combinação com tamoxifen. A Fig. 16 mostra que doses múltiplas do anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 inibe o crescimento do tumor A431 in vivo sozinho ou em combinação com o receptor do factor de crescimento epidermal (EGF-R) inibidor tirosina quinase CP-358,774. A Fig. 17 mostra uma avaliação farmacocinética de uma única injecção intravenosa do anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 e macacos cinomólogos. A Fig. 18 mostra que a combinação do anticorpo anti-IGF-IR 2.13.2 e adriamicina aumenta a subregulação de IGF-IR em tumores 3T3-IGF-IR in vivo. A Fig. 19 apresenta o número de mutações em regiões diferentes de cadeias pesadas e leves de 2.13.2 e 2.12.1 comparativamente às sequências de linhas germinativas.
Figuras 19A-D apresentam os alinhamentos de sequências de aminoácidos de cadeias pesadas e leves dos anticorpos 12 2.13.2 e 2.12.1 com sequências as linhas germinativas, das quais derivam. A Fig. 19B apresenta um alinhamento da sequências de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo 2.13.2 (SEQ ID N°: 45) com a da sequência da linha germinal DP-47 (3-23)/D6-19/JH6 (SEQ ID N°: 46). A Fig. 19C apresenta o alinhamento da sequências de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo 2.13.2 (SEQ ID N°: 47) com a da sequência de linha germinal A30/JK2 (SEQ ID N°: 48). A Fig. 19D apresenta o alinhamento da sequências de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo 2.12.1 (SEQ ID N°: 49) com a da sequência da linha germinal DP-35 (3-11)/D3-3/JH6 (SEQ ID N° : 50) . A Fig. 19E apresenta o alinhamento da sequências de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo 2.12.1 (SEQ ID N°: 51) com a da sequência de linha germinal A30/JK1 (SEQ ID N°: 52). Para as Figuras 19B-E, as sequências sinais encontram-se em itálico, as CDRs encontram-se sublinhadas, os domínios variáveis encontram-se a negrito, as mutações da estrutura (FR) são assinaladas com um sinal de "+" acima do resíduo aminoácido e as mutações CDR são assinaladas com um asterisco acima do resíduo aminoácido.
RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta um anticorpo humano monoclonal isolado ou porção de ligação ao antigénio do mesmo que se liga ao IGF-IR, preferencialmente um que se ligue ao IGF-IR de primata e humano, em que o anticorpo anti-IGF-IR referido inibe a ligação do IGF-I ou IGF-II ao IGF-IR e inibe o crescimento do tumor in vivo·, e em que o anticorpo mencionado ou porção de ligação ao antigénio do mesmo compreende as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de uma cadeia pesada e as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 da região 13 variável de uma cadeia leve, em que a cadeia pesada e a cadeia leve mencionadas são: a) a cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo 2.13.2 ((ATCC Arquivo No. PTA-2788); ou b) a cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo 4.9.2 ((ATCC Arquivo No. PTA-2789); ou c) uma cadeia pesada que inclui a região variável que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 8 e uma cadeia leve que inclui a região variável que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 6; ou d) uma cadeia pesada que inclui a região variável que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 16 e uma cadeia leve que inclui a região variável que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 14; ou e) uma cadeia pesada que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 45 sem a sequência sinal e uma cadeia leve que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 47 sem a sequência sinal. A presente invenção faculta uma composição farmacêutica que inclui um anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ainda compreender outro componente, tal como um agente anti-tumoral ou um reagente de imagiologia. 0 anticorpo ou porção do mesmo da presente invenção podem ser utilizados para métodos de diagnóstico e métodos terapêuticos. Os métodos de diagnóstico incluem um método para diagnosticar a presença ou localização de um tecido que expressa IGF-IR utilizando um anticorpo anti IGF-IR. Um método terapêutico inclui a administração do anticorpo a um sujeito que tenha necessidade do mesmo, preferencialmente 14 em conjunto com a administração de um outro agente terapêutico. A presente invenção apresenta uma linha celular isolada, tal como um hibridoma que produz o anticorpo anti-IGF-IR da invenção. A presente invenção apresenta igualmente moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada e leve ou porções de ligação ao antigénio do anticorpo anti-IGF-IR da invenção. A presente invenção apresenta vectores e células hospedeiras que incluem moléculas de ácido nucleico, assim como métodos para produzir de forma recombinante os polipeptideos codificados por moléculas de ácido nucleico. São igualmente apresentados animais transgénicos não humanos que expressem a cadeia pesada e leve ou porções de ligação ao antigénio do mesmo de um anticorpo anti-IGF-IR. A presente invenção apresenta igualmente a utilização de uma molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia pesada e leve ou porções de ligação ao antigénio do mesmo do anticorpo anti-IGF-IR da invenção para a preparação de um medicamento para tratar um sujeito com cancro.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições e Técnicas Gerais
Salvo indicação contrária aqui prevista, os termos científicos e técnicos utilizados com relação à presente invenção deverão ter o significado que é comummente entendido por aqueles com competências comuns na técnica. Mais ainda, salvo disposição contrária exigida pelo presente contexto, os termos no singular incluem 15 pluralidades e os termos no plural incluem o singular. Normalmente, as nomenclaturas utilizadas em ligação com, e técnicas de, células e culturas de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos e hibridização descritas nesta invenção são bem conhecidas e comummente utilizadas na técnica. Salvo indicação contrária, os métodos e técnicas da presente invenção são normalmente efectuados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas citadas e discutidas ao longo da presente especificação. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Clonagem Molecular: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow e Lane
Anticorpos: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1990). As reacções enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do produtor, tal como comummente efectuadas na técnica ou como presentemente descritas. As nomenclaturas utilizadas em ligação com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêutica presentemente descritas são as bem conhecidas e comummente utilizadas na técnica. As técnicas estandardizadas são utilizadas para síntese química, análises químicas, preparação farmacêutica e administração e tratamento de doentes.
Pressupõe-se que os termos seguintes, salvo indicação contrária, têm os seguintes significados: 16 0 termo "polipeptídeo" abrange proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteínas e análogos peptídeos de uma sequência de proteína. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico. 0 termo "proteína isolada" ou "polipeptídeo isolado" é uma proteína ou polipeptídeo que, por virtude da sua origem ou fonte de derivação, (1) não se encontra associado a componentes naturalmente associados que o acompanham no seu estado nativo, (2) é isento de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. Deste modo, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado num sistema celular diferente da célula da qual é naturalmente originária será "isolado" dos seus componentes naturalmente associados. Um polipeptídeo pode também ser tornado substancialmente isento de componentes naturalmente associados por meio de isolamento, utilizando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na técnica.
Uma proteína ou polipeptídeo é "substancialmente puro", "substancialmente homogéneo" ou "substancialmente purificado" quando, pelo menos, cerca de 60 a 70% de uma amostra exibe uma espécie única de polipeptídeo. 0 polipeptídeo ou proteína pode ser monomérico ou multimérico. Um polipeptídeo substancialmente puro ou proteína substancialmente pura irão tipicamente compreender cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% P/P de uma amostra de proteína, mais normalmente cerca de 95% e preferencialmente mais que 99% pura. A pureza ou homogeneidade da proteína pode ser indicada por uma série de meios bem conhecidos na técnica, tais como a electroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguida pela visualização de uma banda simples polipeptídica ao se colorir o gel com um 17 corante bem conhecido na técnica. Para determinados efeitos, pode ser facultada uma resolução mais alta através de HPLC ou de outros meios de purificação bem conhecidos na técnica. 0 termo "fragmento de polipetideo", tal como presentemente referido, designa um polipeptídeo com uma supressão terminal amino e/ou terminal carboxi, mas onde a sequência de aminoácidos remanescente é idêntica às posições correspondentes na sequência de ocorrência natural Os fragmentos têm tipicamente o comprimento de, pelo menos, 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos, preferencialmente, pelo menos, comprimento de 14 aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos, o comprimento de 20 aminoácidos, normalmente, pelo menos, o comprimento de 50 aminoácidos e ainda preferencialmente, pelo menos o comprimento de 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos. O termo "análogo polipeptídeo", tal como presentemente utilizado, designa um polipeptídeo que é composto por um segmento de, pelo menos, 25 aminoácidos com identidade substancial para uma porção de uma sequências de aminoácidos e que possui, pelo menos, uma das seguintes características: (1) ligação específica ao IGF-IR mediante condições de ligação apropriadas, (2) capacidade de bloquear a ligação de IGF-I ou IGF-II ao IGF-IR, ou (3) capacidade de reduzir a expressão de superfície celular IGF-IR ou tirosina fosforilação in vitro ou in vivo. Normalmente, os análogos polipeptídeos compreendem uma substituição de aminoácidos conservadora (ou inserção ou supressão) com respeito à sequência de ocorrência normal. Os análogos têm tipicamente, pelo menos, o comprimento de 20 aminoácidos, preferencialmente, pelo menos, o comprimento de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 18 aminoácidos ou mais e podem frequentemente ser tão compridos quanto um polipeptídeo de ocorrência normal de comprimento total.
As substituições de aminoácidos preferidas são as que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para a formação de complexos de proteinas, (4) alteram a afinidade de ligação e (4) conferem ou modificam outras propriedades fisico-quimicas ou funcionais destes análogos. Os análogos podem incluir inúmeras muteinas de uma sequência que não a sequência de peptideo que ocorre naturalmente. Por exemplo, as substituições de aminoácidos múltiplas ou simples (preferencialmente substituições de aminoácidos conservadoras) podem ser realizadas na sequência que ocorre naturalmente (preferencialmente na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que formam contactos inter-moleculares. Uma substituição de aminoácidos conservadora não deverá mudar substancialmente as características estruturais da sequência parental (por exemplo, um aminoácido de substituição não deverá quebrar uma hélice que ocorra na sequência parental ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência parental). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York. N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
Análogos não peptídeos são comummente utilizados na indústria farmacêutica como fármacos com propriedades análogas às do peptideo modelo. Estes tipos de compostos 19 não peptídeos são designados "peptídeos miméticos" ou " peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veberand Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987).
Estes compostos são frequentemente desenvolvidos com a ajuda de modelos moleculares computorizados. Os peptídeos miméticos que são estruturalmente semelhantes aos peptídeos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equivalente. Normalmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipeptídeo paradigma (isto é, um polipeptídeo que possui uma característica bioquímica desejada ou uma actividade farmacológica), tal como um anticorpo humano, sendo que possui uma ou mais ligações opcionalmente substituíveis por uma ligação seleccionada de um grupo que consiste em: —CH2NH-, —CH2S —,-CH2-CH2—, — CH=CH—(cis e trans), —COCH2 —, —CH(OH)CH2—, e -CH2SO—, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso com um aminoácido D do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode ser igualmente utilizada para gerar peptídeos mais estáveis. Para além disso, os peptídeos limitados que incluem uma sequência de consenso ou uma variação de sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992);
Por exemplo, ao se adicionarem resíduos de cisteína internos com capacidade de formar pontes dissulfureto intramoleculares, as quais ciclizam o peptídeo.
Uma "imunoglobulina" é uma molécula tetramérica. Em uma imunoglobulina de ocorrência natural, cada tetrâmero é 20 composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptideos, sendo que cada par possui uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção terminal amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. A porção terminal carboxi de cada cadeia define uma região constante primeiramente responsável pela função efectora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves κ e λ. As cadeias pesadas são classificadas como as μ, Δ, γ, α, ou ε, e definem o isotipo do anticorpo como as IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são ligadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, sendo que a cadeia pesada inclui também uma região "D" com cerca de mais 10 aminoácidos. Ver, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)).
As regiões variáveis de cada par de cadeias leves/pesadas formam o local de ligação do anticorpo de modo a que uma imunoglobulina intacta tenha dois locais de ligação.
As cadeias de imunoglobulina exibem a mesma estrutura geral de regiões da estrutura relativamente conservadas (FR) ligadas por três regiões hiper-variáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas por regiões da estrutura, permitindo a ligação a um epitopo especifico. Do terminal-N ao terminal-C, tanto a cadeia leve como a pesada incluem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Sequences of 21
Proteins of Immunological Interest de Kabat (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), ou Chothia & Lesk. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
Um "anticorpo" designa uma imunoglobulina intacta ou uma porção de ligação a antigénio do mesmo, que compete com o anticorpo intacto para uma ligação especifica. Porções de ligação a antigénios podem ser produzidas por técnicas de ADN recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Porções de ligação a antigénio incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, e fragmentos de região determinante de complementariedade (CDR), anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e polipeptídeos que contêm, pelo menos, uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ao polipeptídeo a capacidade de ligação ao antigénio específico.
Tal como presentemente utilizado, um anticorpo que é designado como, por exemplo, 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 4.9.2, 4.17.3 e 6.1.1, é um anticorpo que deriva do hibridoma do mesmo nome. Por exemplo, o anticorpo 2.12.1 é derivado do hibridoma 2.12.1.
Um fragmento Fab é um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CH I; um fragmento F(ab')2 é um fragmento bivalente que inclui dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região charneira; um fragmento Fd consiste de domínios VH e CHI; um fragmento Fv consiste de domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) consiste de um domínio VH.
Um anticorpo de cadeia simples (scFv) é um anticorpo, no qual são unidas uma cadeia VL e uma cadeia VH para 22 formar moléculas monovalentes por meio de uma ligação sintética que lhes permite ser feitas de uma proteína de cadeia simples (Bird et al., Science 242:423-426, 1988 and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883, 1988) . Os diacorpos são anticorpos bivalentes, bi-específicos nos quais os domínios VH e VL são expressos em polipeptídeos de cadeia simples, utilizando uma ligação que é demasiado pequena para haver união entre os dois domínios na mesma cadeia, deste modo forçando os domínios à união com domínios complementares de outra cadeia e à criação de dois pontos de ligação ao antigénio (see e.g., Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993, and Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Um ou mais CDRs podem ser incluídos numa molécula ou de modo covalente ou não covalente para tornar a mesma uma imunoadesina. Uma imunoadesina pode incluir o(s) CDR(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeos maior, pode unir covalentemente o(s) CDR(s) a uma outra cadeia polipeptídea ou pode ainda incluir o(s) CDR(s) de modo não covalente. Os CDRs permitem que a imunoadesina se ligue especificamente a um antigénio particular de interesse.
Um anticorpo pode ter um ou mais pontos de ligação. Caso se verifique mais do que um ponto de ligação, estes podem ser idênticos uns aos outros ou diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina que ocorre naturalmente possui dois pontos de ligação idênticos, um anticorpo de cadeia simples ou um fragmento Fab possuem um ponto de ligação, enquanto um anticorpo "bi-específico" ou bi-funcional" possui dois pontos de ligação diferentes.
Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que (1) não está associado a componentes associados naturalmente, incluindo outros anticorpos naturalmente associados, os quais o 23 acompanham no seu estado nativo, (2) é isento de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo anti-IGF-IR que foi purificado por afinidade utilizando IGF-IR, um anticorpo anti-IGF-IR que foi sintetizado por um hibridoma ou outro alinhamento celular in vitro e um anticorpo anti-IGF-IR humano derivado de um ratinho transgénico. 0 termo "anticorpo humano" inclui todos os anticorpos que possuem uma ou mais regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina humana. Em uma concretização preferencial, todos os domínios variáveis e constantes são derivados de sequências de imunoglobulina humana (um anticorpo humano total). Estes anticorpos pode ser preparados de acordo com uma variedade de formas, tal como abaixo descrito.
Um anticorpo humanizado é um anticorpo que deriva de uma espécie não humana, na qual determinados aminoácidos nos domínios estruturais e constantes das cadeias pesada e leve são transformados de modo se evitar ou revogar uma resposta imunológica em seres humanos. Alternativamente, um anticorpo humanizado pode ser produzido por fusão dos domínios constantes de um anticorpo humano para os domínios variáveis de uma espécie não humana. Podem ser encontrados exemplos de como tornar os anticorpos humanizados nas Patentes dos Estados Unidos N°s: 6 054 297, 5 886 152 e 5 877 293. O termo "anticorpo quimérico" designa um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos. Um ou mais dos CDRs pode ser derivado de um anticorpo anti-IGF-IR humano 24 ou todos os CDRs são derivados de um anticorpo anti-IGF-IR humano. Os CDRs de mais do que um anticorpo anti-IGF-IR humano podem ser misturados e correspondidos num anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode incluir um CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo anti-IGF-IR humano, pode ser combinado com um CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um segundo anticorpo anti-IGF-IR humano, e os CDRs da cadeia pesada podem ser derivados de um terceiro anticorpo anti-IGF-IR. Para além disso, as regiões da estrutura podem ser derivadas de um dos mesmos anticorpos anti-IGF-IR, tais como um anticorpo humano ou de um anticorpo humanizado.
Um "anticorpo neutralizante" ou "anticorpo inibidor" é um anticorpo que inibe a ligação de IGF-IR ao IGF-I quando um excesso do anticorpo anti-IGF-IR reduz a quantidade da ligação IGF-I ao IGF-IR em, pelo menos, 20%. Em uma concretização preferencial, o anticorpo reduz a quantidade da ligação IGF-I ao IGF-IR em, pelo menos, 40%, de preferência 60%, mais preferencialmente 80% ou ainda mais preferencialmente 85%. A redução da ligação pode ser avaliada com qualquer meio conhecido pelos especialistas comuns na técnica, por exemplo, tal como avaliado num ensaio de ligação competitivo in vitro. Um exemplo para avaliar a redução na ligação de IGF-I ao IGF-IR está presente abaixo no Exemplo IV.
Um "anticorpo activador" é um anticorpo que activa IGF-IR em, pelo menos, cerca de 20% quando adicionado ao uma célula, tecido ou organismo expressor de IGF-IR. O anticorpo pode activar o IGF-IR em, pelo menos, 40%, 60%, 80% ou 85%. O anticorpo activador pode ser adicionado na presença de IGF-I ou IGF-II. A actividade do anticorpo 25 activador pode ser avaliada ao se determinar a quantidade de tirosina autofosforilação de IGF-IR.
Os fragmentos ou análogos de anticorpos podem ser preparados imediatamente pelos especialistas comuns na técnica seguindo as teorias desta especificação. Os terminais carboxi e amino preferidos de fragmentos ou análogos ocorrem nas proximidades dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados da sequência nucleótida e/ou amino com as bases de dados da sequência pública ou proprietária. Preferencialmente, os métodos de comparação computorizados são utilizados para identificar os motivos da sequência ou conformação dos domínios da proteína prevista que ocorre em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. São conhecidos os métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram em uma estrutura tridimensional. Bowie et ai. Science 253:164 (1991). 0 termo "ressonância de plasmão de superfície", tal como presentemente utilizado, designa um fenómeno ótico que permite a análise de interacções bio-específicas em tempo real por meio da detecção de alterações em concentrações de proteínas dentro de uma matriz biosensor, por exemplo, utilizando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Para descrições mais pormenorizadas, consulte Johnson, U., et ai. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131: e Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. 26 0 termo "K0ff" designa a taxa de variação constante de dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo / antigénio. 0 termo "Kd" designa a constante de dissociação de uma determinada interacção anticorpo-antigénio. 0 termo "epitopo" inclui qualguer determinante de proteina capaz de uma ligação especifica a uma imunoglobulina ou receptor da célula T. Os determinantes epitópicos consistem, normalmente, em grupos conjuntos de moléculas de superfície quimicamente activas, tais como cadeias de aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e normalmente possuem características estruturais tridimensionais específicas assim como características específicas de carga. Diz-se que um anticorpo é especificamente ligado a um antigénio quando a constante de dissociação é ^1 μΜ, preferencialmente ^100 nM e ainda preferencialmente ^10 nM.
Tal como presentemente utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e respectivas abreviaturas respeitam o uso convencional. Vide Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), Os estereoisómeros (por exemplo, aminoácidos-D) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não-naturais, tais como a-, a- aminoácidos dissubstituídos, aminoácidos N-alquilo, aminoácidos lácticos e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para polipeptídeos da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não-convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidrozi-lisina, s-N-metilarginina e 27 outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4-hidroxi-prolina. Na notação de polipeptídeos utilizada, o sentido para a esquerda é o sentido terminal amino e o sentido para a direita é o sentido terminal carboxi, de acordo com o uso padrão e convenções. 0 termo "polinucleótido", tal como presentemente referido, significa uma forma polimérica de nucleótidos de, pelo menos, 10 bases em comprimento, ribonucleótidos ou deoxinucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. O termo inclui formas de ADN de cadeia simples ou dupla. O termo "polinucleótido isolado", tal como presentemente utilizado, significa um polinucleótido de origem genómica, cADN ou sintética ou alguma combinação destas, o qual por virtude da sua origem, o pulinucleótido isolado" (1) não está associado a todas ou a uma porção de um polinucleótido, no qual se encontra um "polinucleótido isolado" por natureza, (2) é ligado operacionalmente a um polinucleótido que não é ligado por natureza ou (3) não corre por natureza como parte de uma sequência maior. O termo "oligonucleótido", presentemente referido, inclui nucleótidos que ocorrem naturalmente e modificados ligados entre si por meio de ligações oligonucleótidas que ocorrem naturalmente ou não. Os oligonucleótidos são um conjunto polinucleótido que normalmente formado por um comprimento de 200 bases ou menos. Os oligonucleótidos são preferencialmente 10 a 60 bases em comprimento e mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases em comprimento. Os oligonucleótidos são normalmente de cadeia simples relativamente a sondas, embora possam ser de cadeia dupla, por exemplo, para utilização na construção de um gene mutante. Os 28 oligonucleótidos da presente invenção podem ser oligonucleótidos sense ou anti-sense. 0 termo "nucleótidos que ocorrem naturalmente", presentemente referido, inclui deoxiribonucleótidos e ribonucleóticos. 0 termo "nucleótidos modificados", presentemente referido, inclui nucleótidos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e semelhantes. 0 termo "ligações oligonucleótidas", presentemente referido, inclui ligações oligonucleóticas, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Vide e.g., LaPlanchc et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al.
Oligonucleótidos e Análogos: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente EU N°: 5,151,510;
Uhlmann e Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990).
Um oligonucleótido pode incluir uma marca para detecção, se desejado.
Sequências "operacionalmente ligadas" incluem tanto sequências de controlo que são contíguas com o gene de interesse como sequências de controlo de expressão que actuam em trans ou à distância para controlar o gene de interesse. O termo "sequência de controlo da expressão", tal como presentemente utilizado, designa sequências de polinucleótidos que são necessárias para produzir a expressão e processamento das sequências codificadoras às quais se encontram operacionalmente ligadas. As sequências de controlo da expressão incluem sequências iniciadoras de transcrição apropriadas, terminais, promotoras e 29 intensificadoras; os sinais de processamento do ARN eficientes, tal como sinais de splicing e poliadenilação; sequências que estabilizam o mARN citoplasmático; sequências que intensificam a eficiência da tradução (por exemplo, sequência de consenso de Kozak); sequências que intensificam a estabilidade da proteína e, quando desejado, sequências que intensificam a secreção da proteína. A natureza destas sequências de controlo difere conforme o organismo hospedeiro. No caso dos procariotas, estas sequências de controlo incluem geralmente promotor, ponto de ligação ribossomal, sequência de terminação da transcrição; nas eucariotas, normalmente, estas sequências de controlo incluem promotores e sequência de terminação da transcrição. 0 termo "sequências de controlo" pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências parceiro de fusão. 0 termo "vector" tal como presentemente utilizado, pretende designar uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de ADN de cadeia dupla, circular, na qual se podem ligar segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vector é um vector virai, em que podem ser ligados segmentos adicionais de ADN ao genoma virai. Certos vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira, na qual são introduzidos (por exemplo vectores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana e vectores epissomais de mamífero). Outros vectores (por exemplo, vectores não- 30 epissomais de mamífero) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira com a introdução na célula hospedeira, e são assim replicados em conjunto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vectores são capazes de orientar a expressão dos genes aos quais estão ligados operacionalmente. Estes vectores são designados como "vectores de expressão recombinantes" (ou apenas "vectores de expressão"). Em geral, os vectores de expressão úteis em técnicas de ADN recombinante encontram-se frequentemente sob a forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vector" podem ser utilizados indiferentemente, na medida em que o plasmídeo é a forma mais vulgarmente empregue de vector. No entanto, a invenção pretende incluir as outras formas de vectores de expressão, tal como vectores virais (por exemplo, retrovírus com replicação deficiente, adenovírus e vírus adeno-associados) que têm funções equivalentes. O termo "célula hospedeira recombinante" (ou apenas "célula hospedeira"), tal como presentemente utilizada, pretende designar uma célula na qual foi introduzido um vector de expressão recombinante. Subentende-se que estes termos não pretendem designar apenas a célula em questão particular, mas toda a descendência dessa célula. Porque podem ocorrer certas modificações nas sucessivas gerações, devido a uma mutação ou influências ambientais, esta descendência poderá, na realidade, não ser idêntica à célula progenitora, mas ainda assim ser incluída no âmbito do termo "célula hospedeira", tal como presentemente utilizado. O termo "híbrida selectivamente" referido no presente documento significa que liga de modo detectável e especificamente. Polinucleótidos, oligonucleótidos e 31 respectivos fragmentos de acordo com a invenção hibridam selectivamente com cadeias de ácido nucleico sob hibridação e condições de lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável para ácidos nucleicos não-especificos. Condições de "grande restringência" ou "muito restringentes" podem ser utilizadas para atingir condições de hibridação selectivas, como conhecido na técnica e discutido no presente documento. Um exemplo de condições de "grande restringência" ou "muito restringentes" consiste num método de incubação de um polinucleótido com outro polinucleótido, podendo um polinucleótido ser afixado numa superfície sólida, tal como uma membrana, num tampão de hibridação de 6X SSPE ou SSC, 50% de formamida, 5X reagente de Denhardt, 0,5% SDS, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado, desnaturado a uma temperatura de hibridação de 42 °C durante 12-16 horas, seguido de lavagem por duas vezes a 55 °C, utilizando tampão de lavagem de IX SSC, 0,5% SDS. Ver também Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55. O termo "identidade da sequência em percentagem" no contexto das sequências de ácido nucleico, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para máxima correspondência. O comprimento da comparação da identidade da sequência pode prolongar-se por um espaço de pelo menos cerca de nove nucleótidos, normalmente pelo menos cerca de 18 nucleótidos, mais habitualmente pelo menos cerca de 24 nucleótidos, tipicamente cerca de 28 nucleótidos, mais tipicamente pelo menos 32 nucleótidos e preferencialmente pelo menos 36, 48 ou mais nucleótidos. Existem alguns algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser utilizados para medir a identidade da sequência de nucleótidos. Por exemplo, 32 sequências polinucleótidos podem ser comparadas utilizando FASTA, Gap ou Bestfit, qeu são programas em Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA fornece alinhamentos e percentagem da identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências query e search (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Metholds Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998) .
Excepto quando especificado em contrário, são utilizados os parâmetros por defeito para um programa ou algoritmo especifico. Por exemplo, a percentagem de identidade da sequência entre sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada utilizando FASTA com os respectivos parâmetros por defeito (um tamanho de palavra de 6 e o factor NOPAM para a matriz de pontuação) ou utilizando Gap, com os seus parâmetros por defeito como fornecido na versão GCG 6.1.
Uma referência a uma sequência de ácidos nucleicos engloba o respectivo complemento excepto quando indicado em contrário. Deste modo, uma referência a uma molécula de ácido nucleico com uma sequência particular deve ser encarada como englobando a respectiva cadeia complementar com a respectiva sequência complementar.
Na tecnologia da biologia molecular, os investigadores utilizam os termos "percentagem de identidade de sequência", "percentagem de similaridade de sequência" e "percentagem de homologia de sequência" indiferentemente. No presente pedido de patente, estes termos terão o mesmo significado relativamente apenas a sequências de ácidos nucleicos. 33 0 termo "similaridade substancial" ou "similaridade substancial da sequência", quando referindo um ácido nucleico ou respectivo fragmento, indica que, quando optimamente alinhado com inserções ou eliminações de nucleótidos apropriadas, com outro ácido nucleico (ou respectiva cadeia complementar) existe uma identidade da sequência de nucleótidos de pelo menos cerca de 85%, mais de preferência pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleótido, conforme medido por qualquer algoritmo de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como anteriormente discutido.
