KR20230152153A - 액티빈 타입 2 수용체 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
액티빈 타입 2 수용체 결합 단백질 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRIIA 및 항-ActRIIB 항체, 및 조성물 및 ActRII-결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 특정 양상에서 상기 ActRII-결합 단백질은 ActRII 활성도를 저해 또는 길항작용한다. 또한, 본 개시내용은 근육 손실과 연관된 질환 및 병태; 섬유증 병태; 염증성, 심혈관, 폐, 근골격, 신경학, 안, 골격, 자가면역, 또는 대사 질환 또는 병태; 상처 치유; 및 암, 및 다른 ActRII-매개된 질환 및 병태의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
Description
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
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형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타) 패밀리는 척추동물 및 무척추동물 둘 모두에서 매우 다양한 세포 유형에 대해서 생물학적 효과를 발휘한다고 공지된 다양한 성장 인자를 함유한다. TGF-베타 패밀리의 구성원은 패턴 형성 및 조직 특이화(tissue specification)에서 배아 발달 동안 중요한 기능을 수행하고, 지질생성, 근생성, 연골형성, 심장발생, 혈액생성, 신경발생, 및 상피 세포 분화를 비롯한 다양한 분화 과정에 영향을 줄 수 있다. 상기 패밀리는 성장 및 분화 인자(GDF), 골 형성 단백질(BMP), 액티빈 및 인히빈으로서 다양하게 기술된 단백질을 포함한다.
TGF-베타 패밀리 구성원은 다단계 과정을 포함하는 기전을 통해서 신호를 변환하는데, 여기서 TGF-베타 패밀리 구성원은 세포 표면 상에서 발현되는 타입 II 세린/트레오닌 카이나제 수용체에 결합하고, 타입 II 수용체는 동족 타입 I 수용체와 헤테로머 복합체(heteromeric complex)를 형성하고, 포스포릴화를 통해서 타입 I 수용체를 활성화시키고, 활성화된 타입-I 수용체는 세포질로부터 핵으로 신호를 변환하는 Smad 단백질을 포스포릴화 및 활성화시키고, 핵 Smad 올리고머는 DNA에 결합하고, 전사 인자와 회합하여 표적 유전자의 발현을 조절한다.
2종의 관련된 타입 II TGF-베타 수용체 패밀리 구성원인, ActRIIB 및 ActRIIA는 액티빈 A 및 액티빈 B, 및 BMP7, BMP9, BMP10, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, 및 노(Nodal)을 비롯한 다른 TGF-베타 패밀리 구성원에 대한 타입 II 수용체로서 식별되었다(Yamashita et al., J. Cell Biol. 130:217-226 (1995); Lee et al., PNAS 98:9306-9311 (2001); Yeo et al., Mol. Cell 7:949-957 (2001); 및 Oh et al., Genes Dev. 16:2749-54 (2002)). ALK4 및 ALK7은 각각 액티빈 A 및 액티빈 B에 대한 일차 타입 I TGF-베타 수용체 패밀리 구성원 수용체이다.
TGF-베타 리간드 및 수용체 패밀리의 구성원의 발현 및 활성도에서의 변경은 근육, 골, 신경 및 대사 장애 및 병태를 비롯한 다양한 장애 및 병태, 및 암과 연관되어 있다고 제안되어 있다. 본 개시내용의 목적은 ActRII 길항제 및 ActRII 및/또는 ActRII 리간드와 연관된 질환 또는 병태의 진단 및 치료, 예방 및/또는 개선에서의 이에 대한 용도를 제공하는 것이다.
본 개시내용은 액티빈 수용체 타입 II(ActRII)-결합 단백질 및 ActRII-결합 단백질의 사용 방법을 제공한다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 1종 이상의 동족 ActRII 리간드 및/또는 1종 이상의 동족 ActRI 수용체에 대한 ActRII의 결합을 저해 또는 차단할 수 있다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)에 대한 ActRII의 결합을 저해 또는 차단할 수 있다. 본 개시내용은 또한 ActRII 발현 및/또는 상승된 ActRII-매개된 신호전달과 연관된 질환 또는 병태의 진단 또는 치료, 예방 및/또는 개선을 위해서 ActRII-결합 단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 질환 또는 병태는 근육 장애, 예컨대, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태; 염증성, 자가면역, 심혈관, 폐, 근골격, 골격, 안, 신경학, 또는 대사 질환 또는 병태; 비만; 상처 치유; 및 암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합한다. 추가 양상에서, 제공된 ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8(마이오스타틴))의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRIIB-결합 VH 및 VL 쌍을 갖는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 항-ActRIIB 항체 또는 ActRIIB-결합 항체 단편이다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합한다. 추가 양상에서, 제공된 ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8(마이오스타틴))의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA, 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRIIB- 및 ActRIIA 결합 VH 및 VL 쌍을 갖는 항체와 ActRIIB- 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRIIB-- 및 ActRIIA-결합 단백질은 항-ActRIIB 및 ActRIIB 항체 또는 ActRIIB- 및 ActRIIB 결합 항체 단편이다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합한다. 추가 양상에서, 제공된 ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8(마이오스타틴))의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRIIA-결합 VH 및 VL 쌍을 갖는 항체와 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 항-ActRIIA 항체 또는 ActRIIA-결합 항체 단편이다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상보성 결정 영역(CDR)의 세트: 중쇄 가변 영역(VH)-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, 경쇄 가변 영역(VL)-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR은 표 1에 개시된 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 쌍으로 존재한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍으로 존재하는 CDR의 세트를 포함한다: (a) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40의 VH 서열, 및 서열번호 9의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함), (b) 서열번호 63 또는 77의 VH 서열, 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c) 서열번호 45 또는 57의 VH 서열, 및 서열번호 50의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (d) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH 서열, 및 서열번호 91의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 액티빈 수용체 타입 IIA(ActRIIA)에 결합함), 및 (e) 서열번호 125의 VH 서열, 및 서열번호 132의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함).
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 VL로 존재하는 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 172의 아미노산 서열을 갖는 VL로 존재하는 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합한다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 64 또는 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65 또는 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합한다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 145의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2은 서열번호 146의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 147의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 152의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 153의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 154의 아미노산 서열을 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 Act IIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 166의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 167의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 168의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 173의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 175의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트를 포함하고, 여기서 (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 64 또는 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65 또는 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트를 포함하고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 145의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2은 서열번호 146의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 147의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 152의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 153의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 154의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트를 포함하고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 166의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 167의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 168의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 173의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 175의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, CDR의 참조 세트로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 10개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDR의 세트를 포함하고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고 ; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; 및 (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (f)(i) VH-CDR1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (g)(i) VH-CDR1은 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (h)(i) VH-CDR1은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (i)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (j)(i) VH-CDR1은 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (k)(i) VH-CDR1은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (l)(i) VH-CDR1은 서열번호 99의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (m)(i) VH-CDR1은 서열번호 106의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 107의 아미노산 서열을 갖고, (iii) VH-CDR3은 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (n)(i) VH-CDR1은 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (o)(i) VH-CDR1는 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3는 서열번호 121의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (p)(i) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIA에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 참조 세트로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 10개 미만 또는 0의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 145의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2은 서열번호 146의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 147의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 152의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 153의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 154의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 참조 세트로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 10개 미만 또는 0의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 166의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2은 서열번호 167의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 168의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 173의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 175의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a)(i) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB를 결합함); (b)(i) 서열번호 45 또는 57과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 50과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c)(i) 서열번호 63 또는 77과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 70과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB를에 결합함); (d)(i) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 아미노산 서열을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 VL(여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); 및 (e)(i) 서열번호 125와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 132와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함).
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 144와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 151와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 172와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40의 VH 서열, 및 서열번호 9의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (b) 서열번호 45 또는 57의 VH 서열, 및 서열번호 50의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c) 서열번호 63 또는 77의 VH 서열, 및 서열번호 70의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (d) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH 서열, 및 서열번호 91의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); 및 (e) 서열번호 125의 VH 서열, 및 서열번호 132의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함).
추가적인 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 VH 및 VL 서열 쌍을 포함하는 항체와 ActRII에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRII-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 (a) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157); (b) ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159); (c) ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161); 및 (d) ActRIIA의 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 서열, 및 서열번호 151의 VL 서열을 포함하고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 서열, 및 서열번호 172의 VL 서열을 포함하고; 그리고 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a) 서열번호 2의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (b) 서열번호 16의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (c) 서열번호 22의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (d) 서열번호 28의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (e) 서열번호 34의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (f) 서열번호 40의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (g) 서열번호 45의 VH 서열 및 서열번호 50의 VL 서열;(h) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 50의 VL 서열; (i) 서열번호 63의 VH 서열 및 서열번호 70의 VL 서열; (j) 서열번호 77의 VH 서열 및 서열번호 70의 VL 서열; (k) 서열번호 84의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (l) 서열번호 98의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (m) 서열번호 105의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (n) 서열번호 112의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (o) 서열번호 119의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; 및 (p) 서열번호 125의 VH 서열 및 서열번호 132의 VL 서열. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 144를 갖는 VH 서열, 및 서열번호 151을 갖는 VL 서열을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165를 갖는 VH 서열, 및 서열번호 172를 갖는 VL 서열을 포함한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a)(i) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (b)(i) 서열번호 45 또는 57의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 50의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c)(i) 서열번호 63 또는 77의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 70의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (d)(i) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119로 이루어진 군으로부터 선택된 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); (e)(i) 서열번호 125의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 132의 참조 VL로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함).
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 144의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 서열번호 151의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열을 포함하고, 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 서열번호 172의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열을 포함하고, 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서: (a) VH 서열은 서열번호 2의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b) VH 서열은 서열번호 16의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c) VH 서열은 서열번호 22의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d) VH 서열은 서열번호 28의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (e) VH 서열은 서열번호 34의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (f) VH 서열은 서열번호 40의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (g) 서열은 서열번호 45의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 50의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나;(h) VH 서열은 서열번호 57의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 50의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (i) VH 서열은 서열번호 63의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 70의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (j) VH 서열은 서열번호 77의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 70의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (k) 서열은 서열번호 84의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (l) VH 서열은 서열번호 98의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (m) VH 서열은 서열번호 105의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (n) VH 서열은 서열번호 112의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (o) VH 서열은 서열번호 119의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (p) VH 서열은 서열번호 125의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 132의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서 VH 서열은 서열번호 144의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, VL 서열은 서열번호 151의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서 VH 서열은 서열번호 165의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, VL 서열은 서열번호 172의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하는 항체이다. 추가적인 양상에서, 항체는 단클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체이다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII-결합 항체 단편이다. 일부 양상에서 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 다이아바디, DART, 및 단일 쇄 항체 분자(예를 들어, BiTE)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이다.
ActRII-결합 단백질을 암호화하는 핵산 및 핵산의 세트가 또한 제공된다. 핵산 및 핵산의 세트를 함유하는 벡터 또는 벡터의 세트, 및 핵산 및 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 추가로 제공된다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 하이브리도마 또는 포유동물 숙주 세포, 예컨대, NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6(등록상표) 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. ActRII-결합 단백질을 생산하는 하이브리도마 및 포유동물 숙주 세포를 비롯한 숙주 세포가 또한 제공된다.
ActRII-결합 단백질의 제조 방법이 또한 제공된다. 일부 양상에서, 방법은 단백질을 발현하고, 임의로 발현된 ActRII-결합 단백질을 단리하기에 적합한 조건 하에서 ActRII-결합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시되거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지된 방법을 사용하여 제조 및/또는 단리된 ActRII-결합 단백질이 또한 제공된다.
ActRII-결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 추가로 제공된다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 상승된 ActRII 발현 또는 ActRII-매개된 신호전달과 연관된 대상체에서 병태를 치료 및/또는 개선시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 대상체에서 ActRII-매개된 신호전달을 감소시킨다. 또한 의약(medicament)의 제조 및 생산에서의, 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 항체)의 용도가 제공된다. 일부 실시형태에서, 의약은 상승된 ActRII 발현 또는 ActRII-매개된 신호전달과 연관된 대상체에서 병태의 치료 및/또는 개선을 위한 것이다. 추가적인 실시형태에서 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 질환 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도를 제공한다.
제공된 방법을 사용하여 대상체에서 치료 및/또는 개선될 수 있는 병태는 근육 장애, 예컨대, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태, 예컨대, 심근 섬유증, 및 특발성 폐 섬유증(IPF)); 대사 질환(예를 들어, 제II형 당뇨병 인슐린 저항성, 고혈당, 및 비만); 염증성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예를 들어, 울혈성 심부전, 및 고혈압); 안질환, 예컨대, 노인성 황반 변성; 폐 질환, 근골격 질환, 골격 질환, 예컨대, 골다공증; 신경학 질환; 신경근 질환, 퇴행성 질환, 상처 치유; 체중 감소; 및 암(예를 들어, 암종, 골수종, 골-손실 유도 암, 뇌하수체암, 및 위장암)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 양상에서, 개시된 방법은 유효량의 ActRII-결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 단독으로 투여된다. 다른 양상에서, ActRII-결합 단백질은 병용 요법으로서 투여된다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 치료 기준 치료/요법에 대한 병용 요법으로서 투여된다.
ActRII 활성도(예를 들어, 리간드 결합 및/또는 신호전달)를 차단 또는 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 일부 양상에서 방법은 ActRII-결합 단백질 및 ActRII를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서 방법은 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRII-결합 단백질 및 ActRII를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 생체내에서 수행된다. 다른 양상에서, 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 양상에서 차단 또는 감소되는 ActRII 활성도는 ActRI의 포스포릴화이다. 추가 양상에서, 포스포릴화되는 ActRI은 ALK4 및/또는 ALK7이다. 추가적인 양상에서 차단되거나 또는 감소되는 ActRII 활성도는 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화이다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 유효량의 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 ActRII 활성도를 차단 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서 유효량의 ActRIIA-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 ActRIIA 활성도를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 양상에서 유효량의 ActRIIB-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 ActRIIB 활성도를 감소시키는 방법이 제공된다.
증가된 ActRII 발현 및/또는 ActRII 신호전달과 연관된 병리학적 병태, 또는 ActRII-리간드의 활성도를 감소 또는 저해함으로써 치료 및/또는 개선될 수 있는 병리학적 병태에서 ActRII 활성도를 차단 또는 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 방법은 ActRII 또는 ActRII-리간드의 증가된 발현을 갖는 대상체에게 ActRII-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 근육 장애이다. 추가 양상에서, 근육 장애는 손실 또는 근디스트로피이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 대사 병태, 예컨대, 비만 또는 제II형 당뇨병이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 폐 또는 간의 섬유증 병태이다. 추가적인 양상에서 병리학적 병태는 암이다. 추가 양상에서, 암은 골수섬유증, 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 뇌하수체암, 유방암, 위장암, 또는 암종이다. 추가적인 양상에서 병리학적 병태는 골-손실 유도 암(예를 들어, 전립선암 및 유방암)이다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 암 치료 유도된 골 손실과 연관된 병리학적 병태에서 ActRII 활성도를 차단 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 근육 장애의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 방법은 근육 장애를 갖는 대상체에게 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)를 투여하는 단계를 포함한다. 추가로 근육 장애의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 추가 양상에서 근육 장애는 손실 또는 근디스트로피이다. 다른 양상에서, 대상체는 근육 장애의 발달 위험이 있다. 추가 양상에서 대상체는 손실 또는 근디스트로피의 위험이 있다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 섬유증 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 방법은 섬유증 병태를 갖는 대상체에게 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물 중의)을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 대상체는 섬유증 병태의 발달 위험이 있다. 일부 양상에서 섬유증 병태는 만성이다. 추가로 섬유증 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 방법은 섬유증을 갖는 대상체에게 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 또는 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 섬유증은 간 또는 폐 섬유증이다. 추가로 섬유증의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 섬유증에 의해서 유발된 간 또는 폐 기능의 손실을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 이의 ActRII-결합 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 방법은 대상체에서 간 기능의 손실을 감소시킨다. 일부 양상에서 방법은 대상체에서 폐 기능의 손실을 감소시킨다.
도 1A 내지 도 1N은 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 A01 계통 항체 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 A01 계통 항체의 농도에 노출시켰다. 도 1A 내지 도 1D는 ActRIIB 단량체(도 1A), ActRIIB 이량체(도 1B), ActRIIA 단량체(도 1C), 및 ActRIIA 이량체(도1D)에 대한 항체 A01(모) 결합의 특징을 도시한 도면. 도 1E 및 도 1F는 ActRIIB 단량체(도 1E) 및 ActRIIB 이량체(도 1F)에 대한 항체 B01 결합의 특징을 도시한 도면. 도 1G 내지 도 1H는 ActRIIB 단량체(도 1G) 및 ActRIIB 이량체(도 1H)에 대한 항체 C01 결합을 도시한 도면. 도 1I 내지 1J는 ActRIIB 단량체(도 1I) 및 ActRIIB 이량체(도 1J)에 대한 항체 D01 결합을 도시한 도면. 도 1K 내지 1L은 ActRIIB 단량체(도 1K) 및 ActRIIB 이량체(도1L)에 대한 항체 E01 결합을 도시한 도면. 도 1M 내지 1N은 ActRIIB 단량체(도1M) 및 ActRIIB 이량체(도1N)에 대한 항체 F01 결합을 도시한 도면.
도 2는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 A01 계통 항체의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 A01 계통 항체 A01, B01, C01, D01, E01 및 F01과 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다.
도 3A 내지 도 3F는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 G02 계통 항체 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 G01 계통을 노출시켰다. 도 3A 내지 도 3D는 ActRIIB 단량체(도 3A), ActRIIB 이량체(도 3B), ActRIIA 단량체(도 3C) 및 ActRIIA 이량체(도 3D)에 대한 항체 G01 결합의 특징을 도시한 도면. 도 1E 및 1F는 ActRIIB 단량체(도 3E) 및 ActRIIB 이량체(도 3F)에 대한 항체 H01 결합의 특징을 도시한 도면.
도 4는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 G01 모 항체 및 H01 최적화된 항체의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A의 부재 하에서, 그리고 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 G01 계통 항체 G01 또는 H01과 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다.
도 5A 내지 도 5P는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 A02 계통 항체 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 A02 계통 항체에 노출시켰다. 도 5A 내지 도 5D는 ActRIIB 단량체(도 5A), ActRIIB 이량체(도 5B), ActRIIA 단량체(도 5C) 및 ActRIIA 이량체(도 5D)에 대한 항체 A02(모) 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5E 내지 도 5H는 ActRIIB 단량체(도 5E), ActRIIB 이량체(도 5F), ActRIIA 단량체(도 5G) 및 ActRIIA 이량체(도 5H)에 대한 항체 B02 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5I 내지 도 5L은 ActRIIB 단량체(도 5I), ActRIIB 이량체(도 5J), ActRIIA 단량체(도 5K) 및 ActRIIA 이량체(도 5L)에 대한 항체 C02 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5M 내지 도 5P는 ActRIIB 단량체(도 5M), ActRIIB 이량체(도 5N), ActRIIA 단량체(도 5O) 및 ActRIIA 이량체(도 5P)에 대한 항체 D02 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5Q 내지 도 5T는 ActRIIB 단량체(도 5Q), ActRIIB 이량체(도 5R), ActRIIA 단량체(도 5S) 및 ActRIIA 이량체(도 5T)에 대한 항체 D03 결합의 특징을 도시한 도면.
도 6A 및 도 6B는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 A02 계통 항체의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A의 부재 하에서, 그리고 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 A02 계통 항체와 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다. 도 6A는 A02(모), B02, C02 및 D02의 중화 활성도를 도시한 도면. 도 6B는 D02 및 D03의 중화 활성도를 도시한 도면.
도 7A 내지 도 7F는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 E02 모 및 F02 변이체 항체 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 E02 및 F02에 노출시켰다. 도 7A 내지 도 7D는 ActRIIB 단량체(도 7A), ActRIIB 이량체(도 7B), ActRIIA 단량체(도 7C) 및 ActRIIA 이량체(도 7D)에 대한 항체 E02 모 결합의 특징을 도시한 도면. 도 7E 및 도 7F는 ActRIIB 단량체(도 7E) 및 ActRIIB 이량체(도 7F)에 대한 항체 F02 결합의 특징을 도시한 도면.
도 8A 내지 도 8D는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 항체 G02 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 평가된 항-hActRII 항체에 노출시켰다. 도 8A 내지 도 8D는 ActRIIB 단량체(도 8A), ActRIIB 이량체(도 8B), ActRIIA 단량체(도 8C) 및 ActRIIA 이량체(도 8D)에 대한 항체 G02 결합의 특징을 도시한 도면.
도 9는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 ActRIIB-결합 E02 모 항체 및 F02 변이체 항체 및 ActRIIA-결합 항체 G02의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A의 부재 하에서, 그리고 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 항체 E02, F02 또는 G02와 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다.
도 2는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 A01 계통 항체의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 A01 계통 항체 A01, B01, C01, D01, E01 및 F01과 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다.
도 3A 내지 도 3F는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 G02 계통 항체 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 G01 계통을 노출시켰다. 도 3A 내지 도 3D는 ActRIIB 단량체(도 3A), ActRIIB 이량체(도 3B), ActRIIA 단량체(도 3C) 및 ActRIIA 이량체(도 3D)에 대한 항체 G01 결합의 특징을 도시한 도면. 도 1E 및 1F는 ActRIIB 단량체(도 3E) 및 ActRIIB 이량체(도 3F)에 대한 항체 H01 결합의 특징을 도시한 도면.
도 4는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 G01 모 항체 및 H01 최적화된 항체의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A의 부재 하에서, 그리고 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 G01 계통 항체 G01 또는 H01과 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다.
도 5A 내지 도 5P는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 A02 계통 항체 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 A02 계통 항체에 노출시켰다. 도 5A 내지 도 5D는 ActRIIB 단량체(도 5A), ActRIIB 이량체(도 5B), ActRIIA 단량체(도 5C) 및 ActRIIA 이량체(도 5D)에 대한 항체 A02(모) 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5E 내지 도 5H는 ActRIIB 단량체(도 5E), ActRIIB 이량체(도 5F), ActRIIA 단량체(도 5G) 및 ActRIIA 이량체(도 5H)에 대한 항체 B02 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5I 내지 도 5L은 ActRIIB 단량체(도 5I), ActRIIB 이량체(도 5J), ActRIIA 단량체(도 5K) 및 ActRIIA 이량체(도 5L)에 대한 항체 C02 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5M 내지 도 5P는 ActRIIB 단량체(도 5M), ActRIIB 이량체(도 5N), ActRIIA 단량체(도 5O) 및 ActRIIA 이량체(도 5P)에 대한 항체 D02 결합의 특징을 도시한 도면. 도 5Q 내지 도 5T는 ActRIIB 단량체(도 5Q), ActRIIB 이량체(도 5R), ActRIIA 단량체(도 5S) 및 ActRIIA 이량체(도 5T)에 대한 항체 D03 결합의 특징을 도시한 도면.
도 6A 및 도 6B는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 A02 계통 항체의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A의 부재 하에서, 그리고 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 A02 계통 항체와 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다. 도 6A는 A02(모), B02, C02 및 D02의 중화 활성도를 도시한 도면. 도 6B는 D02 및 D03의 중화 활성도를 도시한 도면.
도 7A 내지 도 7F는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 E02 모 및 F02 변이체 항체 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 E02 및 F02에 노출시켰다. 도 7A 내지 도 7D는 ActRIIB 단량체(도 7A), ActRIIB 이량체(도 7B), ActRIIA 단량체(도 7C) 및 ActRIIA 이량체(도 7D)에 대한 항체 E02 모 결합의 특징을 도시한 도면. 도 7E 및 도 7F는 ActRIIB 단량체(도 7E) 및 ActRIIB 이량체(도 7F)에 대한 항체 F02 결합의 특징을 도시한 도면.
도 8A 내지 도 8D는 37℃에서 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 결정되는 경우 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 항체 G02 결합의 동력학적 특징을 도시한 도면. 단량체 또는 이량체 hActRIIB 또는 hActRIIA를 칩 상에 포획하고, 이어서 평가된 항-hActRII 항체에 노출시켰다. 도 8A 내지 도 8D는 ActRIIB 단량체(도 8A), ActRIIB 이량체(도 8B), ActRIIA 단량체(도 8C) 및 ActRIIA 이량체(도 8D)에 대한 항체 G02 결합의 특징을 도시한 도면.
도 9는 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 ActRIIB-결합 E02 모 항체 및 F02 변이체 항체 및 ActRIIA-결합 항체 G02의 중화 활성도를 도시한 도면. 액티빈 A의 부재 하에서, 그리고 액티빈 A 단독(2ng/㎖), 및 50ng/㎖의 항체 E02, F02 또는 G02와 조합된 액티빈 A를 사용한 검정 반응이 포함된다.
본 개시내용은 단리된 재조합 ActRII-결합 단백질을 제공한다. 특정 양상에서 ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 특이적으로 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 항-ActRII 항체이다. ActRII-결합 단백질을 암호화하는 핵산, 핵산을 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 ActRII-결합 단백질의 제조 방법 및 사용 방법이 또한 제공된다. 제공된 ActRII-결합 단백질은 증가된 ActRII 발현 및/또는 신호전달과 연관된 질환 및 병태를 진단, 치료 및/또는 개선시키는 데 있어서의 용도를 갖는다. 이러한 용도는 근육 장애, 예컨대, 퇴행성 근육 질환 근디스트로피, 근육 위축증 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태, 예컨대, 심근 섬유증, 및 특발성 폐 섬유증(IPF)); 대사 질환(예를 들어, 제II형 당뇨병 및 비만); 염증성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예를 들어, 울혈성 심부전, 및 고혈압); 안질환, 예컨대, 노인성 황반 변성; 폐 질환, 근골격 질환, 골격 질환, 신경학 질환, 예컨대, 골다공증; 상처 치유; 체중 감소; 및 암(예를 들어, 암종, 골수종, 골-손실 유도 암, 뇌하수체암, 및 위장암)의 예방 및/또는 개선을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 관련된 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해된 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에서 사용되는 용어 중 다수의 일반 사전을 통상의 기술자에게 제공한다. 본 명세서에 제공된 제목은 전체로서 본 명세서에 대한 참조가 될 수 있는 다양한 양상의 제한이 아니다. 더욱이, 바로 아래에 정의된 용어는 전문이 본 명세서에 참조로 보다 완전하게 정의된다.