Tal como é aplicado aos polipeptídeos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptidicas, quando normalmente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT, utilizando pesos de gaps pré-definidos, partilham pelo menos 75% ou 80% de identidade da sequência, de preferência pelo menos 90% ou 95% de identidade da sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade da sequência. De preferência, posições resíduo que não são idênticas diferem em substituições conservadoras de aminoácidos. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em que um resíduo aminoácido é substituído por outro resíduo aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) . Em geral, uma substituição de conservadora aminoácido não irá alterar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem entre si por substituições conservadoras, a percentagem de identidade da sequência ou grau de similaridade pode ser ajustada no 34 sentido ascendente para corrigir a natureza conservadora da substituição. Os meios de realização deste ajuste são bem conhecidos dos peritos na especialidade, vide, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 (1994). Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas idênticas incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidroxilo alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: Asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina e 6) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservadores preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
Em alternativa, uma substituição conservadora consiste em qualquer alteração com valor positivo na matriz de verosimilhança logarítmica PAM250, apresentada em Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992). Uma substituição "moderadamente conservadora" consiste em qualquer alteração com um valor não-negativo na matriz de verosimilhança logarítmica PAM250. A similaridade da sequência para polipeptídeos, que é também designada como identidade da sequência, é tipicamente medida utilizando software de análise de sequência. O software de análise de proteínas emparelha sequências similares utilizando medida de similaridade atribuída a várias substituições, eliminações e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, GCG contém programas, tal como "Gap" e "Bestfit" que podem ser utilizados com parâmetros 35 por defeito para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptideos próximos, tal como polipeptideos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma respectiva muteína. Vide, por exemplo, GCG, Versão 6.1. As sequências de polipeptideos podem também ser comparadas utilizando FASTA com parâmetros pré-definidos ou recomendados, um programa em GCG, Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e percentagem da identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências query e search (Pearson (1990) Methods Enzymol. 2000:63-98). Outro algoritmo preferido no caso da comparação de uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes consiste no programa informático BLAST, especialmente blastp ou tblastn, utilizando parâmetros pré-definidos. Vide, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al. Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997). O comprimento das sequências de polipeptideos comparadas para homologia terá, geralmente, pelo menos 16 resíduos de aminoácidos, normalmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais normalmente pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos e preferencialmente mais de cerca de 35 resíduos. No caso de uma pesquisa de uma base de dados contendo sequências de um grande número de organismos diferentes, é preferível comparar sequências de aminoácidos.
Tal como presentemente utilizado, os termos "marcação" ou "marcado" referem-se à incorporação de outra molécula no anticorpo. Numa forma de realização, a marcação é um marcador detectável, por exemplo incorporação de um 36 aminoácido radiomarcado ou ligação a um polipeptídeo de fracções biotinil que pode ser detectado com avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos) . Noutra forma de realização, o rótulo ou marcador pode ser terapêutico, por exemplo um conjugado ou toxina de um fármaco. Vários métodos de marcação de polipeptídeos e glicoproteinas são conhecidos na técnica e podem ser empregues. Exemplos de marcadores de polipeptídeos incluem, sem constituir limitação, os seguintes: Radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 311ln, 1251, 1311) , marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanídeo fósforos), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, grupos biotinil, epítopos polipeptídeos pré-determinedos reconhecidos por um relator secundário (por exemplo, sequências emparelhadas fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação metálicos, tags epítopo), agentes magnéticos tal como quelatos de gadolínio, toxinas tal como a toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e respectivos análogos ou homólogos. Nalgumas formas de realização, os marcadores são ligados por espaçadores de diferentes comprimentos para reduzir a potencial resistência estérica. 37 0 termo "agente" é utilizado para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto feito a partir de materiais biológicos. 0 termo "agente farmacêutico ou fármaco", tal como presentemente utilizado, refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando adequadamente administrado a um doente. Outros termos de química são utilizados de acordo com o uso convencional na técnica, como exemplificado no The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S, Ed, McGraw-Hill, São Francisco (1985)). 0 termo "agente antineoplásico" é presentemente utilizado para designar agentes que possuem a propriedade funcional de inibir um desenvolvimento ou progressão de uma neoplasia num ser humano, particularmente uma lesão maligna (cancerosa), tal como um carcinoma, sarcoma, linfoma ou leucemia. A inibição de metástases é frequentemente uma propriedade dos agentes anti-neoplásicos. 0 termo doente inclui sujeitos humanos e veterinários.
Anticorpos do Anti-IGF-IR Humanos e Respectiva
Caracterização
Os anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associados aos anticorpos que possuem as regiões variáveis e/ou regiões constantes de ratinho ou rato. A presença destas sequências derivadas de ratinho ou rato podem conduzir à rápida eliminação dos anticorpos e pode conduzir à produção de uma resposta imunitária contra o anticorpo por parte do doente. Por conseguinte, são descritos no presente documento anticorpos do anti-IGF-IR humanizados 38
Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona anticorpos do anti-IGF-IR totalmente humanos introduzindo os genes de imunoglobulina humana num roedor, de forma a que o roedor produza anticorpos completamente humanos. São mais preferidos os anticorpos do IGF-IR anti-humanos humanos. Prevê-se que os anticorpos do anti-IGF-IR totalmente humanos minimizem as respostas imunogénicas intrínsecas aos anticorpos monoclonais (Mabs) de ratinhos ou derivatizados de ratinhos e aumentem assim a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. Pode esperar-se que a utilização de anticorpos totalmente humanos proporcione uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas crónicas e recorrentes, tal como inflamação e cancro, o que pode exigir administrações repetidas de anticorpos. Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR da invenção não liga a complemento.
Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR é 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR inclui uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada da SEQ ID NO: 6 ou 14 ou pelo menos os CDRs de uma destas sequências de aminoácidos. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR compreende uma cadeia pesada, incluindo uma sequência de aminoácidos seleccionada da SEQ ID NO: 8 ou 16 ou pelo menos os CDRs de uma destas sequências de aminoácidos.
Classe e Subclasse de Anticorpos do Anti-IGF-IR 0 anticorpo pode ser uma molécula de IgG, de IgM, de IgE, de IgA ou de IgD. Numa forma de realização preferida, o realização é do subtipo IgG e é um IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR é da subclasse IgG2. Noutra forma de realização 39 preferida, o anticorpo anti-IGF-IR pertence à mesma classe e subclasse que o anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2, que pertence a IgG2 . A classe e subclasse de anticorpos anti-IGF-IR pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo pode ser determinada utilizando anticorpos que são específicos de uma classe e subclasse particular do anticorpo. Estes anticorpos encontram-se disponíveis comercialmente. A classe e subclasse pode ser determinada por ELISA, Western Blot, bem como outras técnicas. Em alternativa, a classe e subclasse pode ser determinada por sequenciação da totalidade ou uma porção dos domínios constantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparando as respectivas sequências de aminoácidos com as sequências de aminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinando a classe e subclasse dos anticorpos.
Espécies e Selectividade da Molécula
Noutro aspecto da invenção, o anticorpo anti-IGF-IR da invenção demonstra selectividade tanto quanto à espécie como quanto à molécula. Numa outra forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR da invenção liga-se ao IGF-IR humano, de macaco caranguejeiro ou rhesus. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR não se liga a IGF-IR de cão ou de coelho. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR não se liga a uma espécie de macaco do novo mundo, tal como o marmoset. Segundo o exposto na especificação, é possível determinar a selectividade da espécie do anticorpo anti-IGF-IR recorrendo a métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, é possível determinar a selectividade da espécie utilizando Western Blot, FACS, 40 ELISA ou RIA. Numa forma de realização preferida é possível determinar a selectividade da espécie utilizando Western blot.
Noutra forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR possui uma selectividade para IGF-IR que é pelo menos 50 vezes maior do que a selectividade para o receptor de insulina. Numa forma de realização, a selectividade do anticorpo anti-IGF-IR é mais de 100 vezes maior do que a respectiva selectividade para o receptor de insulina. Numa forma de realização ainda mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR não exibe uma ligação específica apreciável a qualquer outra proteína que não seja IGF-IR. É possível determinar a selectividade do anticorpo anti-IGF-IR para IGR-IR recorrendo a métodos bem conhecidos na técnica, segundo o exposto na especificação. Por exemplo, é possível determinar a selectividade utilizando Western Blot, FACS, ELISA ou RIA. Numa forma de realização preferida é possível determinar a selectividade molecular utilizando Western blot.
Afinidade de Ligação do Anti-IGF-IR a IGF-IR
Noutro aspecto da invenção, os anticorpos do anti-IGF-IR da invenção ligam-se a IGF-IR com elevada afinidade. Numa forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR liga-se a IGF-IR com um Kd de 1 x 10-8 M ou inferior. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com um Kd de 1 x 1CT9 M ou inferior. Numa forma de realização ainda mais preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com um Kd de 5 x 1CT10 M ou inferior. Noutra forma de realização, o anticorpo liga-se a IGF-IR com um Kd de 1 x 1CT10 M ou inferior. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2. 41
Noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo que compreende um ou vários CDRs do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2. Ainda noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo que compreende uma das sequências de aminoácidos seleccionada das SEQ ID NOS: 6, 8, 14 ou 16. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com substancialmente o mesmo Kd que o anticorpo que compreende um ou vários dos CDRs de um anticorpo que compreende uma das sequências de aminoácidos seleccionada das SEQ ID NOS: 6, 8, 14 ou 16.
Noutro aspecto da invenção, o anticorpo anti-IGF-IR possui uma taxa de dissociação baixa. Numa forma de realização, o anticorpo possui um Koff de 1 x IO”4 s~4 ou inferior. Numa forma de realização preferida, o Koff é 5 x 10 5 s_1 ou inferior. Noutra forma de realização preferida, o Koff é substancialmente igual ao do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com substancialmente o mesmo Koff que o anticorpo que compreende um ou vários CDRs do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2. Ainda noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com substancialmente o mesmo KQff que o anticorpo que compreende uma das sequências de aminoácidos seleccionada das SEQ ID NOS: 6, 8, 14 ou 16. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo liga-se a IGF-IR com substancialmente o mesmo Koff que um anticorpo que compreende um ou vários dos CDRs de um anticorpo que compreende uma das sequências de aminoácidos seleccionada das SEQ ID NOS: 6, 8, 14 ou 16. A afinidade de ligação e taxa de dissociação de um anticorpo anti-IGF-IR para IGF-IR pode ser determinada por 42 qualquer método conhecido na técnica. Numa forma de realização, a afinidade de ligação pode ser redimensionada por ELISAs competitivos, RIAs ou ressonância de plasmão de superfície tal como BIAcore. A taxa de dissociação pode ainda ser medida por ressonância de plasmão de superfície. Numa forma de realização mais preferida, a afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas por ressonância de plasmão de superfície. Numa forma de realização mais preferida, a afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas utilizando um BIAcore. Um exemplo da determinação da afinidade de ligação e taxa de dissociação encontra-se descrito seguidamente, no exemplo II.
Semi-vida dos Anticorpos do Anti-IGF-IR
De acordo com outro objecto da invenção, o anticorpo anti-IGF-IR possui uma semi-vida de pelo menos um dia in vitro ou in vivo. Numa forma de realização preferida, o anticorpo ou respectiva porção possui um tempo de semi-vida de pelo menos três dias. Numa forma de realização preferida, o anticorpo ou respectiva porção possui um tempo de semi-vida de quatro dias ou mais. Numa forma de realização preferida, o anticorpo ou respectiva porção possui um tempo de semi-vida de oito dias ou mais. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao anticorpo é derivatizado/a ou modificado/a de forma que possua uma semi-vida mais longa, como discutido posteriormente. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo pode conter mutações pontuais para aumentar a semi-vida no soro, como descrito na WO 00/09560, publicada em 24 de Fevereiro de 2000. A semi-vida do anticorpo pode ser medida por qualquer meio conhecido de alguém com formação ordinária na matéria. Por exemplo, a semi-vida do anticorpo pode ser medida por 43
Western blot, ELISA ou RIA ao longo de um período apropriado de tempo. A semi-vida do anticorpo pode ser medida em qualquer animal apropriado, por exemplo macaco, tal como os macacos caranguejeiros, um primata ou um ser humano.
Identificação dos Epítopos do IGR-IR Reconhecidos por Anticorpo anti-IGF-IR 0 anticorpo anti-IGF-IR da invenção liga de preferência o mesmo antigénio ou epítopos que o anticorpo anti-IGF-IR humano 2.13.2 ou 4.9.2. A invenção proporciona ainda um anticorpo anti-IGF-IR que inter-compete com o anticorpo anti-IGF-IR humano 2.13.2 ou 4.9.2. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR humano é 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR humano compreende uma das sequências de aminoácidos seleccionada das SEQ ID NOS: 6, 8, 14 ou 16. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR humano da invenção um ou vários CDRs de um anticorpo que compreende uma das sequências de aminoácidos seleccionada das SEQ ID NOS: 6, 8, 14 ou 16.
Será possível determinar se um anticorpo anti-IGF-IR se liga ao mesmo antigénio utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, é possível determinar se um anticorpo anti-IGF-IR de ensaio se liga ao mesmo antigénio utilizando um anticorpo anti-IGF-IR para capturar um antigénio que se sabe ligar ao anticorpo anti-IGF-IR, tal como IGF-IR, eluindo o antigénio de um anticorpo e depois determinando se o anticorpo de ensaio se irá ligar ao antigénio eluído. É possível determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-IGF-IR ligando o anticorpo anti-IGF-IR a IGF-IR em condições de saturação e depois medindo a capacidade do anticorpo de 44 ensaio ligar ao IGF-IR. Se o anticorpo de ensaio for capaz de ligar ao IGF-IR ao mesmo tempo gue o anticorpo anti-IGF-IR, então o anticorpo de ensaio liga-se a um epítopo diferente do anticorpo anti-IGF-IR. No entanto, se o anticorpo de ensaio não for capaz de ligar ao IGF-IR ao mesmo tempo, então o anticorpo de ensaio liga-se ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-IGF-IR humano. Esta experiência pode ser executada utilizando ELIAS, RIA ou ressonância de plasmão de superfície. Numa forma de realização preferida, a experiência é executada utilizando ressonância de plasmão de superfície. Numa forma de realização mais preferida é utilizado BIAcore. Pode-se ainda determinar se um anticorpo anti-IGF-IR inter-compete com um anticorpo anti-IGF-IR. Numa forma de realização preferida é possível determinar se um anticorpo anti-IGF-IR inter-compete com outro, utilizando o mesmo método utilizado para medir se o anticorpo anti-IGF-IR é capaz de ligar ao mesmo epítopo que outro anticorpo anti-IGF-IR.
Utilização da cadeia leve e cadeia pesada 0 anticorpo anti-IGF-IR da invenção inclui de preferência sequências variáveis codificadas um gene κ humano.
Numa forma de realização preferida, as sequências variáveis são codificadas por uma família de genes Vk A30. Numa forma de realização mais preferida, a cadeia leve não compreende mais de dez substituições de aminoácidos da linha germinal Vk A30, de preferência não mais de seis substituições de aminoácidos e mais preferencialmente, não mais de três substituições de aminoácidos. Numa forma de realização preferida, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras. 45
As SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18 e 22 proporcionam as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de seis cadeias leves κ do anti-IGF-IR. As SEQ ID NO: 38, 40 e 42 proporcionam as sequências de aminoácidos das três cadeias leves da linha germinal κ das quais são derivadas as seis cadeias leves κ do anti-IGF-IR. As figs. IA a 1C mostram os alinhamentos das sequências de nucleótidos das regiões variáveis das cadeias leves dos seis anticorpos do anti-IGF-IR entre si e relativamente às sequências de linha germinal das quais são derivadas. Na sequência do exposto na presente especificação, alguém com formação ordinária na técnica poderia determinar a sequência de aminoácidos das seis cadeias leves κ do anti-IGF-IR e as cadeias leves da linha germinal κ e determinar as diferenças entre as sequências da linha germinal e as sequências de anticorpos.
Numa forma de realização preferida, o VL do anticorpo anti-IGF-IR contém as mesmas substituições do aminoácido relativamente à sequência do aminoácido da linha germinal, que o VL do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2. Por exemplo, o VL do anticorpo anti-IGF-IR pode conter uma ou várias substituições do aminoácido que são iguais às que se encontram presentes no anticorpo 2.13.2 e outra substituição do aminoácido que é igual ao anticorpo 4.9.2. Deste modo, é possível misturar e emparelhar características diferentes da ligação de anticorpos a fim de alterar, por exemplo, a afinidade do anticorpo para IGF-IR ou respectiva taxa de dissociação de um antigénio. Noutra forma de realização, as substituições de aminoácidos são efectuadas na mesma posição das encontradas no VL do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2, mas são efectuadas substituições conservadoras do aminoácido em vez de se utilizar o mesmo aminoácido. Por exemplo, se a substituição do aminoácido 46 comparada com a linha germinal do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2 for glutamato, é possível substituir de forma conservadora o aspartato. De modo semelhante, se a substituição do aminoácido for serina é possível substituir de forma conservadora treonina.
Noutra forma de realização preferida, a cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que é igual à sequência de aminoácidos de VL de 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização muito preferida, a cadeia leve inclui sequências de aminoácidos que são iguais às regiões CDR da cadeia leve de 2.13.2 ou 4.9.2.
Noutra forma de realização preferida a cadeia leve inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou 14. Noutra forma de realização, a cadeia leve inclui a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5 ou 13 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos com 1 a 10 inserções, eliminações ou substituições aminoácido. De preferência, as substituições de aminoácidos são substituições aminoácido conservadoras. Noutra forma de realização, o anticorpo ou porção deste inclui uma cadeia leve lambda. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo de anti-IGF-IR ou porção deste que inclui uma cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma cadeia pesada humana Numa forma de realização, a sequência de aminoácidos de cadeia pesada é derivada da família genética VH DP-47 humana. Numa forma de realização preferida, a sequência de aminoácidos de cadeia pesada é derivada da família genética VH DP-47 humana. Numa forma de realização mais preferida, a cadeia pesada não compreende mais de oito alterações de aminoácidos da linha germinal VH-47, de preferência não 47 mais de seis alterações de aminoácidos e mais preferencialmente, não mais de três alterações de aminoácidos.
As SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20 e 24 proporcionam as sequências de aminoácidos das regiões variáveis de seis cadeias pesadas do anti-IGF-IR. As SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36 e 44 proporcionam as sequências de aminoácidos e as SEQ ID NOS: 29, 31, 33, 35 e 43 proporcionam as sequências de nucleótidos das cadeias pesadas da linha germinal DP-35, DP-47, DP-70, DP-71 e VIV-4, respectivamente. As figs. 2A a 2D mostram os alinhamentos das sequências de aminoácidos da região variável dos seis anticorpos do anti-IGF-IR relativamente às sequências da linha germinal correspondente. Na sequência do exposto na presente especificação, alguém com formação ordinária na técnica poderia determinar a sequência de aminoácidos codificada das seis cadeias pesadas do anti-IGF-IR e as cadeias pesadas da linha germinal e determinar as diferenças entre as sequências da linha germinal e as sequências de anticorpos.
Numa forma de realização preferida, o VH do anticorpo anti-IGF-IR contém as mesmas substituições do aminoácido relativamente à sequência do aminoácido da linha germinal, que o VH do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2.
De modo similar ao discutido anteriormente, o VH do anticorpo anti-IGF-IR pode conter uma ou várias substituições do aminoácido que são iguais às que se encontram presentes no anticorpo 2.13.2 e outra substituição do aminoácido que é igual ao anticorpo 4.9.2. Deste modo, é possível misturar e emparelhar características diferentes da ligação de anticorpos a fim de alterar, por exemplo, a afinidade do anticorpo para IGF- 48 IR ou respectiva taxa de dissociação de um antigénio. Noutra forma de realização, as substituições de aminoácidos são efectuadas na mesma posição das encontradas no VH do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2, mas são efectuadas substituições conservadoras do aminoácido em vez de se utilizar o mesmo aminoácido.
Noutra forma de realização preferida, a cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que é igual à sequência de aminoácidos de VH de 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização muito preferida, a cadeia pesada inclui sequências de aminoácidos que são iguais às regiões CDR da cadeia pesada de 2.13.2 ou 4.9.2.
Noutra forma de realização preferida a cadeia pesada inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 16. Noutra forma de realização, a cadeia leve inclui a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7 ou 15 ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos com 1 a 10 inserções, eliminações ou substituições aminoácido. Noutra forma de realização, as substituições são substituições de aminoácidos conservadoras.
Identificação da Actividade IGF_IR por Anticorpo anti-IGF-IR
Inibição da Ligação IGF-I a IGR-IR 0 anticorpo anti-IGF-IR da invenção inibe a ligação de IGF-I a IGF-IR ou a ligação do IGF-II a IGF-1 IR. Numa forma de realização preferida o IGF-IR é humano. Noutra forma de realização, o anticorpo ou porção deste inibe a ligação entre IGF-IR e IGF-I com um IC50 inferior a 100 nM. Numa forma de realização preferida o IC50 é inferior a 10 nM. Numa forma de realização preferida o IC50 é inferior a 49 5 ηΜ. Ο IC50 pode ser medido por qualquer método conhecido da técnica. Tipicamente, o IC50 pode ser medido por ELISA ou RIA. Numa realização preferida, o IC50 é medido por RIA.
Noutra forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR da invenção impede a activação do IGF-RI na presença de IGF-I. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR inibe a fosforilação da tirosina induzida por IGF-IR que ocorre no caso de ocupação do receptor. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR inibe a ocorrência de eventos celulares a jusante. Por exemplo, o anti-IGF-IR pode inibir a fosforilação da tirosina de She e substrato receptor da insulina (IRS) 1 e 2 que são normalmente fosforilados quando as células são tratadas com IGF-1 (Kim et al., J. Biol. Chem. 273:34543-34550, 1998). Pode-se determinar se um anticorpo anti-IGF-IR pode prevenir a activação do IGF-IR na presença de IGF-I determinando os niveis de auto-fosforilação para IGF-IR, She, IRS-1 ou IRS-2 por Western blot ou imunoprecipitação. Numa forma de realização preferida é possivel determinar os niveis de auto-fosforilação do IGF-IR por Western blot. Vide, por exemplo, Exemplo VII.
Noutro aspecto da invenção, o anticorpo provoca a subregulação do IGF-IR de uma célula tratada com o anticorpo. Noutra forma de realização, o IGF-IR é internalizado no citoplasma da célula. Depois do anticorpo anti-IGF-IR ligar a IGF-IR, o anticorpo é internalizado como se pode verificar por microscopia confocal. Sem pretender ficar limitado por qualquer teoria, acredita-se que o complexo anticorpo-IGF-IR é internalizado num lisossoma e degradado. É possivel medir a sub-regulação do IGR-IR através de qualquer método conhecido na técnica, incluindo a imunoprecipitação, microscopia confocal ou 50
Western blot. Vide, por exemplo, Exemplo VII. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é seleccionado 2.13.2 ou 4.9.2 ou inclui uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou respectiva região de ligação do antigénio.
Inibição da fosforilação da tirosina do IGF-IR, Níveis de IGF-IR e Crescimento de Células Tumorais In Vivo Pelos Anticorpos Anti-IGF-IR
De acordo com outra forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR da invenção inibe a fosforilação da tirosina do IGF-IR e níveis do receptor in vivo. Numa forma de realização, a administração do anticorpo anti-IGF-IR a um animal provoca uma redução no sinal fosfotirosina do IGF-IR em tumores gue expressam IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR provoca uma redução do sinal fosfotirosina de pelo menos 20%. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR provoca uma redução do sinal fosfotirosina de pelo menos 60%, mais preferencialmente 50%. Numa forma de realização ainda mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR provoca uma redução do sinal fosfotirosina de pelo menos 40%, mais preferencialmente 30%, ainda mais preferencialmente 20%. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é administrado aproximadamente 24 horas antes da medição dos níveis de fosforilação ad tirosina. Os níveis de fosforilação da tirosina podem ser medidos através de qualquer método conhecido na técnica, tal como os métodos descritos seguidamente. Vide, por exemplo, exemplo III e figura 5. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é 2.13.2 ou 4.9.2 ou inclui uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou respectiva porção de ligação do antigénio.
Noutra forma de realização, a administração do anticorpo anti-IGF-IR a um animal provoca uma redução nos 51 níveis do IGF-IR em tumores que expressam IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR provoca uma redução dos níveis do receptor de pelo menos 20% em comparação com um animal sem tratamento. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR provoca uma redução dos níveis do receptor de pelo menos 60%, mais preferencialmente 50% dos níveis do receptor num animal sem tratamento. Numa forma de realização ainda mais preferida, o anticorpo provoca uma redução dos níveis do receptor de pelo menos 40%, mais preferencialmente 30%. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é administrado aproximadamente 24 horas antes da medição dos níveis de IGF-IR. Os níveis de IGF-IR podem ser medidos através de qualquer método conhecido na técnica, tal como os métodos descritos seguidamente. Vide, por exemplo, exemplo VIII e figura 6. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é 2.13.2 ou 4.9.2 ou inclui uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou respectiva porção de ligação do antigénio. O anticorpo anti-IGF-IR da invenção inibe o crescimento de células tumorais in vivo. A célula tumoral pode ser derivada de qualquer tipo de célula, incluindo, sem constituir limitação, células da epiderme, Epiteliais, endoteliais, leucemia, sarcoma, mieloma múltiplo ou mesodérmicas. Exemplos de células tumorais incluem células A549 (carcinoma do pulmão de não pequenas células), células MCF-7, células Colo 205, células 3T3/IGF-IR e células A431. Numa forma de realização preferida, o anticorpo inibe o crescimento das células tumorais em comparação com o crescimento do tumor num animal sem tratamento. Numa forma de realização preferida, o anticorpo inibe o crescimento de células do tumor em 50%. Numa forma de realização ainda 52
mais preferida, o anticorpo inibe o crescimento de células do tumor em 60%, 65%, 70% ou 75%. Numa forma de realização, a inibição do crescimento de células tumorais é medido pelo menos 7 dias depois de os animais iniciarem o tratamento com o anticorpo. Numa forma de realização mais preferida, a inibição do crescimento de células tumorais é medido pelo menos 14 dias depois de os animais iniciarem o tratamento com o anticorpo. Noutra forma de realização preferida, outro agente anti-neoplásico é administrado ao animal com o anticorpo anti-IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o agente anti-neoplásico é capaz de inibir ainda o crescimento da célula tumoral. Numa forma de realização ainda mais preferida, o agente anti-neoplásico é adriamicina, taxol, tamoxifeno, 5-fluorodeoxiuridina (5-FU) ou CP-358,774. Numa forma de realização preferida, a co-administração de um agente anti-neoplásico e do anticorpo anti-IGF-IR inibe o crescimento das células tumorais em pelo menos 50%, mais preferencialmente 60%, 65%, 70% ou 75%, mais preferencialmente 80%, 85% ou 90% passado um período de 22 a 24 dias. See, e.g., Fig. 7 and Example IX. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é 2.13.2 ou 4.9.2 ou inclui uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou respectiva porção de ligação do antigénio. Indução da Apoptose por Anticorpos do Anti-IGF-IR
Noutro aspecto, o anticorpo anti-IGF-IR da invenção induz a morte celular. Numa forma de realização, os anticorpos provocam a apoptose. O anticorpo pode induzir a apoptose in vivo como in vitro. Em geral, as células tumorais são mais sensíveis à apoptose do que as células normais, de forma que a administração de um anticorpo anti-IGF-IR provoca preferencialmente a apoptose de uma célula tumoral relativamente a uma célula normal. Noutra forma de 53 realização, a administração de um anticorpo anti-IGF-IR diminui os níveis da enzxima akt, que está envolvida na via fosfatidilinositol (PI) quinase. A via PI quinase, por seu lado, está envolvida na proliferação celular e prevenção da apoptose. Deste modo, a inibição de akt pode provocar apoptose. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo é administrado in vivo para provocar a apoptose de uma célula que expressa IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é 2.13.2 ou 4.9.2 ou inclui uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou respectiva porção de ligação do antigénio. Métodos de Produção de Anticorpos e Linhas de células Produtoras de Anticorpos
Imunização
Numa forma de realização, os anticorpos humanos da presente invenção são produzidos por imunização de um animal não-humano, compreendendo alguns ou todos os locus da imunoglobulina humana com um antigénio IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o animal não-humano é um XENOMOUSE™, que é uma estirpe de ratinho manipulada que compreende grandes fragmentos dos loci da imunoglobulina humana e tem uma produção deficitária de anticorpo de ratinho. Vide, por exemplo, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) e patetnes Norte-americanas 5,916,771, 5, 939, 598, 5, 985, 615, 5, 998,209, 6, 075, 181, 6, 091,001, 6,114,598 e 6,130,364. Vide também WO 91/10741, publicada 25 de Julho de 1991, WO 94/02602, publicada 3 de Fevereiro de 1994, WO 96/34096 e WO 96/33735, ambas publicadas em 31 de Outubro de 1996, WO 98/16654, publicada em 23 de Abril de 1998, WO 98/24893, publicada a 11 de Junho de 1998, WO 98/50433, publicada em 12 de Novembro de 1998, WO 99/45031, publicada em 10 de Setembro de 1999, WO 99/53049, publicada 54 em 21 de Outubro de 1999, WO 00.09560, publicada em 24 de Fevereiro de 2000 e WO 00/037504, publicada em 29 de Junho de 2000. O XENOMOUSE™ produz um repertório humano semelhante ao de um adulto de anticorpos totalmente humanos e gera Mabs humanos específicos do antigénio. Uma segunda geração de XENOMOUSE™ contém aproximadamente 80% do repertório de anticorpos humanos através da introdução de fragmentos com dimensão megabase, YAC de configuração linha genética dos loci de cadeia pesada humanos e loci de cadeia leve k. Vide Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green e Jakobovits J. Exp. Med 188:483-495 (1998). A presente invenção apresenta igualmente um método de preparação de anticorpos do anti-IGF-IR da invenção a partir de animais diferentes de humanos e de ratinhos, imunizando animais transgénicos não-humanos que compreendam loci da imunoglobulina humana. É possível produzir estes animais utilizando os métodos descritos imediatamente acima. Os métodos apresentados nestas patentes podem ser modificados como descrito na patente Norte-americana 5,994,619. Numa forma de realização preferida, os animais não-humanos podem ser ratos, carneiros, porcos, cabras, gado ou cavalos.