단수 표현은 그 용어가 사용되는 문맥이 달리 명확하게 구술되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 단수 표현, 뿐만 아니라 용어 "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본 명세서에 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 추가로, 본 명세서에서 사용되는 경우 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2종 이상의 명시된 특징부 또는 구성성분 각각의 구체적인 개시내용으로서 간주된다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "및/또는"은 구, 예컨대, "A 및/또는 B"는 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 용어 "및/또는"은 구, 예컨대, "A, B, 및/또는 C"에서 사용되는 바와 같이 하기 양상 중 각각을 포함하도록 의도된다. A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
용어 "포함한다"는 하나 이상의 특징부 또는 구성성분의 존재를 포함하는 것, 즉, 허용하는 것의 의미로 일반적으로 사용된다. 양상이 용어 "포함하는"과 함께 본 명세서에 기술되는 경우, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기술된 달리 유사한 양상이 또한 제공된다.
본 명세서 및 청구범위 전체에서 수치와 관련하여 사용되는 경우 용어 "약" 및 "대략적으로"는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 익숙하고 허용 가능한 정확도의 구간을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 정확도 구간은 ± 10%이다. 대안적으로, 그리고 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략적으로"는 주어진 값의 크기의 차수, 바람직하게는 5-배 이하, 보다 바람직하게는 2-배 이하 내인 값을 의미할 수 있다.
수치 범위는 그 범위를 한정하는 수를 포함한다.
ActRII-결합 단백질은 ActRII(즉, ActRIIB 및/또는 ActRIIA)에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 ActRII의 세포외 도메인에 결합하는 단백질을 지칭한다.
용어 "ActRII 액티빈 수용체 타입 II, 및 "ActRII"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 그 용어가 사용되는 문맥이 달리 명확하게 구술하지 않는 한 액티빈 수용체 타입 IIA (ActRIIA) 및/또는 액티빈 수용체 타입 IIB(ActRIIB)를 지칭한다.
용어 "액티빈 수용체 타입 IIA", "ActRIIA 수용체", 및 "ActRIIA"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하세 사용되며, ActRIIA(또한 ACVR2A, ActRIIA, ActRII, 및 문헌에서 EC 2.7.11.30라 칭함)를 지칭한다. 인간 ActRIIA에 대한 참조 서열은 RefSeq NO:NP_001607.1에 제공된다. 제공된 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 138의 아미노산 서열에 상응하는 ActRIIA의 세포외 도메인에 결합한다.
용어 "액티빈 수용체 타입 IIB", "ActRIIB 수용체", 및 "ActRIIB"는 상호 교환 가능하게 사용되며, ActRIIB(ACVR2B, ActRIIB, HTX4, ErbB3 수용체, 및 문헌에서 EC 2.7.11.30라 칭함)를 지칭한다. 인간 ActRIIB에 대한 참조 서열은 NCBI 참조 서열 NP_001097에 제공된다. 제공된 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 139의 아미노산 서열에 상응하는 ActRIIB의 세포외 도메인에 결합한다.
ActRII-결합 단백질(예를 들어, 중화 항체)의 문맥에서 사용되는 경우 용어 "경쟁하다" 또는 "경쟁한다"는 시험 하의 항원 결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체 또는 이의 ActRII-결합 단편)이 일반 항원(예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB 세포외 도메인 또는 이의 단편)에 대한 참조 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드, 또는 참조 항체)의 특이적 결합을 예방 또는 저해하는 검정에 의해서 결정되는 바와 같은 항원 결합 단백질 간의 경쟁을 의미한다. 다수의 유형의 경쟁적인 결합 검정, 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사면역검정(RIA)(예를 들어, 문헌[Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)] 및 [Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15 (1988)]), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 고체상 간접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Cheung, et al., Virology 176:546-552 (1990)] 및 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)]) 및 샌드위치 경쟁 검정(예를 들어, 문헌[Stahli et al., Methods in Enzymology 92:242-253 (1983)] 참조)이 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 이들, 즉, 비표지된 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질 중 어느 하나를 보유하는 세포 또는 고체 표면에 결합하는 정제된 항원의 사용을 포함한다.
경쟁적 저해는 시험 항원 결합 단백질의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합하는 표지의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 통상적으로 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정(경쟁하는 항원 결합 단백질)에 의해서 식별된 항원 결합 단백질은 참조 ActRII-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 ActRII-결합 단백질뿐만 아니라 입체 장애가 생성되는 참조 ActRII-결합 단백질에 의해서 결합된 에피토프에 충분하게 가까운 인접한 에피토프에 결합하는 ActRII-결합 단백질을 포함한다. 통상적으로, 경쟁하는 ActRII(예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB) 결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우, 그것은 참조 ActRII-결합 단백질 ActRII(예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB)의 특이적 결합을 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 저해할 것이다. 일부 예에서, 경쟁하는 항원 결합 단백질은 참조 ActRII-결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% 또는 99% 저해한다.
ActRII 단백질의 문맥에서 사용되는 경우 용어 "에피토프"는 본 개시내용의 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항체)에 결합할 수 있는 결정적인 ActRII(예를 들어, 인간 ActRIIA, 인간 ActRIIB, 뮤린 ActRIIA 또는 뮤린 ActRIIA) 단백질을 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 군으로 이루어지고, 통상적으로 3차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 입체형태 에피토프 및 비-입체형태 에피토프는 후자가 아닌 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 손실되는 것에 의해서 구별된다. ActRII-결합 단백질에 의해서 결합된 ActRII 에피토프는 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
항원 결합 단백질, 예컨대, 본 명세서에 개시된 항-ActRII-결합 항체 및 ActRII-결합 단편, 이의 변이체, 또는 유도체는 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들), 예를 들어 그것이 인식하거나 또는 특이적으로 결합하는 표적 폴리펩타이드와 관련하여 기술되거나 또는 명시될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 ActRII-결합 단백질의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 ActRII의 부분은 "에피토프"이다. 에피토프는 단백질의 3차 접힘에 의해서 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 단백질에 대한 노출에 대해서 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해서 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로의 처리 시에 손실된다. 에피토프 결정기는 분자, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐기의 화학 활성 표면 기를 포함할 수 있고, 특정 3차원 구조 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 독특한 공간 입체형태로 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35개의 아미노산을 포함한다. 에피토프는 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다.
용어 "저해한다", "차단한다", "감소시킨다", "낮춘다", "억제한다","길항작용한다" 및 "중화시킨다"는 상호 교환 가능하게 사용되고, 활성도의 완전 차단을 비롯한, 활성도(예를 들어, ActRII 리간드 결합 및 ActRII 신호전달)의 임의의 통계학적으로 유의한 감소를 지칭한다 예를 들어, "저해" 또는 "억제"는 대조군에 비해서 활성도의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 지칭할 수 있다.
일부 양상에서, 용어 "감소시킨다"는, ActRII-결합 단백질과 접촉되지 않은 경우 세포에서 Smad 포스포릴화의 정도에 대한, ActRII 및 타입 I 수용체를 발현하는 세포를 ActRII 리간드, 예컨대, 액티빈 A과 접촉시킴으로써 유도되는 1종 이상의 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 통계학적으로 유의하게(예를 들어, 0.05 이하의 p 값으로) 감소시키는, ActRII-결합 단백질, 예컨대, 이의 항체 또는 ActRII-결합 단편의 능력을 지칭할 수 있다. ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA)를 발현하는 세포는 자연 발생 세포 또는 세포주일 수 있거나, 또는 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA)를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입함으로써 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 일 양상에서, ActRII-결합 단백질, 예를 들어, ActRII 항체 또는 이의 ActRII-결합 단편은 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, 그 다음 항-포스포타이로신 항체로의 프로빙에 의해서 또는 본 명세서에 기술되거나 관련 기술 분야에 달리 공지된 표준 기술 및 조건을 사용한 ELISA에 의해서 결정되는 경우, 1종 이상의 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 ActRII 리간드 매개된 포스포릴화를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 또는 약 100% 감소시킨다.
일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, 그 다음 항-포스포타이로신 항체로의 프로빙에 의해서 또는 본 명세서에 기술되거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지된 기술을 사용하는 ELISA(예를 들어, P-Smad ELISA) 또는 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의해서 결정되는 경우 1종 이상의 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A) 매개된 포스포릴화를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 또는 약 100% 감소시킨다.
추가적인 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, 그 다음 항-포스포타이로신 항체로의 프로빙에 의해서 또는 본 명세서에 기술되거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지된 표준 기술 및 조건을 사용하는 ELISA(예를 들어, P-Smad ELISA) 또는 Smad 의존성 리포터 유전자 검정에 의해서 결정되는 경우 1종 이상의 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)-매개된 포스포릴화를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 또는 약 100% 감소시킨다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되고 전체(전장) 항체 및 이의 항원 결합 단편 또는 단일 쇄를 포함한다. 전형적인 항체는 다이설파이드 결합에 의해서 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH라 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CHI, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL이라 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FW)이라 지칭되는 보다 보존되는 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)이라 지칭되는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FW로 구성된다: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체계의 제1 구성성분(Clq)을 비롯한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 예시적인 항체는 전형적인 항체, scFvs, 및 이의 조합물을 포함하고, 여기서 예를 들어, scFv는 (예를 들어, 펩타이드 결합을 통해서 또는 화학적 연결기를 통해서) 전형적인 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N 또는 C-말단에 공유 연결되거나, 또는 전형적인 항체의 중쇄 및/또는 경쇄에 삽입된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 그 항체가 목적하는 결합 활성도를 나타내는 한 온전한 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv(scFv) 유도체 및 돌연변이체, 다특이적 항체, 예컨대, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이의 중쇄 불변 도메인의 동일성을 기반으로 면역글로불린의 임의의 5종의 주요 부류일 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위부류(아이소타입)(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2). 면역글로불린의 상이한 부류는 상이하고 널리 공지된 소단위 구조 및 3-차원 형상을 갖는다. 항체는 네이키드일 수 있거나 또는 다른 분자, 예컨대, 독소, 방사성 동위 원소 등에 접합될 수 있다. 용어 "IgG"는 인식된 면역글로불린 감마 유전자에 의해서 실질적으로 암호화된 항체의 부류에 속하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 인간에서 이러한 부류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서 이러한 부류는 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3을 포함한다.
용어 "ActRII 항체", "ActRII에 결합하는 항체", 또는 "항-ActRII 항체"는 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA)에 충분한 친화도로 결합할 수 있어서 그 항체가 각각 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 표적화하는 데 있어서 치료제 또는 진단 시약으로서 유용한 항체를 지칭한다.
ActRII 단백질의 문맥에서 사용되는 경우 "특이적으로 결합한다"는 것은, ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA, 바람직하게는 인간 ActRIIA 및/또는 인간 ActRIIB, 바람직하게는 ActRIIB 및/또는 ActRIIA의 세포외 도메인)에, 결합 단백질이 비관련 대조군 단백질에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 결합하는, 결합 단백질, 예컨대, 항체의 능력을 일반적으로 의미한다. 일부 양상에서, 대조군 단백질은 암닭 알 흰자위 리소자임이다. 바람직하게는 결합 단백질은 대조군 단백질에 대한 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRII에 결합한다. 바람직하게는, 결합 단백질은 관련 기술 분야에 공지된 결합 검정을 사용하여 측정되는 경우 1 X 10-7M 이하 또는 1 X 10-8 이하의 인간 ActRII에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 양상에서, 결합 친화도는 방사면역검정(RIA) 또는 BIACORE(등록상표)(예를 들어, 분석물로서 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA)를 사용하고 리간드로서 ActRII-결합 단백질을 사용하거나 그 역임)를 사용하여 측정된다.
일부 양상에서, 비관련된 비-ActRII 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)의 결합 정도는 예를 들어, 방사면역검정(RIA), BIACORE(등록상표)(분석물로서 재조합 ActRII를 사용하고 리간드로서 ActRII-결합 단백질을 사용하거나 그 역임), 속도 배제 검정(KINEXA(등록상표)), 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 결합 검정에 의해서 측정되는 경우, ActRII에 대한 ActRII-결합 단백질의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 1μM 이하, 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하, 0.1nM 이하, 10pM 이하, 1pM 이하, 또는 0.1pM 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 전장 항체 또는 ActRII-결합 항체 단편이다.
용어 "항원 결합 항체 단편"(예를 들어, "ActRII-결합 항체 단편", "ActRIIA-결합 항체 단편" 및 "ActRIIB-결합 항체 단편")은 온전한 항체의 항원 결합 가변 영역(예를 들어, CDR3)의 전부 또는 부분을 함유하는 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해서 수행될 수 있다고 공지되어 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 1종 이상의 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 양상에서 본 개시내용은 ActRII-결합 항체 단편을 제공하며, 여기서, 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 다이아바디, 또는 단일 쇄 항체 분자이다.
Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 N-말단인 가요성 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우 Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 및 Cγl과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 이의 카복시-말단에 대한 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되고, 여기서 넘버링은 카밧(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991))에 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다. Fc는 단리 시의 이러한 영역, 또는 전체 항체, 항체 단편, 또는 Fc 융합 단백질의 문맥에서의 이러한 영역을 지칭할 수 있다. 다형성은 EU 인덱스에 의해서 넘버링되는 경우 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 다수의 상이한 Fc 위치에서 관찰되었고, 따라서 선행기술에서 제시된 서열과 서열들 간의 약간의 차이가 존재할 수 있다.
"단클론성 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여되는 균질한 항체 집단을 지칭한다. 이것은 항원 결정기에 대해서 지향되는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체와 상반된다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체 둘 모두뿐만 아니라 항체 부분을 포함하는 항체 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv), 단일 쇄(scFv) 돌연번이체, 및 융합 단백질), 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 단클론성 항체는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 및 유전자 이식 동물을 포함하지만 이들로 제한되지 않은 임의의 수의 방식으로 제조될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 목적하는 항원-결합 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 1종의 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 반면, 불변 영역은 그 종에서 면역 반응을 발휘하는 것을 회피하도록 또 다른 종(통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체에서의 서열과 상동성이다.
용어 "인간화된 항체"는 적은, 바람직하게는 최소한의 비-인간(예를 들어, 뮤린) 서열을 함유하도록 조작된 비-인간(예를 들어, 뮤린) 면역글로불린으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체는 CDR로부터의 잔기가 목적하는 항원-결합 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기에 의해서 대체된 인간 면역글로불린이다(Jones, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen, Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FW) 잔기는 목적하는 항원-결합 특이성, 친화도, 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체에서 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 항체 특이성, 친화도, 및/또는 능력을 개선 및 최적화하도록 대체된 Fv 프레임 영역 및/또는 비-인간 잔기 내의 추가적인 잔기의 치환에 의해서 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개 또는 3개의, 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부를 함유하는 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이지만, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다.
인간화된 항체를 생성시키는 데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호 및 제5,639,641호에 기술되어 있다.
용어 "인간 항체"는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된 인간에 의해서 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 인간에 의해서 생산된 항체를 지칭한다. 용어 "인간 항체"는 온전한(전장) 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체, 예컨대, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다.
"길항제", "차단", 또는 "중화" 결합 단백질은 이것이 결합하는 항원, 예컨대, ActRIIB 및/또는 ActRIIA의 활성도를 저해 또는 감소시키는 것이다. 일부 양상에서, 길항제 ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 리간드, 예컨대, 액티빈 A에 의해서 ActRIIA에 대한 결합을 감소 또는 저해한다. 일부 양상에서, 길항제 ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 리간드, 예컨대, 액티빈 A에 의해서 ActRIIB에 대한 결합을 감소 또는 저해한다. 특정 양상에서 길항제 ActRII-결합 단백질은 ActRII의 활성도를 실질적으로 또는 완전히 저해한다. 일부 양상에서, ActRII 활성도는 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 감소된다. 특정 양상에서 길항제 ActRII-결합 단백질은 항-ActRIIA 항체, 예컨대, 전장 항체 또는 ActRIIA-결합 항체 단편이다. 추가 양상에서, 길항제 항-ActRIIA 항체는 ActRIIA의 활성도를 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어는 100% 감소시킨다. 추가적인 양상에서, 길항제 ActRII-결합 단백질은 항-ActRIIB 항체, 예컨대, 전장 항체 또는 ActRIIB-결합 항체 단편이다. 추가 양상에서, 길항제 항-ActRIIB 항체는 ActRIIB의 활성도를 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어는 100% 감소시킨다.
"결합 친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 간의 비-공유 상호작용의 총합의 강도를 일반적으로 지칭한다. 달리 제시되지 않는 한, "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 이의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해서 표현될 수 있다. 친화도는 본 명세서에 기술된 것을 비롯한 관련 기술 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해서 측정될 수 있고, 본 개시내용의 목적을 위해서 사용될 수 있다.
"효력"은 주어진 강도의 효과를 생성시키는 데 요구되는 화합물의 양과 관련하여 표현된 화합물의 약물학적 활성도의 척도이다. 그것은 정의된 생물학적 효과를 달성하는 데 요구되는 화합물의 양을 지칭하고; 더 적은 용량이 요구될 수록, 약물 효력이 더 크다. 효력은 달리 제시되지 않는 한 nM 단위의 IC50 값으로서 일반적으로 표현된다. IC50은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 또는 항-ActRIIB 항체)의 중간 저해 농도이다. 기능 검정에서, IC50은 생물학적 반응을 이의 최대의 50%만큼 감소시키는 농도이다. 리간드-수용체 결합 연구에서, IC50은 리간드-수용체 결합을 최대 특이적 결합 수준의 50%만큼 감소시키는 농도이다. IC50은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 수의 수단에 의해서 계산될 수 있다. 참조 항-ActRII 항체 또는 ActRII-결합 단백질과 비교할 때 본 명세서에 제공된 항체 또는 다른 결합 단백질에 대한 효력의 배수 개선은 적어도 2-배, 4-배, 6-배, 8-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 110-배, 120-배, 130-배, 140-배, 150-배, 160-배, 170-배, 또는 적어도 180-배일 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 세포독성의 형태를 지칭하는데, 여기서 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR) 상에 결합된 분비된 Ig는 이들 세포독성 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고, 이어서 세포독소로 표적 세포를 사멸시키는 것을 가능하게 한다. 표적 세포의 표면으로 지향되는 특이적 고-친화도 IgG 항체는 세포독성 세포를 "준비시키고", 이러한 사멸을 위해서 절대적으로 요구된다. 표적 세포의 용해는 세포외에 존재하며, 직접 세포-대-세포 접촉이 요구되고, 보체에 관여되지 않는다. 항체에 더하여, ActRII-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는, Fc 영역을 포함하는 다른 단백질, 구체적으로 Fc 융합 단백질이 세포-매개된 세포독성에 영향을 줄 수 있을 것이라고 고려된다. 간략화를 위해서, Fc 융합 단백질의 활성도로부터 초래된 세포-매개된 세포독성은 또한 본 명세서에서 ADCC 활성도라 지칭된다.
"단리된" ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRII-결합 단편, 이의 변이체, 및 유도체를 비롯한 ActRII 항체), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 단백질(예를 들어, 항체), 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 그것이 자연에서 발견되는 형태로 더 이상 존재하지 않는 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 양상에서, 단리된 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 단리된 단백질 및 단리된 핵산은, 이러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실시된 재조합 DNA 기술에 의한 것인 경우 이것이 자연적으로 연관된 물질, 예컨대, 이것이 이의 자연 환경 또는 이것이 제조된 환경(예를 들어, 세포 배양물)에서 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산이 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 단백질 및 핵산은 희석제 또는 아주반트와 함께 제형화될 수 있고, 여전히 실시 목적을 위해서 단리될 수 있고 - 예를 들어, 단백질은 면역검정에서 사용하기 위해서 미세역가 플레이트를 코팅하는 데 사용되는 경우 젤라틴 또는 다른 담체와 일반적으로 혼합될 것이거나 또는 진단 또는 요법에서 사용되는 경우 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다.
용어 "대상체", "개체", "동물", "환자", 및 "포유동물"은 진단, 예후 또는 요법이 목적하는 임의의 대상체, 특별하게는 포유동물 대상체를 지칭한다. 포유동물 대상체는 특정 치료의 수령인인 인간, 비-인간 영장류, 가축, 농장 동물, 설치류 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "약제학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성도가 효과적인 것을 허용하도록 하는 이러한 형태인 제제를 지칭하고, 이것은 조성물이 투여될 대상체에 허용 가능하제 않게 독성인 농도의 추가적인 구성성분을 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 멸균될 수 있다.
폴리펩타이드, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 비롯한 항원 결합 단백질의 "유효량"은 구체적으로 제시된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 경험적으로 그리고 일상적 방식으로 결정될 수 있다. 용어 "치료 유효량"은 대상체(예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간)에서 질환 또는 병태를 "치료하기에" 효과적인 폴리펩타이드, 예를 들어, 항체를 비롯한 항원 결합 단백질 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 따라서, "치료 유효"량은 ActRII-매개된 질환 또는 병태의 적어도 하나의 임상 증상에서 일부 개선, 완화 및/또는 감소를 제공하는 양이다. 본 개시내용의 방법에 의해서 치료될 수 있는 질환 또는 병태와 연관된 임상 증상은 널리 공지되어 있다. 추가로, 치료 효과는 일부 이익이 대상체에게 제공되는 한, 완전하거나 치유적일 필요는 없다. 일부 실시형태에서, 용어 "치료 유효"는 이를 필요로 하는 대상체에서 ActRII 활성도를 감소시킬 수 있는 치료제의 양을 지칭한다. 투여되는 실제 양 및 투여 속도 및 시간-과정은 치료될 대상의 본성 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량 등에 대한 결정은 일반의 및 다른 의사의 책임 하에 있다. 항체 및 이의 항원 결합 단편의 적절한 용량은 일반적으로 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ledermann et al., Int. J. Cancer 47:659-664 (1991); Bagshawe et al., Ant. Immun. 및 Radiopharm.4:915-922 (1991)] 참조).
"충분한 양" 또는 ActRII-매개된 질환 또는 병태를 갖는 환자에서 특정 결과를 달성하기에 "충분한 양"은 임의로 치료 효과(즉, 치료 유효량의 투여에 의함)인 목적하는 효과를 생성시키기에 효과적인 치료제(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 비롯한 항원 결합 단백질)의 양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 특별한 결과는 이를 필요로 하는 환자에서 ActRII 활성도의 감소이다.
용어 "표지"는 "표지된" 모이어티를 생성시키도록 모이어티, 예컨대, 항-ActRII 항체에 직접 또는 간접적으로 접합된 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출 가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는, 효소 표지의 경우에는, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 작용할 수 있다.
용어, 예컨대, "치료하는", 또는 "치료", "치료하기 위한" 또는 "개선시키는" 및 "개선시키기 위한"은 (a) 진단된 병리학적 병태 또는 장애의 증상을 치유, 둔화, 경감시키고/거나 그것의 진행을 중단시키는 치료적 조치 및 (b) 표적 질환 또는 병태의 발달을 예방 및/또는 둔화시키는 예방적 또는 예방 조치 둘 모두를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체는 질환 또는 병태를 이미 갖는 대상체; 질환 또는 병태의 발달 위험을 갖는 대상체; 및 질환 또는 병태가 예방될 대상체를 포함한다. 특정 양상에서, 대상체는, 그 대상체가 예를 들어, 질환 또는 병태와 연관된 증상의 전체적인, 부분적인 또는 일시적인 개선을 나타내면 본 명세서에 제공된 방법에 따라서 성공적으로 "치료된다". 일부 양상에서, 본 개시내용은 질환 또는 불용(disuse)으로 인한 근육 장애, 예컨대, 근육 손실을 치료하는 방법을 제공한다. 추가적인 양상에서 본 개시내용은 근육 장애, 예컨대, 퇴행성 근육 질환 근디스트로피, 근육 위축증 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태, 예컨대, 심근 섬유증, 및 특발성 폐 섬유증(IPF)); 대사 질환(예를 들어, 제II형 당뇨병 및 비만); 염증성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예를 들어, 울혈성 심부전, 및 고혈압); 안질환, 예컨대, 노인성 황반 변성; 폐 질환, 근골격 질환, 골격 질환, 신경학 질환, 예컨대, 골다공증; 상처 치유; 체중 감소; 및 암(예를 들어, 암종, 골수종, 골-손실 유도 암, 뇌하수체암, 및 위장암)으로부터 선택된 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공한다. 추가 양상에서 본 개시내용은 상기 질환 또는 병태 중 하나 이상의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이,"와 조합하여" 또는 "병용 요법"은 추가적인 요법(예를 들어, 제2, 제3, 제4 등)이 신체에 여전히 유효하도록 하는 투여의 임의의 형태를 지칭한다(예를 들어, 다수의 화합물이 대상체에서 동시에 유효하며, 이것은 이들 화합물의 상승작용적 효과를 포함할 수 있음). 효과는 혈액, 혈청 또는 혈장 중의 작용제의 측정 가능한 농도에 상관되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상이한 치료 화합물은 동일한 제형 또는 별개의 제형으로, 동시에 또는 순차적으로 그리고 상이한 스케줄로 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 치료가 제공되는 대상체는 상이한 요법의 조합된 효과로부터 이로울 수 있다. 본 개시내용의 1종 이상의 ActRII-결합 단백질은 1종 이상의 다른 추가적인 작용제 및/또는 지지 요법과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 이러한 치료제는 특정 작용제에 대해서 결정된 용량 및/또는 시간 스케줄로 투여될 것이다. 치료요법에서 사용되기 위한 특정 조합물은 본 개시내용의 길항제와 요법 및/또는 목적하는 결과의 상용성을 고려할 것이다.