Noutra forma de realização, o animal não-humano comprendendo os loci do gene da imunoglobulina humana são animais que possuem um "minilocus" da imunoglobulina humana. Na abordagem minilocus, é mimetizado um locus Ig exógeno através da inclusão de genes individuais do locus Ig. Assim, são formados um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, uma região constante mu e uma segunda região constante (de preferência uma região constante gama) numa são formados numa construção para inserção num animal. Esta abordagem encontra-se descrita 55 55 5,545,807, 5,661,016, 5,612,205, 5,545,806, 5,770,429, 5,721,367, nas patentes norte-americanas n°. 5, 625,825, 5, 625, 126, 5, 633,425, 5,789, 650, 5, 814,318, 5,591, 669, 5,789,215 e 5,643,763, entre outras
Uma vantagem da abordagem minilocus reside na rapidez em que as construções, incluindo porções do locus Ig, podem ser geradas e introduzidas em animais. No entanto, uma desvantagem potencial da abodagem minilocus reside na possibilidade de não haver diversidade de imunoglobulina suficiente para suportar um desenvolvimento completo de células B, de forma que a produção de anticorpos poderá ser inferior.
Para produzir um anticorpo anti-IGF-IR humano, imuniza-se um animal não-humano, compreendendo alguns ou todos os loci da imunoglobulina humana, com um antigénio IGF-IR e isola-se do animal o anticorpo ou uma célula produtora de anticorpos. O antigénio IGF-IR pode ser IGF-IR isolado e/ou purificado e é de preferência um IGF-IR humano. Noutra forma de realização, o antigénio IGF-IR é um fragmento de IGF-IR, de preferência o domínio extracelular do IGF-IR. Noutra forma de realização o antigénio IGF-IR é um fragmento que compreende pelo menos um epítopo de IGF-IR. Noutra forma de realização, o antigénio IGF-IR é uma célula que expressa IGF-IR na respectiva superfície celular, de preferência uma célula que sobreexpressa IGF-IR na respectiva superfície celular. A imunização dos animais pode ser medida por qualquer método conhecido da técnica. Vide por exemplo Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1990. Os métodos de imunização de animais não-humanos, tal como ratinhos, ratos, carneiros, cabras, porcos, gado e cavalos são bem conhecidos na 56 técnica. Vide, por exemplo, Harlow e Lane e patente norte-americana 5,994,619. Numa forma de realização preferida, o antigénio IGF-IR é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imunitária. Estes adjuvantes incluem adjuvante completo oiu incompleto de Freund, RIBI (dipeptideo murarnil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes) . Estes adjuvantes podem proteger o polipeptideo de uma dispersão rápida sequestrando-o num depósito local ou podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a segregar afctores que são quimiotáticos de macrófagos e outros componentes do sistema imunitário. De preferência, de um polipeptideo está a ser administrado, o programa de imunização irá envolver duas ou mais administrações do polipeptideo distribuídas ao longo de várias semanas. 0 exemplo I apresenta um protocolo de imunização de um XENOMOUSE™ com IGF-IR humano integral em solução salina tamponada com fosfato.
Produção de Anticorpos e Linhas de células Produtoras de Anticorpos
Após a imunização de um animal com um antigénio IGF-IR, é possível obter do animal anticorpos e/ou células produtoras de anticorpos. Obtém-se um soro contendo anticorpo anti-IGF-IR do animal através de sangramento ou sacrifício do animal. 0 soro pode ser utilizado tal como é obtido do animal, pode ser obtida uma fracção imunoglobulina do soro ou os anticorpos do anti-IGF-IR podem ser purificados a partir do soro. 0 soro ou imunoglobulinas obtidos deste modo são policlonais, sendo desvantajosos porque a quantidade de anticorpos que pode ser obtida é limitada e o anticorpo policlonal tem um conjunto heterogéneo de propriedades. 57
Noutra forma de realização, os hibridomas imortalizados, produtores de anticorpos podem ser preparados a partir do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificador e as células B do baço são fundidas a células de mieloma imortalizadas, como conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Numa forma de realização preferida, as células de mieloma não segregam polipeptideos de imunoglobulina (uma linha de células não secretora) . Após a fusão e selecção com antibiótico, os hibridomas são rastreados utilizando IGF-IR, uma porção de ste ou uma célula expressora de IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o rastreio inicial é executado com um imunoensaio com ligação enzimática (ELISA) ou um rádio-imunoensaio (RIA), de preferência um ELISA. Um exemplo de rastreio com ELISA encontra/se na WO 00/37504.
Noutra forma de realização, as células produtoras de anticorpos podem ser preparadas a partir de um ser humano possuidor de uma perturbação auto-imune e que expressa anticorpos do anti-IGF-IR. As células expressoras dos anticorpos do anti-IGF-IR podem ser isoladas por meio do isolamento dos glóbulos brancos e sujeitando-os a separação de células de alta velocidade (fluorescence-activated cell sorting - FACS) oui por panning em placas revestidas com IGF-IR ou uma porção deste. Estas células podem ser fundidas com mieloma não secretor humano para produzir anticorpos do anti-IGF-IR humanos expressores de hibridomas humanos. Em geral, esta é uma forma de realização menos preferida porque é provável que os anticorpos do anti-IGF-IR tenham uma baixa afinidade para o IGF-IR.
Os hibridomas produtores de anticorpo anti-IGF-IR são seleccionados, clonados e rastreados para detectar 58 características desejáveis, incluindo crescimento robusto do hibridoma, elevada produção de anticorpos e caracteristicas desejáveis dos anticorpos, como discutido seguidamente. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo, em animais singénicos, em animais sem um sistema imunitário por exemplo ratinhos nus, ou em cultura de células in vitro. Os métodos de selecção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos de alguém com formação ordinária na técnica.
De preferência, o animal imunizado é um animal não-humano que expressa genes da imunoglobulina humana e as células B do baço são fundidas a um mieloma derivado das mesmas espécies que o animal não-humano. Mais preferencialmente, o animal imunizado é um XENOMOUSE™ e a linha de células é um mieloma de ratinho não-secretor, tal como a linha de células do mieloma é NS0-bcl2. Vide, por exemplo, Exemplo I.
Num aspecto, a invenção proporciona hibridomas que produzem anticorpos do anti-IGF-IR humano. Numa forma de concretização preferida, os hibridomas são hibridomas de ratinho, como anteriormente descrito. Numa forma de realização preferida, os hibridomas são produzidos num animal não-humano, espécies diferentes de ratinhos, tais como ratos, carneiros, porcos, cabras, gado ou cavalos. Numa outra forma de realização, os hibridomas são hibridomas humanos, nos quais é fundido um mieloma não-secretor humano com uma célula humana expressora de um anticorpo anti-IGF-IR. Ácidos Nucleicos, Vectores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes de Preparação de Anticorpos Ácidos Nucleicos 59 São apresentadas as moléculas de ácidos nucleicos codificadoras de anticorpos do anti-IGF-IR da invenção. Numa forma de realização a molécula de ácido nucleico codifica uma cadeia pesada e leve de uma imunoglobulina do anti-IGF-IR. A imunoglobulina é uma imunoglobulina humana, de preferência uma IgG humana. Ά cadeia leve codificada pode ser uma cadeia λ ou uma cadeia k, de preferência uma cadeia k. A molécula de ácido nucleico codificadora da região variável da cadeia leve pode ser derivada do gene A30 Vk.
Numa forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia leve inclui a região vizinha derivada de JkI, Jk2 ou Jk4. Numa forma de realização ainda mais preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia leve não contém mais de dez alterações de aminoácidos da linha germinal Vk A30, de preferência não mais de seis alterações de aminoácidos e mais preferencialmente, não mais de três alterações de aminoácidos. A invenção apresenta uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia leve (VL) contendo pelo menos três alterações de aminoácidos em comparação com a sequência da linha germinal, em que as alterações do aminoácido são idênticas às alterações do aminoácido da sequência da linha germinal do VL do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2. A molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 2.13.2 ou 4.9.2. 60 A molécula de ácido nucleico inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos de todos os CDRs da cadeia leve de 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou 14 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5 ou 13. Noutra forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos dos CDRs da SEQ ID NO: 6 ou 14 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos de todos os CDRs da SEQ ID NO: 5 ou 13.
De preferência, a molécula de ácido nucleico da invenção codifica uma sequência de aminoácidos de um VL que possui uma sequência de aminoácidos que é idêntica em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ao VL que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou 14. A invenção apresenta também uma sequência de ácidos nucleicos que é idêntica em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:5 ou 13. Noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica um VL que híbrida em condições muito restringentes para uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos codificadora da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou 14. A invenção apresenta também uma sequência de ácido nucleico codificadora de um VL que híbrida em condições muito restringentes para uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 5 ou 13. A molécula de ácido nucleico codificadora da região variável da cadeia leve (VH) pode ser derivada do gene DP- 61 47 VH. Noutra forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora da VH inclui a região vizinha derivada de JH6 ou JH5, mais preferencialmente JH6. Noutra forma de realização preferida, o segmento D é derivado de 3-3, 6-19 ou 4-17. Numa forma de realização ainda mais preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora de VH não contém mais de dez alterações de aminoácidos da linha germinal DP-47, de preferência não mais de seis alterações de aminoácidos e mais preferencialmente, não mais de três alterações de aminoácidos. Numa forma de realização muito preferida, a molécula de ácido nucleico que codifica a VH contém pelo menos uma alteração de aminoácidos em comparação com a sequência da linha germinal, em que a alteração do aminoácido é idêntica à alteração do aminoácido da sequência da linha germinal da cadeia pesada do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2.
Numa forma de realização ainda mais preferida, o VH contém pelo menos três alterações de aminoácidos em comparação com as sequências da linha germinal, em que as alterações são idênticas às alterações da sequência da linha germinal do VH do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2.
Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos da VH de 2.13.2 ou 4.9.2. A molécula de ácido nucleico inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica as sequências de aminoácidos de todos os CDRs da cadeia pesada de 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 16 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7 ou 15. Noutra forma de realização preferida, a 62 molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos de todos os CDRs da SEQ ID NO: 8 ou 16 ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos de todos os CDRs da SEQ ID NO: 7 ou 15.
De preferência, a molécula de ácido nucleico da invenção codifica uma sequência de aminoácidos de um VH que é idêntica em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% a um VH que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 16. A invenção apresenta também uma sequência de ácidos nucleicos que é idêntica em pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% à sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:7 ou 15.
Noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica um VH que híbrida em condições muito restringentes para uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de uma VH que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 16. A invenção apresenta também uma sequência de ácidos nucleicos codificadora de um VH que híbrida em condições muito restringentes para uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 7 ou 15. A molécula de ácido nucleico codificadora de ambas as cadeias pesada e leve inteiras de um anticorpo anti-IGF-IR ou respectivas regiões variáveis pode ser obtida a partir de qualquer fonte produtora de um anticorpo anti-IGF-IR. Os métodos de isolamento do mARN codificador de um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al. O mARN pode ser utilizado para produzir cADN para utilizar na reacção em cadeia de polimerase (PCR) ou clone cADN de genes de anticorpo. Noutra forma de realização da invenção, as moléculas de ácido nucleico podem ser obtida a 63 partir de um hibridoma que expressa um anticorpo anti-IGF-IR, como anteriormente descrito, de preferência um hibridoma que possui como um dos seus parceiros de fusão uma célula de animal transgénico que expressa os genes da imunoglobulina humana, tal como um XENOMOUSE™, um animal transgénico ratinho não-humano ou um anima transgénico não- humano, não-raztinho. Noutra forma de realização, o hibridoma é derivado de um animal não -humano, não- transgénico, que pode ser utilizado, por exemplo para anticorpos humanizados.
Uma molécula de ácido nucleico codificadora de toda a cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR pode ser construído fundindo uma molécula de ácido nucleico codificadora do dominio variável de uma cadeia pesada ou respectivo dominio de ligação ao antigénio com um dominio constante de uma cadeia pesada. De modo semelhante, uma molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia leve de um anticorpo anti-IGF-IR pode ser construída fundindo uma molécula de ácido nucleico codificadora do domínio variável de uma cadeia leve ou respectivo domínio de ligação ao antigénio com um domínio constante de uma cadeia leve. As moléculas de ácido nucleico codificadoras da cadeia VH e VL podem ser convertidas nos genes anticorpo integrais inserindo-os em vectores de expressão que codificam já regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada, respectivamente, de forma que o segmento VH está ligado de forma operacional ao (s) segmento (s) região constante de cadeia pesada (CH) no vector e o segmento VL está ligado de modo operacional ao segmento região constante de cadeia leve (CL) no vector. Em alternativa, as moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias VH oui VL são convertidas em genes de anticorpo integrais unindo, por 64 exemplo ligando, a molécula de ácido nucleico codificadora de uma cadeia VH a uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma cadeia CH, utilizando técnicas padrão da biologia molecular. Pode-se conseguir o mesmo utilizando moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias VL e Cl. As seguência de genes da região constante de cadeia pesada e leve humana são conhecidas na técnica Vide, por exemplo, Kabat et al., Seguences of Proteins of Immunologica/ Interest, 5a Ed., NIH Publ. No. 91 -3242, 1991. As moléculas de ácido nucleico codificadoras das cadeias pesada e/ou leve integrais podem então ser expressas a partir de uma célula na qual foram introduzidas e o anticorpo anti-IGF-IR pode ser isolado.
Numa forma de realização preferida, o ácido nucleico codificador da região variável da cadeia pesada codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 16 e a molécula de ácido nucleico codificadora da região variável das cadeias leves codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou 14. A SEQ ID NO: 28 descreve a sequência de aminoácidos e a SEQ ID NO: 27 descreve a sequência de ácidos nucleicos codificadora da região constante da cadeia pesada dos anticorpos do anti-IGF-IR 2.13.2 ou 4.9.2. A SEQ ID NO: 26 descreve a sequência de aminoácidos e a SEQ ID NO: 25 descreve a sequência de ácidos nucleicos codificadora da região constante da cadeia leve dos anticorpos do anti-IGF-IR 2.13.2 ou 4.9.2. Assim, numa forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora do domínio constante da cadeia pesada codifica a SEQ ID NO: 28 e a molécula de ácido nucleico codificadora do domínio constante da cadeia leve codifica a SEQ ID NO: 26. Numa forma de realização preferida, a molécula de ácido nucleico codificadora do domínio constante da cadeia pesada 65 possui a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 27 e a molécula de ácido nucleico codificadora do domínio constante possui a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 25. A molécula de ácido nucleico codificadora da cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR ou um respectivo domínio de ligação do antigénio ou a cadeia leve de um anticorpo anti-IGF-IR ou um respectivo domínio de ligação do antigénio pode ser isolada de um animal não-humano, não-ratinho que expressa os genes de imunoglobulina humana e que foi imunizado com um antigénio IGF-IR. Noutra forma de realização, a molécula de ácido nucleico pode ser isolada a partir duma célula produtora de anticorpos do anti-IGF-IR derivada de um animal não transgénico ou de um doente humano que produz anticorpos do anti-IGF-IR. Métodos de isolamento do mARN a partir das células produtoras de anticorpos do anti-IGF-IR pode ser isolado por meio de técnicas padrão, clonados e/ou amplificados utilizando PCR e técnicas de construção de biblioteca, e rastreado utilizando protocolos padrão para obter moléculas de ácido nucleico codificadoras de cadeias pesada e leve do anti-IGF-IR.
As moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas para expressar de forma recombinante grandes quantidades de anticorpos do anti-IGF-IR como descrito abaixo. As moléculas de ácido nucleico podem ainda ser utilizadas para produzir anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, imunoadesinas, diacorpos, anticorpos com mutações e derivados de anticorpos, tal como descrito mais abaixo. Se as moléculas de ácido nucleico são derivadas de um animal não-humano, não-transgénico, as moléculas de ácido 66 nucleico podem ser utilizadas para humanização de anticorpos, também descrito mais abaixo.
Noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser utilizadas como sondas ou iniciadores de PCR para sequências de anticorpos específicas. Por exemplo, uma sonda de molécula de ácido nucleico pode ser utilizada em métodos de diagnóstico ou um iniciador PCR de molécula de ácido nucleico pode ser utilizada para amplificar regiões de ADN que poderiam ser utilizadas, entre outros aspectos para isolar sequências de ácidos nucleicos, destinadas a serem aplicadas na produção de domínios variáveis de anticorpos do anti-IGF-IR. Numa forma de concretização preferida, as moléculas de ácido nucleico são oligonucleótidos. Numa forma de realização mais preferida, os oligonucleótidos são de regiões muito variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo de interesse. Numa forma de realização ainda mais preferida, os oligonucleótidos codificam a totalidade ou parte de um ou mais dos CDRs.
Vectores A presente invenção apresenta vectores incluindo as moléculas de ácido nucleico da invenção que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve da porção de ligação do antigénio destas.
Para expressar os anticorpos ou porções dos anticorpos da invenção, os ADNs codificadores de cadeias leve e pesada parciais ou integrais, obtidas como anteriormente descrito, são inseridos em vectores de expressão de forma que os genes estão ligados de forma operativa a sequências de controlo transcricionais ou traducionais. Os vectores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, cosmídeos, YACs, episomas derivados de EBV e semelhantes. 0 gene anticorpo 67 está ligado num vector de forma que as sequências de controlo trancricionais e traducionais dentro do vector servem a função prevista de regulação da transcrição e tradução do gene anticorpo. 0 vector de expressão e sequências de controlo da expressão são escolhidos tendo em vista a compatibilidade com a célula hospedeira expressora utilizada. 0 gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vectores separados. Numa forma de realização preferida, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes anticorpo são inseridos no vector de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de locais de restrição complementares no fragmento do gene anticorpo e vector ou ligação de extremidade romba se não estiverem presentes locais de restrição).
Um vector conveniente é aquele que codifica uma sequência de imunoglobulina CH ou CL humana funcionalmente completa com locais de restrição apropriados manipulados, de forma que qualquer sequência VH ou VL pode ser facilmente inserida e expressa como anteriormente descrito. Neste vectores, o splicing ocorre normalmente entre o local dador de splicing na região J inserida e o local aceitador de splicing que precede a região C humana e ainda nas regiões de splicing que ocorrem no interior dos exões CH humanos. A poliadenilação e a terminação da transcrição ocorrem em locais cromossómicos nativos a jusante das regiões cofificadoras. 0 vector de expressão recombinante pode ainda codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vector, de forma que o peptídeo de sinal está ligado in~ frame ao terminal amino do gene da cadeia do anticorpo. 0 68 peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína não-imunoglobulina).
Para além dos genes da cadeia de anticorpo, os vectores de expressão recombinantes da invenção possuem sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes da cadeia de anticorpos numa célula hospedeira. Os peritos na especialidade poderão constatar que a concepção do vector de expressão, incluindo a selecção das sequências reguladoras poderá depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira que será transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. As sequências reguladoras preferidas para a expressão da célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que dirigem elevados níveis de expressão proteica em células de mamífero, tal como promotores e/ou intensificadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tal como promotor/intensificador CMV), vírus Simian 40 (SV40) (tal como o promotor/intensificador SV40), adenovírus (por exemplo promotor tardio principal de adenovírus (PTPAd)), polioma e promotore de mamífero fortes tal como imunoglobulina nativa e promotores actina. Para uma descrição mais aprofundada sobre os elementos reguladores virais e respectivas sequências, consultar por exemplo a pat. E.U. n° 5, 168,062 de Stinski, pat. E.U. n° 4,510,245 de Bell et al. e a pat. E.U. n° 4,968,615 de Schaffner et al.
Para além dos genes das cadeias do anticorpo e sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinantes da invenção podem possuir sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vector em células hospedeiras (por exemplo, origens de 69 replicação) e genes marcadores seleccionáveis. 0 gene marcador seleccionável facilita a selecção de células hospedeiras nas quais o vector foi introduzido {vide, por exemplo, pat E.U. n° 4 399 216, 4 634 665 e 5 179 017, todas de Axel et al.) · Por exemplo, tipicamente o gene marcador seleccionável confere resistência a fármacos, tal como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Os genes marcadores seleccionáveis preferidos incluem o gene da di-hidrofolato reductase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr com selecção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para selecção G418). Células Hospedeiras Não-Hibridoma e Métodos de Produção Recombinante de Proteína
As moléculas de ácido nucleico codificadoras da cadeia pesada ou uma respectiva porção de ligação ao antigénio e/ou da cadeia leve ou uma respectiva porção de ligação ao antigénio de um anticorpo anti-IGF-IR e vectores que compreendem estas moléculas de ácido nucleico podem ser utilizados para a transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada. A transformação pode ser através de qualquer método conhecido de introdução de polinucleótidos numa célula hospedeira. Os métodos de introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada com polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulamento do(s) polinucleótido(s) em lipossomas, injecção biolística e microinjecção directa do ADN dentro dos núcleos. Além disso, podem ser introduzidas moléculas de ácido nucleico em células de mamífero através de vectores virais. Os métodos de transformação das células 70 são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, patente norte-americana n°s 4 399 216, 4 912 040, 4 740 461 e 4 959 455.
As linhas de células de mamifero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhas de células imortalizadas, disponíveis junto da American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluem, entre outras, células do ovário de hamster chinês (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células renais de hamster bebé (BHK), células renais de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549, células 3T3 e várias outras linhas de células. Células hospedeiras de mamífero incluem células humanas, de ratinho, rato, cão, macaco, porco, cabra, bovino, cavalo e hamster. As linhas de células particularmente preferidas são seleccionadas mediante determinação das linhas de células que têm elevados níveis de expressão. Outras linhas de células que podem ser utilizadas são linhas de células de insecto, tal como células Sf9, células de anfíbio, células bacterianas, células veqetais e células fúnqicas. Quando são introduzidos vectores de expressão recombinantes codificadores da cadeia pesada ou da respectiva porção de ligação ao antigénio, da cadeia leve e/ou respectiva porção de ligação ao antigénio em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos através da cultura das células hospedeiras durante tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente secreção do anticorpo para o meio de cultura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de 71 cultura utilizando métodos de purificação de proteínas padrão.
Além disso, a expressão de anticorpos da invenção (ou outras fracções destes) a partir de linhas de células de produção pode ser intensificada utilizando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene da glutamina sintase (o sistema GS) é uma abordagem comum parta aumentar a expressão em determinadas condições. 0 sistema GS é discutido na íntegra ou em parte associado às Patentes Europeias n° 0 216 846, 0 256 055, e 0 323 997 pedido de Patente Europeia n° 89303964.4. É provável que os anticorpos expressos por linhas de células diferentes ou em animais transgénicos tenham glicosilações diferentes. No entanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucleico apresentados ou compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas fazem parte da presente invenção independentemente da glicosilação dos anticorpos.
Animais Transgénicos A invenção apresenta também animais não-humanos transgénicos compreendendo uma ou várias moléculas de ácido nucleico que podem ser utilizadas para produzir anticorpos da invenção. Os anticorpos podem ser produzidos em e recuperados do tecido ou fluidos corporais, tal como leite, sangue ou urina de cabras, vacas, cavalos, porcos, ratos, ratinhos, coelhos, hamsters ou outros mamíferos. Vide, por exemplo, patente norte-americana N°. 5 827 690, 5 756 687, 5 750 172 e 5 741 957. Como anteriormente descrito, animais transgénicos não-humanos que compreendem loci de imunoglobulina humana podem ser produzidos por imunização com IGF-IR ou uma porção deste. 72
Noutra forma de realização, animais transgénicos não-humanos são produzidos introduzindo uma ou várias moléculas de ácido nucleico da invenção no animal mediante técnicas transgénicas padrão. Vide Hogan, supra. As células transgénicas utilizadas na preparação do animal trangénico podem ser células estaminais embriónicas ou células somáticas. Os organismos não-humanos trangénicos podem ser heterozigotos quiméricos, não-quiméricos e homozigotos não-quiméricos. Vide, por exemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mose Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A
Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Noutra forma de realização, os organismos não-humanos transgénicos poderão ter uma interrupção e recolocação orientada que codifica uma cadeia pesada e/ou cadeia leve de interesse. Numa forma de realização preferida os animais transgénicos compreendem e expressam moléculas de ácido nucleico codificadoras de cadeias pesadas e leves que ligam especificamente a IGF-IR, de preferência IGF-IR humano. Noutra forma de realização, os animais transgénicos compreendem moléculas de ácido nucleico codificadoras de um anticorpo modificado, tal como um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos do anti-IGF-IR podem ser preparados em qualquer animal transgénico. Numa forma de realização preferida, os animais não-humanos são ratinhos, ratos, carneiros, porcos, cabras, gado ou cavalos. O animal transgénico não-humano expressa os polipeptideos codificados mencionados em sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, múco e outros fluidos corporais.
Bibliotecas Apresentadas em Fagos ("Phage Display") 73 0 anticorpo anti-IGF-IR ou respectiva porção de ligação ao antigénio da invenção podem ser produzidos por um método compreendendo as etapas de síntese de uma biblioteca de anticorpos humanos em fagos, rastreio da biblioteca com um IGF—IR ou respectiva porção, isolamento do fago que liga IGF—IR e obtenção do anticorpo a partir do fago. Um método de preparação da biblioteca de anticorpos compreende as fases de imunização de um animal hospedeiro não-humano compreendendo o locus da imunoglobulina humana com IGF-IR ou uma respectiva porção antigénica para criar uma resposta imunitária, extracção do animal hospedeiro das células que são responsáveis pela produção de anticorpos, isolamento do ARN a partir das células extraídas, realização de transcriptase inversa com o ARN para produzir cADN, amplificação do cADN utilizando um iniciador e inserção do cADN no vector de apresentação do fago de forma que os anticorpos são expressos no fago. Os anticorpos do anti-IGF-IR recombinantes da invenção podem ser obtidos deste modo.
Os anticorpos do anti-IGF-IR humanos recombinantes da invenção, para além dos anticorpos do anti-IGF-IR apresentados, podem ser isolados por rastreio de uma biblioteca de anticorpos combinatórios recombinantes, de preferência uma biblioteca apresentada em fagos scFv, preparada com cADNs VL e VH humanos, preparados a partir de mARN derivado de linfócitos humanos. As metodologias de preparação e rastreio destas bibliotecas são conhecidas na técnica. Existem conjuntos à venda para a criação de bibliotecas apresentadas em fagos (por exemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n° do catálogo 27-9400-01; e o Stratagene SurfZAP™ phage display kit, n° do catálogo 240612) . Existem também outros métodos e reagentes 74 que podem ser utilizados para a geração e rastreio de bibliotecas de anticorpos apresentadas em fagos {vide, por exemplo, Ladner et al. Pat E.U. n° 5,223,409; Kang et al. Publicação PCT n° WO 92/18619; Dower et al. Publicação PCT n° WO 91/17271; Winter et al. Publicação PCT n° WO 92/20791; Markland et al. Publicação PCT n° WO 92/15679; Breitling et al. Publicação PCT n° WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT n° WO 92/01047; Garrard et al. Publicação PCT n° WO 92/09690; Fuchs et al. (1991)
Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod.
Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554;
Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8 9:357 6-358 0; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-
4137; e Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 :7978-7982.
Numa forma de realização preferida, para isolar
anticorpos do anti-IGF-IR humanos com as caracteristicas desejadas, um anticorpo anti-IGF-IR humano, como presentemente descrito, é utilizado primeiro apra seleccionar sequências de cadeia pesada e leve humanas com actividade de ligação semelhante relativamente a IGF-IR, utilizando métodos de impressão do epitopo descrito em Hoogenboom et al, Publicação PCT n°. WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpos utilizadas neste método são de preferência bibliotecas scFv preparadas e rastreadas como descrito em McCafferty et al, Publicação PCT n°. WO 92/01047, McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; e
Griffiths et al, (1993) EMBO J 12:725-734. As bibliotecas 75 de anticorpos scFv são preferencialmente rastreadas utilizando IGF-IR humano como antigénio.
Uma vez seleccionados os segmentos VL e VH humanos iniciais efectuam-se experiências "mix and match", nas quais são rastreados pares diferentes dos segmentos VL e VH inicialmente seleccionados para detectar ligação de IGF-IR para seleccionar as combinações de VL/VH preferidas. Além disso, para melhorar ainda mais a qualidade do anticorpo, os segmentos VL e VH do(s) par(es) VL/VH preferido pode ser aleatoriamente sujeito a mutação, de preferência na região CDR3 de VH e/ou VL, num processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação de afinidade de anticorpos durante uma resposta imunitária natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser conseguida mediante amplificação das regiões VH e VL, utilizando iniciadores PCR complementares ao CDR3 VH ou CDR3 VL, respectivamente, iniciadores esses que foram "adicionados" com uma mistura aleatória de quatro bases de nucleótidos em determinadas posições, de forma que os produtos PCR resultantes codificam segmentos VH e VL, nos quais foram introduzidas mutações aleatórias nas regiões VH e/ou VL CDR3. Estes segmentos VH e VL mutados aleatoriamente podem ser novamente rastreados para detectar ligações a IGF-IR.
Na sequência do rastreio e isolamento de um anticorpo anti-IGF-IR da invenção a partir de uma biblioteca de imunoglobulina recombinante apresentada, é possível recuperar o ácido nucleico a codificar o anticorpo seleccionado a partir do pacote apresentado (por exemplo do genoma do fago) e subclonado em outros vectores de expressão por meio de técnicas de ADN recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucleico pode ainda ser manipulado 76 para criar outras formas de anticorpos da invenção, como descrito posteriormente. Para expressar um anticorpo recombinante humano isolado por rastreio de uma biblioteca combinatória, o ADN codificador do anticorpo é clonado num vector de expressão recombinante e introduzido numa célula hospedeira de mamífero, como anteriormente descrito. Troca de Classe
Outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um mecanismo mediante o qual a classe de um anticorpo anti-IGF-IR pode ser trocada por outra. Num aspecto da invenção, uma molécula de ácido nucleico codificadora de VL ou VH é isolada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, de forma que não inclua quaisquer sequências de ácido nucleico codificadoras da CL ou CH. As moléculas de ácido nucleico codificadoras de VL ou VH são depois ligadas de forma operativa a uma sequência de ácido nucleico codificadora de um CL ou CH de uma classe diferente das moléculas de imunoglobulina. Este objectivo pode ser atingido utilizando um vector ou molécula de ácido nucleico que compreende uma cadeia CL ou CH, como anteriormente descrito. Por exemplo, um anticorpo anti-IGF-IR que era originalmente IgM pode ser trocado de classe com um IgG. Além disso, a troca de classe pode ser utilizada para converter uma subclasse IgG noutra, por exemplo, de IgGl a IgG2. Um método preferido de produção de um anticorpo da invenção, compreendendo um isotipo desejado compreende as fases de isolamento de um ácido nucleico codificador da cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR e um ácido nucleico codificador da cadeia leve de um anticorpo anti-IGF-IR, obtendo a região variável da cadeia pesada, ligando a região variável da cadeia pesada ao domínio constante de uma cadeia pesada do isotipo desejado, 77 expressando a cadeia leve e a cadeia pesada ligada numa célula e recolhendo o anticorpo anti-IGF-IR com o isotipo desejado.
Derivados de Anticorpo É possível utilizar as moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente para gerar derivados de anticorpos utilizando técnicas e métodos conhecidos de alguém com competências ordinárias na técnica.
Anticorpos Humanizados
Como anteriormente discutido no contexto da criação de anticorpos humanos, existem vantagens na produção de anticorpos com imunogenicidade reduzida. Este objectivo pode ser conseguido até certo ponto utilizando técnicas de humanização e técnicas de apresentação utilizando as bibliotecas apropriadas. Será observado que os anticorpos de murino ou anticorpos de outras espécies podem ser humanizados ou primatizados utilizando técnicas bem conhecidas. Vide, por exemplo, Winter e Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) e Wright et al. Crit. Reviews in
Immunol. 12125-168 (1992). 0 anticorpo de interesse pode ser manipulado por técnicas de ADN recombinante para substituir os domínio charneira CHI, CH2, CH3 e/ou o domínio estrutural pela sequência humana correespondente (vide WO 92/02190 e pat E.U. n° 5, 530,101, 5,585, 089, 5,693,761, 5,693,792,5,714,350, e 5,777,085). Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser humanizado substituindo os domínios CHI, CH2, CH3, charneira e/ou o domínio estrutural pela sequência humana correspondente, mantendo todos os CDRs da cadeia pesada, da cadeia leve ou ambas as cadeias tanto pesada como leve.
Anticorpos Mutados 78
Noutra forma de realização as moléculas de ácido nucleico, vectores e células hospedeiras podem ser empregues para preparar anticorpos do anti-IGF-IR mutados. Os anticorpos podem ser mutados nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser efectuada em uma ou várias das regiões CDR para aumentar ou diminuir o Kd do anticorpo para IGF-IR, para aumentar ou diminuir Koff ou alterar a especificidade de ligação do anticorpo. As técnicas de mutagénese dirigida são bem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al. e Ausubel et al., supra. Numa forma de realização preferida, as mutações são efectuadas num resíduo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparação com a linha germinal numa região variável de um anticorpo anti-IGF-IR. Numa forma de realização preferida, uma ou várias mutações são efectuadas num resíduo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparação com a linha germinal numa região variável ou região CDR de um dos anticorpos do anti-IGF-IR 2.13.2 ou 4.9.2. Noutra forma de realização, uma ou várias mutações são efectuadas num resíduo de aminoácido que é conhecido por ser alterado em comparação com a linha germinal numa região variável ou região CDR cuja sequência de aminoácidos se encontra na SEQ ID NOS: 6, 8, 14 ou 16 ou cuja sequência de ácidos nucleicos está presente nas SEQ ID NOS: 5, 7, 13 ou 15.
Noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleico são mutadas numa ou várias regiões estruturais. Uma mutação pode ser introduzida numa região estrutural ou domínio constante para aumentar a semi-vida do anticorpo anti-IGF-IR. Vide, por exemplo, WO 00/09560, publicada em 24 de Fevereiro de 2000. Numa forma de realização poderá 79 existir uma, três ou cinco mutações pontuais e nunca mais de dez mutações pontuais. Uma mutação numa região estrutural ou domínio constante pode também ser efectuada para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para proporcionar um local para ligação covalente ou não-covalente a qualquer molécula ou para alterar propriedades tal como a fixação complementar. Podem ser efectuadas mutações em cada uma das regiões estruturais, domínio constante e as regiões variáveis num único anticorpo mutado. Em alternativa podem ser efectuadas mutações em apenas uma das regiões estruturais, regiões variáveis ou domínio constante num único anticorpo mutado.
Numa forma de realização, não há mais de que dez alterações de aminoácidos nas regiões VH ou VL do anticorpo anti-IGF-IR mutado em comparação com o anticorpo anti-IGF-IR antes da mutação. Numa forma de realização mais preferida, não há mais de que cinco alterações de aminoácidos nas regiões VH ou VL do anticorpo anti-IGF-IR mutado, mais preferencialmente não há mais de três alterações do aminoácido. Noutra forma de realização, não há mais de quinze alterações de aminoácido nos domínios constantes, mais preferencialmente, não há mais de dez alterações de aminoácidos, ainda mais preferivelmente não há mais de cinco alterações de aminoácidos.
Anticorpos Modificados
Noutra forma de realização, pode ser feito um anticorpo de fusão ou imunoadesina que compreende a totalidade ou uma porção de um anticorpo anti-IGF-IR ligado a outro polipeptídeo. Numa forma de realização preferida apenas as regiões variáveis do anticorpo anti-IGF-IR estão ligadas ao polipeptídeo. Numa forma de realização preferida, o domínio VH de um anticorpo anti-IGF-IR está ligado a um primeiro 80 polipeptídeo, enquanto o domínio VL de um anticorpo anti-IGF-IR está ligado a um segundo polipeptídeo que associa ao primeiro polipeptídeo de uma forma em que os domínios VH e VL possam interagir entre si para formar um local de ligação de anticorpo. Noutra forma de realização preferida, o domínio VH é separado do domínio VL por um ligante de forma que os domínios VH e VL possam interagir entre si (vide abaixo, Anticorpos de Cadeia Simples). 0 anticorpo VH-ligante-VL é então ligado ao polipeptídeo de interesse. 0 anticorpo de fusão é útil para dirigir um polipeptídeo para uma célula ou tecido expressores de IGF-IR. O polipeptídeo pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, factor de crescimento ou outra proteína reguladora ou pode ser um agente de diagnóstico, tal como uma enzima que pode ser facilmente visualizada, tal como peroxidase de rábano silvestre. Além disso, podem ser criados anticorpos de fusão, nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia simples estão ligados entre si. Este facto é útil se desejarmos criar um anticorpo divalente ou polivalente numa única cadeia de polipeptídeo ou se desejarmos criar um anticorpo biespecífico.
Para criar um anticorpo de cadeia simples (scFv), os fragmentos de ADN codificadores VH e VL são ligados de modo operativo a outro fragmento codificador de um ligante flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 60), de forma que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexível (vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554). O anticorpo de cadeia simples pode ser 81 monovalente se for utilizado apenas um VH e VL simples, bivalente se forem utilizados dois VH e VL ou polivalente se forem utilizados mais de dois VH e VL.
Noutra forma de realização podem ser preparados anticorpos modificados utilizando as moléculas de ácido nucleico codificadoras de anti-IGF-IR. Por exemplo, "corpos Kappa" (III et al. Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "Minicorpos" (Martin et al, EMBO J 13: 5303-9 (1994)), "Diacorpos" (Holliger et al, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)) ou "Janusins" (Traunecker et al, EMBO J 10:3655-3659 (1991) e Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Câncer Suppl 7:51-52 (1992)) podem ser preparados utilizando técnicas da biologia molecular padrão segundo o exposto nesta especificação.
Noutro aspecto, podem ser gerados anticorpos quiméricos e biespecíficos. Pode ser feito um anticorpo quimérico pode ser que compreende CDRs e regiões estruturais de diferentes anticorpos. Numa forma de realização preferida, os CDRs do anticorpo quimérico compreendem todos os CDRs da região variável de uma cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR, enquanto as regiões estruturais são derivadas de um ou vários anticorpos diferentes. Numa forma de realização preferida, os CDRs do anticorpo quimérico compreendem todos os CDRs da região variável de uma cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo anti-IGF-IR. As regiões estruturais podem ser de outras espécies e podem, numa forma de realização preferida, ser humanizadas. Em alternativa, as regiões estruturais podem ser de outro anticorpo humano.
Pode ser gerado um anticorpo biespecifico que liga especificamente ao IGF-IR através de um domínio de ligação e a uma segunda molécula através de um segundo domínio de 82 ligação. 0 anticorpo biespecífico pode ser produzido através de técnicas da biologia molecular recombinantes ou pode ser conjugado fisicamente. Além disso, pode ser criado um anticorpo de cadeia simples contendo mais de um VH e VL que liga especificamente ao IGF-IR e a outra molécula. Estes anticorpos biespecificos podem ser gerados utilizando técnicas que são bem conhecidas, por exemplo no contexto de (i) e (ii) vide por exemplo Fanger et al. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) e Wright and Harris, supra, e no contexto de (iii) vide por exemplo, Traunecker et al. Int. J. Câncer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). Numa forma de realização preferida, o anticorpo biespecífico liga ao IGF-IR e a outra molécula expressa a lato nivel em células cancerígenas ou tumorais. Numa forma de realização mais preferida, a outra molécula é o receptor erbB2, VEGF, CD20 ou EGF-R.
Numa forma de realização, os anticorpos modificados descritos anteriormente são preparados utilizando uma ou várias das regiões variáveis nas regiões CDR do anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2.
Noutra forma de realização, os anticorpos modificados são preparados utilizando uma ou várias das regiões variáveis ou as regiões CDR cuja sequência de aminoácidos está presente na SEQ ID NO: 6, 8, 14 ou 16 ou cuja sequência de ácidos nucleicos está presente na SEQ ID NO: 5, 7, 13 ou 15.
Anticorpos Derivatizados e Marcados
Um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula (por exemplo outro peptídeo ou proteína). Em geral, os anticorpos ou porção destes são derivatizados de forma que a ligação IGF-IR não seja afectada de modo adverso pela derivatização ou 83 marcação. Assim, pretende-se que os anticorpos e porções de anticorpos da invenção incluam formas tanto intactas como modificadas dos anticorpos anti-IGF-IR humanos presentemente descritos. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser ligado de modo funcional (por acoplagem química, fusão genética, associação não covalente ou outra) a uma ou mais entidades moleculares, tal como outro anticorpo (por exemplo anticorpo biespecifico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeo que possam mediar associar do anticorpo ou porção do anticorpo com outra molécula (tal como uma região nuclear estreptavidina ou uma etiqueta poli-histidina).
Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido pela interligação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo para criar anticorpos biespecíficos) . Reticulantes adequados incluem os que são heterobifuncionais, com dois grupos reactivos distintos separados por um espaçador apropriado (por exemplo éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncional (por exemplo suberato de di-succinimidilo). Estes ligantes encontram-se disponíveis junto da Pierce Chemical Company, Rockford, III.
Outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo marcado. Agentes de detecção úteis, com os quais é possível derivatizar um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção incluem compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoreesceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantanídeo e semelhantes. Um anticorpo pode também ser marcado com enzimas que são úteis para a detecção, tal como 84 peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, oxidase glucose e semelhantes. Quando um anticorpo é marcado com uma enzima detectável é detectado adicionando reagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto da reacção que pode ser discernido. Por exemplo, quando o agente peroxidase de rábano-silvestre está presente, a adição de peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina conduz a um produto da reacção colorido que é detectável. Um anticorpo pode também ser marcado com biotina e detectado através de medição indirecta de ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo pode ser marcado com um agente magnético, tal como gadolinio. Um anticorpo pode ainda ser marcada com epitopos de polipeptideo pré-determinados, reconhecidos por um relator secundário (por exemplo, sequências emparelhadas fecho de leucina,locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação metálicos, tags epítopo) Nalgumas formas de realização, os marcadores são ligados por espaçadores de diferentes comprimentos para reduzir a potencial resistência estérica.
Um anticorpo anti-IGF-IR pode também ser marcado com um aminoácido radiomarcado. A radiomarcação pode ser utilizada para fins diagnósticos e terapêuticos. Por exemplo, a radiomarcação pode ser utilizada para detectar tumores expressores de IGF-IR por raio-x ou outras técnicas de diagnóstico. Além disso, a radiomarcação pode ser utilizada de modo terapêutico como uma toxina para células cancerosas ou tumorais. Exemplos de marcadores de polipeptídeos incluem, sem constituir limitação, os seguintes radioisótopos ou radionuclídeos --3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, luIn, 125I, 131I. 85
Um anticorpo anti-IGF-IR pode também ser derivatizado com um grupo químico, tal como polietilenoglicol (PEG), um grupo metilo ou etilo ou um grupo hidrato de carbono. Estes grupos podem ser úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo para aumentar a semi-vida sérica ou para aumentar a ligação tecidular.
Composições farmacêuticas e Kits A presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de uma doença hiperproliferativa num mamífero, a qual compreende uma porção com eficácia terapêutica de um anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização, a composição farmacêutica mencionada destina-se ao tratamento de cancro tal como cancro do cérebro, do pulmão, das células escamosas, da bexiga, gástrico, pancreático, da mama, da cabeça, pescoço, das células renais, do rim, dos ovários, da próstata, colo-rectal, esofágico, ginecológico ou da tiróide. Noutra forma de realização, a composição farmacêutica mencionada refere-se a perturbações hiperproliferativas não-cancerosas, tal como, sem constituir limitação, restenose na sequência de angioplastia e psóríase.
Os anticorpos anti-IGF-IR da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração num sujeito. Tipicamente, a composição farmacêutica inclui um anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como presentemente utilizado, "veículo farmaceuticamente aceitável" pretende incluir qualquer e todo o solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes isotónicos e de absorção e semelhantes, fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos 86 farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de entre água, soro fisiológico, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações destes. Em muitos casos será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tal como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis, tal como humectante ou quantidades mínimas de substâncias auxiliares, tal como agentes humectantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões que intensificam o tempo de vida útil ou eficácia do anticorpo oiu porção do anticorpo.
As composições da presente invenção podem encontrar-se numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tal como soluções líquidas (por exemplo soluções injectáveis e de perfusão), dispersões e suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. Esta forma preferida depende do modo de administração pretendido e aplicação terapêutica. Composições tipicamente preferidas encontram-se sob a forma de soluções injectáveis ou de perfusão, tal como composições semelhantes às utilizadas para a imunização passiva de seres humanos com outros anticorpos. 0 modo preferido de administração é a via parentérica (por exemplo intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Numa forma de realização preferida, o anticorpo é administrado por perfusão ou injecção intravenosa. Numa outra forma de realização preferida, o anticorpo é administrado por injecção intramuscular ou subcutânea.
As composições terapêuticas têm tipicamente de ser estéreis e estáveis nas condições de fabrico e armazenagem. As composição pode ser formulada sob a forma de solução, 87 microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura organizada adequada para uma elevada concentração do fármaco. Soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas por meio de incorporação do anticorpo anti-IGF-IR na quantidade necessária num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados anteriormente, conforme necessário, seguida de esterilização por filtração. Em geral, as dispersões são preparadas por meio de incorporação do composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os restantes ingredientes necessários de entre os enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação consistem em secagem sob vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente activo mais um ingrediente desejado adicional de uma solução previamente esterilizada por filtração. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, mantendo a dimensão de partícula necessária no caso de dispersão e uso de surfactantes. Uma absorção prolongada de composições injectáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.
Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos da técnica, embora para muitas das aplicações terapêuticas a via/modo de administração preferido é intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intravenosa ou perfusão. Tal como será apreciado por um perito, a via e/ou modo de administração irá variar conforme os resultados desejados. Numa forma de realização, os anticorpos da presente 88 invenção podem ser administrados numa única dose ou podem ser administrados em múltiplas doses.
Nalgumas formas de realização, o composto activo pode ser preparado com um veiculo que irá proteger o composto contra uma libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímero biodegradáveis, biocompatíveis, tal como acetato de etilenovinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação destas formulações estão patenteados ou são conhecidos em geral pelos peritos na especialidade. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.
Nalgumas formas de realização, o anti-IGF-IR da invenção pode ser administrado por via oral, por exemplo com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. 0 composto (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser encerrado numa cápsula de gelatina rígida ou macia, prensado em comprimidos ou incorporado directamente na dieta do sujeito. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados em excipientes e utilizados sob a forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bocais, trocistos, cápsula, elixires, suspensões, xaropes, obreia e semelhantes. Para administrar um composto da invenção por outra via que não a administração parentérica poderá ser necessário revestir o composto com ou co-administrar o composto com um material parap revenir a respectiva inactivação. 89
Compostos activos suplementares podem ainda ser incorporados nas composições. Nalgumas formas de realização, um anti-IGF-IR da invenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como um agente quimioterapêutico, um agente anti-neoplásico ou um agente anti-tumor. Por exemplo, um anticorpo anti-IGF-IR pode ser co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos. Estes agentes incluem, sem constituir limitação, anticorpos que ligam outros alvos (por exemplo, anticorpos que ligam um ou mais factores de crescimento ou citoquinas, respectivos receptores da superfície celular ou IGF-1), proteínas de ligação IGF-I, agentes antineoplásicos, agentes quimioterapêuticos, agentes anti-tumor, oligonucleótidos antisense contra IGF-IR ou IGF-I, análogos do peptídeo que bloqueiam a activação IGF-IR, IGF-IR solúvel e/ou um ou mais agentes químicos que inibem a produção ou actividade de IGF-I, os quais são conhecidos na técnica, por exemplo octreótido.
Estas terapias combinadas podem exigir doses menores de anticorpo anti-IGF-IR, bem como os agentes co-administrados, evitando assim eventuais toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias.
As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade com eficácia terapêutica" ou uma "quantidade com eficácia profilática" de um anticorpo ou uma porção de anticorpo da invenção. Uma "quantidade com eficácia terapêutica" refere-se a uma quantidade eficaz às doses e durante os períodos de tempo necessários para se atingir o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade com eficácia terapêutica do anticorpo ou porção do anticorpo pode variar conforme factores, tal como o estado 90 da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou porção do anticorpo para desencadear uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade com eficácia terapêutica é também uma quantidade em que são comparados os efeitos tóxicos ou negativos do anticorpo ou porção do anticorpo em comparação com os efeitos terapêuticos benéficos. Uma "quantidade com eficácia profilática" refere-se a uma quantidade eficaz às doses e durante os períodos de tempo necessários para se atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em sujeitos antes ou numa fase precoce da doença, a quantidade com eficácia profilática será inferior à quantidade com eficácia terapêutica.
Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta desejada óptima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, pode ser administrado um único bolus, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumentada proporcionalmente conforme indicação das exigências da situação terapêutica. A composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou compreendendo uma terapia combinada compreendendo o anticorpo e um ou mais agentes terapêuticos adicionais pode ser formulada em doses única ou múltipla. É especialmente vantajoso formular as composições farmacêuticas parentéricas em formas de dosagem unitárias para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. As formas de dosagem unitárias, tal como as utilizadas no presente caso, referemse a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para sujeitos mamíferos em tratamento, contendo cada unidade uma quantidade pré-determinada do composto activo, calculada para provocar o efeito terapêutico desejado, em 91 associação ao suporte farmacêutico necessário. A especificação das formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por e directamente dependentes de (a) as caracteristicas únicas do composto activo e o efeito terapêutico ou profilático especifico a atingir e (b) as limitações inerentes na técnica de constituição de um composto activo assim destinado ao tratamento da sensibilidade em indivíduos. Uma formulação particularmente útil é 5 mg/ml de anticorpo anti-IGF-IR num tampão de 20 mM de citrato de sódio, pH 5,5, 140 mM de NaCl e 0,2 mg/ml de polisorbato 80.
Um intervalo não-limitador, a título de exemplo, de uma quantidade com eficácia terapêutica oui profilática de um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção é 0,1-100 mg/kg, mais preferencialmente 0,5-50 mg/kg, mais preferencialmente 1-20 mg/kg e ainda mais preferencialmente 1-10 mg/kg. De destacar que os valores da dosagem podem variar com o tipo e gravidade do estado que se pretende aliviar. Subentende-se ainda que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados no tempo conforme a necessidade individual e juízo profissional de quem administra ou supervisiona a administração das composições e que os intervalos de dosagem apresentados constituem apenas exemplos e não se pretende limitar o âmbito ou prática da composição reivindicada. Numa forma de realização, a quantidade com eficácia terapêutica ou profilática de um anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio é administrada em conjunto com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se à administração de um anticorpo anti-IGF-IR para tratamento de cancro numa dose inferior a 300 mg por mês. 92
Outro aspecto da presente divulgação apresenta kits que compreendem os anticorpos anti-IGF-IR e as composições farmacêuticas que compreendem estes anticorpos. Um conjunto pode incluir, para além do anticorpo ou da composição farmacêutica, agentes de diagnóstico ou terapêuticos. Um kit pode incluir instruções de utilização num método diagnóstico ou terapêutico. Numa forma de realização preferida, o conjunto inclui o anticorpo ou uma respectiva composição farmacêutica e um agente de diagnóstico que pode ser utilizado num método descrito seguidamente. Noutra forma de realização preferida, o conjunto inclui o anticorpo ou uma respectiva composição farmacêutica e um ou mais agentes terapêuticos, tal como um agente antineoplásico adicional, agente anti-tumor ou agente quimioterapêutico que pode ser utilizado num método descrito seguidamente. A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas destinadas à inibição do crescimento celular anómalo num mamífero, as quais incluem uma quantidade de um composto da invenção em combinação com uma quantidade de um agente quimioterapêutico, em que as quantidades do composto, sal, solvato ou pró-fármaco e do agente quimioterapêutico são conjuntamente eficazes na inibição do crescimento celular anómalo. Actualmente, são conhecidos na técnica muitos agentes quimioterapêuticos. Numa concretização, o agente quimioterapêutico é seleccionado do grupo constituído por inibidores mitóticos, agentes de alquilação, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inibidores do factor de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, agentes anti-sobrevivência, modificadores da resposta biológica, 93 anti-hormonas, por exemplo anti-androgénicos e agentes anti-angiogénicos.
Os agentes anti-angiogénicos, tais como inibidores de MMP-2 (metaloproteinases da matriz 2), inibidores de MMP-9 (metaloproteinases da matriz 9) e inibidores de COX-II (ciclooxigenase II) podem ser utilizados em conjunto com um composto da presente invenção. Exemplos de inibidores úteis da COX-II incluem CELEBREX™ (alecoxib), valdecoxib e rofecoxib. Exemplos de inibidores de metaloproteinases da matriz úteis são descritos em WO 96/33172 (publicado em 24 de Outubro de 1996), WO 96/27583 (publicado em 7 de Março de 1996), pedido de patente europeia n° 97304971.1 (requerido a 8 de Julho de 1997), pedido de patente europeia n° 99308617.2 (requerido a 29 de Outubro de 1999), WO 98/07697 (publicado em 26 de Fevereiro de 1998), WO 98/03516 (publicado em 29 de Janeiro de 1998), WO 98/34918 (publicado em 13 de Agosto de 1998), WO 98/34915 (publicado em 13 de Agosto de 1998), WO 98/33768 (publicado em 6 de Agosto de 1998), WO 98/30566 (publicado em 16 de Julho de 1998) , publicação de patente europeia 606,046 (publicado em 13 de Julho de 1994), publicação de patente europeia 931,788 (publicado em 28 de Julho de 1999), WO 90/05719 (publicado em 31 de Maio de 1990), WO 99/52910 (publicado em 21 Outubro de 1999), WO 99/52889 (publicado em 21 de Outubro de 1999), WO 99/29667 (publicado em 17 de Junho de 1999) , pedido internacional PCT N°. PCT/IB98/01113 (requerido em 21 de Julho de 1998), pedido de patente europeia n° 99302232.1 (requerido em 25 de Março de 1999), pedido de patente britânica número 9912961.1 (requerida em 3 de Junho de 1999, 1999), patente norte-americana 5,863,949 (publicada em 26 de Janeiro de 1999), patente norte-americana 5,861,510 (publicada em 19 de Janeiro de 94 1999) e publicação de patente europeia 780,386 (publicado em 25 de Junho de 1997), todas as quais são presentemente incorporadas na integra por referência. Inibidores de MMP preferidos são os que não demonstram artralgia. São mais preferidos os que inibem selectivamente MMP-2 e/ou MMP-9 relativamente a outras metaloproteinases da matriz (isto é MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 e MMP-13). Alguns exemplos específicos de inibidores de MMP, úteis na presente invenção são AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830 e os compostos enumerados na lista seguinte: Ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoí1-ciclopentil)-amino]-propiónico; ácido 3-exo-3-[4-(4 — fluoro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico hidroxiamida; ácido (2R, 3R) 1-[4-(2-cloro-4-fluoro-benziloxi)-benzenossulfonil]-3- hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico hidroxiamida; ácido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-tetra-hidro-pirano-4-carboxílico hidroxiamida; ácido 3—[[4— (4 — fluoro-fenoxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoí1-ciclobutil)-amino]-propiónico; ácido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-tetra-hidro-pirano-4-carboxílico hidroxiamida; ácido 3-[4-(4-cloro-fenoxi)- benzenossulfonilamino]-tetra-hidro-pirano-3-carboxílico hidroxiamida; ácido (2R, 3R) 1 -[4-(4-fluoro-2-metil- benziloxi)-benzenossulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidina-2-carboxílico hidroxiamida; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-benzenossulfonil]-(1-hidroxicarbamoí1-1-metil-etil)-amino]-propiónico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)- benzenossulfonil]-(4-hidroxicarbamoíl-tetra-hidro-pirano-4-il)-amino]-propiónico; ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-benzenossulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano-3-carboxílico hidroxiamida; ácido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi) -benzenossulfonilamino]-8-oxa-biciclo[3.2.1]octano- 95 3-carboxílico hidroxiamida; ácido (R) 3-[ 4-(4-fluoro- fenoxi)-benzenossulfonilamino]-tetra-hidro-furano-3-carboxílico hidroxiamida; e sais farmacologicamente aceitáveis, solvatos e hidratos dos mesmos.