본 개시내용의 방법 및 기술은 달리 제시되지 않는 한 공지된 종래의 방법에 따라서 그리고 본 개시내용 전체에 논의되고 인용된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 문헌에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행된다(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] 참조, 이들 모두는 참조로 본 명세서에 포함됨).
용어 "암", "종양", "암성", 및 "악성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태를 지칭 또는 기술한다. 암의 예는 선암, 림프종, 아세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병을 비롯한 암종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 예컨대, 간 암종 및 간세포암, 방광암, 유방암(호르몬 매개된 유방암 포함(예를 들어, 문헌[Innes et al., Br. J. Cancer 94:1057-1065 (2006)] 참조), 결장 암, 결장직장 암, 자궁내막 암종, 골수종(예컨대, 다발성 골수종), 침샘 암종, 기저 세포 암종, 흑색종, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 고환암, 식도암, 다양한 유형의 두경부암 및 뮤신 기원의 암, 예컨대, 뮤신성 난소암 및 담관암종(간)을 포함한다. 특별한 양상에서, 암은 골수섬유증, 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 또는 뇌하수체암이다. 또 다른 양상에서, 암은 유방암, 위장암, 또는 암종(예를 들어, 기저 및 편평 세포 암종)이다. 추가적인 양상에서, 암은 골-손실-유도암이다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 상호 교환 가능하게 사용되고, 단일 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포함하도록 의도되고, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), 상보성 DNA(cDNA), 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 특정 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 종래의 포스포다이에스터 결합 또는 비-종래의 결합(예를 들어, 아마이드 결합, 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견되는 것)을 포함한다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드 중에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어, DNA, cDNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드에 적용되는 경우, 용어 "단리된"은 이의 네이티브 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 지칭하고, 예를 들어, 벡터 내에 함유된 항원 결합 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 개시내용의 목적을 위해서 단리된다고 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가 예는 이종 숙주 세포 중에 유지되거나 또는 용액 중의 다른 폴리뉴클레오타이드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물을 포함한다. 본 개시내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성으로 생산된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대, 포로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내에서 1종 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달, 및 일부 양상에서는 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터 및 특정 진핵 세포, 예컨대, 생산자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "숙주 세포"는 재조합 핵산을 보유하거나 보유할 수 있는 세포 또는 세포의 집단을 지칭한다. 숙주 세포는 원핵(예를 들어, 이. 콜라이), 또는 진핵일 수 있다. 숙주 세포는 효모를 비롯한 진균 세포, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)일 수 있다. 숙주 세포는 또한 다양한 동물 세포, 예컨대, 곤충 세포(예를 들어, Sf-9) 또는 포유동물 세포(예를 들어, HEK293F, CHO, COS-7, NIH-3T3, NS0, PER.C6(등록상표), 및 하이브리도마) 중 임의의 것일 수 있다. 추가 양상에서, 숙주 세포는 CHO-K, CHO-0 CHO-Lec10, CHO-Lec13, CHO-Lec1, CHO Pro-5 및 CHO dhfr-로 이루어진 군으로부터 선택된 CHO 세포이다. 특정 양상에서, 숙주 세포는 하이브리도마이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것은 비-아미노산에 의해서 중단될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 구성성분과의 접합에 의해서 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 이 정의 내에는 예를 들어, 아미노산(예를 들어, 비자연 아미노산 등 포함)의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 관련 기술 분야에 공지된 다른 변형물이 포함된다. 일부 양상에서 제공된 ActRII-결합 단백질은 항체를 기반으로 하기 때문에, ActRII-결합 단백질은 단일 쇄 또는 연관된 쇄로서 생성될 수 있다는 것이 이해된다.
"재조합" 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체는 재조합 DNA 기술을 통해서 생산된 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체를 지칭한다. 재조합 방식으로 생산된 폴리펩타이드, 단백질 및 숙주 세포에서 발현된 항체는 본 개시내용의 목적을 위해서 임의의 적합한 기술에 의해서 분리되거나, 분별되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 네이티브 또는 재조합 폴리펩타이드로서 단리된 것으로 간주된다.
또한 본 개시내용에는 폴리펩타이드의 단편, 변이체, 또는 유도체, 및 이들의 임의의 조합물이 포함된다. 폴리펩타이드 및 단백질을 지칭하는 경우 용어 "단편"은 참조 폴리펩타이드 또는 단백질의 특성 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 단편은 단백질분해 단편, 뿐만 아니라 결실 단편을 포함한다.
용어 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해서 모 항체 또는 폴리펩타이드 서열의 것과 상이한 항체 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 항체 또는 폴리펩타이드의 변이체는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해서 변형된 아미노산 서열을 갖는 단편, 및 또한 항체 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 관련 기술 분야에 공지된 돌연변이 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
항체 또는 폴리펩타이드에 적용되는 바와 같은 용어 "유도체"는 네이티브 항체 또는 폴리펩타이드에서 발견되지 않는 추가적인 특징을 나타내도록 변형된 항체 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. "유도체" 항체의 예는 제2 폴리펩타이드 또는 또 다른 분자(예를 들어, 중합체, 예컨대, PEG, 발색단, 또는 형광단) 또는 원자(예를 들어, 방사동위원소)와의 융합체 또는 접합체이다.
용어 "아미노산 치환"은 모 서열 내에 존재하는 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산은 예를 들어, 화학적 펩타이드 합성을 통해서 또는 공지된 재조합 방법을 통해서 모 서열 내에서 치환될 수 있다. 따라서, "위치 X에서의 치환"에 대한 언급 또는 "위치 X에서의 치환"은 위치 X에 존재하는 아미노산 잔기의 대안적인 아미노산 잔기로의 치환을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치환 패턴은 도식 AXY에 따라서 기술될 수 있는데, 여기서, A는 위치 X에 본래 존재하는 아미노산 잔기에 상응하는 단일 문자 암호이고, Y는 치환 아미노산 잔기이다. 다른 실시형태에서, 치환 패턴은 도식 XY에 따라서 기술될 수 있는데, 여기서, Y는 위치 X에 본래 존재하는 아미노산 잔기를 치환하는 아미노산 잔기에 상응하는 단일 문자 암호이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 이미 정의되어 있으며, 염기성 측쇄(예를 들어, Lys, Arg, His), 산성 측쇄(예를 들어, Asp, Glu), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, Gly, Asp, Gln, Ser, Thr, Tyr, Cys), 비극성 측쇄(예를 들어, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, Thr, Val, Ile) 및 방향족 측쇄(예를 들어, Tyr, Phe, Trp, His)를 포함한다. 따라서, 폴리펩타이드 내의 아미노산 잔기가 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되면, 그 치환은 보존적이라고 간주된다. 또 다른 양상에서, 아미노산 잔기의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
비-보존적 치환은 (a) 양전성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Arg, His, 또는 Lys)가 음전성 잔기(예를 들어, Glu 또는 Asp)에 대해서 또는 그것에 의해서 치환된 것, (b) 친수성 잔기(예를 들어, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들어, Ala, Leu, Ile, Phe, 또는 Val)에 대해서 또는 그것에 의해서 치환된 것, (c) Cys 또는 Pro가 임의의 다른 잔기에 대해서 또는 그것에 의해서 치환된 것, 또는 (d) 입체적으로 큰 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Val, His, Ile 또는 Trp)가 더 작은 측쇄를 갖는 것(예를 들어, Ala 또는 Ser) 또는 측쇄를 갖지 않는 것(예를 들어, Gly)에 대해서 또는 그것에 의해서 치환된 것을 포함한다.
다른 치환이 용이하게 식별될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 알라닌의 경우, 치환은 D-Ala, Gly, 베타-Ala, L-Cys 및 D-Cys 중 어느 하나로부터 취할 수 있다. 라이신의 경우, 대체는 D-Lys, Arg, D-Arg, 호모-Arg, Met, D-Met, 오미틴, 또는 D-오르니틴 중 어느 하나일 수 있다. 일반적으로, 단리된 폴리펩타이드의 특성에서 변화를 유도하는 것으로 예상될 수 있는 기능적으로 중요한 영역에서의 치환은 (a) 극성 잔기(예를 들어, Ser 또는 Thr)가 소수성 잔기(예를 들어, Leu, Ile, Phe, 또는 Ala)에 대해서(또는 그것에 의해서) 대체된 것; (b) Cys 잔기가 임의의 다른 잔기에 대해서(또는 그것에 의해서) 대체된 것; (c) 양전성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Lys, Arg 또는 His)가 음전성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Glu 또는 Asp)에 대해서(또는 그것에 의해서) 대체된 것; 또는 (d) 입체적으로 큰 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어, Phe)가 이러한 측쇄를 갖지 않는 것(예를 들어, Gly)에 대해서(또는 그것에 의해서) 대체된 것이다. 상기 비-보존적 치환 중 하나가 단백질의 기능적 특성을 변경할 수 있는 가능성은 단백질의 기능적으로 중요한 영역에 대해서 치환의 위치와 또한 상관관계가 있고: 일부 비-보존적 치환은 따라서 생물학적 특성에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않을 수 있다.
용어 "아미노산 삽입"은 모 서열 내에 존재하는 2개의 아미노산 잔기 사이에 새로운 아미노산 잔기를 도입하는 것을 지칭한다. 아미노산 잔기는 예를 들어, 관련 기술 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성을 통해서 또는 재조합 방법을 통해서 모 서열 내에 삽입될 수 있다. 따라서, 구 "위치 X와 Y 사이에서의 삽입" 또는 "카밧 위치 X와 Y 사이에서의 삽입"(여기서 X 및 Y는 아미노산 잔기 위치(예를 들어, 위치 239과 240 사이에서의 시스테인 아미노산 잔기 삽입)에 상응함)은 X 위치와 Y 위치 사이에서의 아미노산 잔기의 삽입, 및 또한 위치 X 및 Y에서 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 상에서의 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈의 핵산 서열에서의 삽입을 지칭한다.
두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 간의 용어 "백분율 서열 동일성" 또는 "백분율 동일성"은, 두 서열의 최적의 정렬을 위해서 도입되어야 하는 부가 또는 결실(즉, 갭)을 고려하여, 비교 윈도우에 걸쳐서 서열에 의해서 공유된 동일한 매칭된 위치의 수를 지칭한다. 매칭된 위치는, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 표적 서열 및 참조 서열 둘 모두에 존재하는 임의의 위치이다. 표적 서열 내에 존재하는 갭은 계수되지 않는데, 그 이유는 갭이 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 아니기 때문이다. 마찬가지로, 참조 서열 내에 존재하는 갭은 계수되지 않는데, 그 이유는 참조 서열로부터의 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 아니라 표적 서열 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 계수되기 때문이다. 서열 동일성의 백분율은 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성을 백분율을 산출함으로써 계산된다. 두 서열 간의 서열의 비교 및 백분율 서열 동일성의 결정은 쉽게 입수 가능한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다. 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 공급원으로부터 그리고 단백질 및 뉴클레오타이드 서열 둘 모두의 정렬을 위해서 입수 가능하다. 백분율 서열 동일성을 결정하기에 적합한 한 프로그램은, 생명공학 정보에 대한 미국 정부 국립 센터 BLAST 웹 사이트(U.S. government's National Center for Biotechnology Information BLAST web site (blast.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 입수 가능한 프로그램의 BLAST 세트의 부분인, bl2seq이다. Bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘 중 어느 하나를 사용하여 두 서열 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면, BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들어, 생물정보 프로그램의 EMBOSS 세트의 부분이고, www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보 연구소(EBI)로부터 입수 가능한 니들(Needle), 스트레처(Stretcher), 워터(Water), 또는 마처(Matcher)이다.
CDR 또는 CDR의 세트를 보유하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 상당한 부분을 가질 것인데, 여기서 CDR 또는 CDR의 세트는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해서 암호화된 자연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR의 세트에 상응하는 위치에 위치된다. 면역글로불린 가변 도메인 및 이의 CDR의 구조 및 위치는 프로그램 또는 공지된 가변 도메인 잔기 넘버링 시스템, 예컨대, 코티아(Chothia), 코티아+ 및 카밧을 사용하여 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 용이하게 결정될 수 있고, 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 카밧(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. U.S. DHHS. 1987), 및 인터넷(예를 들어, bioinf.org.uk/ abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.html; and immuno.bme.nwu.edu) 상에서 입수 가능한 툴을 참조로 일상적으로 결정될 수 있다.
CDR은 또한 다른 스캐폴드, 예컨대, 피브로넥틴, 사이토크롬 B, 알부민(예를 들어, ALBUdAb(도만티스(Domantis)/GSK) 및 ALB-쿠니츠(Kunitz)(다이악스(Dyax))), 3 또는 6개의 아미노산의 비구조화 반복 서열(예를 들어, PASylation(등록상표) 기술 및 XTEN(등록상표) 기술), 및 엘라스틴-유사 반복 도메인을 함유하는 서열(예를 들어, 미국 특허 출원 제61/442,106호 참조, 이것은 본 명세서에 이의 전문이 참조로 포함됨)에 의해서 보유될 수 있다.
본 명세서에 실질적으로 제시된 바와 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분에서 CDR로서 보유될 수 있다. 본 명세서에 실질적으로 제시된 바와 같은 HCDR3 서열은 본 개시내용의 실시형태를 나타내고, 이들 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분에서 HCDR3으로서 보유될 수 있다.
본 개시내용에서 사용된 가변 도메인은 임의의 생식계열 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득될 수 있거나, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열을 기반으로 하는 합성 가변 도메인일 수 있다. CDR 서열(예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여, CDR(예를 들어, CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리에 도입될 수 있다.
예를 들어, 마크스(Marks) 등(Bio/Technology 10:779-783 (1992; 이것은 본 명세서에 이의 전문이 참조로 포함됨)은 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 제공하는데, 여기서 가변 도메인 영역의 5' 단부에서 지향되거나 또는 그것에 인접한 컨센서스 프라이머가 인간 VH 유전자의 제3 프레임워크 영역에 컨센서스 프라이머와 함께 사용되어 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공한다. 마크스 등은 이러한 레퍼토리를 특정 항체의 CDR3과 조합할 수 있는 방법을 추가로 기술한다. 유사한 기술을 사용하여, 본 개시내용의 CDR3-유래된 서열은 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플링되고, 셔플링된 완벽한 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합되어 항원 결합 단백질을 제공할 수 있다. 이어서, 레퍼토리는 적합한 숙주계, 예컨대, 국제 출원 공개 제WO92/01047호 또는 문헌[Kay et al., (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press]을 비롯한, 다수의 후속 문헌 중 임의의 것의 파지 디스플레이 시스템에 디스플레이될 수 있어서, 적합한 항원 결합 단백질이 선택될 수 있다. 레퍼토리는 104 개체 구성원을 초과하게, 예를 들어 106 내지 108, 또는 1010 구성원으로부터의 어느 것으로부터 이루어질 수 있다. 다른 적합한 숙주계는 효모 디스플레이, 박테리아 디스프레이, T7 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 포함한다. 리보솜 디스플레이의 검토에 대해서는 문헌[Lowe et al., Curr. Pharm. Biotech. 517-527 (2004)] 및 국제 출원 공개 제WO92/01047을 참조하기 바라며, 이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함된다. 유사한 셔플링 조합 기술은 또한 스테머(Stemmer(Nature 370:389-391 (1994), 이것은 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)에 의해서 개시되어 있는데, 이것은 β-락타마제 유전자와 관련하여 기술을 기술하지만, 그 접근법은 항체의 생성을 위해서 사용될 수 있다는 것이 관찰된다.
ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 항체 및 항-ActRIIB 항체)는, 그것이 ActRII에 대한 참조 분자의 결합을 어느 정도로 차단하는 정도까지 ActRII에 결합하면 ActRII(예를 들어, 각각 ActRIIB 및/또는 ActRIIA)에 대한 결합에 대해서 참조 분자와 "경쟁한다"고 한다. ActRII에 대한 결합에 대해서 경쟁하고, 따라서 ActRII에 대한 또 다른 것의 결합을 방해, 차단 또는 "교차-차단(cross-block)"하는 단백질의 능력은 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정, 표면 플라스몬 공명(SPR; BIACORE(등록상표), 바이오센서(Biosensor), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 비롯한 관련 기술 분야에 공지된 임의의 표준 경쟁 결합 검정에 의해서 또는 스타차드(Scatchard) 등(Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))에 의해서 기술된 방법에 따라서 결정될 수 있다. ActRII-결합 단백질은 ActRII에 대한 참조 분자의 결합을, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해한다고 할 수 있다. 일부 양상에 따라서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 대한 참조 분자의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해한다. 다른 양상에 따라서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 대한 참조 분자의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60% 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 저해한다.
ActRII-결합 단백질
ActRII에 특이적으로 결합하는 단백질이 제공된다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 TGF-베타 수용체 패밀리 구성원이 아닌 대조군 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질의 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRII에 결합한다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 결합하고, 1μM 미만, 100nM 미만, 10nM 미만, 1nM 미만, 0.1nM 미만, 10pM 미만, 1pM 미만 또는 0.1pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 1μM 이하 및 0.1pM 이상, 100μM 이하 및 0.1pM 이상 또는 100μM 이하 및 1pM 이상의 범위 내의 인간 ActRII에 대한 KD를 갖는다.
일부 양상에서, BIACORE(등록상표) 분석법을 사용하여 참조 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)에 의해서 ActRII 단백질에 대한 결합과 경쟁하고/이것을 차단하는 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)의 능력을 결정한다. BIACORE(등록상표) 장비(예를 들어 BIACORE(등록상표) 3000)가 제조사의 제안에 따라서 작동되는 추가 양상에서, ActRII-Fc 융합 단백질을 이미 부착된 항-niFc IgG에 의해서 CM5 BIACORE(등록상표) 칩 상에 포획하여 ActRII-코팅된 표면을 생성시킨다. 전형적으로 200 내지 800 공명 단위의 ActRII-Fc(이량체)가 칩에 커플링할 것이다(측정 가능한 결합 수준을 쉽게 제공하지만 사용될 시험 시약의 농도에 의해서 용이하게 포화될 수 있는 양).
서로와 경쟁하고/서로를 차단하는 이들의 능력에 대해서 평가될 두 ActRII-결합 단백질(A* 및 B*라 칭함)을 적합한 완충제 중에서 결합 부위의 1 대 1 몰비로 혼합하여 시험 혼합물을 생성시킨다. 결합 부위 기준으로 농도를 계산하는 경우, ActRII-결합 단백질의 분자량은 ActRII-결합 단백질의 총 분자량을 그 ActRII-결합 단백질 상의 ActRII-결합 부위의 수로 나눈 것이라 추정된다. 시험 혼합물 중의 각각의 ActRII-결합 단백질(즉, A* 및 B*)의 농도는 BIACORE(등록상표) 칩 상에 포획된 ActRII-Fc 분자 상의 그 ActRII-결합 단백질에 대해서 결합 부위를 용이하게 포화시키기에 충분히 높아야 한다. 혼합물 중의 A* 및 B* ActRII-결합 단백질은 동일한 몰 농도(결합 기준)로 존재하고, 그 농도는 전형적으로 1.00 내지 1.5마이크로몰(결합 부위 기준)일 것이다. ActRII-결합 단백질 A* 단독 및 ActRII-결합 단백질 B* 단독을 함유하는 별개의 용액을 또한 제조한다. 이들 용액 중의 ActRII-결합 단백질 A* 및 ActRII-결합 단백질 B*는 시험 혼합물과 동일한 완충제 중에 그리고 동일한 농도로 존재해야 한다. 시험 혼합물을 ActRII-Fc-코팅된 BIACORE(등록상표) 칩 상에 통과시키고, 결합의 총량을 기록한다. 이어서 칩을 칩-결합된 ActRII-Fc를 손상시키지 않으면서 결합된 ActRII-결합 단백질을 제거하도록 하는 방식으로 처리한다. 전형적으로, 이것은 30mM HC1로 60초 동안 칩을 처리함으로써 수행된다. 이어서, ActRII-결합 단백질 A* 단독의 용액을 ActRII-Fc-코팅된 표면 상에 통과시키고, 결합의 양을 기록한다. 칩을 칩-결합된 ActRII-Fc를 손상시키지 않으면서 결합된 항체를 제거하도록 다시 처리한다. 이어서, ActRII-결합 단백질 B* 단독의 용액을 ActRII-Fc-코팅된 표면 상에 통과시키고, 결합의 양을 기록한다. 다음으로, ActRII-결합 단백질 A*과 ActRII-결합 단백질 B*의 혼합물의 최대 이론 결합을 계산하고, ActRII 표면 상을 단독으로 통과하는 경우 각각의 ActRII-결합 단백질의 결합의 합을 계산한다. 혼합물의 실제 기록된 결합이 이러한 이론 최대치보다 낮으면, 두 ActRII-결합 단백질은 서로와 경쟁/서로를 차단한다. 따라서, 일반적으로, 차단 ActRII-결합 단백질은 상기 BIACORE(등록상표) 차단 검정에서 ActRII에 결합할 것이어서 검정 동안 그리고 제2 ActRII-결합 단백질의 존재 하에서 기록된 결합이 조합물의 두 ActRII-결합 단백질의 (상기에 정의된 바와 같은) 최대 이론 결합의 80% 내지 0.1%(예를 들어, 80% 내지 4% 초과), 구체적으로 최대 이론 결합의 75% 내지 0.1 %(예를 들어, 75% 내지 4%), 보다 구체적으로 최대 이론 결합의 70% 내지 0.1%(예를 들어, 70% 내지 4%)인 것이다.
상기에 기술된 BIACORE(등록상표) 검정은 두 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRII 항체가 ActRII에 대한 결합에 대해서 서로와 경쟁하고/서로를 차단하는지를 결정하기 위해서 사용되는 예시적인 검정이다. 희귀한 경우에, 특정 ActRII-결합 단백질은 항-Fc IgG를 통해서 CM5 BIACORE(등록상표) 칩에 커플링된 ActRII-Fc에 결합하지 않을 수 있다(이것은 ActRII 상의 관련된 결합 부위가 Fc에 대해서 ActRII 링키지에 의해서 마스킹 또는 파괴된 경우 일어날 수 있다). 이러한 경우, 차단은 ActRII의 태깅된 버전, 예를 들어, C-말단 His-태킹된 ActRII를 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 특정 포맷에서, 항-His 항체를 BIACORE(등록상표) 칩에 커플링시키고, 이어서 His-태킹된 ActRII를 칩의 표면 상에 통과시키고, 항-His 항체에 의해서 포획할 것이다. 각각의 칩 재생 사이클 후에 새로운 His-태킹된 ActRII를 항-His 항체로 코팅된 표면 상에 다시 적재하는 것을 제외하고는, 교차-차단 분석법을 본질적으로 상기에 기술된 바와 같이 수행할 것이다. 더욱이, 다양한 다른 공지된 태그 및 태그 결합 단백질 조합물이 이러한 차단 분석법을 위해서 사용될 수 있다(예를 들어, 항-HA 항체를 갖는 HA 태그; 항-FLAG 항체를 갖는 FLAG 태그; 스트렙타비딘을 갖는 바이오틴 태그). 하기는 ActRII-결합 단백질이 ActRII에 대한 참조 ActRII-결합 단백질의 결합을 차단하거나 또는 차단할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 ELISA 검정을 일반적으로 기술한다.
일부 양상에서, ELISA를 사용하여 참조 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체 또는 ActRII 리간드)을 사용하여 ActRII 단백질에 대한 결합에 대해서 경쟁하는 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)의 능력을 결정한다. 이러한 검정의 일반적인 원칙은 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)을 갖는 것이다. 과량의 제2의 잠재적인 차단, 시험 ActRII-결합 단백질을 용액으로 첨가한다(즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않음). 이어서, 제한된 양의 ActRII(또는 대안적으로 ActRII-Fc)를 웰에 첨가한다. 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질 및 용액 중의 시험 ActRII-결합 단백질은 제한된 수의 ActRII(또는 ActRII-Fc) 분자의 결합에 대해서 경쟁한다. 플레이트를 세척하여 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질에 의해서 결합되지 않은 ActRII를 제거하고 또한 시험, 용액-상 ActRII-결합 단백질뿐만 아니라 시험, 용액-상 ActRII-결합 단백질과 ActRII 간에 형성된 임의의 착물을 제거한다. 이어서 결합된 ActRII의 양을 적절한 ActRII 검출 시약을 사용하여 측정한다. ActRII에 대한 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질의 결합을 차단할 수 있는 용액 중의 시험 ActRII-결합 단백질은 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질이 제2의 용액-상 시험 ActRII-결합 단백질의 부재 하에서 결합할 수 있는 ActRII 분자의 수에 비해서 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질이 결합할 수 있는 ActRII 분자의 수를 감소시킬 수 있을 것이다. 검정에 대한 배경 신호는 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질, 용액-상 시험 ActRII-결합 단백질, ActRII 완충제 단독(즉, ActRII 없음) 및 ActRII 검출 시약을 갖는 웰에서 수득된 신호로서 정의된다. 검정에 대한 양성 대조군 신호는 코팅된 참조 ActRII-결합 단백질, 용액-상 시험 ActRII-결합 단백질, 완충제 단독(즉, 용액-상 시험 ActRII-결합 단백질 없음), ActRII 및 ActRII 검출 시약을 갖는 웰에서 수득된 신호로서 정의된다. ELISA 검정은 배경 신호의 적어도 3배의 양성 대조군 신호를 갖도록 하는 그러한 방식으로 수행될 것이다. 방법론적 인공물에 대한 대조군으로서, 교차-차단 검정은 단지 기술되고, 또한 역전된 포맷으로 수행될 수 있는데, 코팅된 항체로서 시험 ActRII-결합 단백질을 사용하고 용액-상 항체로서 참조 ActRII-결합 단백질을 사용한다.