Um composto da presente invenção pode também ser utilizado com inibidores da transdução do sinal, tal como agentes que podem inibir respostas de EGFR (epidermal growth factor receptor - receptor do factor de crescimento epidérmico), tal como anticorpos EGF-R, anticorpos EGF e moléculas que são inibidores de EGFR; inibidores de VEGF (vascular endothelial growth factor - factor de crescimento endotelial vasculares), tal como receptores de VEGF e moléculas que podem inibir VEGF e inibidores do receptor erbB2, tais como moléculas orgânicas ou anticorpos que ligam ao receptor erbB2, por exemplo HERCEPTINTM (Genentech, Inc.). Os inibidores de EGF-R estão descritos em, por exemplo WO 95/19970 (publicado em 27 de Julho de 1995), WO 98/14451 (publicado em 9 de Abril de 1998), WO 98/02434 (publicado em 22 de Janeiro de 1998) e patente norte-americana 5, 747,498 (publicada em 5 de Maio de 1998) e estas substâncias podem ser utilizadas na presente invenção tal como presentemente descrito. Agentes inibidores de EGFR incluem, sem constituir limitação, os anticorpos monoclonais C225 e anti-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. and Merck KgaA) e os compostos ZD-1834, ZD-1838 e ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI- 166/CGP-75166 (Novartis), PTK787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner
Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert
Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 96 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), toxina de fusão EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Câncer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Câncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Câncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) e vacina EGF-R (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Estes e outros agentes inibidores de EGF-R podem ser utilizados na presente invenção.
Inibidores de VEGF, por exemplo SU-5416 e SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) e NX-1838 (NeXstar) podem também ser combinados com o composto da presente invenção. Inibidores de VEGF encontram-se descritos, por exemplo em WO 99/24440 (publicado em May 20, 1999), pedido de patente internacional PCT PCT/IB99/40797 (requerido em 3 de Maio de 1999), na WO 95/21613 (publicado em 17 de Agosto de 1995), WO 99/61422 (publicado em 2 de Dezembro de 1999), patente norte-americana 5,834,504 (divulgado em 10 de Novembro de 1998), WO 98/50356 (publicado em 12 Novembro de 1998), patente norte-americana 5,883,113 (divulgado em 16 de Março de 1999), patente norte-americana 5,886,020 (divulgado em 23 de Março de 1999), patente norte-americana 5,792,783 (divulgado em 11 de Agosto de 1998), WO 99/10349 (publicado em 4 de Março de 1999), WO 97/32856 (publicado em 12 de Setembro de 1997), WO 97/22596 (publicado em 26 de Junho de 1997), WO 98/54093 (publicado em 3 de Dezembro de 1998), WO 98/02438 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), WO 99/16755 (publicado em 8 de Abril de 1999) e WO 98/02437 (publicado em 22 de Janeiro de 1998). 97
Outros exemplos de alguns inibidores específicos de VEGF, úteis na presente invenção são EM862 (Cytran Inc.); anticorpo monoclonal anti-VEGF da Genentech, Inc. e angiozima, uma ribozima sintética da Ribozyme e Chiron. Este e outros inibidores VEGF podem ser utilizados na presente invenção tal como presentemente descritos.
Os inibidores do receptor ErbB2, tal como GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) e os anticorpos monoclonais AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) e 2B-1 (Chiron) podem ainda ser combinados com o composto da presente invenção, por exemplo os indicados na WO 98/02434 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), WO 99/35146 (publicado em 15 de Julho de 1999), WO 99/35132 (publicado em 15 de Julho de 1999), WO 98/02437 (publicado em 22 de Janeiro de 1998), WO 97/13760 (publicado em 17 de Abril de 1997), WO 95/19970 (publicado em 27 de Julho de 1995), patente norte-americana 5,587,458 (divulgada em 24 de Dezembro de 1996) patente norte-americana 5,877,305 (divulgada em 2 de Março de 1999).
Os compostos inibidores do receptor erbB2 e a substância descrita nos pedidos de patente PCT, patente norte-americana anteriormente mencionados, bem como outros compostos e substâncias que inibem o receptor erbB2, podem ser utilizados com o composto da presente invenção de acordo com a presente invenção.
Agentes anti-sobrevivência incluem anticorpos anti-IGF-IR e agentes anti-integrina, tal como anticorpos anti-integrina. Métodos de Utilização Diagnósticos
Os anticorpos anti-IGF-IR podem ser utilizados para detectar IGF-IR numa amostra biológica in vitro ou in vivo. Os anticorpos anti-IGF-IR podem ser utilizados num imunoensaio convencional, incluindo, sem constituir limitação, um ELISA, RIA, FACS, imuno-histoquímica de 98 tecido, Western blot ou imunoprecipitação. Os anticorpos do anti-IGF-IR da invenção podem ser utilizados para detectar IGF-IR de seres humanos. Noutra forma de realização, os anticorpos anti-IGF-IR podem ser utilizados para detectar IGF-IR de primatas do velho mundo, tal como o macaco caranguejeiro e rhesus, chimpanzés e gorilas. A invenção apresenta um método de detecção de anti-IGF-IR numa amostra biológica, compreendendo o contacto de uma amostra biológica com um anticorpo anti-IGF-IR da invenção e detectar o anticorpo ligado ao anti-IGF-IR, para detectar o IGF-IR numa amostra biológica. Numa forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR é marcado directamente com um marcador detectável. Noutra forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR (o primeiro anticorpo) não está marcado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode ligar o anticorpo anti-IGF-IR está marcado. Como é bem conhecido de um perito na especialidade, é escolhido um segundo anticorpo que é capaz de ligar especificamente as espécies especificas e classe do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-IGF-IR é um IgG humano, então o anticorpo secundário poderá ser um anti-IgG-humano. Outras moléculas que podem ligar a anticorpos incluem, sem constituir limitação, proteína A e proteína G, ambas comercialmente disponíveis, por exemplo junto da Pierce Chemical Co.
Marcadores adequados para o anticorpo ou secundário foram revelados anteriormente e incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, agentes magnéticos e materiais radioactivos. Constituem exemplos de enzimas adequadas a peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de grupos prostéticos 99 complexos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansyl ou ficoeritrina, um exemplo de um material luminescente inclui luminol, um exemplo de um agente magnético inclui gadolinio e exemplos de material radioactivo adequado inclui 125I, 131I, 35S ou 3H.
Numa forma de realização alternativa, IGF-IR pode ser analisado numa amostra biológica com um imunoensaio competição, utilizando padrões de IGF-IR marcados com uma substância detectável e um anticorpo anti-IGF-IR sem marcação. Neste teste, a amostra biológica, os padrões IGF-IR marcados e o anticorpo anti-IGF-IR são combinados e é determinada a quantidade de padrão IGF-IR marcado ligado ao anticorpo sem marcação. A quantidade de IGF-IR na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão IGF-IR marcado ligado ao anticorpo anti-IGF-IR. É possível utilizar os imunoensaios anteriormente apresentados para vários fins. Numa forma de realização, os anticorpos anti-IGF-IR podem ser utilizados para detectar IGF-IR em células em cultura de células. Numa forma de realização preferida, os anticorpos anti-IGF-IR podem ser utilizados para determinar o nível de fosforilação da tirosina, auto-fosforilação da tirosina de IGF-IR e/ou a quantidade de IGF-IR na superfície da célula após o tratamento das células com vários compostos. Este método pode ser utilizado para testar compostos que podem ser utilizados para activar ou inibir o IGF-IR. Neste método, uma amostra de células é tratada com um composto de ensaio durante um período de tempo, enquanto outra amostra é deixada sem tratamento. Se for medida a auto-fosforilação 100 da tirosina, as células são lisadas e a fosforilação da tirosina do IGF-IR é medida utilizando um imunoensaio descrito anteriormente ou como descrito no exemplo III que utiliza ELISA. Se for medido o nível total de IGF-IR, as células são lisadas e o nível total de IGF-IR é medido utilizando um dos imunoensaios descritos anteriormente.
Um imunoensaio preferido para a determinação da fosforilação da tirosina IGF-IR ou medição dos níveis de IGF-IR total é o ELISA ou Western blot. Se for medido apenas o nível de IGF-IR na superfície da célula, as células não são lisadas e os níveis de IGF-IR na superfície da célula são medidos utilizando um dos imunoensaios descritos anteriormente. Um imunoensaio preferido para a determinação dos níveis de IGF-IR na superfície da célula inclui as fases de marcação das proteínas da superfície da célula com um marcador detectável, tal como biotina ou 125I, imunoprecipitação do IGF-IR com um anticorpo anti-IGF-IR e depois detecção do igf-ir marcado. Outro imunoensaio para determinação da localização de IGF-IR, por exemplo, níveis na superfície da célula consiste na utilização da imuno-histoquímica. Métodos tal como ELISA, RIA, Western blot, imuno-histoquímica, marcação na superfície celular das proteínas da membrana integrais e imunoprecipitação são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Além disso, os imunoensaios podem ser ampliados para um rastreio de elevado débito a fim de testar um grande número de compostos seja quanto à activação seja inibição de IGF-IR.
Os anticorpos anti-IGF-IR da invenção podem ainda ser utilizados para determinar os níveis de IGF-IR num tecido ou em células derivadas do tecido. Numa realização preferida o tecido é um tecido doente. Numa realização mais 101 preferida o tecido é um tumor ou biopsia deste. Numa forma de realização preferida do método, é excisado um tecido ou uma biopsia deste de um doente. 0 tecido ou biopsia é depois utilizado num imunoensaio para determinar, por exemplo, níveis de IGF-IR, níveis na superfície celular de IGF—IR, níveis de fosforilação da tirosina do IGF-IR ou localização de IGF-IR pelos métodos discutidos anteriormente. O método pode ser utilizado para determinar se um tumor expressa IGF-IR a um elevado nível. 0 método de diagnóstico anteriormente descrito pode ser utilizado para determinar se um tumor expressa elevados níveis de IGF-IR, o que pode ser indicativo de que o tumor irá responder bem ao tratamento com anticorpo anti-IGF-IR. 0 método de diagnóstico pode também ser utilizado para determinar se um tumor é potencialmente canceroso, se expressa níveis elevados de IGF-IR, ou benigno se expressa baixos níveis de IGF-IR. Além disso, o método de diagnóstico pode ainda ser utilizado para determinar se o tratamento com anticorpo anti-IGF-IR (ver abaixo) faz com que um tumor expresse níveis inferiores de IGF-IR e/ou expresse níveis inferiores de auto-fosforilação da tirosina, podendo assim ser utilizado para determinar se o tratamento tem êxito. Em geral, um método para determinar se um anticorpo anti-IGF-IR diminui a fosforilação da tirosina compreende as fases de medição do nível de fosforilação da tirosina numa célula ou tecido de interesse, incubando a célula ou tecido com um anticorpo anti-IGF-IR ou respectiva porção de ligação do antigénio, depois repetição da medição do nível de fosforilação da tirosina na célula ou tecido. Pode ser medida a fosforilação da tirosina de IGF-IR ou outra(s) proteína(s). O método de diagnóstico pode ainda ser utilizado para 102 determinar se um tecido ou célula não expressa niveis suficientemente elevados de IGF-IR ou niveis suficientemente elevados de IGF-IR activado o que pode ser o caso de indivíduos com nanismo, osteoporose ou diabetes. Um diagnóstico com níveis de IGF-IR ou IGF-IR activo demasiado baixos pode ser utilizado para tratamento com anticorpos anti-IGF-IR activantes, IGF-I ou outros agentes terapêuticos para níveis ou actividade maior de IGF-IR.
Os anticorpos da presente invenção podem ainda ser utilizados in vivo para localizar tecidos e órgãos que expressam IGF-IR. Numa forma de realização preferida, os anticorpos anti-IGF-IR podem ser utilizados para localizar tumores que expressam IGF-IR. A vantagem dos anticorpos anti-IGF-IR da presente invenção consiste em que não irão gerar uma resposta imunitária com a administração. O método inclui as fases de administração de um anticorpo anti-IGF-IR ou composição farmacêutica respectiva a um doente necessitado desse teste diagnóstico e sujeição do doente a análises de imagiologia para determinar a localização dos tecidos que expressam IGF-IR. A análise imagiológica é bem conhecida na técnica médica e inclui, sem constituir limitação, análise por raio-x, ressonância magnética nuclear (magnetic resonance imaging - MRI) ou tomografia computorizada (computed tomography - CE) . Noutra forma de realização do método, a biopsia é obtida do doente para determinar se o tecido de interesse expressa IGF-IR em vez que sujeitar o doente à análise imagiológica. Numa forma de realização preferida, os anticorpos anti-IGF-IR podem ser marcados com um agente detectável que pode ser visualizado num doente. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um agente de contraste, tal como bário, que pode ser utilizado para análise por raio-x ou um agente de contraste 103 magnético, tal como um quelato de gadolínio, que pode ser utilizado apra MRI ou CE. Outros agentes marcadores incluem, sem constituir limitação, radioisótopos, tal como "Tc. Noutra forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR não será marcado e será visualizado mediante a administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que é detectável e que pode ligar o anticorpo anti-IGF-IR. Métodos Terapêuticos de Utilização O anticorpo anti-IGF-IR da invenção pode ser utilizado para inibir a actividade IGF-IR mediante a administração do anticorpo mencionado a um doente necessitado do mesmo. Qualquer um dos tipos de anticorpos descritos pode ser utilizado a titulo terapêutico.
Noutra forma de realização preferida, o IGF-IR é humano e o doente é um ser humano. Em alternativa, o doente pode ser um mamifero que expressa um IGF-IR, com o qual o anticorpo anti-IGF-IR possa inter-reagir. O anticorpo pode ser administrado a um mamifero não-humano que expressa um IGF-IR, com o qual o anticorpo inter-reaja (isto é um primata ou um macaco caranguejeiro ou rhesus) para fins veterinários ou como modelo animal de uma doença humana. Estes modelos animais podem ser úteis para a avaliação da eficácia terapêutica de anticorpos da presente invenção.
Tal como presentemente utilizado, o termo "uma perturbação em que a actividade do IGF-IR seja prejudicial" pretende incluir doenças e outras perturbações em que se demonstrou que a presença de elevados níveis de IGF-IR num sujeito que sofra da perturbação é ou suspeita-se que seja responsável pela patofisiologia da perturbação ou um factor que contribui para o agravamento da perturbação. Assim, uma perturbação em que elevados níveis de actividade do IGF-IR sejam prejudiciais é uma perturbação em que se espera que a 104 inibição da actividade do IGF-IR alivie os sintomas e/ou progressão da perturbação. Estas perturbações podem ser comprovadas, por exemplo, mediante um aumento dos níveis de IGF-IR na superfície celular ou um aumento da auto-fosforilação da tirosina do IGF-IR nas células ou tecidos afectados de um sujeito que sofra da perturbação. O aumento dos níveis de IGF-IR pode ser detectado, por exemplo, utilizando um anticorpo anti-IGF-IR como anteriormente descrito.
Numa forma de realização preferida, os anticorpos anti-IGF-IR podem ser administrados a um doente com um tumor que expressa IGF-IR. Um tumor pode ser um tumor sólido ou pode ser um tumor não-sólido, tal como um linfoma. Numa forma de realização mais preferida, os anticorpos anti-IGF-IR podem ser administrados a um doente com um tumor que expressa IGF-IR, o qual é canceroso. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR é administrado a um doente com um tumor do pulmão, mama, próstata ou cólon. Numa forma de realização muito preferida, o método faz com que o tumor não aumente de peso ou volume ou diminua de peso ou de volume. Noutra forma de realização, o método faz com que o IGF-IR no tumor seja internalizado. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é 2.13.2 ou 4.9.2. ou inclui uma cadeia pesada, cadeia leve ou região de ligação do antigénio do mesmo.
Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser administrado a um doente que expressa níveis inadequadamente elevados de IGF-I. É sabido na técnica que a expressão de alto nível de IGF-I pode conduzir a uma variedade de cancros comuns. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR é administrado a um doente com um cancro da próstata, glioma 105 ou fibrossarcoma. Numa forma de realização ainda mais preferida, o método faz com que o tumor pare a proliferação anómala ou não aumente de peso ou volume ou diminua de peso ou de volume.
Numa forma de realização, o anticorpo é utilizado para o tratamento de cancros tal como cancro do cérebro, das células escamosas, da bexiga, gástrico, pancreático, da mama, da cabeça, pescoço, esofágico, da próstata, colo-rectal, do pulmão, renal, do rim, dos ovários, ginecológico ou da tiróide. Os doentes que podem ser tratados com um composto da invenção de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, doentes a quem foi diagnosticado cancro do pulmão, cancro ósseo, cancro pancreático, cancro da pele, cancro da cabeça ou pescoço, melanoma curâneo ou intra-ocular, cancro uterino, cancro dos ovários, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro do cólon, cancro da mama, tumores ginecológicos (por exemplo sarcomas uterinos, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma cervical, carcinoma da vagina ou carcinoma da vulva), doença de Hodgkin, cancro do exófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino (por exemplo cancro da tiróide, paratiróide ou glândulas supra-renais, sarcoma do tecido conjuntivo, cancro da uretra, cancro do pénis, cancro da próstata, leucemia crónica ou aguda, tumores sólidos infantis, linfomas linfociticos, cancro da bexiga, cancro do rim ou uretra (por exemplo, carcinoma das células renais, carcinoma da pélvis renal) ou neoplasmas do sistema nervoso central (por exemplo, linfoma primário do SNC, tumores do eixo espinal, glioma do tronco cerebral ou adenoma da pituitária). 106 O anticorpo pode ser administrado uma vez, mas mais preferencialmente é administrado várias vezes. 0 anticorpo pode ser administrado entre três vezes ao dia e uma vez de seis em seis meses. A administração pode ser programada, tal como três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez por dia, de dois em dois dias, de três em três dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada seis meses. O anticorpo pode ser administrado por via oral, mucosal, bucal, intranasal, inalação, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parentérica, intratumor ou tópica. 0 anticorpo pode ser administrado num local distante do local do tumor. O anticorpo pode ainda ser administrado de modo continuo por uma minibomba. 0 anticorpo pode ser administrado uma vez, pelo menos duas vezes ou durante pelo menos o período de tempo necessário até a condição estar tratada, aliviada ou curada. 0 anticorpo será geralmente administrado enquanto o tumor estiver presente, desde que o anticorpo faça com que o tumor ou cancro pare de crescer ou diminua de peso ou volume. O anticorpo será geralmente administrado como parte de uma composição farmacêutica, como anteriormente descrito. A dosagem de anticorpo situar-se-à geralmente entre 0,1-100 mg/kg, mais preferencialmente 0,5-50 mg/kg, mais preferencialmente 1-20 mg/kg e ainda mais preferencialmente 1-10 mg/kg. A concentração no soro do anticorpo pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica. Vide, por exemplo, examplo XVII sequinte. 0 anticorpo pode também ser administrado a título profilático a fim de prevenir a ocorrência de um cancro ou tumor. Este aspecto pode ser especialmente útil em doentes que possuem um nível "normal elevado" de IGF-I porque estes doentes 107 revelaram possuir um risco maior de desenvolvimento de cancros comuns. Vide Rosen et al, supra.
Noutro aspecto, o anticorpo anti-IGF-IR pode er co-administrado com outros agentes terapêuticos, tal como fármacos ou moléculas anti-neoplásicos, a um paciente com uma perturbação hiper-proliferativa, tal como cancro ou tumor. Num aspecto, a invenção refere-se a um método de tratamento da perturbação hiper-proliferativa num mamífero compreendendo a administração ao mamífero mencionado de uma quantidade com eficácia terapêutica de um composto da invenção em combinação com um agente anti-tumor seleccionado do grupo constituído por, mas não limitado a, inibidores mitóticos, agentes de alquilação, antimetabolitos, agentes intercalantes, inibidores do factor de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, modificadores da resposta biológica, anti-hormonas, inibidores da quinase, inibidores da metaloprotease da matriz, agentes terapêuticos genéticos e anti-androgénios. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo pode ser administrado com um agente antineoplásico, tal como adriamicina ou taxol. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo ou terapia combinada é administrado em conjunto com radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, cirurgia ou outra imunoterapia. Noutra forma de realização preferida, o anticorpo será administrado com outro anticorpo. Por exemplo, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser administrado com um anticorpo ou outro agente que é conhecido por inibir a proliferação de células de tumor ou cancerígenas, por exemplo um anticorpo ou agente inibidor do receptor erbB2, EGF-R, CD20 ou VEGF. 108 A co-administração do anticorpo com um agente terapêutico (terapia combinada) engloba a administração de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-IGF-IR e o agente terapêutico adicional e a administração de duas ou mais composições farmacêuticas separadas, uma compreendendo o anticorpo anti-IGF-IR e outra(s) compreendendo o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) . Além disso, embora a co-administração ou terapia combinada signifique em geral que o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados simultaneamente, inclui também casos em que o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados em momentos diferentes. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado uma vez a cada três dias, enquanto o agente terapêutico é administrado uma vez ao dia. Em alternativa, o anticorpo pode ser administrado antes ou imediatamente a seguir ao tratamento da perturbação com o agente terapêutico adicional. De modo semelhante, a administração do anticorpo anti-IGF-IR pode ser efectuada antes ou depois de outra terapia, tal como radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinâmica, cirurgia ou outra imunoterapia. 0 anticorpo e um ou vários agentes terapêuticos adicionais (terapia combinada) podem ser administrados uma vez, duas vezes ou durante pelo menos o período de tempo necessário até a condição estar tratada, aliviada ou curada. De preferência, a terapia combinada é administrada múltiplas vezes. A terapia combinada pode ser administrada entre três vezes ao dia e uma vez de seis em seis meses. A administração pode ser programada, tal como três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez por dia, de dois em dois dias, de três em três dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois 109 meses, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada seis meses ou pode ser administrada de forma continua por uma minibomba. A terapia combinada pode ser administrada por via oral, mucosal, bucal, intranasal, inalação, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parentérica, intratumor ou tópica. A terapia combinada pode ser administrada num local distante do local do tumor. A terapia combinada será geralmente administrada enquanto o tumor estiver presente, desde que o anticorpo faça com que o tumor ou cancro pare de crescer ou diminua de peso ou volume.
Em mais uma forma de realização, o anticorpo anti-IGF-IR é marcado com um radiomarcador, uma imunotoxina ou uma toxina ou é uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo tóxico. O anticorpo anti-IGF-IR ou proteína de fusão do anticorpo anti-IGF-IR orienta o radiomarcador, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico para as células de tumor ou cancerígenas que expressam IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o radiomarcador, imunotoxina, toxina ou peptídeo tóxico é internalizado depois de o anticorpo anti-IGF-IR ter ligado ao IGF-IR na superfície do tumor ou célula cancerígena.
Noutro aspecto, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser utilizado terapeuticamente para induzir a apoptose de células específicas num doente necessitado. Em muitos casos, as células alvo da apoptose são células cancerosas ou de tumor. Assim, numa forma de realização preferida, o anticorpo da invenção pode ser utilizado num método de indução da apoptose mediante administração de uma quantidade com eficácia terapêutica de um anticorpo anti-IGF-IR a um doente necessitado. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é 2.13.2 ou 4.9.2. ou inclui uma 110 cadeia pesada, cadeia leve ou região de ligação do antigénio do mesmo.
Num outro aspecto, o anticorpo anti-IGF-IR pode ser utilizado para tratar estados não-cancerosos em que os elevados níveis de IGF-I e/ou IGF-IR foram associados ao estado ou doença não-canceroso. Numa forma de realização, esta compreende a fase de administração de um anticorpo anti-IGF-IR a um doente com um estado patológico não-canceroso provocado ou exacerbado por níveis elevados de IGF-I e/ou níveis ou actividade de IGF-IR. Numa forma de realização preferida, o estado patológico não-canceroso é acromegalia, gigantismo, psoríase, aterosclerose, restenose do músculo liso dos vasos sanguíneos ou proliferação microvascular inapropriada, tal como a encontrada como complicação do diabetes, especialmente no olho. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR atrasa o progresso do estado patológico não cancerígeno. Numa forma de realização mais preferida, o anticorpo anti-IGF-IR atrasa para ou inverte pelo menos parcialmente o estado patológico não cancerígeno.
Terapia Genética
As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser administradas a um doente necessitado das mesmas mediante terapia genética. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Numa forma de realização preferida, as moléculas de ácido nucleico codificadoras da cadeia pesada e da cadeia leve são administradas a um doente. Numa forma de realização mais preferida, as moléculas de ácido nucleico são administradas de forma a serem integradas com estabilidade no cromossoma de células B, porque estas células são especializadas para a produção de anticorpos. Numa forma de realização preferida, as células B 111 precursoras são transfectadas ou infectadas ex vivo e re-transplantadas num doente necessitado das mesmas. Noutra forma de realização, as células B precursoras ou outras células são infectadas in vivo utilizando um vírus conhecido por infectar o tipo de células de interesse. Os vectores típicos, utilizados para terapia genética incluem lipossomas, plasmídeos ou vectores virais, tal como retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados. Após a infecção, seja in vivo, seja ex vivo, os níveis de expressão do anticorpo podem ser vigiadas recolhendo uma amostra do doente em tratamento e utilizando qualquer imunoensaio conhecido na técnica e presentemente discutido.
Numa forma de realização preferida, o método da terapia genética compreende as fases de administração de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora da cadeia pesada ou da respectiva porção que liga ao antigénio do anticorpo humano ou respectiva porção e expressão da molécula de ácido nucleico. Noutra forma de realização preferida, o método da terapia genética compreende as fases de administração de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora da cadeia leve ou da respectiva porção que liga ao antigénio do anticorpo humano ou respectiva porção e expressão da molécula de ácido nucleico. Numa forma de realização mais preferida, o método da terapia genética compreende as fases de administração de uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora da cadeia pesada ou da respectiva porção que liga ao antigénio do anticorpo humano ou respectiva porção e uma quantidade eficaz de uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora da cadeia leve ou da respectiva porção que liga ao antigénio do anticorpo humano ou respectiva 112 porção e expressão das moléculas de ácido nucleico. 0 método da terapia genética pode ainda incluir a fase de administração de outro agente anticancerígeno, tal como taxol, tamoxifen, 5-FU, adriamicina ou CP-358.774. A fim de proporcionar uma melhor compreensão desta invenção são apresentados os exemplos seguintes. Estes exemplos destinam-se apenas a servir de ilustração e não se pretende de forma alguma que constituam uma limitação do âmbito da invenção.
EXEMPLO I: Geração de Hibridomas produtores de anticorpos do Anti-IGF-IR
Os anticorpos da invenção foram preparados, seleccionados e testados da seguinte maneira: Imunização e geração de hibridomas
Rationhos XENOMICE™ de oito a dez semanas de idade foram imunizados intraperitonealmente ou nas suas regiões subplantares posteriores com o domínio extracelular do IGF-IR humano (10 pg/dose/ratinho) ou com células 3T3-IGF-IR ou 300.19-IGF-IR, as quais são duas linhas de células transfectadas que expressam o IGF-IR humano nas suas membranas de plasma (10 x 106 células/dose/ratinho). Esta dose foi repetida cinco a sete vezes durante um período de três a oito semanas. Quatro dias antes da fusão, os ratinhos receberam uma injecção final do domínio extracelular do IGF-IR humano em PBS. Os linfócitos do baço e dos nódulos linfáticos de ratinhos imunizados foram fundidos com a linha celular P3-X63-Ag8.653 do mieloma não secretório e foram sujeitos a selecção HAT conforme descrito previamente (Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Foi recuperado um painel de hibridomas secretando todos anticorpos lgG2K específicos humanos do IGF-IR. Foram seleccionados para estudos adicionais sete 113 hibridomas produtores de anticorpos monoclonais específicos para o IGF-IR e foram designados 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2, 4.17.3 and 6.1.1.
Os hibridomas 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 and 4.17.3 foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 210-2209, em 1-2 de Dezembro de 2000 com os seguintes números de depósito:
Hibrido Depósito ma_N° ._ 2.12.1 PTA-2792 2.13.2 PTA-2788 2.14.3 PTA-27 90 3.1.1 PTA-2791 4.9.2 PTA-2789 4.17.3 PTA-2793 EXEMPLO II: Determinação de Constantes de Afinidade (Kd) de Anticorpos Monoclonais Anti-IGF-IR Completamente Humanos por BIAcore
Executámos medições de afinidade de anticorpos purificados por ressonância de plasmão de superfície utilizando o instrumento BIAcore 3000, seguindo os protocolos do fabricante.
Protocolo 1
Para executar análises cinéticas, a proteína-A foi imobilizada nas superfícies do sensor chip do BIAcore. O sensor chip foi então utilizado para capturar os anticorpos do anti-IGF-IR da presente invenção. Foram injectadas concentrações diferentes do domínio extracelular do IGF-IR no sensor chip e foram analizadas as ligações e 114 dissociações cinéticas das interacções entre os anticorpos do anti-IGF-IR e o domínio extracelular do IGF-IR. Os dados foram avaliados com ajuste global de Langmuir a 1:1 utilizando modelos de desvio de linha de base no software BIAevaluation fornecido pela BIAcore.
Protocolo 2
As medições BIAcore foram executadas essencialmente como descrito por Fagerstam et al. "Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance. Applications to epitope mapping." J. Mol. Recog. 3:208-214. (1990). O Quadro I enumera as medições de afinidade para anticorpos anti-IGF-IR representativos da presente invenção.
Quadro 1
Anticorpos monoclonais Kd (M) Protoco lo 1 Kd (M) Protoco lo 2 2.12.1 7,37 x IO-9 2.13.2 3,5 x IO-9 1,53 x IO-9 2.14.3 6,41 xlO~10 3.1.1 1,15 x io-9 4.9.2 6, 84 x 10_1° 4,27 x 10_1° 4.17.3 1,3 x IO-8 6.1.1 5, 65 x 1Q-10
As análises cinéticas indicam que os anticorpos preparados de acordo com a invenção possuem afinidades 115 elevadas e constantes de ligação fortes para o domínio extracelular do IGF-IR. EXEMPLO III: Inibição mediada por anticorpos de
fosforilação induzida por IGF-I do IGF-IR
Executamos experiências ELISA de modo a determinar se os anticorpos desta invenção eram capazes de bloquear a activação mediada por IGF-I do IGF-IR. A activação mediada por IGF-I do IGF-IR foi detectada por aumento da fosforilação de tirosina associada a receptor.
Preparação de Placas ELISA
Preparámos placas ELISA de captura por adição de 100 μΐ de tampão de bloqueio (3% de albumina de soro bovino [BSA] em solução tris salina tamponada [TBS]) para cada poço de placas de 96 poços (Pierce) cobertos com Proteína G ReactiBind e encubámos as placas com agitação durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diluímos anticorpos do anti-IGF-IR SC-713 pan específico de coelhos (Santa Cruz) em tampão de bloqueio para uma concentração de 5 pg/ml e adicionámos 100 μΐ de anticorpo diluído por cada poço. Incubámos as placas com agitação durante 60-90 minutos a temperatura ambiente. Então lavámos as placas cinco vezes com tampão de lavagem (TBS + 0,1% Tween 20) e sujeitámos o tampão remanescente a coloração suave para toalhas de papel. Não foi permitido as estas placas secarem antes da adição de lisado.
Preparação de Lisado de células que expressam o IGF-IR
Colocámos células NIH-3T3 transfectadas do IGF-IR (5xl04/ml) em 100 μΐ de meio DMEM com glicose elevada suplementado com L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivado por calor, e 500 pg/ml de cada de geneticina, penicilina e estreptomicina em placas com fundo em U de 96 116 poços. Incubámos as placas a 37°C, 5% de CO2 de um dia para o outro para permitir que células se ligassem. Então decantámos o meio das placas e substituímo-lo com 100 μΐ de meio fresco por poço. Para teste, diluímos os anticorpos anti-IGF-IR potenciais a cinco vezes a concentração final desejada em meio de crescimento e adicionámos 25 μΐ por poço. Todas as amostras foram executadas em triplicado. Então incubámos as placas a 37°C durante uma hora. Estimulámos as células com 25 μΐ/poço de 600 ng/ml de IGF-I (preparado em meio de crescimento) e incubámos as placas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Então decantámos o meio invertendo as placas e sujeitámos a coloração suave para toalhas de papel e lisámos as células aderentes através de adição de 50 μΐ de tampão de lise (50 mM de HEPES, pH 7,4, 10 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 1,6 mM de NaV04, 1% de Triton X-100, 1% de glicerol suplementado imediatamente antes de ser usado com um comprimido de inibidor de protease isento de EDTA [Roche Molecular Sciences] por 50 ml) e agitação durante 5 minutos a temperatura ambiente. Adicionámos 200 μΐ de tampão de diluição (50 mM de HEPES, pH 7,4, 1,6 mM de NaV04) a cada poço e misturámos através de pipetação para cima e para baixo. Transferimos 100 μΐ de lisado de cada poço para cada paço da placa ELISA de captura preparadado conforme descrito acima e incubámos com agitação suave durante duas horas a temperatura ambiente. ELISA com Anticorpos Anti-tirosina-fosfato (pTYR)
Removemos o lisado de células invertendo as placas, lavámos as placas cinco vezes com tanpão de lavagem e sujeitámos a coloração em toalhas de papel. Adicionámos 100 μΐ por poço de anticorpo específico de pTYR (HRP-PY54) diluído em tampão de bloqueio para uma concentração de 0,2 117 μg/ml e incubámos as placas com agitação durante 30 minutos a temperatura ambiente. Então lavámos estas placas cinco vezes com tampão de lavagem e sujeitámos a coloração em toalhas de papel.
Detectámos ligação do anticorpo HRP-PY54 através de adição de 100 μΐ por poço de solução de substrato de peroxidase TMB (Kirkegaard & Perry) e incubámos com agitação enquanto a cor revelava (aproximadamente 2-10 minutos). Parámos a reacção de revelação de cor através de adição de 100 μΐ por poço de solução color stop TMB (Kirkegaard & Perry). Então agitámos as placas durante 10 segundos à temperatura ambiente para misturar a solução e quantificámos por medições a OD45onm· 0 Quadro II e a Figura 4 apresentam os resultados desta experiência executada com vários anticorpos da invenção. Os resultados desta experiência demonstram a capacidade dos anticorpos desta invenção para bloquear a activação mediada por IGF-I do IGF-IR como apresentado por aumento da fosforilação de tirosina associada a receptor. Alem disso, estes resultados podem ser usados para quantificar a potência relativa dos anticorpos desta invenção
Quadro II
Anticorpos monoclonais IC50 (pg/ml) 2.12.1 0, 172 2.13.2 0,0812 2.14.3 0,325 4.9.2 0,0324
EXEMPLO IV: Bloqueio mediado por anticorpos da ligação do IGF-I/IGF-IR 118
Executámos experiências ELISA para quantificar a capacidade dos anticorpos desta invenção para inibirem a ligação do IGF-IR ao IGF-IR num teste baseado em células. Colocámos células NIH-3T3 transfectadas do IGF-IR (5xl04/ml) em 100 μΐ de meio DMEM com glicose elevada suplementado com L-glutamina (0,29 mg/ml), 10% de FBS inactivado por calor, e 500 pg/ml de cada de geneticina, penicilina e estreptomicina em placas com fundo em U de 96 poços. Então incubámos as placas a 37°C, 5% de C02 de um dia para o outro para permitir que células se ligassem. Então decantámos o meio das placas e substituímo-lo com 100 μΐ de meio fresco por poço. Para testar, dissolvemos anticorpos em meio de ensaio (meio DMEM com glicose elevada suplementado com L-glutamina, 10% de FBS inactivado por calor, 200 pg/ml e 500 pg/ml de cada de geneticina, penicilina e estreptomicina) para a concentração final desejada e adicionámos 50 μΐ por poço. Todas as amostras foram executadas em triplicado. Então incubámos as placas a 37°C durante 10 minutos. Diluímos [ 125I ]-IGF-I para uma concentração de 1 pCi/ml em meio de ensaio e adicionámos 50 μΐ por poço da placa. Como controlo para radioactividade de fundo, adicionámos IGF-I frio para uma concentração final de 100 ng/ml. Incubámos as placas durante 10 minutos a 37°C, decantámos o meio absorvendo-o suavemente com toalhas de papel e lavámos duas vezes com meio de ensaio. Então lisámos as células por adição de 50 μΐ de 0,1 N NaOH, 0,1% SDS agitando as placas durante cinco minutos a temperatura ambiente. Então transferimos as amostras para uma placa de cintilação, adicionámos 150 μΐ de OptiPhase Supermix e lemos o sinal num contador Micro-Beta Wallac. O Quadro III e a Figura desta experiência 3 apresentam os realizada com três resultados anticorpos 119 representativos da invenção. Nesta experiência demonstrámos que os anticorpos da invenção inibem especificamente a ligação de [125I]-IGF-I às células que superexpressa o IGF-IR.
Quadro III.
Anticorpos monoclonais IC50 2.12.1 0,45 pg/ml 2.13.2 0,18 pg/ml 4.9.2 0,1 pg/ml EXEMPLO V: Estudos de mapeamento de epitopos
Tendo demonstrado que os anticorpos da invenção reconhecem o IGF-IR, executámos estudos de mapeamento de epitopos com vários anticorpos da invenção. Focámos estas experiências em particular nos anticorpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, e 4.9.2.
Conduzimos estudos de competição em BIAcore para determinar se os anticorpos desta invenção se ligam ao mesmo ou a sítios distintos na molécula do IGF-IR. Ligámos o domínio extracelular (ECD) do IGF-IR a um sensor chip BIAcore conforme descrito acima no Exemplo II. Ligámos um primeiro anticorpo da invenção a este IGF-IR ligado a sensor chip sob condições de saturação. Então medimos a capacidade dos anticorpos secundários subsequentes da invenção em competir com os anticorpos primários para ligação ao IGF-IR. Esta técnica permitiu-nos atribuir os anticorpos desta invenção a diferentes grupos de ligação.
Executámos esta experiência com os anticorpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, e 4.9.2. Observámos que os 2.13.2 e 4.9.2 120 competem pelo mesmo sítio no domínio extracelular do IGF-IR. Os outros anticorpos, 2.12.1 e 2.14.3, ligam a sítios do IGF-IR que são diferentes de ambos e do sítio ligado pelos 2.13.2 e 4.9.2. EXEMPLO VI: Reactividade cruzada de espécies dos anticorpos da invenção
De modo a determinar a reactividade cruzada de espécies dos anticorpos da invenção, executámos várias experiências incluindo imunoprecipitação, bloqueio mediado de anticorpos da fosforilação induzida por receptor de IGF-I e análise por FACS.
Plaqueámos células em meio DMEM com glicose elevada suplementado com L-glutamina, 10% de FBS inactivado por calor, e 500 pg/ml de cada de geneticina, penicilina e estreptomicina para 50% de confluência em balões T25. Então adicionámos 100 μΐ de um anticorpo da invenção em solução tampão salina de Hank (HBSS; Gibco BRL) a uma concentração de 1 pg/ml. Incubámos as placas durante 30 minutos a 37°C numa incubadora e então estimulámos as células com IGF-I a 100 ng/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lisámos as células e tampão RIPA (Harlow and Lane, supra) e imunoprecipitámos o IGF-IR com 2 pg de anticorpo anti-IGF-IR SC-713 pan específico (Santa Cruz) mais microesferas de agarose de proteína A durante 1 hora a 4°C. Transformámos as microesferas em pellets e lavámos três veezs com PBS/T (PBS + 0.1% de Tween-20) e depois fervemos as microesferas em 40 μΐ de tampão de Laemmli contendo 5% de βΜΕ.
As amostras preparadas conforme descrito acima foram então testadas por Western blot. Carregámos 12 μΐ de cada amostra por pista em passagens de 4-10% de gradiante com gel Novex™ com lx tampão MES (Novex™). Os géis foram passados a 150 V durante 1 hora ou a 200 V durante 121 apeoximadamente 30 minutos. Transferimos o gel para uma membrana em tampão de transferência Novex™ com 10% de matanol de um dia para o outro ou durante 1-1,5 horas a 250 mA. Então permitimos que a membrana secasse completamente e bloqueasse a temperatura ambiente com TBS (solução tris salina pH 8,0) contendo Superblock (Pierce Chemical Co.). Adicionámos o anticorpo IGF-IR de coloração SC713 (Santa Cruz) para detectar o IGF-IR imunoprecipitado.
Esta experiência foi executada com anticorpos da invenção, em particular os 2.12.1, 2.13.2, 4.17.3 e 4.9.2, em células de uma variedade de animais. Descobrimos que os anticorpos 2.12.1, 2.13.2 e 4.9.2 eram capazes de ligação humana, mas não canina, cobaia, coelho ou do IGF-IR. Alem disso, estes anticorpos eram capazes de ligação de COS7 e do IGF-IR de Rhesus, ambos derivados de macacos do velho mundo, mas não do IGF-IR do marmoset, o qual é um macaco do novo mundo. Estas experiências indicam que os anticorpos são altamente específicos.
Bloqueio mediado por anticorpos da ligação do IGF-I/IGF-IR em primatas não humanos.
No seguimento da nossa observação de que os anticorpos da invenção reconhecem o IGF-IR de macacos do velho mundo, testámos igualmente a capacidade deles para bloquear a ligação do IGF-I/IGF-IR em células derivadas destes macacos do velho mundo. Plaqueámos células em meio DMEM com glicose elevada suplementado com L-glutamina, 10% de FBS inactivado por calor, e 500 pg/ml de cada de geneticina, penicilina e estreptomicina para 50% de confluência em balões T25. Então adicionámos um anticorpo da invenção, ou meio sem anticorpo como controlo, e estimulámos as células com IGF-I a 100 ng/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Após estimulação, lisámos as células e imunoprecipitámos o IGF- 122 IR com anticorpo do IGF-IR pan específico SC713 conforme descrito acima. Então executámos testes de Western blot conforme descrito acima usando anticorpo HRP-PY54 para detectar tirosina fosforilada no IGF-IR activado.
Observámos que os anticorpos desta invenção, em particualr os 2.13.2 e 4.9.2 conseguiam bloquear a fosforilação induzida por IGF-I de IGF-IR em ambas as células de C0S7 e de Rhesus. 0 IC50 para a inibição observada era de 0,02 pg/ml e 0, 005 pg/ml para o COS7 e o IGF-IR de Rhesus, respectivamente.
Determinação de Afinidade inter-espécies de Anticorpos da invenção
Executámos análise por FACS para determinar a afinidade dos anticorpos da invenção para o IGF-IR de outros animais, em particular os macacos do velho mundo descritos acima. Incubámos alíquotas de células humanas e de macaco (5x105) durante 1 hora em gelo com concentrações crescentes de anticorpos anti-IGF-IR biotinilados da invenção ou com anticorpo de anti hemocianina de Megathura biotinilada (KLH) (Abgenix) como um controlo negativo. Então incubámos as amostras durante 30 minutos em gelo com conjugado de estreptavidina RPE (ficoeritrina). Medimos a ligação por citometria de fluxo e analisámos os histogramas de intensidade de fluorescência (F12-H) versus número de células (contagens) usando software CellQuest. Calculámos as ligações (kd) para cada anticorpo de gráficos de intensidade de intensidade de fluorescência média versus concentração de anticorpos. Na maioria da experiências, medimos as ligações em células humanas MCF-7 cultivadas e em células de cultura tecidular de rhesus ou de macaco caranguejeiro. Controlámos a depleção do anticorpo através 123 de medição das ligações sobre uma gama de concentrações de células.
Executámos as análises FACS mencionadas anteriormente para testar a capacidade dos anticorpos da invenção, particularmente 2.13.2 ou 4.9.2. para ligar células humanas, de rhesus e de macaco caranguejeiro. Observámos uma formação semi-máxima de banda (Kd) de 0,1 pg/ml para todas as linhas de células testadas.
EXEMPLO VII: Subregulação do Receptor de IGF-I
Executámos experiências de bloqueio essencialmente como anteriormente descrito no exemplo IV até à adição de IGF-I marcado com [ I] . Neste ponto, fervemos as células em 40 μΐ de tampão de Laemmli contendo 50% me. Depois analisámos as amostras por western blot como anteriormente descrito no exemplo VI e sondámos as manchas com ambos os anticorpos IGF-IR pan especifico SC713 para quantificar os níveis de anticorpo IGF-IR e HRP-PY54 para controlar os níveis de tirosina fosforilada no IGF-IR activado.
Como observado anteriormente (exemplo III) observámos bloqueio da fosforilação induzida por IGF-I do IGF-IR na sequência do tratamento de células com um anticorpo da presente invenção (figura 4) . Observámos ainda que este bloqueio da fosforilação induzida por IGF-I foi seguida da subregulação do IGF-IR nestas células. Vide, por exemplo, fig 4. Os níveis de IGF-IR tiveram a sua redução máxima 16 horas depois da estimulação com IGF-IR na presença de um anticorpo da invenção. EXEMPLO VIII: Efeitos dos Anticorpos da Invenção no IGF-IR in vivo
Determinámos se os efeitos dos anticorpos da invenção em IGF-IR como descrito nos exemplos precedentes poderia 124 ocorrer in vivo. Induzimos tumores em ratinhos atimicos de acordo com com métodos publicados (V.A. Pollack et al., "Inhibition of epidermal growth factor receptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymic mice," J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739-748 (1999). Resumidamente, injectámos células NIH-3T3 com IGF-IR transfectado (5xl06) por via subcutânea em ratinhos atimicos de 3 a 4 semanas de idade (nu/nu) com 0,2 ml de preparação de Matrigel. Injectámos então ratinhos com um anticorpo da invenção por via intraperitoneal depois da formação de tumores estabelecidos (isto é aproximadamente 400 mm3) .
Passadas 24 horas, extraímos os tumores, homogeneizámos e determinámos o nível de IGF-IR. Para determinar os níveis de IGF-IR diluímos o anticorpo SC-713 em tampão de bloqueio até atingir uma concentração final de pg/ml e adicionámos 100 μΐ a cada poço de uma placa revestida com cabra anti coelho (GAR) (Pierce) . Incubámos as placas à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação e depois lavámos as placas cinco vezes com tampão de lavagem. Pesámos então amostras de tumor que previamente preparadas como anteriormente descrito e homogeneizámos em tampão de lise (1 ml/100 mg) . Diluímos 12,5 μΐ de extrato de tumor com tampão de lise até atingir um volume final de 100 μΐ e adicionámos este a cada poço de uma placa de 96 poços. Incubámos as placas à temperatura ambiente durante 1 a 2 horas com agitação e depois lavámos as placas cinco vezes com tampão de lavagem. Adicionámos 100 μΐ de HRP-PY54 ou anticorpo anti-IGF-IR biotinilado em tampão de bloqueio a cada poço e incubámos à temperatura ambiente com agitação durante 30 minutos. Então lavámos estas placas cinco vezes 125 com tampão de lavagem e revelámos as placas. Revelámos as placas sondadas com HRP-PY54 adicionando 100 μ do substrato TMB Microwell por poço e parámos a ervelação da cor com adição de 100 μΐ de H2S04 0,9M. Quantificámos então o sinal agitando durante 10 segundos e medindo OD450nm· O sinal foi normalizado para proteina total. Revelámos as placas sondadas com anticorpo anti-IGF-IR mediante adição de 100 μΐ de estreptavidina-HRP diluido com tampão de bloqueio em cada poço, incubando à temperatura ambiente com agitação durante 30 minutos e depois continuando como descrito para HRP-PY54.
Observámos que a injecção intraperitoneal de um anticorpo da presente invenção, particularmente 2.13.2 ou 4.9.2., teve como resultado a inibição da actividade do IGF-IR conforme medido por uma diminuição de [ambas fosfotirosina do IGF-IR (IGF-IR fosforilado) e] proteina de IGF-IR total (figura 6). Além disso, observámos também uma diminuição da fosfotirosina de IGF-IR (IGF-IR fosforilado) (figura 5) . Sem desejar limitar-nos a qualquer teoria, os niveis diminuidos de fosfotirosina de IGF-IR pode-se ficar a dever aos menores niveis da proteina de IGF-IR in vivo depois do tratamento com o anticorpo ou poderá dever-se à combinação dos niveis menores de proteina de IGF-IR e uma diminuição na fosforilação da tirosina no IGF-IR que está presente devido ao bloqueio da activação por ligando (por exemplo, IGF-I ou IGF-II). Além disso, esta inibição respondeu à dose de anticorpo injectado (figura 6) . Estes dados demonstram que os anticorpos da invenção são capazes de estabelecer o IGF-IR como alvo in vivo de uma forma análoga à observada in vitro.
EXEMPLO IX: Inibição do Crescimento (TGI) de Tumores de Células 3T3/IGF-IR 126
Testámos se os anticorpos anti-IGF-IR da invenção inibiriam o crescimento tumores. Induzimos tumores como anteriormente descrito (exemplo VIII) e depois de estabelecidos, formados tumores palpáveis (isto é 250 mm3, no espaço de 6 a 9 dias) tratámos os ratinhos com uma única dose de 0,20 ml de anticorpo por injecção intraperitoneal. Medimos o tamanho do tumor com o nónio de Vernier por dois diâmetros a cada três dias e calculámos o volume utilizando a fórmula (comprimento x [largura]2/2 utilizando métodos definidos por Geran, et al, "Protocols for screening Chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems," Câncer Chemother. Rep. 3:1 — 104 .
Quando realizámos esta análise com um anticorpo da invenção constatámos que um único tratamento com o apenas com o anticorpo 2.13.2 inibiu o crescimento dos tumores induzidos em células NIH-3T3 transfectadas com IGF-IR (figura 7, painel da esquerda). Além disso, em estudos de combinação com uma única dose de 7,5 mg/kg com adriamicina administrada por via intravenosa, observámos que a administração de uma única dose de 2.13.2 intensificou a eficácia da adriamicina, um inibidor conhecido do crescimento de tumores. A combinação da adriamicina com um anticorpo da invenção, 2.13.2 demonstrou um atraso no crescimento de 7 dias em comparação com o tratamento com apenas o anticorpo ou adriamicina (figura 7, painel da direita).
EXEMPLO X: Relação dos Niveis de Anticorpos com a Subregulação do IGF-IR
Os tumores foram induzidos em ratinhos nus, como descrito no exemplo VIII. Os ratinhos foram depois tratados com 125 pg de 2.13.2 por injecção intraperitoneal, como 127 descrito no exemplo VIII. Os tumores foram extraídos e os níveis de IGF-IR foram medidos por ELISA como descrito no exemplo VIII. A figura 8 mostra os níveis de anticorpo 2.13.2 no soro e os níveis do receptor IGF-IR no tempo. A experiência demonstra que o IGF-IR é subregulado pelo anticorpo e que o grau de inibição de IGF-IR é proporcional à dose relativamente à concentração do anticorpo. EXEMPLO XI: Inibição do Crescimento de Tumores 3T3/IGF-IR com Doses Múltiplas de Anticorpo em Combinação com Adriamicina
Os tumores foram induzidos em ratinhos nus, como descrito no exemplo IX. Os ratinhos com tumores subcutâneos estabelecidos com aproximadamente 250 mm3 foram tratados nos dias 1, 8, 15 e 22 com várias quantidades de anticorpo 2.13.2 (i.p.) ou 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.) seja como agentes simples como em combinação, como descrito no exemplo IX. A figura 9 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR aplicado uma vez a cada sete dias inibe o crescimento de células de tumor e intensifica a inibição do crescimento de células do tumor em combinação com adriamicina, um conhecido inibidor de tumores. EXEMPLO XII: Inibição do Crescimento de Tumores Grandes
Os tumores foram induzidos em ratinhos nus, como descrito no exemplo IX. Os ratinhos com tumores grandes subcutâneos estabelecidos com ligeiramente menos que 2000 mm3 foram tratados nos dias 1 e 8 com várias quantidades de anticorpo 2.13.2 (i.p.) ou 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.) seja como agentes simples como em combinação, como descrito no exemplo IX. A figura 10 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. Os grupos de 128 controlo, apenas anticorpo e apenas adriamicina foram terminados no dia 5, altura em que o tamanho do tumor excedeu os 2000 mm3. A experiência demosntra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR em combinação com adriamicina é muito eficaz contra tumores grandes quando administradas doses múltiplas. EXEMPLO XIII: Inibição do Crescimento de Tumores de Células Colorrectais
Os tumores foram induzidos em ratinhos nus, como descrito no exemplo IX, com excepção da utilização de células Colo 205 (ATCC CCL 222) . As células Colo 205 são célula do adenocarcinoma colorrectal humano. Os ratinhos com tumores subcutâneos estabelecidos com aproximadamente 250 mm3 foram tratados com várias quantidades de anticorpo 2.13.2 (i.p.) ou 100 mg/kg de 5-fluorodeoxiuridina (5-FU, i.v.) seja como agentes simples como em combinação, como descrito no exemplo IX. A figura 11 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR administrado uma vez inibe o crescimento de células de cancro colorrectal humano quando apresentado como agente simples e intensifica a eficácia de 5-FU, um inibidor de tumores conhecido.
Os ratinhos com tumores Colo 205 estabelecidos foram tratados nos dias 1, 8, 15 e 22 com 500 pg de 2.13.2 (i.p.), 100 mg/kg 5-FU (i.v.) ou respectiva combinação. A figura 12 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR administrado uma vez a cada sete dias inibe o crescimento de células de cancro colorrectal humano e intensifica a eficácia de 5-FU. 129 EXEMPLO XIV: Inibição do Crescimento de Tumores de Células Cancerígenas da Mama
Ratinhos nus, como descrito no exemplo VIII foram implantados com pellets de estrogénio biodegradáveis (0,72 mg de 17^-estradiol/peIIet, libertação 60 dias; Innovative Research of America). Passads 48 horas, os tumores foram induzidos em ratinhos nus, como descrito no exemplo IX, com excepção da utilização de células MCF-7 (ATCC HTB-22). As células MCF-7 são células do carcinoma da mama humano dependentes de estrogénios. Os ratinhos com tumores subcutâneos estabelecidos com aproximadamente 250 mm3 foram tratados com 50 pg de anticorpo 2.13.2 (i.p.) nos dias 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 e 22 (g3dx7) ou 6,25 mg/kg de taxol (i.p.) nos dias 1, 2, 3, 4, 5 (gldx5) seja como agentes simples como em combinação, essencialmente como descrito no exemplo IX. A figura 13 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR por si só inibe o crescimento de células de cancro da mama humano quando administrado uma vez a cada três dias e intensifica a eficácia do taxol, um inibidor do cancro da mama conhecido, quando adinistrado em combinação.
Os ratinhos com tumores estabelecidos de células MCF-7 como descrito imediatamente acima foram tratados no dia 1 com várias quantidades de apenas anticorpo 2.13.2 (i.p.) ou 3,75 mg/kg de adriamicina (i.v.) essencialmente como descrito no exemplo IX. A figura 14 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um único tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR em si inibe o crescimento de células de cancro da mama humano e 130 intensifica a eficácia da adriamicina, um conhecido inibidor de tumores.
Ratinhos com tumores estabelecidos de células MCF-7 como imediatamente descrito foram tratados com 250 pg de anticorpo 2.13.2 (i.p.) nos dias 1, 8, 15 e 23 ou com um pellet biodegradável de tamoxifen (25 mg/pellet, abse livre, libertação a 60 dias, Innovative Research of America) , seja como agentes únicos ou em combinação, essencialmente como descrito no exemplo IX. O pellet de tamoxifen foi implantado no dia 1, uma vez estabelecido o tumor. A figura 15 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR administrado uma vez a cada sete dias inibe o crescimento do cancro da mama humano e intensifica a eficácia do tamoxifen, um conhecido inibidor de tumores. EXEMPLO XVI: Inibição do Crescimento de Tumores de Células do Carcinoma Epidermóide
Os tumores foram induzidos em ratinhos nus, essencialmente como descrito no exemplo IX, com excepção da utilização de células A431 (ATCC CRL-1555). As células A431 são células de carcinoma epidermóide humano que sobreexpressam EGFR. Os ratinhos com tumores subcutâneos estabelecidos com aproximadamente 250 mm3 foram tratados nos dias 1, 8, 15, 22 e 29 com 500 pg do anticorpo 2.13.2 (i.p.) ou foram tratados uma vez ao dia durante 27 dias com 10 mg/kg de CP-358,774 administrado oralmente (p.o.) seja como agentes simples ou como combinação, como descrito no exemplo IX. CP-358,774 encontra-se descrito na patente norte-americana 5, 747,498 e em Moyer et al., Câncer Research 57: 4838-4848 (1997). 131 A figura 16 mostra o tamanho do tumor em relação aos vários tratamentos no tempo. A experiência demonstra que o tratamento com um anticorpo anti-IGF-IR intensifica a eficácia de CP-358,774, um conhecido inibidor da tirosina quinase, ma inibição do crescimento de um tumor do carcinoma epidermóide humano. EXEMPLO XVII: Farmacocinética dos Anticorpos do Anti-IGF-IR in vivo
Para avaliar a farmacocinética dos anticorpos anti-IGF-IR, injectaram-se macacos caranguejeiros por via intravenosa com 3, 30 ou 100 mg/kg de anticorpo 2.13.2 num tampão de acetato. O soro foi recolhido dos macacos a vários momentos e determinou-se as concentrações de anticorpo anti-IGF-IR nos macacos por um período até dez semanas. Para quantificar os níveis funcionais de anticorpo no soro, o dominio extracelular do IGF-IR humano (IGF-l-sR, R&D Systems, refa Catálogo 391 GR) foi fixado a placas de 96 poços. 0 soro de macaco (diluído entre 1:100 e 1:15,000) foi adicionado às placas de análise de forma que cada amostra se encontraria dentro do intervalo linear da curva padrão e foi incubado nas condições em que o anticorpo anti-IGF-IR se ligaria a IGF-l-sR. Depois de lavadas as placas, adicionou-se um anticorpo IgG humano às placas e incubou-se nas condições em que o anticorpo IgG humano se ligaria ao anticorpo anti-IGF-IR. As placas foram depois lavadas e reveladas e foi utilizada uma curva padrão de controlo e ajustes de regressão linear para quantificar a quantidade de anticorpos anti-IGF-IR. A figura 17 mostra a concentração de 2.13.2 no soro no tempo. A experiência demosntra que a semi-vida do anticorpo anti-IGF-IR é de 4,6 a 7,7 dias e possui um volume de distribuição de 74-105 mL/kg. Além disso, a experiência demonstra que as 132 quantidades administradas são proporcionais à dose no macaco, o que indica que o anticorpo anti-IGF-IR saturou quaisquer locais de ligação ao IGF-IR no corpo, mesmo com a dose menor de 3 mg/kg. EXEMPLO XVIII: Terapia Combinada de Anticorpo anti-IGF-IR e Adriamicina Subregula IGF-IR in vivo
Os tumores foram induzidos em ratinhos nus, como descrito no exemplo IX. Os ratinhos com tumores subcutâneos estabelecidos com aproximadamente 400 mm3 foram tratados com uma única injecção de 250 pg de anticorpo 2.13.2 (i.p.) ou 7,5 mg/kg de adriamicina (i.v.) seja como agentes simples como em combinação, como descrito no exemplo IX. 72 horas após a administração dos agentes, os tumores foram extraídos como descrito no exemplo VIII e quantidades iguais dos extractos do tumor foram sujeitos a electroforese em gel de poliacrilamida dodecilfosfato de sódio (SDS PAGE) e análise de western blot, utilizando o anticorpo anti-IGF-IR SC-713 (Santa Cruz). A figura 18 mostra as quantidades de IGF-IR em células de tumor em animais de controlo (três primeiras pistas de cada painel), em animais tratados só com anticorpo (painel superior), em animais tratados só com adriamicina (painel do meio) e em animais tratados com anticorpo e adriamicina (painel inferior). Cada pista representa quantidades iguais de proteina de tumores individuais de ratinhos individuais. A experiência demonstra que o tratamento só com adriamicina tem pouco efeito nos níveis de IGF-IR e que o tratamento apenas com anticorpo revela alguma diminuição dos níveis de IGF-IR. Surpreendentemente, o tratamento com adriamicina e anticorpo juntos revelam uma diminuição dramática dos níveis de IGF-IR, demonstrando que a adriamicina e o anticorpo subregulam muito os níveis de IGF-IR. 133 LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> ABGENIX, INC. PFI2ER, INC.