일부 양상에서, 리포터 유전자 검정을 사용하여 ActRII(예를 들어, ActRIIB)을 중화시키는 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)의 능력을 결정한다. 일부 양상에서, 리포터 유전자 검정을 재조합 A204 세포를 사용하여 수행하여 ActRII(예를 들어, ActRIIB) 활성도를 중화시키는 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)의 능력을 결정한다. 이러한 검정은 (CAGA)12 모티프를 함유하는 pGL3(CAGA)12 플라스미드로 형질주입된 인간 횡문근육종 세포주(예를 들어, 문헌[Dennler et al., EMBO 17:3091-3100 (1998)] 및 미국 특허 제8,765,385호 참조, 이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함됨)뿐만 아니라 형질주입 효율을 위한 대조군에 대한 ReniUa 리포터 플라스미드(pRLCMV)를 기반으로 한다. CAGA12 모티프는 TGF-베타 반응성 유전자(PAI-1 유전자) 내에 존재하여, 따라서 이러한 벡터는 일반적으로 Smad2 및 Smad3을 통한 신호전달 인자에 사용된다. 이러한 검정을 사용하여 후보자 단백질의 ActRIIB-결합 활성도를 측정하는 것과 관련하여, A204 세포주는 ActRIIB보다는 주로 ActRIIA를 발현하기 때문에, 잠재적인 ActRIIB 중화 능력에 대해서 항체를 직접 시험하는 것이 가능하지 않다. 대신에, 이러한 검정은 ActRIIB 및 ActRIIA 둘 모두에 대해서 높은 친화도로 결합할 수 있는 리간드(예컨대, 액티빈 A 또는 GDF11)에 의해서 내인성 ActRIIA의 활성화에 대한 가용성 융합 단백질 ActRIIB-Fc의 저해 효과를 중화시키는 시험 ActRII 단백질 결합 후보자의 능력을 검출하도록 설계된다. 따라서, 이러한 검정에서, ActRIIB-결합이 중화되면 ActRIIB-Fc의 존재에도 불구하고 ActRIIA의 리간드-매개된 활성화가 일어날 것이다.
검정 제1일에, A204 세포(ATCC HTB-82)를 웰당 105 세포로 48-웰 플레이트에 분포시킨다. 제2일에, 10㎍ pGL3(CAGA)12, 1㎍ pRLCMV, 30㎕ 퓨젠(Fugene) 6 (로슈 다이어그나스틱스(Roche Diagnostics)), 및 970㎕ OptiMEM(인비트로젠)을 30분 동안 사전인큐베이션시키고, 이어서 맥코이 성장 배지(McCoy's growth medium)를 첨가하고, 이것을 실온에서 밤새 인큐베이션을 위해서 플레이팅된 세포(500㎕/웰)에 적용한다. 제3일에, 배지를 제거하고, 세포를 6시간 동안 37℃에서 리간드 및 하기에 기술된 바와 같이 제조된 저해제의 혼합물과 함께 인큐베이션시킨다.
일 양상에 따라서, ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRII 항체의 중화 효력을 평가하고, 이에 의해서 시험 단백질의 연속 희석물을 48-웰 플레이트에서 검정 완충제(맥코이 배지 + 0.1 % BSA)의 200㎕ 부피로 제조한다. ActRIIB 활성도를 중화시키는 후보 단백질의 능력을 평가하는 검정을 위해서, 이어서 검정 완충제 중의 동일 부피의 ActRIIB-Fc(200㎍/㎖)를 첨가한다. 시험 용액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 400㎕의 액티빈 A(10ng/㎖)를 모든 웰에 첨가하고, 350㎕의 이 혼합물을 A204 세포의 48-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다. 시험 단백질의 각각의 농도를 2회 시험한다. ActRIIB 활성도를 중화시키는 후보 단백질의 능력을 평가하는 검정을 위해서, ActRIIB-Fc의 최종 농도는 50ng/㎖(이것은 액티빈 A의 최종 농도가 5ng/㎖인 경우 액티빈 A 신호전달의 이러한 저해제에 대한 IC50임)이다. 시험 용액과 6시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 0.1% BSA를 함유하는 인산염-완충 염수로 헹구고, 이어서 능동 용해 완충제(프로메가 E1941)로 용해시키고, 밤새 -70℃에서 저장한다. 제4일 및 마지막 날에, 플레이트를 약하게 진탕하면서 실온까지 가온시킨다. 세포 용해물을 2회 반복물로 화학발광 플레이트(96-웰)로 옮기고, 루미노미터(luminometer)에서 듀얼-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(프로메가 E1980)으로부터의 시약을 사용하여 분석하여 정규화된 루시퍼라제 활성도를 결정한다.
ActRIIB를 중화시키고, 치료 이익을 제공할 수 있는 이들 결합 단백질을 식별하기 위해서 ActRIIB 신호전달에 의존성인 약력학적 파라미터를 ActRIIB-결합 단백질의 생체내 시험을 위한 종점으로서 측정할 수 있다. ActRIIB 중화 결합제는 이러한 약력학적 파라미터에서, 비히클-치료된 동물과 비교할 때, 통계학적으로 유의한 변화를 유발할 수 있는 것으로서 정의된다. 이러한 생체내 시험은 임의의 적합한 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트 또는 원숭이)에서 수행될 수 있다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 TGF-베타 수용체 패밀리 구성원이 아닌 대조군 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질의 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRIIA에 결합한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 TGF-베타 수용체 패밀리 구성원이 아닌 대조군 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질의 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRIIA에 결합한다. 특정 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 ActRIIA에 결합하고, 1μM 미만, 100nM 미만, 10nM 미만, 1nM 미만, 0.1nM 미만, 10pM 미만, 1pM 미만 또는 0.1pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 1μM 이하 및 0.1pM 이상, 100μM 이하 및 0.1pM 이상 또는 100μM 이하 및 1pM 이상의 범위 내의 인간 ActRIIA에 대한 KD를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 TGF-베타 패밀리 구성원이 아닌 대조군 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질의 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRIIB에 결합한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 TGF-베타 수용체 패밀리 구성원이 아닌 대조군 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질의 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRIIB에 결합한다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 결합하고, 1μM 미만, 100nM 미만, 10nM 미만, 1nM 미만, 0.1nM 미만, 10pM 미만, 1pM 미만 또는 0.1pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 1μM 이하 및 0.1pM 이상, 100μM 이하 및 0.1pM 이상 또는 100μM 이하 및 1pM 이상의 범위 내의 인간 ActRIIB에 대한 KD를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 TGF-베타 패밀리 구성원이 아닌 대조군 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질의 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 TGF-베타 수용체 패밀리 구성원이 아닌 대조군 단백질에 대한 ActRII-결합 단백질의 친화도보다 적어도, 100, 500 또는 1000배 더 큰 친화도로 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합한다. 특정 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하고, 1μM 미만, 100nM 미만, 10nM 미만, 1nM 미만, 0.1nM 미만, 10pM 미만, 1pM 미만 또는 0.1pM 미만의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA- 및 ActRIIB-결합 단백질은 1μM 이하 및 0.1pM 이상, 100μM 이하 및 0.1pM 이상 또는 100μM 이하 및 1pM 이상의 범위 내의 인간 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 KD를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하는 항체이다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 전장 항-ActRIIA 항체 또는 전장 항-ActRIIB 항체이다. 추가적인 양상에서, 항체는 단클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 또는 이의 ActRII-결합 항체 단편이다. 추가적인 양상에서, 항체는 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 특이적으로 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체 및 ActRII-결합 항체 단편)은 종에 걸쳐서 ActRII 분자에 결합할 수 있다.
인간 ActRIIA의 성숙 ActRIIA 세포외 도메인(서열번호 138)은 단지 2개의 보존된 아미노산 치환(즉, K19R 및 V72I)이 마우스 ActRIIA 오쏘로그(Ref. P27038)의 것과 상이하다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 인간ActRIIA(hActRIIA) 및 뮤린 ActRIIA(murActRIIA)에 결합할 수 있다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 항-ActRIIA 항체(예를 들어, 전장 ActRIIA-항체, ActRIIA-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)이고, BIACORE(등록상표) 또는 KINEXA(등록상표)에 의해서 결정되는 경우, 10-8M 미만, 10-9M 미만 또는 10-10M 미만의 해리 상수 또는 KD로 ActRIIA(예를 들어,hActRIIA 또는 murActRIIA)에 특이적으로 결합할 수 있다. 추가 양상에서, 항-ActRIIA 항체는 1nM 미만(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)의 KD 로 ActRIIA에 결합한다. 추가 양상에서, 항-ActRIIA 항체는 1nM의 한자릿수 또는 1nM의 두자릿수 내의 KD로 ActRIIA에 결합한다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 1μM 이하 및 0.1pM 이상, 100μM 이하 및 0.1pM 이상 또는 100μM 이하 및 1pM 이상의 범위 내의 인간 ActRIIA에 대한 KD를 갖는다.
인간 ActRIIB의 성숙 세포외 도메인(서열번호 139)은 하나의 아미노산 치환(즉, A95P)이 마우스 ActRIIB 오쏘로그(NCBI Ref. Seq. NP 031423)의 상응하는 서열과 상이하다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 BIACORE(등록상표) 또는 KINEXA(등록상표)에 의해서 결정되는 경우, 10-8M 미만, 10-9M 미만 또는 10-10M 미만의 해리 상수 또는 KD로 ActRIIB(예를 들어,hActRIIB 또는 murActRIIB)에 특이적으로 결합하는 항-ActRIIB 항체(예를 들어, 전장 ActRIIB-항체, ActRIIB-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)이다. 추가 양상에서, 항-ActRIIB 항체는 1nM 미만( BIACORE(등록상표) 또는 KINEXA(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)의 KD로 ActRIIB에 결합한다. 추가 양상에서, 항-ActRIIB 항체는 1nM의 한자릿수 또는 1nM의 두자릿수 내의 KD로 ActRIIB에 결합한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 1μM 이하 및 0.1pM 이상, 100μM 이하 및 0.1pM 이상 또는 1nM 이하 및 1pM 이상의 범위 내의 인간 ActRIIB에 대한 KD를 갖는다.
일부 양상에서, 항-ActRII 항체는 ActRII-결합 항체 단편이다. 일부 양상에서, ActRII-결합 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 다이아바디, 또는 단일 쇄 항체 분자이다. 추가적인 양상에서, ActRII-항체는 Fd, 단일 쇄 Fv(scFv), 다이설파이드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트라이아바디, 다이아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, scFv-Fc 또는 비스-scFv이다.
추가적인 양상에서 ActRII-결합 단백질은 VH 및 VL을 포함하는 항체이다. 일부 양상에서 항-ActRII 항체는 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 포함한다: (a) 인간 IgA 불변 영역, 또는 이의 단편; (b) 인간 IgD 불변 영역, 또는 이의 단편; (c) 인간 IgE 불변 도메인, 또는 이의 단편; (d) 인간 IgG1 불변 영역, 또는 이의 단편; (e) 인간 IgG2 불변 영역, 또는 이의 단편; (f) 인간 IgG3 불변 영역, 또는 이의 단편; (g) 인간 IgG4 불변 영역, 또는 이의 단편; 및 (h) 인간 IgM 불변 영역, 또는 이의 단편. 특정 양상에서 ActRII-결합 단백질은 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편, 예를 들어, 인간 IgG 불변 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 변경된 효과기 기능 및/또는 반감기를 갖거나 이를 갖도록 돌연변이된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다.
특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 효과기 기능을 감소시키는 돌연변이를 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체이다(예를 들어, 문헌[Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001); Sazinsky et al., PNAS USA 105:20167-20172 (2008); Davis et al., J. Rheumatol.34:2204-2210 (2007); Bolt et al., Eur. J. Immunol. 23:403-411 (1993); Alegre et al., Transplantation 57:1537-1543 (1994); Xu et al., Cell Immunol. 200:16-26 (2000); Cole et al., Transplantation 68:563-571 (1999); Hutchins et al., PNAS USA 92:11980-11984 (1995); Reddy et al., J. Immunol. 164:1925-1933 (2000); 국제 특허 제WO97/11971호, 및 제WO07/106585호; 미국 출원 공개 제2007/0148167A1호; McEarchern et al., Blood 109:1185-1192 (2007); Strohl, Curr. Op. Biotechnol.20:685-691 (2009); 및 Kumagai et al., J. Clin. Pharmacol. 47:1489-1497 (2007)] 참조, 이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함됨).
일부 양상에서, 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편은 야생형 IgG 불변 도메인에 비해서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기에 비해서 감소된 ADCC를 갖는다. ADCC를 감소시키는 제공된 항체에 함유된 Fc 서열 조작 변형의 예는 하기에 상응하는 하나 이상의 변형을 포함하고: IgG1-K326W, E333S; IgG2-E333S; IgG1-N297A; IgG1-L234A, L235A; IgG2-V234A, G237A; IgG4-L235A, G237A, E318A; IgG4-S228P, L236E; IgG2-EU 서열 118-260; IgG4-EU 서열 261-447; IgG2-H268Q, V309L, A330S, A331S; IgG1-C220S, C226S, C229S, P238S; IgG1-C226S, C229S, E233P, L234V, L235A; 및 IgG1-L234F, L235E, P331S, 여기서 위치 넘버링은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따른다.
특정 양상에서 ActRII-결합 단백질은 감소된 CDC 활성도를 갖거나 또는 이를 갖도록 돌연변이된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 CDC 활성도를 감소시키는 돌연변이를 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체이다(예를 들어, 국제 특허 제WO97/11971호 및 제WO07/106585호; 미국 출원 공개 제2007/0148167A1호; 문헌[McEarchern et al., Blood 109:1185-1192 (2007); Hayden-Ledbetter et al., Clin. Cancer 15:2739-2746 (2009); Lazar et al., PNAS USA 103:4005-4010 (2006); Bruckheimer et al., Neoplasia 11:509-517 (2009); Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); 및 Sazinsky et al., PNAS USA 105:20167-20172 (2008)] 참조; 이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함됨). CDC를 감소시키는 항-ActRII 항체에 함유된 Fc 서열 조작 변형의 예는 하기에 상응하는 하나 이상의 변형을 포함한다: IgG1-S239D, A330L, I332E; IgG2 EU 서열 118-260; IgG4-EU 서열 261-447; IgG2-H268Q, V309L, A330S, A331S; IgG1-C226S, C229S, E233P, L234V, L235A; IgG1-L234F, L235E, P331S; 및 IgG1-C226S, P230S.
추가 양상에서, 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편은 야생형 IgG 불변 도메인에 비해서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기에 비해서 증가된 반감기를 갖는다. 예를 들어, IgG 불변 도메인은 위치 251 내지 257, 285 내지 290, 308 내지 314, 385 내지 389, 및 428 내지 436에서 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있고, 여기서 아미노산 위치 넘버링은 카밧에 제시된 바와 같은 EU 인덱스를 따른다. 특정 양상에서 IgG 불변 도메인은 카밧 위치 252에서의 아미노산의 Tyr, Phe, Trp 또는 Thr로의 치환; 카밧 위치 254에서의 아미노산의 Thr로의 치환; 카밧 위치 256에서의 아미노산의 Ser, Arg, Gln, Glu, Asp 또는 Thr로의 치환; 카밧 위치 257에서의 아미노산의 Leu로의 치환; 카밧 위치 309에서의 아미노산의 Pro로의 치환; 카밧 위치 311에서의 아미노산의 Ser으로의 치환; 카밧 위치 428에서의 아미노산의 Thr, Leu, Phe 또는 Ser으로의 치환; 카밧 위치 433에서의 아미노산의 Arg, Ser, Iso, Pro 또는 Gln으로의 치환; 또는 카밧 위치 434에서의 아미노산의 Trp, Met, Ser, His, Phe 또는 Tyr으로의 치환 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 보다 구체적으로, IgG 불변 도메인은 카밧 위치 252에서의 아미노산의 Tyr으로의 치환, 카밧 위치 254에서의 아미노산의 Thr으로의 치환, 및 카밧 위치 256에서의 아미노산의 Glu으로의 치환을 비롯하여, 야생형 인간 IgG 불변 도메인에 대해서 아미노산 치환을 함유할 수 있다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 항체이다. 추가 양상에서, 항체는 인간 Ig 카파 불변 영역 또는 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3, 여기서 CDR은 표 1에 개시된 VH 및 VL 쌍으로 존재한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 CDR의 세트를 포함하고, 여서 CDR은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍으로 존재한다: (a) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40의 VH 서열, 및 서열번호 9의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함), (b) 서열번호 63 또는 77의 VH 서열, 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c) 서열번호 45 또는 57의 VH 서열, 및 서열번호 50의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (d) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH 서열, 및 서열번호 91의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함), 및 (e) 서열번호 125의 VH 서열, 및 서열번호 132의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함).
추가 실시형태에서, ActRII-결합 단백질은 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 CDR은 (a) 서열번호 144의 VH 서열, 및 서열번호 151의 VL 서열을 갖는 VH 및 VL 쌍으로 존재하고, 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
추가 실시형태에서, ActRII-결합 단백질은 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 CDR은 (a) 서열번호 165의 VH 서열, 및 서열번호 172의 VL 서열을 갖는 VH 및 VL 쌍으로 존재하고, 그리고 여기서 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다.
일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 하기 CDR의 세트를 포함하고: (a) VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3, 또는 (b) VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 본 명세서에 개시된 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 표 1에 개시된 VH 또는 VL 서열에서의 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다.
일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 본 명세서에 개시된 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 CDR의 세트를 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 표 1에 개시된 VH 및 VL 서열 쌍에서의 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 64 또는 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65 또는 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 145의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2은 서열번호 146의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 147의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 152의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 153의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 154의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 (i) VH-CDR1은 서열번호 166의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 167의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 168의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 173의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 175의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, CDR의 참조 세트로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 10개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDR의 세트를 포함하고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고 ; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; 및 (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (f)(i) VH-CDR1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (g)(i) VH-CDR1은 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합하고; 그리고 (h)(i) VH-CDR1은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (i)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (j)(i) VH-CDR1은 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (k)(i) VH-CDR1은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (l)(i) VH-CDR1은 서열번호 99의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (m)(i) VH-CDR1은 서열번호 106의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 107의 아미노산 서열을 갖고, (iii) VH-CDR3은 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (n)(i) VH-CDR1은 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (o)(i) VH-CDR1는 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3는 서열번호 121의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (p)(i) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIA에 결합한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 64 또는 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65 또는 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (f)(i) VH-CDR1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (g)(i) VH-CDR1은 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (h)(i) VH-CDR1은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (i)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; 또는 (j)(i) VH-CDR1은 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a)(i) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; 또는 (c)(i) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는다(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함). 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 VH-CDR1은 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖고; VH-CDR2는 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖고; VH-CDR3은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 99의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 106의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 107의 아미노산 서열을 갖고, (iii) VH-CDR3은 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는다(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함). 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 VH-CDR1는 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖고; VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖고; VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖고, VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖고; VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖거나; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖거나; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖거나; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖거나; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖거나; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 의 아미노산 서열을 갖거나; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 64 또는 78의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65 또는 79의 아미노산 서열을 갖거나; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖거나; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖거나; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 VH 및 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3를 포함하고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖거나; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖거나; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖거나; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖거나; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖거나; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 의 아미노산 서열을 갖거나; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 64 또는 78의 아미노산 서열을 갖거나; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65 또는 79의 아미노산 서열을 갖거나; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖거나; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖거나; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 VH 및 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 (a) VH-CDR1은 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VH-CDR2는 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖거나; (c) VH-CDR3은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖거나; (d) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖거나; (e) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (f) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함고, 여기서 (a) VH-CDR1은 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VH-CDR2는 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖거나; (c) VH-CDR3은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖거나; (d) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖거나; (e) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (f) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖거나; (c) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖거나; (d) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖거나; (e) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (f) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서: (a) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖거나; (c) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖거나; (d) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖거나; (e) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (f) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트를 포함하고, 여기서 (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하고; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 64 또는 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65 또는 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합하고; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합한다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 CDR의 세트를 포함하고, 여기서: (a)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b)(i) VH-CDR1은 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고 ; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c)(i) VH-CDR1은 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d)(i) VH-CDR1은 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (e)(i) VH-CDR1은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; 및 (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (f)(i) VH-CDR1은 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (g)(i) VH-CDR1은 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합하고; 그리고 (h)(i) VH-CDR1은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (i)(i) VH-CDR1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (j)(i) VH-CDR1은 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 59의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (k)(i) VH-CDR1은 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (l)(i) VH-CDR1은 서열번호 99의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (m)(i) VH-CDR1은 서열번호 106의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 107의 아미노산 서열을 갖고, (iii) VH-CDR3은 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (n)(i) VH-CDR1은 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3은 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 그리고 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나 또는; (o)(i) VH-CDR1는 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖고; (ii) VH-CDR2는 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖고; (iii) VH-CDR3는 서열번호 121의 아미노산 서열을 갖고; (iv) VL-CDR1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖고; (v) VL-CDR2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖고; (vi) VL-CDR3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖고; 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합한다.
일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 VH-CDR3 또는 VL-CDR3 서열을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 표 1에 개시된 VH-CDR3 또는 VL-CDR3 서열을 포함한다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 VH-CDR3 및 VL-CDR3 서열을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 표 1에 개시된 VH-CDR3 및 VL-CDR3 서열을 포함한다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 5, 46, 66 또는 80의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 ActRIIB-결합 단백질을 제공한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 4, 18, 24, 30 또는 36의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 3, 17, 23, 29, 35 또는 41의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다.
추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 12, 53 또는 73의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하는 ActRIIB-결합 단백질을 제공한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하고, 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질을 제공한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 서열번호 87, 101, 108, 115 또는 121의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 86, 100, 107, 114 또는 120의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2 및 서열번호 85, 99, 106 또는 113의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA 결합 단백질은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB- 및/또는 ActRIIA 결합 단백질은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 99의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 108의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 107의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 106의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 115의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 121의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 120의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 113의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하는 ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질을 제공한다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및/또는 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 142의 아미노산 서열을 갖는 VH-항원 결합 도메인 3(ABD3)을 포함하는 ActRIIB- 및/또는 ActRIIA-결합 단백질을 제공한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 142의 아미노산 서열을 갖는 VH-ABD3 및 서열번호 141의 아미노산 서열을 갖는 VH-항원 결합 도메인 2(VH-ABD2)를 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는 VH-ABD3, 서열번호 141의 아미노산 서열을 갖는 VH-ABD2, 및 서열번호 140의 아미노산 서열을 갖는 VH-항원 결합 도메인 1(VH-ABD1)을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3을 포함하는 ActRIIA-결합 단백질을 제공한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3 및 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 128의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR3, 서열번호 127의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR2, 및 서열번호 126의 아미노산 서열을 갖는 VH-CDR1을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, 본 개시내용은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3을 포함하는 ActRIIA-결합 단백질을 제공한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3 및 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2를 포함한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 서열번호 135의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR3, 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR2, 및 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는 VL-CDR1을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 참조 VH 또는 VL에 비해서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 또는 VL를 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 표 1에 개시된 참조 VH 또는 VL에 비해서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 또는 VL를 포함한다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 참조 VH 및 VL 쌍에 비해서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 및 VL 쌍을 포함한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 참조 VH 및 VL 쌍에 비해서 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 및 VL 쌍을 포함한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a)(i) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (b)(i) 서열번호 45 또는 57의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 50의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c)(i) 서열번호 63 또는 77의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 70의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (d)(i) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119로 이루어진 군으로부터 선택된 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); 및 (e)(i) 서열번호 125의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 132의 참조 VL로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함).
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 (i) 서열번호 144의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 151의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열을 갖는 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 (i) 서열번호 165의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VH 서열, 및 (ii) 서열번호 172의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 VL 서열을 갖는 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서: VH 서열은 서열번호 2의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (b) VH 서열은 서열번호 16의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (c) VH 서열은 서열번호 22의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (d) VH 서열은 서열번호 28의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (e) VH 서열은 서열번호 34의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (f) VH 서열은 서열번호 40의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 9의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (g) 서열은 서열번호 45의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 50의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (h) VH 서열은 서열번호 57의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 50의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (i) VH 서열은 서열번호 63의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 70의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (j) VH 서열은 서열번호 77의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 70의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합하거나; (k) 서열은 서열번호 84의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (l) VH 서열은 서열번호 98의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (m) VH 서열은 서열번호 105의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (n) VH 서열은 서열번호 112의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; (o) VH 서열은 서열번호 119의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 91의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합하거나; 또는 (p) VH 서열은 서열번호 125의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; VL 서열은 서열번호 132의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고; 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서 VH 서열은 서열번호 144의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, VL 서열은 서열번호 151의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 여기서 VH 서열은 서열번호 165의 참조 VH 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, VL 서열은 서열번호 172의 참조 VL 서열로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 그리고 여기서 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합한다.
일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 참조 VH 또는 VL과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 또는 VL을 포함한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 표 1에 개시된 참조 VH 또는 VL과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 또는 VL을 포함한다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 참조 VH 및 VL과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다. 추가 양상에서 ActRII-결합 단백질은 표 1에 개시된 참조 VH 및 VL과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a)(i) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB를 결합함); (b)(i) 서열번호 45 또는 57과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 50과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c)(i) 서열번호 63 또는 77과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 70과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB를에 결합함); (d)(i) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 아미노산 서열을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 VL(여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); 및 (e)(i) 서열번호 125와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 132와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함). 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 결합하고, (i) 서열번호 144와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 151와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하고, 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 결합하고, 서열번호 165와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH, 및 (ii) 서열번호 172와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하고, 그리고 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a) 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40의 VH 서열, 및 서열번호 9의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (b) 서열번호 45 또는 57의 VH 서열, 및 서열번호 50의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c) 서열번호 63 또는 77의 VH 서열, 및 서열번호 70의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (d) 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH 서열, 및 서열번호 91의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); 및 (e) 서열번호 125의 VH 서열, 및 서열번호 132의 VL 서열(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함). 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a) 서열번호 2의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (b) 서열번호 16의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (c) 서열번호 22의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (d) 서열번호 28의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (e) 서열번호 34의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (f) 서열번호 40의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (g) 서열번호 45의 VH 서열 및 서열번호 50의 VL 서열;(h) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 50의 VL 서열; (i) 서열번호 63의 VH 서열 및 서열번호 70의 VL 서열; (j) 서열번호 77의 VH 서열 및 서열번호 70의 VL 서열; (k) 서열번호 84의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (l) 서열번호 98의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (m) 서열번호 105의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (n) 서열번호 112의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (o) 서열번호 119의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; 및 (p) 서열번호 125의 VH 서열 및 서열번호 132의 VL 서열.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 서열번호 144의 VH 서열, 및 서열번호 151의 VL 서열을 포함하고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합한다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165의 VH 서열, 및 서열번호 172의 VL 서열을 포함하고; 그리고 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a) 서열번호 2와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (b) 서열번호 16과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (c) 서열번호 22와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (d) 서열번호 28과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (e) 서열번호 34와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (f) 서열번호 40과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (g) 서열번호 45와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 50과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함);(h) 서열번호 57과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 50과 와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (i) 서열번호 63과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 70과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (j) 서열번호 77과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 70과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB에 결합함); (k) 서열번호 84와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); (l) 서열번호 98과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); (m) 서열번호 105와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); (n) 서열번호 112와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); (o) 서열번호 119와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 결합함); 및 (p) 서열번호 125와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 132와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL(그리고 여기서 단백질은 ActRIIA에 결합함). 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 144와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 151와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하고; 그리고 단백질은 ActRIIB에 결합한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 172와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하고, 그리고 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 결합한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다: (a) 서열번호 2의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (b) 서열번호 16의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (c) 서열번호 22의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (d) 서열번호 28의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (e) 서열번호 34의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (f) 서열번호 40의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열; (g) 서열번호 45의 VH 서열 및 서열번호 50의 VL 서열;(h) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 50의 VL 서열; (i) 서열번호 63의 VH 서열 및 서열번호 70의 VL 서열; (j) 서열번호 77의 VH 서열 및 서열번호 70의 VL 서열; (k) 서열번호 84의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (l) 서열번호 98의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (m) 서열번호 105의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (n) 서열번호 112의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열; (o) 서열번호 119의 VH 서열 및 서열번호 91의 서열; 및 (p) 서열번호 125의 VH 서열 및 서열번호 132의 서열.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 서열, 및 서열번호 151의 VL 서열을 포함한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 서열, 및 서열번호 172의 VL 서열을 포함한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 2, 16, 22, 28, 34, 40, 45, 57, 63 또는 77과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 2와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 16과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 22와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 28과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 34과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 40과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 45와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 57과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 63과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 77과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 9, 50 또는 70과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 2, 16, 22, 28, 34 또는 40과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 9와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 45 또는 57과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 50과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 45 또는 57과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 50과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL를 포함하고, 여기서, VH는 서열번호 63 또는 77과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고; VL은 서열번호 70과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 63 또는 77과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 70과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 144와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 151과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL를 포함하고, 여기서, VH는 서열번호 144와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고; VL은 서열번호 151과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 151의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 172와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL를 포함하고, 여기서, VH는 서열번호 165와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고; VL은 서열번호 172와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActIIRA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 172의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 및/또는 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIA 및/또는 ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIA 및/또는 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 및/또는 ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA 및 ActRIIB 각각에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 서열번호 84, 98, 105, 112, 또는 119와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 84와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 98과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 105와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 112와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 119와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 84와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 98과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 105와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 112와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 119와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 서열번호 91과 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 125와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 132와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL를 포함하고, 여기서, VH는 서열번호 125와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고; VL은 서열번호 132와 적어도 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 VH 및 VL 서열 쌍을 포함하는 항체와 ActRII에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가적인 양상에서 ActRII-결합 단백질은 표 1에 개시된 VH 및 VL 서열 쌍을 포함하는 항체와 ActRII에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRII-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 표 1에 개시된 ActRII-결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합한다. 참조 ActRII-결합 단백질과 동일한 ActRII의 에피토프와의 결합에 대해서 경쟁하고/이것에 결합하는 ActRII-결합 단백질의 능력은 본 명세서에 개시되거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지된 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 2, 16, 22, 28, 34, 40, 45, 57, 63 또는 77의 VH를 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 9, 50 또는 70의 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 2, 16, 22, 28, 34, 40, 45, 57, 63 또는 77의 VH; 및 서열번호 9, 50 또는 70의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 144의 VH를 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 151의 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 144의 VH 및 서열번호 151의 VL를 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하지만, ActRIIA에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165의 VH를 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 172의 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL를 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 결합한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 결합하지만, AcRIIA에 결합하지 않는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 VKKGCWLDD(서열번호 158)에 결합하지만, AcRIIA에 결합하지 않는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 ActRIIB의 아미노산 잔기 VKKGCWLDD(서열번호 158)에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 ActRIIB의 아미노산 잔기 VKKGCWLDD(서열번호 158)에 결합하지만, ActRIIA에 결합하지 않는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드에 결합한다: (a) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157); (b) ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159); (c) ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161); 및 (d) ActRIIA의 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162).
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 세트에 결합한다: (a) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159); (b) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 아미노산 잔기 VKKGCWLDD(서열번호 158); (c) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157), 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159), 및 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160); (d) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 ActRIIA의 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162); (e) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157), 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160), 및 아미노산 잔기 VKKGCWLDD(서열번호 158); (f) ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159) 및 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161); (g) ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161), 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162), 및 아미노산 잔기 CWLDDI NCYDRT(서열번호 163); (h) ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157), 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159), 및 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160), 및 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161), 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162), 및 아미노산 잔기 CWLDDINCYDRT(서열번호 163).
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 2, 16, 22, 28, 34, 40, 45, 57, 63, 77 또는 144의 VH 및 서열번호 9, 50, 70 또는 151의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 2, 16, 22, 28, 34, 40, 45, 57, 63, 77 또는 144의 VH 및 서열번호 9, 50, 70 또는 151의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및/또는 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체)은 서열번호 2의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 2의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 2의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 16의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 16의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 16의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 22의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 22의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 22의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 28의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 28의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 28의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 34의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 34의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 34의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 40의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 40의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 40의 VH 및 서열번호 9의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 45의 VH 및 서열번호 50의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 45의 VH 및 서열번호 50의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 45의 VH 및 서열번호 50의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 57의 VH 및 서열번호 50의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 57의 VH 및 서열번호 50의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 57의 VH 및 서열번호 50의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 63의 VH 및 서열번호 70의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 63의 VH 및 서열번호 70의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 63의 VH 및 서열번호 70의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 77의 VH 및 서열번호 70의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 77의 VH 및 서열번호 70의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 77의 VH 및 서열번호 70의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 및 서열번호 151의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 및 서열번호 151의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 및 서열번호 151의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 및 서열번호 151의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 및 서열번호 151의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 VKKGCWLDD(서열번호 158)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 144의 VH 및 서열번호 151의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 아미노산 잔기 VKKGCWLDD(서열번호 158)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하지 않는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및/또는 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 결합한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 ActRIIB의 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)에 결합한다. 일부 실시형태에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159)에 결합한다. 추가 실시형태에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157), 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159), 및 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA의 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162)에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161) 및 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA의 아미노산 잔기 CWLDDINCYDRT(서열번호 163)에 결합한다. 추가 실시형태에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161), 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162), 및 아미노산 잔기 CWLDDINCYDRT(서열번호 163)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159) 및 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 ActRIIA의 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162)에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159) 및 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161) 및 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162)에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159), 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157) 및 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160) 및 ActRIIA의 아미노산 잔기 CCEGNMCNEK(서열번호 161), 아미노산 잔기 ECLFFNANWEKD(서열번호 162) 및 아미노산 잔기 CWLDDINCYDRT(서열번호 163)에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159) 및 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159) 및 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159), 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157), 및 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB의 아미노산 잔기 CCEGNFCNER(서열번호 159), 아미노산 잔기 NANWELERT(서열번호 157), 및 아미노산 잔기 GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)에 대한 결합에 대해서 경쟁한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH를 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 91의 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA 및 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 서열번호 84, 98, 105, 112 또는 119의 VH; 및 서열번호 91의 VL을 포함한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165의 VH를 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 172의 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, 서열번호 165의 VH 및 서열번호 172의 VL를 포함한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 84의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 98의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 98의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 98의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 105의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 105의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 105의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 112의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 112의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 112의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 119의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 119의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 119의 VH 및 서열번호 91의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 및 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 125의 VH 및 서열번호 132의 VL을 포함한다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 서열번호 125의 VH 및 서열번호 132의 VL을 포함하는 항체와 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 서열번호 125의 VH 및 서열번호 132의 VL을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIA의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a) VH-CDR1는 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (c) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이하의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 하기 CDR의 세트를 포함하고: VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (c) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, CDR의 세트: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3을 포함하고, 여기서 CDR의 세트는 CDR의 참조 세트와 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 미만의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서: (a) VH-CDR1은 서열번호 3 또는 58의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VH-CDR2는 서열번호 4 또는 59의 아미노산 서열을 갖거나; (c) VH-CDR3은 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖거나; (d) VL-CDR1은 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖거나; (e) VL-CDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (f) VL-CDR3은 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, VH 항원 결합 도메인(ABD)의 세트: VH-ABD1, VH-ABD2, VH-ABD3, VL-ABD1, VL-ABD2 및 VL-ABD3을 포함하고, 여기서: (a) VH-ABD1은 서열번호 140의 아미노산 서열을 갖거나; (b) VH-ABD2는 서열번호 141의 아미노산 서열을 갖거나; (c) VH-ABD3은 서열번호 142의 아미노산 서열을 갖거나; (d) VL-ABD1은 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖거나; (e) VL-ABD2는 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (f) VL-ABD3은 서열번호 94의 아미노산 서열을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 VH 및 VL을 포함한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, BMP7, BMP9, 또는 BMP10)와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL을 포함하고, 여기서 VH 서열은 서열번호 125의 참조 VH 서열과 동일하거나, 또는 이것으로부터 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 여기서 VL 서열은 서열번호 132의 참조 VL 서열과 동일하거나, 또는 이것과 총 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 미만, 또는 0개의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 갖는다. 추가 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 양상에서, 항-ActRII는 ActRIIB 및/또는 ActRIIA특이적으로 결합한다. 일부 양상에서, 항-ActRII 항체는 뮤린 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합 항체, 다특이적 항체, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 일부 양상에서 항-ActRII 항체는 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, dsFv 단편, scFv 단편, 또는 sc(Fv)2 단편이다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII(예를 들어, ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 특이적으로 결합하고, ActRII-리간드(예를 들어, GDF8(마이오스타틴) 및/또는 액티빈)의 활성도를 차단한다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 ActRII(예를 들어, )에 특이적으로 결합하고, ActRII 리간드(예를 들어, GDF8(마이오스타틴 및/또는 액티빈)의 활성도와 연관된 지방 형성의 증가 또는 근육 형성의 저해를 감소시킨다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 ActRII에 특이적으로 결합하고, 근육 장애 또는 대사 장애와 연관된 1종 이상의 병태를 치료 또는 개선한다. 일부 양상에서, 근육 장애는 질환 또는 불용으로 인한 근육 손실이다. 일부 양상에서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 고혈당 또는 골 손실이다.
특정 양상에서, ActRIIB-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체 또는 항-ActRIIB 및 ActRIIA 항체)은 GDF8(마이오스타틴) 또는 GDF8-매개된 ActRIIB Smad 신호전달에 의해서 ActRIIB의 결합을 저해하거나 또는 감소시킨다. 또 다른 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 근육 형성의 저해 또는 지방 형성의 증가를 감소시킨다. 일부 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 ActRIIB에 결합하고, 근육 장애 또는 대사 장애와 연관된 1종 이상의 병태를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 양상에서, 근육 장애는 질환 또는 불용으로 인한 근육 손실이다. 일부 양상에서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 고혈당 또는 골 손실이다. 대상체에서 근육 질량 또는 강도를 증가시킨다.
특정 양상에서, 본 명세서에 기술된 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체 및 항-ActRIIA 항체)에 의한 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA) 활성도의 차단은 근육 장애, 예컨대, 근육 손실과 연관된 1종 이상의 병태를 저해하거나 또는 감소시킨다. 추가 양상에서 ActRII의 차단은 질환 또는 불용으로 인한 근육 손실과 연관된 1종 이상의 병태를 저해하거나 또는 감소시킨다. 특정 양상에서, ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체 또는 항-ActRIIB 및 ActRIIA 항체)은 GDF8에 의한 ActRIIB에 대한 결합을 저해하거나 또는 감소시킨다. 또 다른 양상에서 ActRIIB-결합 단백질은 Smad-의존적인 경로에 의한 근육 분화의 저해를 저해하거나 또는 감소시킨다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, ActRIIB 리간드-매개된 활성도를 차단한다. 일부 ActRIIB 리간드, 예컨대, GDF-8은 골격 근육 조직의 부정적인 조절자인 것으로 공지되어 있고, 마이오스타틴 신호전달은 근육량으로 이어진다고 공지되어 있다. ActRIIB 리간드-매개된 신호전달은 또한 근육-특이적 효소(예를 들어, 크레아틴 카이나제)의 생산을 조절하고, 근아세포 증식을 자극하고, 지방세포로의 지방선구세포 분화를 조절한다. 증가된 마이오스타틴 활성도는 근육 손실 장애, 불활성도로 인한 근육 손실, 및 당뇨명, 비만, 고혈당 및 골 손실을 비롯한 대사 장애와 연관되었다. 증가된 ActRIIB 리간드-매개된 활성도는 또한 지방 대 근육비의 노화 관련 증가 및 노화 관련 근위측증과 연관되었다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 일부 ActRIIB 리간드-의 활성도와 연관된 지방 형성의 증가 또는 근육 형성의 저해를 감소시킨다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, 근육 장애 또는 대사 장애와 연관된 1종 이상의 병태를 치료 또는 개선한다. 일부 양상에서, 근육 장애는 질환 또는 불용으로 인한 근육 손실이다. 일부 양상에서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 고혈당 또는 골 손실이다. ActRIIB 리간드-매개된 활성도는 기술 분야에서 인지되는 방법, 예컨대 본 명세서에 기술된 것을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 양상에서, 본 명세서에 기술된 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체 및 항-ActRIIA 항체)에 의한 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA) 활성도의 차단은 섬유증과 연관된 1종 이상의 병태를 감소시킨다. 특정 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 섬유증 병변, 체중 감소 또는 다른 임상 증상의 ActRIIB-매개된 발생 및/또는 섬유증 병태의 발달과 연관된 생물 분자(예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현)의 변경된 발현을 저해하거나 또는 감소시킨다. 특정 양상에서, ActRIIA-결합 단백질은 섬유증 병변, 체중 감소 또는 다른 임상 증상의 ActRIIA-매개된 발생 및/또는 섬유증 병태의 발달과 연관된 생물 분자(예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현)의 변경된 발현을 저해하거나 또는 감소시킨다.
상기에 주목된 바와 같이, ActRII에 결합하는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열을 함유하는 항-ActRII 항체(예를 들어, a전장 ActRIIB-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)는 본 명세서에 제시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 양상에서, ActRII에 결합하는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열(들)은 본 명세서에 제시된 서열에 비해서 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개의 아미노산 부가, 치환(예를 들어, 보존적 치환) 또는 결실을 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII에 결합하는 VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 본 명세서에 제시된 서열에 비해서 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 아미노산 부가, 치환(예를 들어, 보존적 치환) 또는 결실을 포함한다. VH 영역 또는 VL 영역와 특정 백분율 유사성을 갖거나, 또는 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 삽입(예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 VH 영역 및 VL 영역을 함유하는 항-ActRII 항체는 본 명세서에 기술된 VH 영역 및/또는 VL 영역을 암호화하는 핵산 분자를 돌연변이유발(예를 들어, 부위-지향된 또는 PCR-매개된 돌연변이유발)시키고, 그 다음 ActRII에 대한 결합에 대해서 암호화된 변경된 항체를 시험하고, 임의로 보유된 기능을 시험하도록 일상적으로 변형될 수 있는 본 명세서에 기술된 기능 검정 또는 관련 기술 분야에 공지된 검정을 사용하여 보유된 기능을 시험함으로써 수득될 수 있다.
hActRIIB, murActRIIB에 대한 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRIIB 항체(예를 들어, 전장 ActRIIB-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)의 친화도 또는 결합활성(avidity)은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 유세포 분석법, 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 또는 방사면역검정(RIA), 또는 동력학(예를 들어, BIACORE(등록상표) 또는 KINEXA(등록상표) 분석법)을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 직접 결합 검정 및 경쟁 결합 검정 포맷이 용이하게 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 본 명세서에 기술된 방법 참조). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는, 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH, 온도) 하에서 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 ActRII-결합 파라미터(예를 들어, KD 또는 Kd, Kon, Koff)의 측정은 ActRII-결합 단백질 및 ActRII의 표준화된 용액을 사용하여 수행되고, 측정은 본 명세서에 기술되거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지된 바와 같은 표준화 조건 및 방법을 사용하여 수행된다.
본 개시내용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRIIB 항체 및/또는 항-ActRIIA 항체를 추가로 제공하며, 여기서 ActRII-결합 단백질은 이종 작용제에 접합된다. 특정 양상에서 이종 작용제는 항미생물제, 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약제학적 작용제, 림포카인, 이종 항체 또는 항체 단편, 검출 가능한 표지, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 이종접합체 ActRII-결합 단백질은 본 명세서 다른 곳에 보다 상세하게 논의되어 있다.
특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 항-ActRII 항체가 아니다. 단백질 표적에 높은 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩타이드를 식별 및 생산하는 다양한 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Skerra, Curr. Opin. Biotech. 18:295-304 (2007); Hosse et al., Protein Science 15:14-27 (2006); Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol.17:653-658 (2006); Nygren, FEBS J.275:2668-2676 (2008); 및 Skerra, FEBS J. 275:2677-2683 (2008)] 참조, 이들 각각은 이들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨). 일부 양상에서, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 ActRII-결합 단백질을 식별/생산할 수 있다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 VASP 폴리펩타이드, 조류 췌장 폴리펩타이드(aPP), 테트라넥틴(CTLD3을 기반으로 함), 아필린(γB-크리스탈린/유비퀴틴), 노틴(knottin), SH3 도메인, PDZ 도메인, 텐다미스타트, 트랜스페린, 안키린 컨센서스 반복 도메인(예를 들어, DARPins), 리포칼린 단백질 폴드(예를 들어, 안티칼린 및 듀오칼린), 단백질 에피토프 미메틱(PEM), 맥시바디/아비머, 도메인 항체, 피브로넥틴 도메인(예를 들어, 10 Fn3(예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0170753호 및 제20090155275호 참조, 이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함됨), 단백질 A의 도메인(예를 들어, 애피바디), 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드를 포함한다.
일부 양상에서 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 항-ActRIIA 항체와 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁하는 ActRIIA-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 항체, 예컨대, 전장 항-ActRIIA 항체 및 ActRIIA-결합 항체 단편)을 제공한다. 일부 양상에서 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 ActRIIA-결합 단백질과 동일한 ActRIIA의 에피토프에 결합하는 ActRIIA-결합 단백질을 제공한다.
일부 양상에서 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 항-ActRIIB 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁하는 ActRIIB-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체, 예컨대, 전장 항-ActRIIB 항체 및 ActRIIB-결합 항체 단편)을 제공한다. 일부 양상에서 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 ActRIIB-결합 단백질과 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합하는 ActRIIB-결합 단백질을 제공한다. ActRIIB에 대한, 예를 들어, 참조 결합 단백질, 예컨대, 서열번호 40의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열, 또는 서열번호 119의 VH 서열 및 서열번호 91의 VL 서열을 포함하는 항체의 결합을 저해하는 시험 ActRII-결합 단백질의 능력은 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 참조 항체와 경쟁할 수 있다. 이러한 ActRIIB-결합 단백질은 비제한적인 이론에 따라서, 그것이 경쟁하는 ActRIIB-참조 항체와 동일한 또는 관련된(예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 가까운) ActRIIB 상의 에피토프에 결합한다. 일 양상에서, ActRIIB-결합 단백질은 서열번호 40의 VH 서열 및 서열번호 9의 VL 서열을 포함하는 항체와 동일한 ActRIIB 상의 에피토프에 결합한다.
ActRII 수용체, 예컨대, ActRIIB 및 ActRIIA는 ActRI 공수용체(예를 들어, Alk4 및 Alk7)를 포스포릴화시키고, Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 통해서 신호를 전달한다고 공지되어 있다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체 및 항-ActRIIA 항체)은 이의 동족 ActRI 수용체의 ActRII-매개된 포스포릴화를 감소시킬 수 있다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체)은 ALK4 및/또는 ALK7의 ActRIIB-매개된 포스포릴화를 감소시킬 수 있다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 항체)은 ALK4 및/또는 ALK7의 ActRIIA-매개된 포스포릴화를 감소시킬 수 있다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII2-발현 세포에서 ActRII-매개된 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3) 포스포릴화를 저해할 수 있다. 일부 양상에서, ActRIIB-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체)은 ActRIIB를 발현하는 세포에서 ActRIIB-매개된 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3) 포스포릴화를 감소시킬 수 있다. 일부 양상에서, ActRIIA-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 항체)은 ActRIIA를 발현하는 세포에서 ActRIIA-매개된 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3) 포스포릴화를 감소시킬 수 있다. 일부 양상에서 ActRII 수용체 발현 세포는 인간이다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 하기로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 및/또는 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 액티빈 A와 경쟁함; (b) ActRIIA 및/또는 ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA 및/또는 ActRIIB를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) BIACORE(등록상표) 또는 KINEXA(등록상표)에 의해서 결정되는 경우 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD로 ActRIIA 및/또는 ActRIIB에 결합함.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체)은 세포-기반 검정을 사용하여 측정되는 경우 ActRII를 발현하는 세포에서 ActRI 수용체(예를 들어, ALK4 및/또는 ALK7)의 ActRII-매개된 포스포릴화 또는 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 억제한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 세포-기반 검정을 사용하여 측정되는 경우, 500pM보다 낮거나, 350pM보다 낮거나, 250pM보다 낮거나, 150pM보다 낮거나, 100pM보다 낮거나, 75pM보다 낮거나, 60pM보다 낮거나, 50pM보다 낮거나, 40pM보다 낮거나, 30pM보다 낮거나, 20pM보다 낮거나, 15pM보다 낮거나, 10pM보다 낮거나 또는 5pM보다 낮은 IC50으로 ActRII-매개된 포스포릴화를 억제한다.
ActRII-결합 단백질의 제조
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA)의 세포외 도메인에 결합한다. 추가 양상에서, ActRII-결합 단백질은 항-ActRIIA 항체 및/또는 항-ActRIIB 항체, 예컨대, 전장 항-ActRIIA 항체 및 전장 항-ActRIIB 항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체이다.
ActRII-결합 단백질은 공지된 기술을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 단클론성 항-ActRII(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA) 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)]에 기술된 것을 비롯한, 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 상기에 기술된 바와 같이 면역화하여 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구의 생산을 도출한다. 림프구는 또한 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 이후에, 림프구를 단리하고, 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하고, 이어서 이것을 비융합된 림프구 및 골수종 세포로부터 선택할 수 있다. 이어서, 면역침전, 면역블롯팅 또는 시험관내 결합 검정(예를 들어, 방사면역검정(RIA); 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA))에 측정되는 경우, ActRII, 예컨대, hActRIIB 및 hActRIIA에 대해서 특이적으로 지향되는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 표준 방법(예를 들어, 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986] 참조)을 사용하여 시험관내 배양물 중에서 또는 동물에서 생체내 복수 종양 중에서 번식시킬 수 있다. 이어서, 단클론성 항체를 상기 다클론성 항체에 대해서 기술된 바와 같이 배양 배지 또는 복수 유체로부터 정제할 수 있다.
제공된 단클론성 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있는데, 여기서 단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터, 예컨대, RT-PCR에 의해서, 서열의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 단리하고, 이의 서열을 공지된 절차를 사용하여 결정한다. 이어서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를, 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대, 이. 콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, Per.C6 세포, 또는 골수종 세포(예를 들어, NS0 세포)에 형질주입하는 경우 단클론성 항체가 숙주 세포에 의해서 생산되는 적합한 벡터 내로 클로닝한다. 재조합 항-ActRII 단클론성 항체는 또한 공지된 기술을 사용하여 목적하는 종의 CDR을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 용이하게 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); 및 Marks et al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991)] 참조).