<120> ANTICORPOS PARA O RECEPTOR DO FACTOR I DE CRESCIMENTO TIPO INSULINA <130> ABX-PF2 <140> <141 > <150> 60/259,927 <151 >2001-01-05 <160> 60
<170> Patent In Ver. 2.1 <210> 1 <211 >291 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ttagacgtga 60 * atgctgcatc 120 cagaattcac ISO tacagcataa 240 c 291 tgcatctgta ggagacagag tcaccttcac ttgccgggca agtcaggaca tttaggctgg tatcagcaga aaccagggaa agctcctaag cgcctgatct ccgtttacaa agtggggtcc cateaaggtt cagcggcagt ggatctggga tctcacaatc agcagectgc agcctgaaga ttttgcaact tateactgtc taattatcct cggacgttcg gccaagggac cgaggtggaa atcatacgaa <210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens 134 <400>2
Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 1 5 10 15 Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 20 25 30 Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin ser Gly Vai Pro Ser 35 40 45 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser 50 55 60 Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Vai Glu lie Ile Arg 85 90 95 Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105 110
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Aen Phe Tyr 115 120 125
Pro Arg Glu Ala Lys vai Gin Trp 130 13S
<210> 3 <211 >352 <212> ADN <213> Homo sapiens <400>3 gggaggcttg gtcaagcctg gaggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcact €0 ttcagtgaet actatatgag ctggatccgc caggctccag ggaaggggct ggaatgggtt 120
tçataçatta gtagtagtgg tagtaccaga gactacgcag. actctgtgaa gggccgattc ISO accatctcca gggacaacgc caagaactca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 240 gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgtgaga gatggagtgg aaactacctt ttactactac 300 tactacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc ag 3S2 <210> 4 135
<211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>4
Gly Arg Leu Gly Gin Ala Trp Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 1 S 10 15 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ser Tyr Ue Ser Ser Ser Gly Ser 35 40 45 Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 50 55 60 Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 65 70 75 B0 Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Vai Arg Asp Gly vai Glu Thr Thr 8S 90 95 Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Vai Lys Asp Tyr phe Pro Glu Pro vai Thr Vai Ser Trp Asn- Ser 145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ser Cys Ala 165 170 <210> 5 <211> 322 <212> ADN <213> Homo sapiens <400>5 136 gacatccaga tgacccagtt tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct aggttcagcg gcagtggacc tgggacagaa gaagattttg caacttatta ctgtttacaa gggaccaagc tggagatcaa ac ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gcatcccgtt tgcacagagg ggtcccatca 180 ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 cataatagtt acccgtgcag ttttggccag 300 322
<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>6
Asp lie Gin Met Thr Gin Phe Pto Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cye Arg Ala Ser Gin Gly Ile. Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cye Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Cys 85 90 95 Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys
100 10S
<210> 7 <211 >375 <212> ADN <213> Homo sapiens <400>7 137 aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct 60 cctgtaeagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gaactgggtc cgecaggete 120 cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtacc acattctacg 180 cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaggacc acgctgtatc 240 tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca eggccgtata ttactgtgcg aaagatcttg 300 gctggtccga ctcttactac tactactacg gcatggacgt ctggggccaa gggaccacgg 360 tcaccgtctc ctcag <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>8
Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser IS 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 20 25 30
Met Asn Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Vai Ser 35 40 45
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser vai Lye 50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu 85 Lys Asp Leu Gly Trp 100 Val Trp Gly Gin Gly 115
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 90 95
Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp 105 no
Thr Thr Val Thr vai Ser Ser 120
<210> 9 <211 >302 <212> ADN 138 <213> Homo sapiens <400>9 tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga atcagacgtg atctaggctg gtatcagcag catgctgcat cccgtttaca aagtggggtc acagaattca ctctcacaat cagcagcctg ctacagcata ataattatcc tcggacgttc ac gtcaccttca cttgccgggc aagtcaggac 60 aaaccaggga aagctcctaa gcgcctgatc 120 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg 180 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt 240 ggccaaggga ccgaggtgga aatcatacga 300 302
<210> 10 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly A3p Arg vai Thr Phe Thr Cye Arg 15 10 15
Ala Ser Gin Asp Ile Arg Arg Aep Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 20 25 30 Gly Lyd Ala Pro Lya Arg Leu ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gin Ser 35 40 45 Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 50 55 60 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys $5 70 75 00 Leu Gin Uis Asn Asn Tyr Pro Arg Thr phe Gly Gin Gly Thr Glu Vai 85 90 95 Glu Ile Ile Arg <210> 11 <211 >338 100 139 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 gggcccagga ctggtgaagc ctccatcagt aattactact gattgggcgt atctatacca caccatgtca gtagacacgt cgcggaeacg gccgtgtatt ctactggggc cagggaaccc cttcggagac cctgtccctc ggagctggat ccggcagccc gtgggagccc caactacaac ccaagaacca gttctccctg actgtgcggt aacgattttt tggtcaccgt ctcctcag acctgcactg tctctggtgg €0 gccgggaagg gactggagtg 120 ccctccctca agagtcgagt 180 aagctgaact ctgtgaccgc 240 ggagtggtta ttatctttga 300 338 <210> <211> <212> <213> <400> Gly Pro 1 Vai Ser Pro Ala Ser Pro 50 Asp Thr 6S Ala Aep 12 112
PRT
Homo sapiens
Qly Leu Val Lys Pro Ser 5 Gly Gly Ser Ile Ser Asn 20 Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 55 Ser Lys Asn Gin Phe Ser 70 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 10 15 Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin 25 30 Ile Gly Arg He Tyr Thr Ser Gly 45 Lys ser Arg Val Thr Met ser Val 60 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala 75 80 Ala val Thr Ile Phe Gly val Val 90 95
He Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 HO <210> 13 <211 >322 12 140
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgcaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga agcgatttag gctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccaaat tacaeegtgg ggtcccatca 1B0 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagccg cctgcagcct 240 gaagacttcg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctctcac tctcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322
<210> 14 <211>107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14
Asp Ile Gin Met Thr Oln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 S 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Ser Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Hie Arg Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gin Pro 6S 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211 >376
<212> ADN 141 <213> Homo sapiens <400> 15 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggcc ectgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtat cacatactac ISO gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctg 300 ggctacggtg acttttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag 376
<210> 16 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Het Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 — . . . . - 40 - - - - - . . .45. • — — - Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Het Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Gly Tyr Gly Asp Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser ser 115 120 125 <210> 17 142
<211 >279 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 cattagtacc tttttaaatt €0 ccatgttgca tccagtttac 120 gacagatttc actctcacca ISO tcaacagagt Cacaatgccc 240 279 acttgccggg caagtcagag aaagccccta aactcctgat ttcagtggca gtggatctgg gattttgcaa cttactactg accaaggtgg agatcaaac caggagacag agtcaccatc ggtatcagca gaaaccaggg aaggtggggt cccatcaagg tcagcagtct gcaacctgaa eaetcaettt eggcggaggg <210> 18 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18
Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Thr 15 10 IS
Phe Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 20 25 30
Ile His Vai Ala Ser Ser Leu Gin Gly Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser 35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin 50 55 60
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Asn Ala Pro 65 70 75 80
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 85 90 <210> 19 <211 >341 143
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 19 cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcaec tgcactgtct ctggtggctc 60 caccagtagt tactactgga gttggatccg gcagccccca gggaagggac tggagtggat 120 tgggtatatc tattacagtg ggagcaccaa ctacaacccc tccctcaaga gtcgagtcac 180 catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag ctgagttctg tgaccgctgc 240 ggacacggcc gtgtattact gtgccaggac gtatagcagt tcgttctact actacggtat 300 ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgcctcctca g 341 <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 20
Pro Gly 1 Leu Vai Lys 5 Pro Ser Glu Thr Leu 10 Ser Leu Thr Cys Thr 15 Val Ser Gly Gly Ser 20 Ile Ser Ser Tyr Tyr 25 Trp Ser Trp Ile Arg 30 Gin Pro Pro Gly Lye Gly 35 Leu Glu Trp Ile 40 Gly Tyr He Tyr Tyr 45 Ser Gly Ser Thr Asn SO Tyr Asn Pro Ser Leu 55 Lys Ser Arg Vai Thr He 60 Ser Val Asp thr Ser 65 Lys Asn Gin Phe Ser 70 Leu Lys Leu ser 75 Ser Val Thr Ala Ala 80 Asp Thr Ala Vai Tyr 85 Tyr Cys Ala Arg Thr 90 Tyr Ser Ser Ser Phe 95 Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 Aap vai Trp Gly Gin 105 Gly Thr Thr val Thr 110 val Ser
Ser <210> 21 <211 >274 144
<212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221 > base modificada <222> (240) <223> a, c, t, g, outro ou desconhecido <400> 21 agagccaccc cagcagaaae ggcatcccag agactggagc acgttcggcc tctcctgtag ggccagtcag agtgttcgcg gcaggtactt agcctggtac 60 ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg gtgcatccag cagggccact 120 acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 1Θ0 ctgaagattt tgcagtgttt tactgtcagc agtatggtag ttcacctcgn 240 aagggaccaa ggtggaaatc aaac 274
<210> 22 <211 >91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Arg Gly Arg Tyr 15 10 is
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 20 25 30
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 35 40 45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Arg Leu Glu Pro 50 55 50
Glu Asp Phe Ala Vai Phe Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Arg 65 70 75 80
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 85 90 <210> 23 145 <211 >367
<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag tacatactac 1BO gcagactecg tgaagggccg gttcaccatc cccagagaca attccaagaa cacgctgcac 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcca 300 gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcag 367
<210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <210> 26 <400> 24 146 146 Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ser .Gly Ile Hir Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Aep Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 SO Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 25 <211 >320 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 gaactgtggc gaactgccCc ggaaggtgga gcaaggacag aacacaaagt gctccaacag tgcaccatct gtettcatet teccgceatc tgatgageag ttgaaatctg 60 tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt 120 taaegccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca 1BO cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga 240 ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga 300 gggagagtgt 320
<211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 147
Thr Vai Ala Ala Pro Ser vai Phe Ile Pbe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Aen Phe Tyr 20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lye Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80
Hls Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95
Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 27 <211> 978 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 27 gcctccacca agggcccatc agcacagcgg ccctgggctg tggaactcag gcgctctgac ggactctact ccctcagcag taeacetgca acgtagatca aaatgttgtg tcgagtgccc ctcttccccc caaaacccaa gtggtggtgg acgcgagcca gtggaggtgc ataatgccaa gtggtcagcg tcctcaccgt aaggtcteca acaaaggcet cagccccgag aaccacaggt caggtcagcc tgacctgcct gagagcaatg ggcagccgga ggctccttct tcctctacag gtcttcteat gceccgtgat tccctgtctc cgggtaaa ggtctteccc ctggcgccct cctggtcaag gactacctcc cagcggcgtg cacaccttcc cgtggtgacc gtgccctcca caagcccagc aacaccaagg accgtgccca gcaccacctg ggacaccctc atgatctccc cgaagacccc gaggtccagt gacaaagcca cgggaggagc tgtgcaccag gactggctga cccagccccc atcgagaaaa gtacaccctg cccccatcce ggtcaaaggc ttctacccca gaacaactac aagaccacac caagctcacc gtggacaaga gcatgaggct ctgcacaacc gctccaggag cacctccgag 60 ccgaaccggt gacggtgtcg 12o cagctgtcct acagtcctca 1B0 gcaacttcgg cacccagacc 240 tggacaagac agttgagcgc 300 tggcaggacc gtcagtcttc 360 ggacccctga ggtcacgtgc 420 tcaactggta cgtggacggc 480 agttcaacag cacgttccgt 540 acggcaagga gtacaagtgc 600 ccatctccaa aaccaaaggg 660 gggaggagat gaccaagaac 720 gcgacatcgc cgtggagtgg 780 ctcccatgct ggactcegac 840 gcaggtggca gcaggggaac 900 actacaegca gaagagcctc 960 978 148
<210> 28 <211 >326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Ala 1 Ser Thr Lys Gly Pro 5 Ser Val Phe Pro 10 Leu Ala Pro Cys Ser 15 Arg Ser Thr Ser Glu Ser 20 Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu Val Lya 30 Asp Tyr Phe Pro Glu 35 Pro Val Thr Val Ser 40 Trp Asn ser Gly Ala 45 Leu Thr Ser Gly Vai 50 Hia Thr Phe Pro Ala 55 val Leu GlD Ser Ser 60 Gly Leu Tyr Ser 149
Leu Ser Ser val val Thr Val Pro 65 70 Tyr Thr Cys Αβη Val Aep His Lys 65 Thr Vai Glu Arg Lys Cye Cys Val 100 Pro Vai Ala Gly Pro Ser Val Phe 115 120 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 130 135 vai Ser His Glu Αβρ Pro Glu val 145 150 Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 165 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser val 160 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 195 200 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 210 215 Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 225 230 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val 245 Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 260 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 295 280 Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp 290 295 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 305 310 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 32S
Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 75 80 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 90 95 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 105 110 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 125 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 140 Gin Phe Aeh Trp Tyr* Val Asp Gly 155 160 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 170 175 Leu Thr val val His Gin Asp Trp IBS 190 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 205 Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 220 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 235 240 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 250 255 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 265 270 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 285 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser cys 300 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 315 320 <210> 29 <211 >296
<212> ADN 150 <213> Homo sapiens <400> 29 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtggtagcac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagectgag agccgaggac aeggeegtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 30 <211 >98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val OS 40 4S Ser Tyr ile Ser Ser ser Gly ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser val SO 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Αβη Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 31 <211 >296 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 31 151 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggagge tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ccagggaagg ggetggagtg ggtctcagct gcagactccg cgaagggccg gttcaccatc ctgeaaatga acagcctgag agccgaggac ttggtacagc ctggggggtc Gctgagactc 60 agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 attagtggta gtggtggtag cacatactac ISO tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 acggccgtat attactgtgc gaaaga 296
<210> 32 <211 >98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys
<210> 33 <211 >296 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 33 152 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagtaact ggtggagttg ggtccgccag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc atagtgggag caccaactac 18 o aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 286
<210> 34 <211 >98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>
Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Zle Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu SO 55 60 Lys Ser Arg Vai Thr rie Ser Vai Asp Lys Ser Lys Asn Gin Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 35 <211 >293 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 35 153 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 aectgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atetattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gecgtgtatt actgtgcgag aga 293
<210> 36 <211 >97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>
Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn' Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 36 **
<210> 37 <211 >290 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 154 154 aagagccacc 60 ccagcagaaa 120 tggcatccca 180 cagactggag 240 290 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc
<210> 38 <211 >96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Glu ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 4S lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Arg Leu Glu 65 70 75 BO Pr o Glu Aap Phe -Aia- Vai Tyr Tyr- Cys Gin Gin- Tyr Gly- Ser ser Pro - - 85 90 95
<210> 39 <211 >288 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221 > base modificada <222> (288) 155 <223> a, c, t, g, outro ou desconhecido <400> 39 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa gaagattttg caacttatta ctgtctacag ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 aatgattcag gctggtatca gcagaaacca 120 gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 cataatagtt accctccn 288 <210> 40 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Aan Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lye Pro Gly Lye Ala Pro Lye Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin His Asn Ser Tyr Pro Pro 85 90 95
<210> 41 <211 >288 <212> ADN <213> Homo sapiens 40 156 <400> 41 gacatccaga tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct aggttcagtg gcagtggatc gaagattttg caacttacta tccatcctcc ctgtctgcat gagcattagc sgctatctaa gatctatgct gcatccagtt tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag agttacagta ctgtaggaga cagagtcacc 60 attggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 cccctcch 288 <210> 42 <211 : >96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro l 5
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg 20
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 50 55
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys BS
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15
Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 25 30
Gly LyB Ala Pro Lys Leu Leu Ile 45
Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80
Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 90 95
<210> 43 <211 >293 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 43 157 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccç 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt atctatacca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccacgtca gtagacacgt ccaagaacea gccccccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aga 293
<210> 44 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>
Gin Vai 1 Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Pro Gly 10 Leu Vai Lys Pro Ser 15 Glu Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr vai Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp 35 Ile Arg Gin Pro 40 Ala Gly Lya Gly Leu 45 Glu Trp ile Gly Arg 50 lie Tyr Thr Ser Gly 55 Ser Thr Asn Tyr Asn 60 Pro Ser Leu Lys
Ser Arg-Vai Thr Met Ser- Val-Asp Thr -Ser-Lys-. Asn GlnP-he-Ser. Leu...... 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 44
Arg
<210> 45 <211 >470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 158
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Vai Gin Cys Glu val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Aan Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Vai Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Trp Ser Asp Ser Tyr Tyr Tyr Tyr 11S 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 159
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 ias 190 Gly vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys 225 230 .... — -- 235 ---- ·- ' - - · ' 240 Thr Val Glu Arg Lye Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 250 265 270 Thr Leu «et Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Vai Glu Val His Aon Ala Lye Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 305 310 315 320 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 32S 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lye Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380 Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 40S 410 415 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 160
Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470
<210> 46 <211 >470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala ile Leu Lys Gly 1 5 10 IS vai Gin Cys' Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin. 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Vai Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Aap Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 »5 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 145 150 155 160 Ser Thr ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 phe Pro Glu Pro Vai Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser ISO 185 190 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Vai val Thr val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asa Vai Aep Hie Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 23S 240 46 162
Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Val 245 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 260 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 Vai Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser val 325 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 420 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 Ser Val Met HiS Glu Ala Leu His 450 455 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470
Glu Cys Pro pro Cys Pro Ala Pro 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 265 270 Glu Val Thr Cys Val val val Asp 285 Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 315 320 Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp 3-30 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 345 350 Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 395 400 Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 425 430 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 445 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 460
<210> 47 <211 >236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 163
Met 1 Asp Met Arg Vai 5 Pro Ala Gin Leu Leu Gly 10 Leu Leu Leu Leu IS Trp Phe Pro Gly Ala 20 Arg Cys Asp Xle Gin 25 Met Thr Gin Phe Pro 30 Ser Ser
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys so ss 60 Ala Pro Lys Arg Leu lie Tyr Ala Ala Ser Arg Leu His Arg Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 100 105 110 HÍB Asn Ser Tyr Pro Cys Ser Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 ' " 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe Ile phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val A&p Asn Ala Leu 165 170 175 Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Aap Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 48 <211 >236
<212> PRT 164 <213> Homo sapiens <400>
Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Oln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 IS
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 100 105 110 His Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn 145 — ISO · 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Oln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 49 <211 >470 165
<212> PRT <213> Homo sapiens <400>
Met 1 Glu Phe Gly Leu S Ser Trp Val Phe Leu Val 10 Ala lie Ile Lye 15 Gly val Gin Cys Gin 20 Ala Gin Leu Val Glu Ser Gly 25 Gly Gly Leu 30 Val Lys Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe Ser Asp SO Tyr Tyr Met Ser Trp SS Ile Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu Glu 6S Trp val ser Tyr Ile 70 Ser Ser Ser Gly Ser 75 Thr Arg Asp Tyr Ala 80 Asp Ser Val Lys Gly as Arg Phe Thr Ile Ser Arg 90 Asp Asn Ala Lys 95 Asn 49 166
Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Gly Val Glu Thr Thr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys ser Arg 145 150 155 160 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 IBS 190 Gly vai Hls Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr Thr Cys Asn Val Asp Hls Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Thr Vai Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys.Pro Ala Pro 245 250 255 Pro Vai Ala Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 26S 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Vai Glu val Hls Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn 30S 310 315 320 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val val Hls Gin Asp Trp 325 330 33S Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 340 34S 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380
Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 167
Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lye Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Met Leu Αβρ Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr vai Asp Lye Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 435 440 445 Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470
<210> 50 <211 >473 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 168
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile ile Lys Gly 1 s 10 15 val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Ttp val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg val Leu Arg Phe Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165 170 175 Lys Aap Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 160 185 190 169
Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser ser Gly 195 200 205 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 210 215 220 Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240 vai Asp Lys Thr vai Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 2 85 Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 vai Asp Gly Vai Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GlU 505 310 315 320 Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 32S 330 335 Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys 340 345 350 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 370 375 3S0 Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 3B5 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys* Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 51 <211 >236 170
<212> PRT <213> Homo sapiens
Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp. Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gin Asp Ile Arg Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu lie Tyr Ala Ala Sei: Arg Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 100 105 110 His Αεη Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Glu Val Glu Ile 115 120 125 Ile Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gin Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser val val Cye Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 19S 200 205 Glu Lye His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 52 <211 >236
<212> PRT 171 <213> Homo sapiens <400> 51 <400> 52
Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cya Asp 20
Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp 35
Oln Gly Ile Arg Asn Asp Leu 50 55
Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr 65 70
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 íle Ser ser Leu Gin Pro Glu 100
His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr 115
Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 130 135
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 145 150
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 165
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 180
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 195
Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala 210 215
Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe 225 230
Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 25 30
Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg 40 45
Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 60
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 75
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 90
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 105 110
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai 120 125
Ser Vai Phe ile Phe Pro Pro 140
Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu 155
Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn 170
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 185 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 200 205
Cys Glu Val Thr His Gin Gly 220
Asn Arg Gly Glu Cys 235
Ser Ser Ala Ser Gly Lys Gly Val 80 Leu Thr 95 Leu Gin Glu Ile Ser Asp Asn Asn 160 Ala Leu 175 Lys Asp Asp Tyr Leu Ser 172
<210> 53 <211 >326 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência concenso <22 0> <221 > base modificada <222> (289) <223> a, c, t, g, outro ou desconhecido <400> 53 gacatecaga tgacccagty tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagccacc 60 wtcacttgcc gggcaagtca ggrcattaga mrtgatttag gctggtwtca gcagaaacca 120 gggaaagcyc ctaagcgcet gatctatgct gcatccmrwt trcammgwgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcmg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatca ctgtytacar cataatartt ayeekybsns kctyggcsrr 300 gggaccrags tggaratcaw acgaac 326
<210> 54 <211 >322 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência concenso <400> 54 173 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgyaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcateagy asctwtttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaarctcct gatcyacgyt gcatccagtt trcaargtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacartr ccccayychc tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322
<210> 55 <211 >325 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência concenso <22 0> <221 > base modificada <222> (291) <223> a, c, t, g, outro ou desconhecido <400> 55 gaaattgtgt ctctcctgya cctggccagg gacaggttca cctgaagatc eaagggacca tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 gggccagtca gagtgttmgc rgcagstact tagcctggta ccagcagaaa 120 ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcateeca 180 gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 ttgcagtgtw ttactgtcag cagtatggta gytcacctca nacgttcggc 300 aggtggaaac caaac 325
<210> 56 <211 >376 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 174 <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência concenso caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacyttcagt gactactaya tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggartg ggtttcatac attagtagta gcggtagtac cakakactac 180 gcagactctg tgaagggccc attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgy gagagatgga 300 gtggaaacta ctttttacta ctactactac ggtatggacg tetggggcca agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcag 376
<210> 57 <211 >358 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência concenso <220> <221 > base modificada <222> (337)
<210> 59 <211 >364 <212> ADN desconhecido ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 arttactact ggagctggat ccggcagccc 120 atctatacca gtgggagcmc caactacaac 180 gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 gccgtgtatt actgtgcggt aacgattttt 300 cagrganccc tggtcaccgt ctcctcag 3S8 <223> a, c, t, g, outro ou <400> 57 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt gecgggaagg gactggagtg gattgggcgt ccctccctca agagtcgagt caccatgtca aagctgaret ctgtgaccge cgcggacacg ggagtggtta ttatctctga ctactggggc 175
<210> 58 <211 >418 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <400> 56 <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência concenso <400> 58 caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtrcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgarctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaget attaetggka gtggtggtab yacatwctac ião gcagactccg tgaagggccc gttcaccatc tccagagaca attccargam cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatctk 300 ggctrsksyg actyttacca etactactac ggtatggacg tctggggcca agggacyacg 360 gtgattatga gttggttcga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 418 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagytggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtac atctattaca gtgggagcac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgact caccatatca gtagaeacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagyt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgccag gacgtatagc 300 agttcgttct actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tcag 364
<210> 60 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Ligante Gli-
Ser 176 <400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly .Gly Gly Ser 1 5 10 15 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência concenso <400> 59 177
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o EPO rejeita toda a responsabilidade a este respeito.
Documentos de patente citados na descrição:
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WO 9802438 A
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Lisboa, 13/07/2010

Claims (25)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal humano ou respectiva porção de ligação ao antigénio que se liga especificamente ao receptor do factor de crescimento I semelhante a insulina (IGF-IR), em que o anticorpo mencionado ou respectiva porção inibe a ligação de IGF-I ou IGF-II a IGF-IR e inibe o crescimento tumoral in vivo, e em que o anticorpo mencionado ou respectiva porção de ligação ao antigénio compreende as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de uma cadeia pesada e as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de uma cadeia leve, em que a cadeia pesada e cadeia leve mencionadas são: a) a cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo 2.13.2 N° depósito ATCC PTA-2788) ou b) a cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo 4.9.2 N° depósito ATCC PTA-2789) ou c) uma cadeia pesada compreendendo a região variável com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 e uma cadeia leve compreendendo a região variável com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 d) uma cadeia pesada compreendendo a região variável com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a região variável com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14 ou e) uma cadeia pesada compreendendo a região variável com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 45 sem a sequência de sinal e uma cadeia leve compreendendo a região variável com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 47 sem a sequência de sinal. 2
2. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o IGF-IR é humano.
3. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio possui pelo menos uma propriedade seleccionada a partir do grupo constituído por: a) não se liga a IGF-IR de cão ou coelho; b) liga-se a IGF-IR de Macaca mulatta ou de Macaca fascicularisi, mas não ao IGF-IR de sagui; c) possui uma selectividade para IGF-IR que é pelo menos 50 vezes maior do que a selectividade para o receptor de insulina, d) provoca o desaparecimento de IGF-IR da superfície celular quando incubado com uma célula que expressa IGF-IR; e) inibe a fosforilação da tirosina induzida por IGF-IR; f) liga-se a IGF-IR com uma Kd de 8 x IO”9 M ou menos e g) possui uma taxa de dissociação para IGF-IR de KQff de 10”4s_1 ou menor.
|4 Tempo (h) I Mancha anti-ptyr
Mancha anti-IGFIR FIG. 4 10/25
FIG. 5
Ο 250 500 750 1000 Dose (μ9)FiG. 6 11/25
cuíiíí jouiíií ομ οτ| ussuikx 12/25 Tratamento: dose 125 μg
FIG. 8 13/25 Πaa u 9 B 9 'ã © Xi s «
—♦— Veículo —62.5 Mg 2.13.2 + Adria 250 Mg 2,13.2 +- Adria 31 >25 μδ 2.13,2 -í- Adria 125 Mg 2.13.2 + Adria 500 Mg 2.13.2 7.5 mg/kg Adria FIG. 9 14/25 5000 -] 4500 - 3 4000 - S 3500 - O S s 3000 - o 2500 - 2000 - se i 1500 * 3000 - 500 - 0 -4 Ο Controlo 500 2.13.2
Γ-——ι -1— -i—--r......' '—r—— i-c-----------1 1 1 234 56789 10 11 Tempo, dias FIG. 10 15/25
CUItCí JUdiri} Op OÍ[tiRUf0£ LL.
4. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio possui todas as propriedades mencionadas.
5. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio possui pelo 3 menos uma propriedade seleccionada a partir do grupo constituído por: a) competição cruzada para ligação ao IGF-IR com o anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2; b) liga-se ao mesmo epítopo de IGF-IR que o anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2; c) liga-se ao mesmo antigénio que o ligado ao anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2; d) liga-se ao IGF-IR com substancialmente a mesmo Kd que o anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2 e e) liga-se ao IGF-IR com substancialmente a mesma taxa de dissociação que o anticorpo 2.13.2 ou 4.9.2.
6. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com a reivindicação 5, em que o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio compreende todas as propriedades mencionadas.
7. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio inibe a ligação entre o IGF-IR e IGF-I ou IGF-II com uma IC50 inferior a 100 nM.
8 Τ“ i 24/25
8. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio uma região variável de um cadeia leve k, compreendendo a sequência da região variável mencionada da cadeia leve κ mencionada não mais de dez alterações de aminoácido em relação à sequência de 4 aminoácidos codificada por um gene Vk A30 da linha germinal.
9. Anticorpo ou respectiva porção que se liga ao antigénio de acordo com a reivindicação 8, em que a região variavel da cadeia leve κ compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 14 ou uma sequência de aminoácidos derivada daquelas com 1 a 10 inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos.
10. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio mencionado compreende uma região variável de um cadeia pesada, compreendendo a sequência da região variável mencionada não mais de oito alterações de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos codificada pelo gene VH DP47 da linha germinal.
11. Anticorpo ou respectiva porção que liga ao antigénio de acordo com a reivindicação 10, em que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 16 ou uma sequência de aminoácidos derivada daquelas com 1 a 10 inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos.
12. Anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualquer um das reivindicações 1 a 11, que é a) uma imunoglobulina G (IgG), uma molécula de IgM, de IgE, de IgA ou de IgD ou é derivada destas ou b) um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um anticorpo de cadeia simples, um 5 anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo biespecífico.
13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é 2.13.2 (N° Depósito ATCC PTA-2788) ou 4.9.2 (N° Depósito ATCC PTA-2789) .
14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo mencionado compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, e em que as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve são: a) a sequência de aminoácidos da cadeia pesada e a sequência de aminoácidos da cadeia leve de 4.9.2 (N° Depósito ATCC PTA-2789) ou b) a sequência de aminoácidos da cadeia pesada e a sequência de aminoácidos da cadeia leve de 2.13.2 (N° Depósito ATCC PTA-2788) ou c) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 sem a sequência de sinal e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 sem a sequência de sinal.
15. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualquer um das reivindicações 1 a 14 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
16/25
FIG. 12 17/25
Dias FIG* Ϊ3 18/25
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£tmu jftiuniop oqueuriíx 19/25
Tempo, dias FiG. 15 20/25
Controlo 3K- 500 ng Ab (2.13.2) 10 mg/kg CP-3S8774 10 mg/kg CP-3 58774 + Ab FIG. 16 21/25
Ceff 22/25 Tumores de controlo Tumores tratados Tratado com 2.13.2
Tratado com adriamicina
Tratado com 2.13.2 + adriamicina FIG. 18 23/25 Λ ο Μ «3 £ 2 1 ·+* US 5 W O O o O 1 Ί s; 2U 9 < O ή i o O « Β υ Ο ί« a· çç> ·# «3 3 S . S U i 'a - Ol H 03 <n ·§ υ £ .2 (C q. 3 1 s 3: § ~ O O O o CM CM CM <u : 0 H « . «0 CM. Sm Π ri j» ^5 «ã FÍ M , sf> CM l· ÍN ? • CJ 3 #
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, compreendendo ainda um agente antineoplásico, quimioterapêutico, anti-angiogénico ou anti-tumoral.
17. Processo de preparação do anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualquer um das reivindicações 1 a 14 compreendendo as fases: 6 a) imunização de um mamífero não humano com um agente imunogénico, compreendendo IGF-IR, sendo o mamífero capaz de expressar anticorpos humanos em células B do animal; b) isolamento das células B a partir do mamífero; c) rastreio das células B ou linhas de células derivadas destas para identificar uma linha de células que produz anticorpos que se ligam ao IGF-IR; d) cultura da linha de células que expressa anticorpos que se ligam a IGF-IR e e) isolamento dos anticorpos que se ligam a IGF-IR a partir da linha de células.
18. Linha de células isolada que produz o anticorpo de acordo com qualquer um das reivindicações 1 a 14.
19. Linha de células de acordo com a reivindicação 18 que produz o anticorpo 2.13.2 (N° Depósito ATCC PTA-2788) ou 4.9.2 (N° Depósito ATCC PTA-2789) ou um anticorpo com as mesmas sequências de aminoácidos que 2.13.2 ou 4.9.2.
20. Utilização de um anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 para a preparação de um medicamento de diagnóstico da presença ou localização de um tumor que expressa IGF-IR num sujeito necessitado deste.
Utilização do anticorpo ou respectiva porção de ligaçao ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 para a preparação de um 7 medicamento destinado ao tratamento do cancro num ser humano.
22. Utilização do anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio de acordo com qualguer uma das reivindicações 1 a 14 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de um doente necessitado deste.
23. Utilização de acordo com a reivindicação 21 ou 22, compreendendo o medicamento mencionado ainda um agente antineoplásico, anti-tumoral, anti-angiogénico ou quimioterapêutico.
24. Molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma cadeia pesada ou respectiva porção de ligação ao antigénio e uma cadeia leve ou respectiva porção de ligação ao antigénio de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
25. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 24, compreendendo a molécula de ácido nucleico: a) uma sequência de ácido nucleico que codifica as três sequências CDR da cadeia pesada do anticorpo 2.13.2 (N° Depósito ATCC PTA-2788) ou 4.9.2 (N° Depósito ATCC PTA-2789) ou b) uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia pesada ou respectiva porção de ligação ao antigénio do anticorpo 2.13.2 (N° Depósito ATCC PTA-2788) ou 4.9.2 (N° Depósito ATCC PTA-2789) ou 8 c) uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou 16 ou d) a sequência de ácido nucleico da SEQ ID N° 7 ou 15; em que a molécula de ácido nucleico mencionada compreende opcionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.
26. Molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 24, compreendendo a molécula de ácido nucleico: a) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica as três sequências CDR da cadeia leve do anticorpo 2.13.2 (N° Depósito ATCC PTA-2788) ou 4.9.2 (N° Depósito ATCC PTA-2789) ou b) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos da cadeia leve ou respectiva porção de ligação ao antigénio do anticorpo 2.13.2 (N° Depósito ATCC PTA-2788) OU 4.9.2 (N° Depósito ATCC PTA-2789) OU c) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou 14 ou d) a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID N° 5 ou 13; em que a molécula de ácido nucleico mencionada compreende opcionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
27. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, em 9 que o vector compreende opcionalmente uma sequência de controlo da expressão ligada de modo funcional a uma molécula de ácido nucleico.
28. Célula hospedeira que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou respectiva porção de ligação ao antigénio e uma cadeia leve ou respectiva porção de ligação ao antigénio de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
29. Método de preparação de um anticorpo anti-IGF-IR ou respectiva porção de ligaçãp ao antigénio, compreendendo a cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 28 ou da linha de células de acordo com a reivindicação 18 em condições adequadas e recuperação do anticorpo ou respectiva porção de ligação ao antigénio mencionado.
30. Animal transgénico não humano que compreende sequências de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada ou respectiva porção de ligação ao antigénio e a cadeia leve ou respectiva porção de ligação ao antigénio de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o animal transgénico não humano expressa as sequências de ácido nucleico mencionadas.
31. Utilização de uma molécula de ácido nucleico isolada, que codifica a cadeia pesada ou respectiva porção de ligação ao antigénio e uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia leve ou respectiva porção de ligação ao antigénio ou uma molécula de ácido 10 nucleico isolada que codifica as cadeias leve e pesada ou respectivas porções de ligação ao antigénio de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de um sujeito com cancro.
32. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da região variável da SEQ ID NO: 8 ou a sequência mencionada com até cinco substituições conservadoras de aminoácidos e a sequência de aminoácidos da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da região variável da SEQ ID NO: 6 ou a sequência mencionada com até cinco susbtituições de aminoácidos.
33. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 32, em que a sequência de aminoácidos da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da região variável da SEQ ID NO: 8 e a sequência de aminoácidos de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da região variável da SEQ ID NO: 6.
34. Anticorpo monoclonal humano que se liga especificamente a IGF-IR, em que a cadeia pesada do anticorpo mencionado consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 sem a sequência de sinal e a cadeia leve do anticorpo mencionado consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 sem a sequência de sinal. Lisboa, 13/07/2010 1/25 2.13.2Κ Α30 2.Χ4.3Κ 2.12.1Κ 4.9.2Κ Consensus GACATCCAGA TGACCCAGTT TCCATCCTCC CTGTCrGCAT CTGTAGGAGA GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCrGCAT CTGTAGGAGA ------------------------TCCTCC CTGTC TGCAT CTGTAGGAGA ---------- rGCAT CTGTAGGAGA GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCrGCAT CTGTAGGAGA GACATCCAGA TGACCCAGTY TCCATCCTCC CTGTorGCAT CTGTAGGAGA CDR1 50 50 26IS 50 50 2.13.2K A30 2.14.3K 2.12.1K- 4.9.2K Consensus Γ CAGAGTCACC CAGAGTCACC CAGAGTCACC CAGAGTCACC. CAGAGTCACC CAGAGTCACC A A T T A h rCACTTGOC rCACTTGCC rCACTTGCC rCACTTGCC rCACTTGCC rCACTTGCC gggcaagtca gg GGGCAAGTCA GG GGGCAAGTCA GG GGGCAAGTCA GG GGGCAAGTCA GG GGGCAAGTCA GG 3 3 A 5 B CATTAGA CATTAGA CATTAGA CATTAGA CATTAGA CATTAGA S CG cg AG MH TGATTTAG rGATTTAG TGATTTAG rGATTTAG rGATTTAG rGATTTAG 100 100 76 65 100 100 2.13.2K A30 2.14.3K 2.12.1K 4.9.2K Consensus GCTGGl GCTGGT ft ΓΟΑ GCAGAAACCA GGGAAAGC Z C CTAAGCGCCT GATCTA K3CT TCA GCAGAAACCA GGGAAAGC ' 2 CTAAGCGCCT GATCTATGCT GCTGGTferCA GCAGAAACCA. GGGAAAGC I 2 CTAAGCGCCT GATCTATGCT GCTGGl& TCA GCAGAAACCA GGGAAAGCIC CTAAGCGCCT GATCTATGCT GCTGGlIΓΟΑ GCAGAAACCA GGGAAAGC:C CTAAGCGCCT GATCTATGCT GCTGGTWTCA GCAGAAACCA GGGAAAGCMC CTAAGCGCCT GATCTATGCT CDR2 150 150 126 115 150 150 2.13.2K Ά30 2.14.3X2.12.1K 4.9.2K Consensus GCATCC GCATCC />( vvn A. GCATCC GCATCC GCATCC
GGTCCCATCA GGTCCCATCA GGTCCCATCA GGTCCCATCA GGTCCCATCA GGTCCCATCA AGGTTCAGCG AGGTTCAGCG AGGTTCAGCG AGGTTCAGCG AGGTTCAGCG AGGTTCAGCG GCAGTGGATC GCAGTGGATC GCAGTGGATC GCAGTGGATC GCAGTGGATC GCAGTGGATC 200 200 nc *. t w 165 200 200 2.13.2K A30 2.14.3K 2.12.1K 4.9.2K Consensus TGGGACAGAA TGGGACAGAA TGGGACAGAA TGGGACAGAA TGGGACAGAA TGGGACAGAA TTCACTCTCA TTCACTCTCA TTCACTCTCA TTCACTCTCA TTCACTCTCA TTCACTCTCA CAATCAGC A 3 CCTGCAGCCT CAATCAGCA 3 CCTGCAGCCT CAATCAGCΛ 3 CCTGCAGCCT CAATCAGCA 3 CCTGCAGCCT CAATCAGC : 3 CCTGCAGCCT CAATCAGC H3 CCTGCAGCCT GAAGATTTTG GAAGATTTTG GAAGATTTTG GAAGATTTTG GAAGATTTTG GAAGATTTTG 250 250 226 215 250 250 CDR3 2.13.2K A30 2.14.3K 2.12.1K 4.9.2K Consensus CAACTTATTA CAACTTATTA CAACTTATTA CAACTTATTA CAACTTATTA CAACTTATTA ItlíTACA A AC A 3 'ACA 3 AC A 3 TGltfTACA 3 TGT i TACA R CTG' CTG' CTG' CTGitír, c C1 300 288 276 265 300 300 TfTTTGGCCAG GTTCCGCCAA GTTCGGCCAA TTTCGGCGGA KTTYGGCSRR CSTGCÍ CATAATApjTT CATAAT, CATAATAb CATAATA A CATAATA j ΓΤ AttXtrC1 CATAATA 3 ΓΤ AKCCK' Αρ ΓΤ ΓΤ ΓΤ a: ci a: cd· AG •TCCN- dcqrcGGAc GGAC TC AC YBSNS iccrc 2.13.2K GGGACCAAGC TGGAGATCAA AC---- 322 A30 -------------------------- 288 2.14.3K GGGACCGAGG TGGAAATCAT ACGAAC 302 2.12.1K GGGACCGAGG TGGAAATCAT ACGAAC 291 4.9.2K GGGACCAAGG TGGAGATCAA AC---- 322 Consensus GGGACCRAGS TGGARATCAW ACGAAC 326 FIG. IA 2/25 4.17.3Κ - 01-2 -- -Consensus 7 50.. 50 --------------------------------------------AGGAGA GAGATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGT AGGAGA GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGYlAGGAGA CDR1 4.17.3K 012 Consensus CAGAGTCACC ATCACTTGC CAGAGTCACC ATCACTTGC CAGAGTCACC ATCACTTGC C GGGCAAGTCA GAGCATTAGT C GGGCAAGTCA GAGCATTAGC C GGGCAAGTCA GAGCATTAGY A A A 21 21 ÇT ΓΤΤΑΑ ΓΤΤΑΑ ΓΤΤΑΑ 57 100 100 4.17.3K 012 Consensus attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaaa:tcct gatc : at : i r ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAA Q CTCCT GATC IATC C Γ ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAA R STCCT GATC Ϊ ATG Sí Γ 107 150 150 CDR2 4.17.3K 012 Consensus GCATCCAGTT Tí GCATCCAGTT T GCATCCAGTT T CAA CA A ÍCAA 3 A R K3G GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC 5TGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC 157 200 200 4.17.3K 012 Consensus 4.17.3K 012 Consensus TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CDR3 CAACTTACTA CTGT CAACAG AGTTACA f T 3 CCCC iCTfc CAACTTACTA CTGTCAACAG AGTTACA ’ T \ CCCC-TC 3 CAACTTACTA CTGTCAACAG AGTTACA = T * CCCC AYYE \C\ i- 1C TTTCGGCGGA TTTCGGCGGA 207 250 250 257 288 300 4.17.3K GGGACCAAGG TGGAGATCAA AC 279 012 ---------------------- 288 Consensus GGGACCAAGG TGGAGATCAA AC 322 FIG. 1B 3/25 6.1.1Κ Α27 Consensus GAÀÃTTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA .50 GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 50 CDR1 6-1-1K A27 Consensus -Jagagccacc CTCTCCTGIA A|AGAGCCACC CTCTCCTGIA íAGAGCCACC CTCTCCTGy GGGCCAGTCA GAGTGTT : 5C G 3CA( GGGCCAGTCA GAGTGTT k 3C AXA |A GGGCCAGTCA GAGTGTT&jsC |l?fecA‘ G3Pi .cir,,G3r, 'ACT 'ACT 'ACT 49 100 100 6.1.1K A27 Consensus TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT 99 150 150 6.1.1K A27 Consensus CDR2 ΕΞΖΞΞΞΞΞΞΞΞΖΙ_ GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA GACAGGTTCA GTGGCAGTGG 149 200 200 6.1.1K A27 Consensus GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCTGAAGATT GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCTGAAGATT GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG CCTGAAGATT CDR3 199 250 250 6.1.1K A27 Consensus TTGCAGTGTΓ TTGCAGTGTA .TTGCAGTGT 4 NAC(jrTCGGC TTACTGTCAG CAGTATGGTA GITCACCTC 3 TTACTGTCAG CAGTATGGTA G 3 TCACCTC 2 ---------- TTACTGTCAG CAGTATGGTA dvíTCACCTcIs NACGTTCGGC 249 290 300 6.1.1K CAAGGGACCA AGGTGGAAAT CAAAC 274 A27 ------------------------- 290 Consensus CAAGGGACCA AGGTGGAAAT CAAAC 325 FIG. 1C 4/25 -----------------------GGGAGGC TTGGTCAAGC CTGGA-SGTC CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGCGGGAGGC TTGGTCAAGC CTGGA]3GTC CAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGqGGGAGGC TTGGTCAAGC CTGGAÇ GGTC CDR1 CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CAi CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CA< CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CAI CITTCAGT IGACTACTAI A ,C 2 TTCAGT gactacta:a ,C Ϊ TTCAGT GACTACTA ϊ A XL TGACfcl x::otãc TGGAT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGAATG GGTTTC, TGAGCTGGAT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGA 3 TG GGTTTCATAC TGAGCTGGAT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GGCTGGA P TG GGTTTCATAC CDR2 3cLc ATTAGTAGTA GTGGTAGTAC CA: A 3 ACTAC GCAGACTCTG TGAAGGGCCG ATTAGTAGTA GTGGTAGTAC CAIAIACTAC GCAGACTCTG TGAAGGGCCG ATTAGTAGTA GTGGTAGTAC CAMAy ACTAC GCAGACTCTG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGGGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA ATTCACCATC TCCAGGGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA ATTCACCATC TCCAGGGACA ACGCCAAGAA CTCACTGTAT CTGCAAATGA GAGíKA TGGA GAGAGA---- GAGACA IOGA ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTG Γ ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTG; ACAGCCTGAG AGCCGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTG^ CDR3
TCTGGGGCCA GTGGAAACTA CTTTTTACTA CTACTACTAC GGTATGG GTGGAAACTA CTTTTTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAG AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAG FIG. 2A 305/25 PF2-2.14.3H.DNAνιν-4/4.35 Consensus ...................- GGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC GGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC | GGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC _CDR1 50 50 PF2-2.14.3H.DNA VIV-4/4.35 Consensus CCTGTCCCTC ACCTGCACTG CCTGTCCCTC ACCTGCACTG CCTGTCCCTC ACCTGCACTG CDR1 TCTCTGGTGG CTCCATCAGT TCTCTGGTGG CTCCATCAGT TCTCTGGTGG CTCCATCAGT '/ t PTACTACT tCTTACTACT 11 TTACTACT 80100 100 PF2-2.14.3H.DNA VIV-4/4.35 Consensus Ãg^tgga ggagcTggat ccggcagccc GGAGCTGGAT CCGGCAGCCC GGAGCTGGAT CCGGCAGCCC sJ:gt GCCGGGAAGG GACTGGAGTG GATTGGCfcGT GCCGGGAAGG GACTGGAGTG GATTGGGCGT GCCGGGAAGG GACTGGAGTG GATTGGGCGT 130 150 150 CDR2 PF2-2.14.3H. DNA VIV-4/4.3S Consensus ATCTATACCA GTGGGAGC atctatacca gtgggag ATCTATACCA GTGGGAG MC CAACTACAAC CCCTCCCTCA AGftGltGAGT CAACTACAAC CCCTCCCTCA AGAGTCGAGT CAACTACAAC CCCTCCCTCA AGAGTCGAGT 180 200 200 PF2-2.14.3H.DNA VIV-4/4.35 Consensus CACCATGTCA GTAGACACGT ccaagaacca gttctccctg aacctc, CACCATGTCA GTAGACACGT CCAAGAACCA GTTCTCCCTG AAGCTGAt CACCATGTCA GTAGACACGT CCAAGAACCA GTTCTCCCTG AAGCTGflHCT :t 3CT íí PC' 230 250 250 PF2-2.14.3H.DNA VIV-4/4.35 Consensus JÃ CTGTGACCGC CGCGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGOfcT AÍACGATTTTT CTGTGACCGC CGCGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCC ------------ CTGTGACCGC CGCGGACACG GCCGTGTATT ACTGTQCqST AACGATTTTT CDR3_____ 280 288 300 PF2-2.14.3H.DNA VIV-4/4.35 Consensus Ãctggggc <á GGAGTGGTTA TTATCTTTGA CTAC GGAGTGGTTA TTATCTTTGA CTACTGGGGC C$ ACCC TGGTCACCGT B----—.....— NCCC TGGTCACCGT 330 294 350 PF2-2.14.3H.DNA CTCCTCAG 338 VIV-4/4.35 ........ 294 Consensus CTCCTCAG 358 FIG 2B 6/25 6.1.1Η 4.9-2Η DP47 2 .13.2Η Consensus G AGGTGCAGC GGTGCAGC TGCAGC .GGTGCAGC GGTGCAGC GA OAGGl G FU G Ai TGTTGGAGTC TGTTGGAGTC TGTTGGAGTC TGTTGGAGTC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TGGGGGAGGC TGGGGGAGGC TGGGGGAGGC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC TTGGTACAGC TTGGTACAGC TTGGTACAGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CTGGGGGGTC CTGGGGGGTC CTGGGGGGTC CTGGGGGGTC CDR1 50 50 50 50 50 6.1.1H 4.9.2H DP47 2.13.2H . Consensus 6.1.1H 4.9.2H DP472.13.2H Consensus 6.1.1H 4.9.2H DP47 2.13.2H Consensus 6.1.1H 4.9.2H DP47 2.13.2H Consensus 6.1.1H 4.9.2H DP47 2.13.2H Consensus 6.1.1H 4.9.2H DP47 2.13.2H Consensus 6.1.1H 4.9.2H DP47 2.13.2H Consensus CCTGAGACTC CCTGAGACTC CCTGAGACTC CCTGAGACTC CCTGAGACTC TCCTG1 TCCTG' TCCTG' tcctg·; TCCTG' ;t a ;tb:. :ag :ag :ag :ag :ag CCTCTGGATT CCTCTGGATT CCTCTGGATT CCTCTGGATT CCTCTGGATT CACCTTTAGC CACCTTTAGC CACCTTTAGC CACCTTTAGC CACCTTTAGC AGCTATGCCA AGCTATGCCA AGCTATGCCA AGCTATGCCA AGCTATGCCA 100100 100 100 100 CDR1 TGÃfc^TGG TGA3 3TGGGT TGí 3 CTGGGT TGí3 CTGGGT TGASCTGGGT TGíB 3TGGGT CCGCCAGGCT CCGCCAGGCT CCGCCAGGCT CCGCCAGGCT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG CCAGGGAAGG CCAGGGAAGG CCAGGGAAGG CCAGGGAAGG GGCTGGAGTG GGCTGGAGTG GGCTGGAGTG GGCTGGAGTG GGCTGGAGTG CDR2 GGTCTCAG' GGTCTCAG3 GGTCTCAG 3 T GGTCTCAG:T GGTCTCAG:T T Jr 150 150 150150 150 C0R2 ATTJ ATTJ ATTJ ATTJ ATTJ ά:γι 'í 3 Γ' A 3 TG' Ά3ΓΙ Ά 5ΓΙ
GTGGTGGTA G TACATB21 A GTGGTGGTAT qACATpp1 A GTGGTGGTAG A GTGGTGGTA C CjAÇAT(I gtggtggtaIb CA' ACATt ÃggLc TAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG TAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG TAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG 2TAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG iCTAÇ GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ,TÍT 200 200 200 200 200 GTTCACCATC GTTCACCATC GTTCACCATC GTTCACCATC GTTCACCATC ACAGCCTGAG ACAGCCTGAG ACAGCCTGAG ACAGCCTGAG ACAGCCTGAG TCCAGAGACA ATTCC. TCCAGAGACA ATTCC. TCCAGAGACA ATTCC TCCAGAGACA ATTCC TCCAGAGACA ATTCCAl? ÍAA :A& í A 1AC =teí 4 A HG. :abg, a: g, AGCCGAGGAC AGCCGAGGAC AGCCGAGGAC AGCCGAGGAC AGCCGAGGAC ACGGCCGTAT ACGGCCGTAT ACGGCCGTAT ACGGCCGTAT ACGGCCGTAT CACGCTGTAT CACGCTGTAT CACGCTGTAT CACGCTGTAT CACGCTGTAT CTGCAAATGA CTGCAAATGA CTGCAAATGA CTGCAAATGA CTGCAAATGA iaaaL CDR3 3rc— ATTACTGTGC G, ATTACTGTGC GAAAG. ATTACTGTGC GAAAGA ATTACTGTGC GAAAG. ATTACTGTGC GAAAGAfrCTK 3ATC' 3ATC TG TT 250 2502S0 250 250 298 300 296 300 300 CDR3-for 4.9.2 and 2.13.2 ----C- GGCTACGGTG ACTTTTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG TCjTGGGGCCA GGCTGGTCCG ACTCTTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG TCTGGGGCCA GGCTRSKSYG ACTYTTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG TCTGGGGCCA CDR3-for 6.1.1 AGGGACTACG GTGATTATGA GTTGGTTCGA CCC AGGGACCAC------------------------
GGGC CAGGGAACCC AGGGACCAC----------------------------------------- AGGGACYACG GTGATTATGA GTTGGTTCGA CCCCTGGGGC CAGGGAACCC FIG. 2C-1 299 350 296 350 350 349 359 296 359 400 7/25 6.1.1Η TGGTCACCGT CTCCTCAG 367 4.9.2H -GGTCACCGT CTCCTCAG 376 OP47 ------------------ 296 2.13.2H -GGTCACCGT CTCCTCAG 376 Consensus TGGTCACCGT CTCCTCAG 418 FIG. 2C-2 4.17,3H DP71 Consensus CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC GGGC CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC GGGC CCAGGA CCAGGA CCAGGA CTGGTGAAGC CTGGTGAAGC CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC CTTCGGAGAC CTTCGGAGAC CDR1 27 50 50 4.17.3H DP71 Consensus CCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCATCAGT 'AGTTACTACT CCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCATCAGT AGTTACTACT CCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCTCTGGTGG CTCCATCAGT AGTTACTACT CDR1 77 100 100 4.17.3H DP71 Consensus arrGGAT CCGGCAGCCC ;PGGAT CCGGCAGCCC ¥ TGGAT CCGGCAGCCC SgLat CCAGGGAAGG GACTGGAGTG GATTGGGTTAT CCAGGGAAGG GACTGGAGTG GATTGGGTAT CCAGGGAAGG GACTGGAGTG GATTGGGTAT 127 150 150 CDR2 4.17.3H DP71 Consensus 4.Π.3Η DP71 Consensus 4.17.3H DP71 Consensus 4.17.3H DP71 Consensus ATCTATTACA GTGGGAGCAC ATCTATTACA GTGGGAGCAC ATCTATTACA GTGGGAGCAC 3b CAACTACAAC CCCTCCCTCA AGAGTCGAGT CAACTACAAC CCCTCCCTCA AGAGTCGAGT CAACTACAAC CCCTCCCTCA AGAGTCGAGT 177 200 200 JÃÕ CACCATATCA GTAGACACGT CCAAGAACCA GTTCTCCCTG AiftGCTGAG I Γ CACCATATCA GTAGACACGT CCAAGAACCA GTTCTCCCTG AAGCTGAG: Γ CACCATATCA GTAGACACGT CCAAGAACCA GTTCTCCCTG AÃGCTGAcMr CDR3 CTGTGACCGC TGCGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGC3AG CTGTGACCGC TGCGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGC —-CTGTGACCGC TGCGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCCAG GACGTATAGC Gí-------- GACGTATAGC 227 250 250 277 289 300 3 3ACGTC TCC AGTTCGTTCT ACTACTACGG TATC3ACGTC TCGGGCCAAG G5A3CACGGT ------------------------3A---------------3A------- AGTTCGTTCT ACTACTACGG TATG3ACGTC TGGGGCCAAG GSACCACGGT 327 293 350 4.17.3H CACCGTCTCC TCAG 341 DP71 -------------- 293 Consensus CACCGTCTCC TCAG 364 FIG. 2D 8/25
FIG, 3 9/25 EstimlGFl Agudo - +4-++++4-+24 Ab(lug/ral) - - ++++++
25/25
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