항-ActRII 항체는 ActRII 항원(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA)에 대한 높은 친화도 및 다른 선호되는 생물학적 특성을 나타내도록 임의로 인간화, 표면처리 및 조작될 수 있다. 예를 들어, 인간화된(또는 인간) 항-ActRII 항체는, 일반적으로 입수 가능한 3차원 면역글로불린 모델링 및 프레임워크(FW) 잔기, 컨센서스 서열, 및 생식계열 서열을 선택하기 위한 공지된 절차를 사용하여 쉽게 설계 및 제조되어 목적하는 항체 특징, 예컨대 ActRII에 대한 증가된 친화도를 제공할 수 있다.
친화도 성숙 전략 및 쇄 셔플링 전략은 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 명세서에 개시된 높은 친화도 항-ActRII(예를 들어, 항-ActRIIA 및/또는 항-ActRIIB) 항체뿐만 아니라 ActRII-결합 단백질의 유도체 및 변이체를 생성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)] 참조, 이것은 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨). 본 명세서에 개시된 높은 친화도 항-ActRII(예를 들어, 항-ActRIIA 및/또는 항-ActRIIB) 항체뿐만 아니라 ActRII-결합 단백질의 유도체 및 변이체를 생성시키는 추가적인 전략은 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 사용하여 본 개시내용의 CDR-유래 서열을 보유하는 신규 VH 또는 VL 영역을 생성시켜 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성시키는 것이다. 실수 유발 PCR을 사용하는 이러한 기술은 문헌[Gram et al. (PNAS USA 89:3576-3580 (1992))]에 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 VH CDR 및/또는 VL CDR의 세트 내에 행해진다. 사용되는 추가 전략은 본 명세서에 개시된 항-ActRII 항체를 암호화하는 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 돌연변이유발을 유도한다. 이러한 기술의 예는 문헌[Barbas et al. (PNAS USA 91:3809-3813 (1994)) 및 Schier et al. (J. Mol. Biol.263:551-567 (1996))]에 개시되어 있다.
본 개시내용의 항-ActRII 항체의 인간화, 표면처리 또는 조작은 문헌[Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901 (1987), Carter et al., PNAS USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)], 미국 특허 제5,639,641호, 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 제4,816,567호; 제7,557,189호; 제7,538,195호 및; 제7,342,110; 국제 출원 제PCT/US98/16280호; 제PCT/US96/18978호; 제PCT/US91/09630호; 제PCT/US91/05939호; 제PCT/US94/01234호; 제PCT/GB89/01334호; 제PCT/GB91/01134호; 제PCT/GB92/ 01755호; 국제 출원 공개 제WO90/14443호; 제WO90/14424호; 제WO90/14430호; 및 유럽 특허 공개 제EP 229246호(이들 각각은 이들의 전문이 참조로 포함됨)에 기술된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 마찬가지로, 공지된 검정은 바람직한 특징을 디스플레이하는 ActRII-항체를 용이하게 선택하는 데 사용 가능하다(예를 들어, ActRII에 대한 결합 친화도를 결정하기 위한 검정; 교차-차단 검정, 예컨대, 본 명세서에 기술된 BIACORE(등록상표)-기반 인간 ActRII-결합 단백질 경쟁 결합 검정).
비-인간 또는 인간 항체를 조작, 인간화 또는 표면처리하는 방법이 또한 사용될 수 있고, 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 인간화된, 표면처리된 또는 면역원성 조작된 항체는 비-인간, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물(이들로 제한되지 않음)인 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "임포트(import)" 잔기라 종종 지칭되는 잔기에 의해서 대체되는데, 이것은 전형적으로 공지된 인간 서열의 "임포트" 가변, 불변 또는 다른 도메인으로부터 획득된다. 이러한 내수송된 서열은 면역원성을 감소시키거나, 또는 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 결합, 친화도, 온-레이트, 오프-레이트, 결합활성, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특징을 감소, 향상 또는 변형시키기 위해서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 부분 또는 모두는 유지되는 반면, 가변 영역 및 불변 영역의 비-인간 서열은 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
ActRII-결합 단백질, 예컨대, 전장 항-ActRIIA 또는 항-ActRIIB 항체를 암호화하는 핵산(들)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 다수의 상이한 방식으로 추가로 변형되어 대안적인 항체를 생성시킬 수 있다. 일부 양상에서, 예를 들어, 마우스 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을 암호화하는 핵산(들)은 (a) 예를 들어, 인간 항체의 이러한 암호 영역을 대체하여 키메라 항체를 생성시키거나 또는 (b) 핵산(들)을 암호화하는 비-면역글로불린을 대체하여 융합 항체를 생성시킬 수 있다. 일부 양상에서, 불변 영역은 절두 또는 제거되어 단클론성 항체의 목적하는 항체 단편을 생성시킨다. 가변 영역 암호 서열의 부위-지향된 또는 고-밀도 돌연변이유발을 사용하여 단클론성 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
항-ActRII 인간 항체는 관련 기술 분야에 공지된 다수의 기술 중 임의의 것을 사용하여 직접 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조). 유사하게, 인간 항-ActRII 항체는 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA)에 대해서 지향되는 항체를 생산하는 시험관내에서 면역화되거나 또는 면역화된 개체로부터 단리된 불멸화된 인간 B 림프구로부터 용이하게 수득될 수 있다.
인간 항-ActRII 항체는 또한 예를 들어, 문헌[Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996), Sheets et al., PNAS 95:6157-6162 (1998), Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991), 및 Marks et al., J. Mol. Biol.222:581 (1991)]에 기술된 바와 같이, 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 스크리닝을 위한 기술은 또한 미국 특허 제5,969,108호; 제6,172,197호; 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,300,064호; 제6,653,068호; 제6,706,484호; 및 제7,264,963; 및 문헌[Rothe et al., J. Mol. Biol. 376(4):1182-1200 (2008)](이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함됨)에 또한 기술되어 있다.
인간 항-ActRII 항체는 또한 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에서 면역화 시 인간 항체를 생산할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 유전자 이식된 마우스에서 제조될 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,807호; 제 5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기술되어 있다.
인간 항-ActRII 항체는 또한 예를 들어, 국제 특허 제WO012/009568호; 제WO09/036379호; 제WO10/105256호; 제WO03/074679호 및 미국 출원 공개 제US2002/0177170호(이들 각각의 내용은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이, 효모-기반 항체 제시 라이브러리로부터 선택 및/또는 단리될 수 있다. 이러한 라이브러리는 인간 전면역 레퍼토리에 의해서 획득된 다양성을 반영하도록 인실리코로 설계된다.
대안적으로, 항-ActRII 항체는 효모-디스플레이된 항체 라이브러리로부터 선택될 수 있다(예를 들어: 문헌[Blaise et al., Gene 342(2):211-218 (2004); Boder et al., Nat Biotechnol. 15(6):553-557 (1997); Kuroda et al., Biotechnol. Lett. 33(1):1-9 (2011). Review; Lauer et al., J. Pharm. Sci. 101(1):102-15 (2012); Orcutt K.D. and Wittrup K.D. Antibody Engineering, yeast display and selectios (2010), 207-233; Rakestraw et al., Protein Eng. Des. Sel.24(6):525-30 (2011)]; 및 미국 특허 제6,423,538호; 제6,696,251호; 및 제6,699,658호 참조).
항원-결합 항체 단편의 생산에 대해서 다양한 기술이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 통해서 유래된다(예를 들어, 문헌[Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 24:107-117 (1993); 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 특정 양상에서 ActRII-결합 항체 단편은 재조합 방식으로 생산된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고, 그것으로부터 분비될 수 있어서, 이들 단편의 다량의 생산을 가능하게 한다. 이러한 ActRII-결합 항체 단편은 상기에 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 추가로 단리될 수 있다. 일부 양상에서, ActRII-결합 항체 단편은 미국 특허 제5,641,870호에 기술된 바와 같은 선형 항체이다. 항원-결합 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
공지된 기술은 ActRII에 결합하는 단일-쇄 항체의 생산을 위해서 용이하게 개작될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, 공지된 방법은 Fab 발현 라이브러리의 작제를 위해서 일상적으로 개작되어(문헌[Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)] 참조) ActRII에 대해서 목적하는 특이성을 갖는 단클론성 Fab 단편의 신속하고 효과적인 식별을 가능하게 한다. ActRII-결합 항체 단편은 (a) 항체의 펩신 소화에 의해서 생산된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 다이설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편, (c) 항-ActRII 항체의 파파인 및 환원제로의 처리에 의해서 생성된 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 관련 기술 분야에 공지된 기술에 의해서 생산될 수 있다.
특정 양상에서, ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 항체 및/또는 항-ActRIIB 항체)는 이의 혈청 반감기를 증가시키기 위해서 변형될 수 있다. 이는, 예를 들어, ActRII-결합 단백질 내의 적절한 영역의 돌연변이에 의한 회수 수용체 결합 에피토프의 ActRII-결합 단백질 내로의 혼입에 의해서 또는 이어서 단부 또는 중심 중 어느 하나에서 ActRIIB-결합 단백질에 접합되는 펩타이드 태그 내로의 회수 수용체 에피토프의 혼입(예를 들어, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해서)에 의해서 달성될 수 있다. ActRII-결합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키기 위한 다른 방법, 예를 들어, 이종 분자, 예컨대, PEG에 대한 접합은 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
이종접합체 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체, 예컨대, 전장 항-ActRIIB 항체 및 ActRIIB-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체) 또한 본 개시내용의 범주 내이다. 이종접합체 ActRII-결합 단백질은 2개의 공유 결합된 단백질로 구성된다. 이종접합체 ActRII-결합 단백질은 가교결합제를 포함하는 것을 비롯한 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다고 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 다이설파이드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에터 결합을 형성함으로써 작제될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
ActRII-결합 단백질은 항체와 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA)의 회합을 제공하는 가변 영역의 임의의 유형을 포함할 수 있다. 이러한 가변 영역은 체액 반응을 증가시키고, ActRII 항원에 대한 면역글로불린을 생성시키도록 유도될 수 있는 임의의 포유동물을 포함하거나 이것으로부터 유래될 수 있다. 항-ActRII 항체의 가변 영역은 예를 들어, 인간, 뮤린, 비-인간 영장류(예를 들어, 시노몰거스 원숭이, 마카크(macaque) 등) 또는 이리(lupine) 기원일 수 있다. 일부 양상에서 변형된 항-ActRII 항체의 가변 영역 및 불변 영역 둘 모두는 인간이다. 다른 양상에서 호환성 항체의 가변 영역(비-인간 공급원으로부터 통상적으로 유래됨)은 결합 특성을 개선시키거나 또는 분자의 면역원성을 감소시키도록 조작되거나 또는 특이적으로 맞춤 조정될 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시내용에 따라서 유용한 가변 영역은 친화도 성숙, 돌연변이유발 절차, 쇄 셔플링 전략 및/또는 본 명세서에 기술되거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지된 다른 방법을 사용하여 내수송된 아미노산 서열의 포함을 통해서 인간화되거나 또는 달리 변경될 수 있다.
특정 양상에서, 항-ActRII 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해서 그리고/또는 부분적인 프레임워크 영역 대체 및 서열 변화에 의해서 변경된다. CDR은 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 부류 또는 심지어는 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR은 상이한 부류의 항체로부터, 그리고 특정 양상에서는 상이한 종으로부터의 항체로부터 유래될 것이라고 예상된다. CDR의 모두를 공여자 가변 도메인으로부터의 완전 CDR로 대체하여 하나의 가변 도메인의 항원-결합 능력을 또 다른 것으로 전달할 필요는 없다. 그 보다는, 항원-결합 부위의 활성도를 유지시키는 데 필요한 그러한 잔기를 전달하는 것만이 필요하다. 감소된 면역원성을 갖는 기능성 항체를 일상적으로 수득하는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호 및 제5,693,762호 참조).
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 본 개시내용의 변형된 항-ActRII가 불변 영역 도메인 중 하나 이상의 적어도 일부가 목적하는 생화학적 특징, 예컨대 네이티브 또는 비변경된 불변 영역을 포함하는 대략적으로 동일한 면역원성의 항체와 비교할 때 감소된 ADCC 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하도록 결실되거나 또는 달리 변경된 항체를 포함할 것이라는 것을 인지할 것이다. 일부 양상에서, 변형된 항-ActRII 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함한다. 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 변형된 항-ActRII 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3) 및/또는 경쇄 불변 도메인(CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 변형된 항-ActRII 항체는 불변 영역을 포함하고, 여기서 하나 이상의 도메인은 부분적으로 또는 전체적으로 결실되었다고 고려된다. 일부 양상에서, 변형된 항-ActRII 항체는 도메인 결실된 작제물 또는 변이체를 포함하고, 여기서 전체 CH2 도메인이 제거되었다(ΔCH2 작제물). 일부 양상에서, 누락된 불변 영역 도메인은 부재 불변 영역에 의해서 전형적으로 부여되는 분자 가요성 중 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서(예를 들어, 10개 잔기)에 의해서 대체될 수 있다.
불변 영역은 몇몇 효과기 기능을 매개한다고 일반적으로 이해된다. 예를 들어, 항체에 대한 보체의 C1 구성성분의 결합은 보체계를 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌작용 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 염증성 반응을 또한 자극하고, 자가면역 과민증에 또한 관여될 수 있다. 추가로, 항체는 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합하는 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위를 갖는 Fc 영역을 통해서 세포에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)를 비롯한, 항체의 상이한 부류에 특이적인 다수의 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은, 항체-코팅된 입자의 흡입 및 파괴, 면역 복합체의 클리어런스, 살해 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개된 세포독성, 또는 ADCC라 불림), 염증성 매개인자의 방출, 태반 통과 및 면역글로불린 생산의 제어를 비롯한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
특정 양상에서, 항-ActRII 항체는 결국 투여된 항-ActRII 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 주는 변경된 효과기 기능을 갖는다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있다. 다른 경우에 불변 영역 변형은, 보체 결합을 조절하고, 따라서 접합된 세포독소의 혈청 반감기 및 비특이적 회합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또 다른 변형을 사용하여 증가된 항원 특이성 또는 항체 가요성으로 인해서 향상된 국지화를 가능하게 하는 다이설파이드 링키지 또는 올리고당 모이어티를 제거할 수 있다. 유사하게, 본 개시내용에 따른 불변 영역의 변형은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 생화학 또는 분자 조작 기술을 사용하여 쉽게 행해질 수 있다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 ActRIIB-결합 단백질은 하나 이상의 효과기 기능을 갖지 않는 ActRII 항체이다. 예를 들어, 일부 양상에서, 항-ActRII 항체는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 활성도 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성도를 갖지 않는다. 특정 양상에서, 항-ActRII 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 양상에서, 항-ActRII 항체는 효과기 기능을 갖지 않는다. ADCC 및/또는 CDC 활성도 및 Fc 수용체 및/또는 보체 인자 결합을 감소 또는 제거한 Fc 서열 조작 변형의 예는 그것을 시험하기 위한 검정 및 절차와 같이 본 명세서에 기술되어 있거나 또는 관련 기술 분야에 달리 공지되어 있다.
일부 양상에서, 항-ActRII 항체는 각각의 변형된 항체의 힌지 영역에 CH3 도메인을 직접 융합시키도록 조작된다. 다른 작제물에서 펩타이드 스페이서는 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된다. 예를 들어, 호환성 작제물이 발현될 수 있는데, 여기서 CH2 도메인은 결실되었고, 나머지 CH3 도메인(변형되거나 또는 비변형됨)은 5 내지 20개의 아미노산 스페이서를 사용하여 힌지 영역에 결합된다. 이러한 스페이서는 예를 들어, 불변 도메인의 조절 요소가 자유롭고 접근 가능하게 유지되거나 또는 힌지 영역이 가요성으로 유지되는 것을 보장하기 위해서 첨가될 수 있다. 아미노산 스페이서는, 일부 경우에, 면역원성인 것으로 증명되고, 작제물에 대해서 원치 않는 면역 반응을 도출할 수 있다. 따라서, 특정 양상에서, 작제물에 첨가되는 임의의 스페이서는, 변형된 항-ActRII의 목적하는 생화학적 품질을 유지시키도록, 비교적 비-면역원성이거나 또는 심지어는 완전히 누락될 수 있다.
추가적인 양상에서 항-ActRII 항체는 불변 영역에서 소수의 또는 심지어는 단일 아미노산의 부분적인 결실 또는 치환에 의해서 변형된다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 면적에서 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시키기에 충분할 수 있다. 유사하게 효과기 기능(예를 들어, 보체 C1Q 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인은 완전히 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 불변 영역의 이러한 부분적인 결실은 항-ActRII 항체의 선택된 특징(예를 들어, 혈청 반감기)을 개선시킬 수 있는 반면, 상응하는 불변 영역 도메인과 연관된 다른 바람직한 기능을 온전하게 남겨둔다. 일부 양상에서 항-ActRII 항체의 불변 영역은 생성된 작제물의 프로파일을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해서 변형된다. 이와 관련하여 변형된 항-ActRII 항체의 구성 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지시키면서 보존된 결합 부위에 의해서 제공되는 활성도(예를 들어, Fc 결합)를 파괴하는 것이 가능하다. 본 개시내용은 또한 불변 영역에 대한 하나 이상의 아미노산의 부가를 함유하여 목적하는 특징, 예컨대 효과기 기능의 감소 또는 증가 또는 하나 이상의 세포독소, 표지화 또는 탄수화물 모이어티에 대한 부착 부위 제공을 향상시킨 항-ActRII 항체를 제공한다. 이러한 양상에서 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특이적 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 제공된 ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질에 대한 변이체인 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 뮤린, 키메라, 인간화된 및 인간 ActRII-결합 단백질)을 제공한다. 추가 양상에서, ActRIIB- 및 ActRIIA-결합 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 액티빈 A와 경쟁함; (b) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA를 발현하는 세포에서 Smad(예를 들어, Smad2 및/또는 Smad3)의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 및/또는 ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7를 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 추가 양상에서, 변이체는 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질에 비해서 보존적 아미노산 잔기 치환 돌연변이를 함유한다.
제공된 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRII 항체는 예를 들어, 용해도, 생물학적 반감기, 생체이용률을 개선시키기 위해서 그리고 ActRII-결합 단백질의 안정성, 제형 및/또는 치료적 특성을 달리 개선시키기 위해서 관련 기술 분야에 공지된 추가적인 화학 모이어티를 함유하도록 유도체화될 수 있다. 이러한 모이어티에 대한 철저하지 않은 개요가 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 발견될 수 있다.
ActRII-결합 단백질 및 이의 발현을 암호화하는 핵산
ActRII-결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및 핵산 분자의 조합물이 또한 제공된다. 일부 양상에서, 핵산 분자는 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 항-ActRII 항체 및 ActRII-결합 항체 단편을 암호화한다. 추가 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 전장 항-ActRII 항체 또는 ActRII-결합 항체 단편의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에 개시된 핵산 분자는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하고; 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥이면 암호 가닥 및/또는 비암호(안티-센스) 가닥일 수 있다. 특정 양상에서, 핵산 분자는 단리된다. 추가적인 양상에서, 핵산 분자는 실질적으로 순수하다. 일부 양상에서 핵산은 cDNA이거나 또는 cDNA로부터 유래된다. 일부 양상에서 핵산은 재조합 방식으로 생산된다.
일부 양상에서, 핵산 분자는 숙주 세포에서 또는 시험관내에서 암호 서열의 발현을 제어하는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 ActRII-결합 단백질 암호 서열을 포함한다. 특정 양상에서, 암호 서열은 cDNA이다. 본 개시내용은 또한 숙주 세포에서 또는 시험관내에서 암호 서열의 발현을 제어하는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 ActRII-결합 단백질 암호 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유하는 벡터에 관한 것이다.
일부 양상에서, 핵산 분자는 동일한 리딩 프레임으로 이종 폴리뉴클레오타이드 서열에 융합된 성숙 ActRII-결합 단백질에 대한 암호 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 이종 폴리뉴클레오타이드 서열은 ActRII-결합 단백질 암호화 핵산 분자(들)로 형질전환된 숙주 세포로부터 발현된 단백질의 분비를 가능하게 하는 리더 펩타이드 서열을 암호화한다. 리더 서열을 함유하는 단백질은 단백질원이라 지칭되며, 숙주 세포에 의해서 절단된 리더 서열을 가져서 ActRII-결합 단백질의 성숙 형태를 형성할 수 있다. 이러한 리더 펩타이드 서열 및 숙주 세포에서 재조합 단백질의 분비를 가능하게 하는 이의 용도는 관련 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 추가적인 양상에서, 이종 폴리뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, 재조합 방식으로 발현된 ActRII-결합 단백질의 정제를 가능하게 하거나, 단백질 안정성 및/또는 치료적 또는 진단적 특성을 부가 또는 개선시키는 기능을 할 수 있는 추가적인 5' 아미노산 잔기를 암호화한다.
일부 양상에서 본 개시내용은 혼성화 프로브, PCR 프라이머 또는 서열결정 프라이머로서 사용하기에 충분한, 단리된 핵산, 예컨대, ActRII-결합 단백질 암호화 cDNA 단편을 제공한다.
일부 양상에서, 핵산 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는 ActRII-결합 단백질을 암호화한다: (a) ActRII에 대한 결합에 대해서 ActRII 리간드와 경쟁함; (b) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 동족 ActRI을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 1종 이상의 Smad의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRII에 결합함. 일부 양상에서, 암호화된 ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRII-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRII-결합 VH 및 VL 쌍을 갖는 항체와 ActRII에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가적인 양상에서, 암호화된 ActRII-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 항체와 동일한 ActRII의 에피토프에 결합한다.
일부 양상에서, 핵산 분자는 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 ActRII-결합 단백질을 암호화하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)와 경쟁함; (b) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A)의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 1종 이상의 Smad의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA에 결합함. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIA-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRIIA-결합 VH 및 VL 쌍을 갖는 항체와 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가적인 양상에서, 암호화된 ActRIIA-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 항체와 동일한 ActRIIA의 에피토프에 결합한다. 추가 양상에서, 핵산 분자는 ActRII에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL을 포함하는 ActRIIA-결합 단백질을 암호화한다.
일부 양상에서, 핵산 분자는 ActRIIB에 특이적으로 결합하는 ActRII-결합 단백질을 암호화하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB에 대한 결합에 대해서 액티빈 A 및/또는 GDF8과 경쟁함; (b) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIB를 발현하는 세포에서 1종 이상의 Smad의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIB-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRIIB-결합 VH 및 VL 쌍을 갖는 항체와 ActRIIB에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가적인 양상에서, 암호화된 ActRIIB-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 항체와 동일한 ActRIIB의 에피토프에 결합한다. 추가 양상에서, 핵산 분자는 ActRIIB에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL을 포함하는 ActRIIB-결합 단백질을 암호화한다.
일부 양상에서, 핵산 분자는 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 ActRII-결합 단백질을 암호화하고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 특징을 갖는다: (a) ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 액티빈 A 및/또는 GDF8과 경쟁함; (b) ActRIIA 및/또는 ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A 및/또는 GDF8)의 존재 하에서 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화를 감소시킴; (c) ActRIIA 및/또는 ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및/또는 ActRIIB를 발현하는 세포에서 1종 이상의 Smad의 포스포릴화를 감소시킴; 및 (d) 1nM 이하 및 1pM 이상의 KD(예를 들어, BIACORE(등록상표) 분석법에 의해서 결정되는 경우)로 ActRIIA 및 ActRIIB에 결합함. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질은 상기 특징 중 2, 3, 또는 4개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIB-결합 단백질은 상기 특징 중 적어도 2개 또는 적어도 3개를 갖는다. 일부 양상에서, 암호화된 ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 ActRIIB 및 ActRIIA-결합 VH 및 VL 쌍을 갖는 항체와 ActRIIB 및 ActRIIA에 대한 결합에 대해서 경쟁한다. 추가적인 양상에서, 암호화된 ActRIIB-결합 단백질은 본 명세서에 개시된 항체와 동일한 ActRIIA 또는 ActRIIB의 에피토프에 결합한다. 추가 양상에서, 핵산 분자는 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL을 포함하는 ActRIIB 및 ActRIIA-결합 단백질을 암호화한다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 제공된 ActRIIB-결합 단백질을 암호화하는 핵산 또는 핵산의 세트를 함유하는 벡터 또는 벡터의 세트를 제공한다. ActRII-결합 단백질을 사용하는 제조 방법에서와 같이, 이들 핵산, 핵산의 세트, 벡터, 및 벡터의 세트로 형질전환된 숙주 세포가 또한 제공된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 상기에 제공된 바와 같은 핵산 분자 또는 핵산 분자의 조합물 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 일부 예에서 ActRII에 특이적으로 결합하는 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRIIB-항체 및 ActRII-결합 항체 단편)을 발현할 수 있다. 추가 양상에서, 본 개시내용은 상기에 제공된 바와 같은 핵산 분자 또는 핵산 분자의 조합물 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 일부 예에서 ActRII에 특이적으로 결합하는 ActRII-결합 단백질을 발현할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 제조 방법에서 사용될 수 있고, 여기서 방법은 (a) 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (b) 숙주 세포로부터 발현된 ActRII-결합 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 적합한 조건 하에서 ActRII-결합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포(예를 들어, 하이브리도마 또는 형질전환된 포유동물 숙주 세포)를 배양하는 단계를 포함하는 ActRII-결합 단백질의 제조 방법을 제공하고, 임의로 숙주 세포로부터 분비된 ActRII-결합 단백질을 단리하는 방법을 제공한다. 그리고 본 개시내용은 개시된 방법을 사용하여 단리된 ActRII-결합 단백질을 추가로 제공한다.
특정 양상에서 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 암호화된 폴리펩타이드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 동일한 리딩 프레임으로 융합된 성숙 ActRII-결합 단백질(들)(예를 들어, ActRII-항체, 예컨대, 전장 항체 및 ActRII-결합 항체 단편)에 대한 암호 서열(들)을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙 폴리펩타이드의 정제를 제공하기 위해서 pQE-9 벡터에 의해서 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주(예를 들어, COS-7 세포)가 사용되는 경우 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다.
ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRII 항체 및 ActRII-결합 항체 단편을 암호화하는 핵산 변이체가 또한 제공된다. 핵산 변이체는 암호 영역, 비-암호 영역 또는 둘 모두에서 변경을 포함할 수 있다. 일부 양상에서 핵산 변이체는 동의 치환, 부가 또는 결실을 생성하는 변경을 함유하지만, 암호화된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성도를 변경하지 않는다. 일부 양상에서, 핵산 변이체는 유전자 암호의 퇴화로 인한 동의 치환에 의해서 생성된다. 핵산 변이체는 다양한 이유를 위해서, 예를 들어, 특정 숙주를 위한 코돈 발현(박테리아 숙주, 예컨대, 이. 콜라이에 의해서 바람직한 것에 대한 인간 mRNA에서의 코돈을 변화시킴)을 최적화하기 위해서 생산될 수 있다. 본 명세서에 기술된 핵산을 포함하는 벡터 및 세포가 또한 제공된다.
일부 양상에서 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 항체 및 ActRII-결합 항체 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해서 작제된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 목적하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 숙주 세포 선호를 기반으로 하는 코돈 최적화를 기반으로 설계될 수 있다. 표준 방법을 일상적으로 적용하여 ActRII-결합 단백질을 암호화하는 단리물 폴리뉴클레오타이드 서열을 합성할 수 있다.
(합성, 부위-지향 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의해서) 일단 조립되면, ActRII-결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 목적하는 숙주에서 ActRII-결합 단백질의 발현에 적절한 제어 서열에 일상적으로 작동 가능하게 연결할 수 있다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 발현 벡터 내에 삽입되고, 목적하는 숙주에서 단백질의 발현에 적절한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 숙주에서 형질주입된 유전자의 높은 발현 수준을 수득하기 위해서, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결되거나 또는 이것과 연관될 수 있다.
특정 양상에서, 재조합 발현 벡터는 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRIIB 항체, 항-ActRIIA 항체, ActRIIB-결합 항체 단편, 또는 ActRIIA-결합 항체 단편을 암호화하는 DNA를 증폭 및 발현하는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 ActRII-결합 단백질의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 합성 또는 cDNA-유래된 DNA 단편을 갖는 복제 가능한 DNA 작제물이다. 전사 단위는 하기에 상세하게 기술된 바와 같은, (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 유전 요소 또는 요소들, 예를 들어, 전사 포로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되는 구조 또는 암호 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립체를 일반적으로 포함한다. 이러한 조절 요소는 전사를 제어하기 위한 작동자 서열을 포함할 수 있다. 복제 기점, 및 선택 유전자에 의해서 통상적으로 부여된, 숙주에서 복제하여 형질전환체의 인식을 가능하게 하는 능력이 추가로 혼입될 수 있다. DNA 영역은 그것이 서로에 기능적으로 관련되는 경우 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 신호 펩타이드(분비 리더)에 대한 DNA는, 그것이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되면 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 포로모터는, 그것이 서열의 전사를 제어하면 암호 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는, 그것이 번역을 허용하도록 위치되면 암호 서열에 작동 가능하게 연결된다. 효모 발현계에서 사용하는 것이 의도된 구조 요소는 숙주 세포에 의해서 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 발현된 재조합 단백질로부터 후속으로 임의로 절단되어 최종 단백질을 제공할 수 있다. 특정 양상에서, 본 개시내용은 1종 이상의 담체, 희석제, 부헝제, 또는 다른 첨가제를 임의로 더 포함하는, 상기에 기술되거나 본 명세서 다른 곳에 기술된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하는, 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 개시된 핵산 분자 또는 cDNA 분자 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 개시내용은 또한 제어 서열에 작동 가능하게 연결되고, 벡터 내에 임의로 삽입된 개시된 핵산 분자 또는 분자들로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 일부 양상에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 추가 양상에서, 포유동물 숙주 세포는 NS0 뮤린 골수종 세포, PER.C6(등록상표) 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 다른 양상에서, 숙주 세포는 하이브리도마이다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 생산하기에 적합한 조건 하에서 본 명세서에 개시된 형질전환된 숙주 세포 또는 하이브리도마를 배양하는 단계를 포함하는 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)의 제조 방법을 제공한다. 본 개시내용은 숙주 세포로부터 분비된 ActRII-결합 단백질을 단리하는 것을 임의로 제공한다. 본 개시내용은 또한 이러한 방법을 사용하여 생산된 ActRII-결합 단백질 및 ActRII-결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 임의로 제공한다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 좌우될 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합물이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 거대세포바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 비롯한 이. 콜라이로부터의 플라스미드 및 또한 더 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대, M13 및 필라멘트성 단일-가닥 DNA 파지를 포함한다.
ActRII-결합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하의 원핵생물, 효모, 곤충 또 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스를 포함한다. 고등 진핵 세포는 하기에 기술된 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 무세포 번역계가 또한 사용될 수 있다. 항체 생산을 비롯한, 단백질 생산 방법에 관련된 추가 정보는 예를 들어, 미국 출원 공개 제2008/0187954호, 미국 특허 제6,413,746호 및 제6,660,501호, 및 국제 출원 공개 제WO04/009823호에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 본 명세서에 이들의 전문이 참조로 포함된다.
다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)을 발현하는 데 이롭게 사용될 수 있다. 포유동물 세포에서 재조합 ActRII-결합 단백질의 발현이 수행될 수 있는데, 그 이유는 이러한 단백질은 일반적으로 정확하게 접히고, 적절하게 변형되고, 완전하게 기능성이기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 HEK-293 및 HEK-293T, 글루즈만(Gluzman)(Cell 23:175 (1981))에 의해서 기술된 원숭이 신장 세포의 COS-7주, 및 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 비롯한 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대, 발현될 유전자에 연결된 복제 기점, 적합한 포로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대, 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 문헌[Luckow and Summers, BioTechnology 6:47 (1988)]에 검토되어 있다.
형질전환된 숙주 세포 또는 하이브리도마에 의해서 생산된 ActRII-결합 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라서 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차동 용해도 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 친화도 태그, 예컨대, 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제는 단백질에 부착되어 적절한 친화도 칼럼 상의 퉁과에 의한 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다. ActRII-결합 단백질은 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 사용하여 물리적으로 특징규명될 수 있다.
예를 들어, 재조합 ActRII-결합 단백질로부터 배양 배지로 분비된 시스템으로부터의 상청액을 먼저 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유닛(Millipore Pellicon ultrafiltration unit)을 사용하여 먼처 농축할 수 있다. 농축 단계 이후에, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트 다이에틸아미노에틸(DEAE)기를 갖는 매트릭스 또는 물질을 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아마이드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 일반적으로 사용되는 다른 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계를 사용할 수 있다. 적합한 양이온 교환제는 설포프로필 또는 카복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족기를 갖는 실리카겔을 사용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 사용하여 ActRII-결합 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 다양한 조합의 상기 정제 단계 중 일부 또는 전부를 또한 일상적으로 사용하여 균질 재조합 ActRII-결합 단백질을 제공할 수 있다.
박테리아 배양물에서 생산된 재조합 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편 및 이의 변이체 및 유도체)은 예를 들어, 먼저 세포 펠릿으로부터의 추출, 그 다음 1회 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해서 단리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계를 위해서 사용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에서 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한, 임의의 편리한 방법에 의해서 파괴될 수 있다.
표적 결합 단백질, 예컨대, 전장 항체 및 항원-결합 항체 단편의 정제를 위한 관련 기술 분야에 공지된 방법은 또한 예를 들어, 미국 출원 공개 제2008/0312425호, 제2008/0177048호, 및 제2009/0187005호에 기술된 것을 포함하고, 이들 각각은 이들의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
특정 양상에서, ActRII-결합 단백질은 항체가 아니다. 단백질 표적에 높은 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩타이드를 식별 및 생산하기 위해서 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18:295-304 (2007); Hosse et al., Protein Science 15:14-27 (2006); Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol.17:653-658 (2006); Nygren, FEBS J.275:2668-2676 (2008); 및 Skerra, FEBS J. 275:2677-2683 (2008)] 참조, 이들 각각은 이들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함됨). 특정 실시형태에서, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 ActRII-결합 단백질을 식별/생산한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩타이드는 단백질 A, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인(예를 들어, 피브로넥틴 타입 III(Fn3)), 안키린 켄센서스 반복 도메인, 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다.
사용 방법 및 약제학적 조성물
제공된 ActRII-결합 단백질(항체, 면역접합체 및 폴리펩타이드 포함)은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 및 ActRIIA 항체)로 다양한 질환 및 병태를 치료 및/또는 개선시키는 방법 및 진단 방법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 응용에서 유용하다. ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA) 신호전달 및/또는 증가된 ActRII 발현과 연관된 질환 또는 병태를 갖는 대상체를 치료하기 위해서 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, ActRII에 특이적으로 결합하는 전장 항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체) 을 사용하기 위한 방법이 제공된다. 추가적인 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 의약으로서 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 ActRII, 증가된 ActRII 발현 및/또는 증가된 ActRII 신호전달과 연관된 질환 또는 병태를 치료 및/또는 개선시키기 위한 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물을 사용하여 치료되는 질환 또는 병태는 질환 또는 불용으로 인한 근육 장애, 예컨대, 근육 손실이다. 추가적인 양상에서 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물을 사용하여 치료되는 질환 또는 병태는 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태); 염증성, 심혈관, 폐, 근골격, 신경학 또는 대사 질환 또는 병태; 상처 치유; 또는 암이다.
일부 양상에서, 약제학적 조성물은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 전장 항체 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 전장 항체) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하고, 표지기 또는 효과기기를 추가로 포함한다. "표지"는 스크린 시에 검출을 가능하게 하도록 부착된 하나 이상의 요소, 동위원소 또는 화학 화합물을 지칭한다. 표지는 일반적으로 하기 3가지 부류에 포함된다: (a) 방사성 동위원소 또는 중동위원소일 수 있는 동위원소 표지, (b) 형광 및 비색 염료를 포함할 수 있는 소분자 표지, 또는 분자, 예컨대, 다른 표지화 방법을 가능하게 하는 바이오틴, 및 (c) 항체에 의해서 인식되는 융합 파트너로서 혼입되는 에피토프일 수 있는 면역 표지, "표지화 기"는 임의의 검출 가능한 표지를 지칭함. 일부 양상에서, 표지화 기는 스페이서(예를 들어, 펩타이드 스페이서)를 통해서 ActRII-결합 단백질에 커플링되어 잠재적인 입체 장애를 감소시킨다. 표지는 임의의 위치에서 화합물에 혼입될 수 있고, 단백질 발현 동안 시험관내 또는 생체내에서 혼입될 수 있다. 단백질을 표지하기 위한 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 제공된 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다. 추가적인 양상에서, 표지화 기는 동위원소 표지, 자성 표지, 산화환원 활성 모이어티, 광학 염료, 바이오틴일화 기 및 2차 리포터에 의해서 인식되는 폴리펩타이드 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 표지화 기는 형광 단백질, 예컨대, 그린 플루오레센트(Green Fluorescent) 단백질 또는 이의 유도체(예를 들어, 강화 GFP, 청색 형광 단백질 또는 이의 유도체(예를 들어, EBFP(인핸스트 블루 플루오레센트 프로테인(Enhanced Blue Fluorescent Protein), EBFP2, 아주라이트(Azurite), 엠칼라마(mKalama)1, 사이안 형광 단백질 또는 이의 유도체(예를 들어, ECFP(인핸스트 사이안 플루오레센트 프로테인(Enhanced Cyan Fluorescent Protein), 세룰레안(Cerulean), CyPet), 황색 형광 단백질 또는 이의 유도체(예를 들어, YFP, 시트린(Citrine), 비너스(Venus), YPet)이다. 일부 양상에서, 폴리펩타이드 에피토프는 바이오틴 신호전달 펩타이드, 히스티딘 펩타이드(his), 헤마글루티닌(HA), Flag, 금 결합 펩타이드로부터 선택된 구성원이다. 추가적인 양상에서 효과기기는 방사동위원소, 방사뉴클레오타이드, 독소, 치료제 및 화학치료제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 ActRII-결합 단백질은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 효용을 갖는다. 예를 들어, ActRII-결합 단백질은 예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서, 또는 대상체에서, 배양물로 세포에 투여되어 다양한 질환 또는 병태를 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 인간 항체, 뮤린 항체, 또는 인간화된 항체이다.
또한 ActRII 활성도를 차단하는 방법이 제공된다. 일부 양상에서, 방법은 ActRII를 ActRII-결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서 방법은 생체내에서 수행된다. 다른 예에서, 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 양상에서 차단되는 ActRII 활성도는 하기로부터 선택된다: (a) ActRII 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, GDF3, BMP9 또는BMP10)에 의한 결합; (b) 액티빈 A의 존재 하에서 ActRII를 발현하는 세포에서 1종 이상의 Smad의 포스포릴화; (c) ActRII 리간드의 존재 하에서 ActRII 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화.
일부 양상에서 ActRIIA 활성도를 차단하는 방법이 제공된다. 추가 양상에서, 방법은 ActRIIA를 ActRIIA-결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서 방법은 생체내에서 수행된다. 다른 예에서, 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 양상에서 차단되는 ActRIIA 활성도는 하기로부터 선택된다: (a) ActRIIA 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF1, GDF3 또는 노달)에 의한 결합; (b) 액티빈 A의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 1종 이상의 Smad의 포스포릴화; (c) ActRIIA 리간드의 존재 하에서 ActRIIA, 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화.
일부 양상에서 ActRIIB 활성도를 차단하는 방법이 제공된다. 추가 양상에서, 방법은 ActRIIB를 ActRIIB-결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서 방법은 생체내에서 수행된다. 다른 예에서, 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 양상에서 차단되는 ActRIIB 활성도는 하기로부터 선택된다: (a) ActRIIB 리간드(예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, GDF8(마이오스타틴), GDF11, BMP6, GDF3, BMP9 또는BMP10)에 의한 결합; (b) 액티빈 A의 존재 하에서 ActRIIA를 발현하는 세포에서 1종 이상의 Smad의 포스포릴화; (c) ActRIIB 리간드의 존재 하에서 ActRIIA 및 ALK4 및/또는 ALK7을 발현하는 세포에서 ALK4 및/또는 ALK7의 포스포릴화.
일 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 전장 항체 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 전장 항체)을 ActRII 발현 및/또는 상승된 ActRII 신호전달과 연관된 질환 또는 병태를 갖거나 또는 그러한 질환 또는 병태의 발달 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 개선을 위해서 제공된다. 또 다른 양상에서 치료는 ActRII-결합 단백질을 대상체로부터의 단리된 조직 또는 세포에 투여하는 것을 포함하며, 대상체는 ActRII 발현 또는 ActRII 신호전달과 연관된 질환 또는 병태를 갖거나, 또는 이들의 발생 위험이 있다. 추가로 ActRII 발현 또는 ActRII 신호전달과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
본 개시내용은 ActRII-결합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 대상체에서 ActRII(예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB)-매개된 활성도와 연관된 병태의 치료 및/또는 개선 방법이 제공되며, 이 방법은 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질은 단독으로 투여된다. 다른 양상에서, ActRII-결합 단백질은 병용 요법으로서 투여된다. 유효량의 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 ActRII 활성도를 감소시키는 방법이 또한 제공된다.
본 개시내용은 또한 근육 장애와 연관된 질환 또는 병태를 치료 및/또는 개선시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 근육 장애는 손실이다. 추가 양상에서 손실은 질환 또는 불용으로 인한 것이다. 일부 양상에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 항체, ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체)를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 단독으로서 또는 병용 요법으로서 투여된다.
일부 양상에 따라서, 본 개시내용은 대상체에서 골격 근육의 형성을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 ActRIIB-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체, 예컨대, 전장 ActRIIB-항체 및 ActRIIB-결합 항체 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 방법은 대상체에서 근육량 또는 강도를 증가시킨다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 근육 장애와 연관된 질환 또는 병태, 예컨대, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태, 예컨대, 심근 섬유증, 및 특발성 폐 섬유증(IPF)); 대사 질환(예를 들어, 제II형 당뇨병 인슐린 저항성, 고혈당, 및 비만); 염증성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예를 들어, 울혈성 심부전, 및 고혈압); 안질환, 예컨대, 노인성 황반 변성; 폐 질환, 근골격 질환, 골격 질환, 예컨대, 골다공증; 신경학 질환; 상처 치유; 체중 감소; 및 암(예를 들어, 암종, 골수종, 골-손실 유도 암, 뇌하수체암, 및 위장암)의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 항체, ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체)를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가적인 양상에서, ActRII-결합 단백질은 단독으로서 또는 병용 요법으로서 투여된다. ActRII 발현 또는 ActRII 신호전달과 연관된 질환 또는 병태, 또는 이들의 발생 위험에 대한 용도가 추가로 제공된다.
본 개시내용은은 또한 대상체에서 ActRII(예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB) 활성도, 예컨대, 신호전달을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 유효량의 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 항체, ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체) 또는 ActRII-결합 단백질을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 근육 손실; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태); 염증성, 심혈관, 폐, 근골격(즉, 골 및/또는 근육), 신경학, 또는 대사 질환 또는 병태; 상처 치유; 또는 암으로 진단된 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 근육 장애를 치료 및/또는 개선시키는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 항체, ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체)을 근육 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 대상체는 근육 장애의 발생 위험이 있다. 일부 양상에서 근육 장애 또는 병태는 근육 위축증이다. 추가 양상에서, 근육 위축증은 글루코코르티코이드 치료, 예컨대, 코티솔, 덱사메타손, 베타메타손, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 또는 프레드니솔론으로의 치료와 연관된 병태이다. 추가적인 양상에서, 근육 위축증은 신경 외상 또는 퇴행성, 대사 또는 염증성 신경병증(예를 들어, 길랭-바레 증후군, 말초 신경병증 또는 환경 독소 또는 약물에 대한 노출)의 결과와 연관된 병태이다. 추가적인 양상에서, 근육 위축증은 성인 운동 뉴런 질환, 영아 척수 근위측증, 근위축성 측색 경화증, 청소년 척수 근위측증, 다초점성 컨덕터 블록을 갖는 자가면역 운동 신경병증, 뇌졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비, 외상, 장기간 요양, 자발적 불활성, 비자발적 불활성, 대사 스트레스 영양 부족으로 인한 골격 고정화, 암, AIDS, 단식, 갑상선 장애, 당뇨병, 양성 선천성 저장력증, 중심핵병 질환, 저온 화상, 만성 폐색성 폐 질환, 간 질환(예, 예컨대, 섬유증, 경화증), 패혈증, 울혈성 심부전, 노화, 우주 여행 또는 무중력 환경에서의 시간 소모와 연관된 병태이다.
일부 양상에서 치료 및/또는 개선된 근육 장애는 근육병과 연관된 근육 위축증이다. 추가 양상에서 근육병은 미토콘드리아 근육병; 예컨대, 글리코겐 또는 지질 저장 질환에 의해서 유발되는 대사 근육병, 선천성 근육병, 네말린 근육병(nemalene myopathy), 다발심/미세심 근육병 및 근세관 (중심핵) 근육병; 근긴장증; 가족성 주기성 마비; 및 염증성 근육병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 양상에서, 근육병은 근디스트로피 증후군과 연관된 병태, 예컨대, 듀시엔형(Duchenne), 베커형(Becker), 근긴장성, 안면견갑상완형, 후쿠야마형(Fukuyama), 지대, 견갑상완, 에머리-드라이푸스형(Emery-Dreifuss), 눈인두, 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease: CMT), 선천성 근디스트로피, 또는 유전성 원위부 근육병이다. 제공된 ActRII-결합 단백질은 포함체 근육염, 마이오글로빈뇨, 횡문근융해증, 골화 근육염, 다발성근염, 또는 피부근염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, 제공된 ActRII-결합 단백질은 글루코코르티코이드 치료, 근육감소증, 장기간 요양, 골격 고정화, 패혈증 또는 울혈성 심부전으로부터 유발되는 근육 위축증을 치료 또는 예방할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 근디스트로피의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 용어 "근디스트로피"는 골격 근육 및 때로는 심근 및 호흡근의 점진적인 약화 및 악화를 특징으로 하는 퇴행성 근육 질환의 군을 지칭한다. 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질 및 약제학적 조성물로 치료 및/또는 개선될 수 있는 예시적인 근디스트로피는 듀시엔형 근디스트로피(DMD), 베커형 근디스트로피(BMD), 에머리-드라이푸스 근디스트로피(EDMD), 지대 근디스트로피(LGMD), 안면견갑상완형 근디스트로피(FSH 또는 FSHD)(란도르 디제린(Landouzy-Dejerine)이라고도 지칭됨), 근긴장성 근디스트로피(MMD)(스타이너트병(Steinert's Disease)), 눈인두 근디스트로피(OPMD), 원위 근디스트로피(DD), 선천성 근디스트로피(CMD) 및 견갑상완 근디스트로피(SMD)를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 섬유증 병태(예를 들어, 섬유증)의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 예에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 항체, ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 ActRIIB 및 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체)을 섬유증 병태를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 대상체는 섬유증 병태의 발달 위험이 있다. 추가 양상에서 섬유증 병태는 DN이다. 일부 양상에서, 치료되는 섬유증 병태 일차성 섬유증이다. 일 양상에서, 치료되는 섬유증 병태는 특발성이다. 일부 양상에서 섬유증 병태는 만성이다. 일부 양상에서, 치료되는 섬유증 병태는 전신성이다. 다른 양상에서, 치료되는 섬유증 질환 또는 병태는 질환(예를 들어, 감염 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환, 악성 또는 암성 질환, 및/또는 결합조직병); 독소; 인설트(예를 들어, 환경 위험(예를 들어, 석면, 석탄 가루, 다환식 방향족 탄화수소), 담배 연기, 상처); 또는 의학적 치료(예를 들어, 수술 절개, 화학요법 또는 방사선)와 연관된 병태이다(예를 들어 이들에 대해서 부차적이다).
본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질로 치료 및/또는 개선될 수 있는 섬유증 병태는 섬유증, 간 손상(예를 들어, 알코올, 및 바이러스 감염, 예컨대, B형 및 C형 간염 바이러스 감염에 의해서 유발되는 간 손상), 폐 섬유증(예를 들어, 담배 연구, 환경 위험 및 화학요법 약물, 블레오마이신에 의해서 유발되는 낭성 섬유증, IPF 또는 폐 섬유증), 방사선 유도된 섬유증, 주사 섬유증, 혈관 섬유증, 죽상경화증, 췌장 섬유증, 근골격 섬유증(예를 들어, 근육 섬유증), 심장 섬유증, 피부 섬유증, 피부경화증, 안과 섬유증(예를 들어, 노인성 황반 변성, 당뇨병성 황반부종, 당뇨병성 망막증, 및 안구 건조 질환), 진행성 전신 경화증 (PSS), 만성 이식편대숙주병, 페이로니병(peyronie's disease), 방광경 후 요도 협착증, 복막뒤 섬유증, 종격동 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 증식성 섬유증, 신생물 섬유증, 듀피트렌 구축(Dupuytren's disease), 협착증, 늑막 섬유증, 사르코이드증, 척수 손상/섬유증, 및 골수섬유증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 섬유증을 갖는 대상체에게 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물 중의) ActRII-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 섬유증을 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 감소된 섬유증은 예를 들어, 감소된 섬유증으로 반영될 수 있고, 예를 들어, 섬유증 병변의 감소된 발달, 체중 손실 또는 다른 임상적 증상의 감소 또는 및/또는 치료될 섬유증 병태의 발달과 연관된 생물학적 분자의 변경된 발현(예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현)을 비롯한 섬유증과 연관된 징후 또는 병태를 감소시킨다. 일부 양상에서, 섬유증은 간, 근육, 또는 폐 섬유증이다. 추가로 섬유증의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 세포 또는 조직에서 섬유증을 감소시키는 방법을 제공한다. 방법은 섬유증 세포 또는 조직을 섬유증을 감소 또는 저해하기에 충분한 양의 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 단일 작용제로서 또는 또 다른 작용제 또는 치료 양상과 조합하여)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내에서 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 일 양상에서, 방법은 생체내에서, 예를 들어, 포유동물 대상체(예를 들어, 동물 모델)에서 수행된다. 일 양상에서 대상체는 인간이다. 일부 양상에서, 섬유증을 감소시키는 것은 하기를 포함한다: (a) 조직 섬유증의 형성 또는 침착을 감소시키거나 저해하는 것; (b) 섬유증 병변의 크기, 세포질(예를 들어, 섬유아세포 또는 면역 세포 구성원), 조성; 또는 세포 내용물을 감소시키는 것; (c) 섬유증 병변의 콜라겐 또는 하이드록시프롤린 함량을 감소시키는 것; (d) 1종 이상의 피브로겐 단백질의 발현 또는 활성도를 감소시키는 것; 및/또는 (e) 염증성 반응과 연관된 섬유증을 감소시키는 것. 일부 양상에서, 섬유증을 감소시키는 것은 하기를 포함한다: (a) 조직 섬유증의 형성 또는 침착을 감소시키거나 저해하는 것; (b) 섬유증 병변의 크기, 세포질(예를 들어, 섬유아세포 또는 면역 세포 구성원), 조성; 또는 세포 내용물을 감소시키는 것; (c) 섬유증 병변의 콜라겐 또는 하이드록시프롤린 함량을 감소시키는 것; (d) 1종 이상의 피브로겐 단백질의 발현 또는 활성도를 감소시키는 것; 및/또는 (e) 염증과 연관된 섬유증을 감소시키는 것.
일부 양상에 따라서, 본 개시내용은 대상체에서 간 또는 폐 기능의 손실을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 방법은 대상체에서 간 기능의 손실을 감소시킨다. 추가 양상에서, 방법은 간 섬유증 감소를 통해서 대상체에서 간 기능의 손실을 감소시킨다. 일부 양상에서 방법은 대상체에서 폐 기능의 손실을 감소시킨다. 일부 양상에서 방법은 폐 섬유증의 감소를 통해서 대상체에서 폐 기능의 손실을 감소시킨다. 일부 양상에서 방법은 특발성 폐 섬유증(IPF)을 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에서 폐 기능 및/또는 폐 섬유증의 손실을 감소시킨다.
추가로 대상체에서 섬유증 감소에 의해서 간 또는 폐 기능을 개선시키는 방법이 제공된다. 일부 예에서, 방법은 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질, 예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체) 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 간 또는 폐 기능 손실을 감소시키는 것은 하기를 포함한다: (a) 상응하는 기관에서 조직 섬유증의 형성 또는 침착을 감소시키거나 저해하는 것; (b) 상응하는 기관에서 섬유증 병변의 크기, 세포질(예를 들어, 섬유아세포 또는 면역 세포 구성원), 조성; 또는 세포 내용물을 감소시키는 것; (c) 상응하는 기관에서 섬유증 병변의 콜라겐 또는 하이드록시프롤린 함량을 감소시키는 것; (d) 상응하는 기관에서 1종 이상의 피브로겐 단백질(예를 들어, 피브리노겐 및 콜라겐)의 발현 또는 활성도를 감소시키는 것; (d) 상응하는 기관에서 세포외 매트릭스 및/또는 EMT의 발현을 감소시키는 것 및/또는 (e) 상응하는 기관에서 염증성 반응과 연관된 섬유증을 감소시키는 것.
인간 신체는 흉터에 의해서 외상 및 손상에 반응한다. 과도한 흉터를 특징으로 하는 장애의 유형인 섬유증은 일반적인 상처 치유 반응이 방해된 경우에 일어난다. 섬유증 동안, 상처 치유 반응이 계속되어 콜라겐의 과도한 생산 및 침착을 유발한다. 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 치료 유효량의 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 항체 또는 ActRIIA에 특이적으로 결합하는 항체)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 섬유증의 치료 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 간 또는 폐 기능을 개선시키거나 또는 이의 손실을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 하기를 초래한다: (a) 상응하는 기관에서 조직 섬유증의 형성 또는 침착을 감소시키거나 저해하는 것; (b) 상응하는 기관에서 섬유증 병변의 크기, 세포질(예를 들어, 섬유아세포 또는 면역 세포 구성원), 조성; 또는 세포 내용물을 감소시키는 것; (c) 상응하는 기관에서 섬유증 병변의 콜라겐 또는 하이드록시프롤린 함량을 감소시키는 것; (d) 상응하는 기관에서 1종 이상의 피브로겐 단백질(예를 들어, 피브리노겐 및 콜라겐)의 발현 또는 활성도를 감소시키는 것; (d) 상응하는 기관에서 세포외 매트릭스 및/또는 EMT의 발현을 감소시키는 것 및/또는 (e) 상응하는 기관에서 염증성 반응과 연관된 섬유증을 감소시키는 것.
본 개시내용은 또한 폐의 섬유증 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, ActRII에 특이적으로 결합하는 항체, 및 이의 단편 및 변이체 및 유도체)을 폐의 섬유증 병태를 갖거나 또는 이의 발달 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 폐 섬유증은 특발성이거나, 약물학적으로-유도되거나, 방사선-유도되거나, 만성 폐색성 폐 질환(COPD) 또는 만성 천식이다. 치료될 수 있는 폐의 섬유증 병태는 일반 간질성 폐렴(UIP), 간질성 폐 질환, 잠인성 섬유성 폐포염(CFA) 및 기관지 확장증으로 이루어진 군의 하나 이상의 구성원을 포함한다. 일부 양상에서 치료되는 폐의 섬유증 병태는 폐의 염증성 장애와 연관된 병태, 예를 들어, 천식, 및/또는 만성 폐색성 폐 질환(COPD)이다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 폐 섬유증을 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유증의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 추가로 폐 섬유증의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 항체 및 항-ActRIIB 항체)로 치료되는 폐의 섬유증 병태는 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 천식, 급성 폐 증후군, 기관지 폐 형성 이상, 폐 고혈압(예를 들어, 특발성 폐 고혈압(IPH)), 조직구증 X 진폐증, 카플란병(Caplan's disease), 류마티즘성 질환 및 전신 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양상에서, 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIA 항체 및 항-ActRIIB 항체)로 치료되는 폐의 섬유증 병태는 자가면역 결합 조직 장애와 연관된 병태이다. 일부 양상에서, 자가면역 결합 조직 장애는 사르코이드증 류마티즘성 관절염, 피부경화증 및 전신 홍반 루프스(SLE)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 양상에서, 폐의 섬유증 병태는 질환, 독서, 인설트 또는 의학적 치료와 연관된 병태이다. 따라서, 일부 양상에서, 폐의 섬유증 병태는 흡입성 작업장 위험물(예를 들어, 먼저, 석면, 실리카, 보크사이트, 철, 면, 탈크 및 석탄 가루), 독소(예를 들어, 아미노다론, 카무스틴, 클로람페니콜, 헥사메토늄), 담배 연기 및 환경 오염물을 비롯한 독소 및 자극물에 대한 노출로 이루어진 군의 하나 이상의 구성원과 연관된 병태이다. 추가적인 양상에서, 폐의 치료되는 섬유증 병태는 감염 질환과 연관된 병태이다. 특정 양상에서 감염 질환은 만성 감염과 연관된 병태이다.
추가적인 양상에서, 폐의 치료되는 섬유증 병태는 의학적 치료와 연관된 병태이다. 특정 양상에서 의학적 치료는 수술, 방사선 요법 및 약물 요법으로부터 선택된다. 추가 양상에서, 약물 요법은 화학요법이다. 추가 양상에서, 화학요법은 블레오마이신, 메토트렉세이트, 아미도다론, 부설판, 나이트로소우레아 및 나이트로푸란토인으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학치료제의 투여를 포함한다.
폐 고혈압 또는 특발성 폐 섬유증(IPF)의 치료 및/또는 개선 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 방법은 대상체 폐 고혈압 또는 IPF를 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에게 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 또는 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, ActRII-결합 단백질 또는 ActRII-결합-단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 폐 고혈압을 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위해서 투여된다. 일부 예에서, ActRII-결합 단백질 또는 ActRII-결합-단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 IPF를 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위해서 투여된다. 일부 양상에서, ActRII-결합 단백질 또는 ActRII-결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 폐 고혈압 또는 IPF을 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에게 투여한다.
본 개시내용은 또한 간의 섬유증 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 방법은 ActRII-결합 단백질 또는 ActRII-결합 단백질을 갖는 유효량의 약제학적 조성물을 간의 섬유증 병태를 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가로 간의 섬유증 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질을 사용하여 치료될 수 있는 간의 섬유증 병태는 지방증(예를 들어, 비알코올성 지방간염(NASH), 지방간 질환, 담즙정체성 간 질환(예를 들어, 운발성 담즙성 경화증(PBC)), 간 경화증, 알코올 유도 간 섬유증, 감염-유도 간 섬유증, 담관 손상, 담즙 섬유증, 선천성 간 섬유증, 자가면역 간염 및 담관병변으로 이루어진 군의 하나 이상의 구성원을 포함한다. 추가 양상에서, 감염-유도 간 섬유증은 박테리아-유도되거나 또는 바이러스-유도된다.
추가적인 양상에서, 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질로 치료될 수 있는 간의 섬유증 병태는 바이러스 감염과 연관된 간 섬유증(예를 들어, 간염(C형, B형 및 D형 간염), 자가면역 간염, 비-알코올성 지방간 질환(NAFLD), 진행성 거대 섬유증, 알코올중독, 및 독소 또는 자극물(예를 들어, 알코올, 약제학적 약물 및 환경 독소)로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 구성원이다.
본 개시내용은 또한 심장 섬유증의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 방법은 ActRII-결합 단백질 또는 ActRII-결합 단백질을 갖는 유효량의 약제학적 조성물을 심혈관계의 섬유증 병태를 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 심장 섬유증은 심내막 섬유증 또는 특발성 심근병증이다. 일부 실시형태에서, 피부 섬유증은 피부경화증, 외상 후, 수술성 피부 흉터, 켈로이드, 또는 피부 켈로이드 형성이다. 일부 실시형태에서, 눈 섬유증은 녹내장, 눈의 경화증, 결막 흉터, 각막 흉터 또는 익상편이다. 일부 실시형태에서, 복막뒤 섬유증은 특발성이거나, 약물학적으로-유도되거나 또는 방사선-유도된다. 일부 실시형태에서, 낭성 섬유증은 췌장의 낭성 섬유증 또는 폐의 낭성 섬유증이다. 일부 실시형태에서, 주사 섬유은 근육내 주사의 합병증으로서 일어난다. 추가로 간의 심혈관계의 섬유증 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
또한 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 안질환 또는 병태의 치료 및/또는 개선 방법이 제공된다. 특정 양상에서 안질환 또는 병태 는 녹내장이다. 일부 양상에서, 안질환은 망막증이다. 추가 양상에서, 안질환 은 당뇨병성 망막증이다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 눈의 섬유증 병태(예를 들어, 눈의 섬유증, 안과 섬유증, 망막 기능장애와 연관된 섬유증)의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 따라서, 일부 예에서, 방법은 눈의 섬유증 병태를 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에게 ActRII-결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 추가로 간의 심혈관계의 섬유증 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
본 명세서에 제공된 방법에 따라서 치료될 수 있는 눈의 섬유증 병태는, 손상, 예컨대, 기계적 상처(예를 들어, 알칼리 화상과 연관된 섬유증) 또는 다양한 대사 기능부전(예를 들어, 염증, 허혈 및 퇴행성 질환에 대한 반응)에 대한 반응으로 일어날 수 있다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 안 수술과 연관된 섬유증의 치료 방법을 제공한다. 추가 양상에서, 섬유증은 안 병태에서 수술후 흉터와 연관된 병태이다. 추가 양상에서, 수술후 흉터는 망막 재유착술, 백내장적출술 또는 배수 절차에 관련된 수술과 연관된 병태이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 황반 부종(예를 들어, 당뇨병성 황반부종), 안구 건조 질환, 렌즈의 섬유증, 각막 기질 또는 내피의 섬유증, 각막 및 결막에서의 흉터, 섬유혈관 흉터, 망막 섬유증 및 망막 신경아교증으로 이루어진 군의 하나 이상의 구성원과 연관된 눈의 섬유증 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 황반 변성과 연관된 눈의 섬유증 병태의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 치료되는 섬유증 병태는 노인성 황반 변성과 연관된 병태이다. 일부 실시형태에서 치료되는 병태는 습윤 황반 변성과 연관된 병태이다. 다른 실시형태에서 치료되는 병태는 건조 황반 변성과 연관된 병태이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 추가로 염증성 질환 또는 병태 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 일부 양상에서, 염증성 질환 또는 병태는 염증성 암, 섬유증과 연관된 염증, 죽상경화증과 연관된 염증, 천식 또는 자가면역 장애이다.
추가로 심혈관 질환 또는 병태의 치료 및/또는 개선 방법이 제공된다. 추가로 심혈관 질환 또는 병태 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 일부 예에서, 방법은 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 심혈관 질환 또는 병태를 치료 또는 개선시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 심혈관 질환 또는 병태는 빈혈, 울혈성 심부전, 심실 기능장애, 혈관 석회화, 폐 고혈압, 동맥 재발협착증, 또는 심근 섬유증이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 폐 질환 또는 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 추가로 폐 질환 또는 병태 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 유효 용량의 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근골격 질환 또는 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 추가로 폐 근골격 질환 또는 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 유효 용량의 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체)을 투여함으로써 치료 및/또는 개선될 수 있는 예시적인 ActRIIB-연관 병태는 신경근 장애(예를 들어, 근디스트로피 및 근육 위축증), 울혈성 폐색성 폐 질환 또는 폐기종(및 연관된 근육 손실), 근육 손실 증후군, 근육감소증, 악액질, 지방질 조직 장애(예를 들어, 비만), 제2형 당뇨병, 및 골 퇴행성 질환(예를 들어, 골다공증)을 포함한다. 이들 칠환 또는 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 본 명세서에 제공된다.
유효 용량의 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRIIB 항체)을 투여함으로써 치료 및/또는 개선될 수 있는 다른 예시적인 ActRII-연관 병태는 근퇴행성 및 신경근 장애, 및 골다공증을 포함한다.
제공된 ActRII-결합 단백질은 근육성장이 필요한 다른 신경근 질환 또는 병태에서 근육량을 증가시키기에 효과적인 수단을 제공한다. 예를 들어, 근위축성 측색 경화증(ALS)에서. ActRII-결합 단백질이 유용할 수 있는 다른 신경근 질환은 척수 손상 또는 뇌졸중으로 인한 마비; 외상 또는 퇴행성, 대사, 또는 염증성 신경병증으로 인한 신경절제; 성인 운동 뉴런 질환; 다초점 컨덕터 블록을 갖는 자가면역 운동 신경병증; 및 영아 또는 청소년 척수 근위측증을 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 골 및/또는 연골 형성을 유도하는 방법, 골 손실을 예방하는 방법, 골광화(bone mineralization)를 증가시키는 방법 또는 골의 탈회(demineralization)를 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 제공된 ActRII-결합 단백질은 대상체(예를 들어, 인간 및 다른 동물)에서 골다공증을 치료하고, 골절 및 연골 결함을 치유하는 데 있어서의 용도를 갖는다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 골절 또는 연골을 치유하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서, 제공된 방법 및 조성물을 투여하여, 골 손실을 유발하는 병태, 예컨대 골다공증, 부갑상선 기능항진, 쿠싱병(Cushing's diease), 갑상선중독증, 만성 설사 상태 또는 흡수 불량 또는 신경성 식욕부진증을 치료한다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경학적 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로 신경학적 장애 또는 병태 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 일부 양상에서, 신경학적 장애 또는 병태는 뉴런사(neuronal death)와 연관된다. 일부 양상에서, 신경학적 장애 또는 병태는 파킨슨병, ALS; 뇌 위축(brain atrophy), 또는 치매이다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로 대사 장애 또는 병태 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 일부 양상에서, 대사 장애 또는 병태는 당뇨병과 연관된 병태이다. 일부 양상에서 대사 장애 또는 병태는 비만이다. 추가 양상에서 대사 장애 또는 병태는 비대성 비만이다. 일부 양상에서, 대사 장애 또는 병태는 암 악액질 또는 근육 손실이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 신체 지방 함량을 조절하기 위한 조성물 및 방법, 및 이에 관련된 병태, 및 특히 이와 관련된 건강 손상 병태를 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 체중을 조절(제어)하는 것은 체중을 감소 또는 증가시키거나, 체중 증가의 속도를 감소 또는 증가시키거나, 또는 체중 감소의 속도를 증가 또는 감소시키는 것을 지칭할 수 있고, 또한 체중을 능동적으로 유지시키거나 또는 (예를 들어, 체중을 달리 증가 또는 감소시킬 수 있는 외부 또는 내부 영향에 대해서) 체중을 상당히 변화시키지 않는 것을 포함한다. 일 양상에 따라서, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여함으로써 체중을 조절하는 방법을 제공한다. 일 양상에서, 본 개시내용은 대상체에서 체중을 감소시키고/거나 체중 증가를 감소시키는 방법, 보다 특별하게는 비만을 앓을 위험이 있거나 또는 비만을 앓고 있는 환자에서 비만을 치료 또는 개선시키는 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 개시내용은 체중을 증가시키거나 또는 유지할 수 없는 대상체(예를 들어, 손실 증후군을 갖는 동물)를 치료하기 위한 방법 및 화합물을 제공한다. 이러한 방법은 체중 및/또는 체질량을 증가시키거나 또는 체중 및/또는 체질량을 감소시키거나 또는 바람직하지 않게 낮은(예를 들어, 건강하지 않은) 체중 및/또는 체질량과 연관되거나 이것에 의해서 유발되는 병태를 개선시키기에 효과적이다. 제공된 ActRIIB-결합 단백질은 제II형 당뇨병 및 대사 증후군의 발달을 둔화시키거나 예방하기 위한 치료제로서 추가로 사용될 수 있다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 당뇨병 및/또는 당뇨병과 연관된 병태를 갖거나 또는 이의 발달 위험을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병과 연관된 병태의 치료 및/또는 개선 방법을 제공한다. 추가로 당뇨병 또는 당뇨병과 연관된 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 일 양상에서, 당뇨병과 연관된 병태는 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신장병, 당뇨병성 혈관병 또는 당뇨병성 미세혈관병이다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 상처 치유를 촉진시키는 방법을 제공한다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 상처 치유와 연관된 흉터 형성을 감소시키기 위해서 대상체에 투여된다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 비대성 흉터 또는 켈로이드의 발달 위험이 있는 대상체에게 투여된다.
추가로 ActRII 발현 및/또는 ActRII 신호전달과 연관된 병리학적 병태에서 ActRII 활성도를 길항작용하는 방법이 제공된다. 일부 예에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 항-ActRII-항체 또는 ActRII-결합 항체 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 근골격 질환 또는 장애, 예컨대, 근육 위축증이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 예를 들어, 폐 또는 간의 섬유증 질환이다. 추가 양상에서, 병리학적 병태는 당뇨병이다. 일부 양상에서, 병리학적 병태는 비만(예를 들어, 비대성 비만)이다. 추가적인 양상에서, 병리학적 병태는 폐 고혈압 또는 특발성 폐 섬유증(IPF)이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 안질환, 예컨대, 당뇨병성 망막증이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 암, 예컨대, 암종(예를 들어, 피부의 기저 및 편평 세포 암종, 두경부 암종 및 신장 세포 암종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 결장직장 암 또는 골-손실 유도암이다.
ActRIIB 발현 및/또는 증가된 ActRIIB 신호전달과 연관된 병리학적 병태에서 ActRIIB 활성도를 길항작용하는 방법이 또한 제공된다. 일부 예에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 항-ActRIIB-항체 및 ActRIIB-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 근골격 질환 또는 장애, 예컨대, 근육 위축증이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 예를 들어, 폐 또는 간의 섬유증 질환이다. 추가 양상에서, 병리학적 병태는 당뇨병이다. 일부 양상에서, 병리학적 병태는 비만(예를 들어, 비대성 비만)이다. 추가적인 양상에서, 병리학적 병태는 폐 고혈압 또는 특발성 폐 섬유증(IPF)이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 안질환, 예컨대, 당뇨병성 망막증이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 암, 예컨대, 암종(예를 들어, 피부의 기저 및 편평 세포 암종, 및 두경부 암종), 골수종, 신장 세포 암종, 결장직장 암, 또는 골-손실 유도 암이다.
추가로 ActRIIA 발현 및/또는 증가된 ActRIIA 신호전달과 연관된 병리학적 병태에서 ActRIIA 활성도를 길항작용하는 방법이 제공된다. 일부 예에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 항-ActRIIA-항체 또는 ActRIIA-결합 항체 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 근골격 질환 또는 장애, 예컨대, 근육 위축증이다. 일 양상에서 병리학적 병태는 섬유증 질환이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 예를 들어, 폐 또는 간의 섬유증 질환이다. 추가 양상에서 병리학적 병태는 폐 또는 간의 섬유증 질환이다. 추가 양상에서, 병리학적 병태는 당뇨병이다. 일부 양상에서, 병리학적 병태는 비만(예를 들어, 비대성 비만)이다. 추가적인 양상에서, 병리학적 병태는 폐 고혈압 또는 특발성 폐 섬유증(IPF)이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 안질환, 예컨대, 당뇨병성 망막증이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 암, 예컨대, 암종(예를 들어, 피부의 기저 및 편평 세포 암종, 두경부 암종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 결장직장 암 또는 골-손실 유도암이다.
추가로 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 발현, 및/또는 증가된 ActRIIB 및/또는 ActRIIA 신호전달과 연관된 병리학적 병태에서 ActRIIB 및 ActRIIA 활성도를 길항작용하는 방법이 제공된다. 일부 예에서, 방법은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 항-ActRII-항체 또는 ActRII-결합 항체 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 근골격 질환 또는 장애, 예컨대, 근육 위축증이다. 일 양상에서 병리학적 병태는 섬유증 질환이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 예를 들어, 폐 또는 간의 섬유증 질환이다. 추가 양상에서 병리학적 병태는 폐 또는 간의 섬유증 질환이다. 추가 양상에서, 병리학적 병태는 당뇨병이다. 일부 양상에서, 병리학적 병태는 비만(예를 들어, 비대성 비만)이다. 추가적인 양상에서, 병리학적 병태는 폐 고혈압 또는 특발성 폐 섬유증(IPF)이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 안질환, 예컨대, 당뇨병성 망막증이다. 일부 양상에서 병리학적 병태는 암, 예컨대, 암종(예를 들어, 피부의 기저 및 편평 세포 암종, 두경부 암종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 결장직장 암 또는 골-손실 유도암이다.
추가적인 양상에서, 본 개시내용은 ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체 또는 이의 ActRII-결합 단편)을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 암과 연관된 병태의 치료 및/또는 개선 방법 또는 이의 치료를 제공한다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 항-ActRIIB 항체 또는 이의 ActRIIB-결합 단편이다. 추가로 암 또는 암과 연관된 병태의 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조에서의 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 항-ActRIIA 항체 또는 이의 ActRIIA-결합 단편이다. 일부 양상에서 ActRII-결합 단백질은 ActRIIB 및 ActRIIA 또는 ActRIIB 및 ActRIIA 이의 ActRIIB-결합 단편에 결합하는 항체이다. 일부 양상에서, 대상체는 흑색종, 자궁암, 폐암, 난소암, 유방암, 결장암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는다. 특정 양상에서, 대상체는 암종(예를 들어, 피부의 기저 및 편평 세포 암종 및 두경부 암종), 골수종, 결장직장 암 또는 골-손실 유도 암을 갖는다.
일부 양상에서, 방법은 암 세포, 종양 연관-기질 세포, 또는 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA)를 발현하는 내피 세포를, ActRII에 특이적으로 결합하는 ActRII-결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 방법은 액티빈 A를 ActRII-결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가적인 양상에서 종양 세포는 골수섬유증, 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 뇌하수체암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로부터 유래된다. 또 다른 양상에서, 암은 유방암, 위장암, 또는 암종(예를 들어, 기저 및 편평 세포 암종)이다. 추가적인 양상에서, 암은 골-손실-유도암이다. 일부 양상에서 종양 세포는 암주(cancer line)로부터 유래된다.
본 개시내용은 치료 유효량의 ActRII-결합 단백질을, 단독으로 또는 1종 이상의 추가적인 치료제(예를 들어, 1종 이상의 추가적인 치료제)와 조합하여 섬유증 병태를 갖거나 이의 발생 위험을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 ActRII-매개된 질환 및/또는 병태(예를 들어, 근육 장애, 예컨대, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태, 예컨대, 심근 섬유증 및 특발성 폐 섬유증(IPF)); 대사 질환(예를 들어, 제II형 당뇨병 인슐린 저항성, 고혈당, 및 비만); 염증성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예를 들어, 울혈성 심부전 및 고혈압); 안질환, 예컨대, 노인성 황반 변성; 폐 질환, 근골격 질환, 골격 질환, 예컨대, 골다공증; 신경학 질환; 상처 치유; 체중 감소; 및 암(예를 들어, 암종, 골수종, 골-손실 유도 암, 뇌하수체암 및 위장암))을 치료(예를 들어, 예방) 및/또는 개선시키는 것에서 사용하기 위한 1종 이상의 의약의 제조를 위해서 ActRII-결합 단백질을 단독으로 또는 또 다른 작용제와의 조합으로 사용하기 위한 조성물을 추가로 제공한다.
또한 예를 들어, 주어진 치료 요법의 효능을 결정하기 위해서, 임상 시험 절차의 부분으로서 혈액 또는 조직에서 단백질(예를 들어, ActRIIB 및/또는 ActRIIA 수준)을 진단적으로 모니터링하기 위한 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질의 용도가 제공된다. 예를 들어, 검출은 ActRII-결합 단백질을 검출 가능한 물질에 커플링시킴으로써 용이해질 수 있다. 검출 가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알카리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민,다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 안실 클로라이드 또는 파이코에리트린을 포함하고; 형광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
약제학적 조성물및 투여 방법
ActRII-결합 단백질을 제조하고, 이것을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나 또는 쉽게 결정된다. ActRII-결합 단백질의 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소에 의해서일 수 있다. 용어 비경구는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 안내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다.
이들 모든 투여 형태는 본 개시내용에 포함되는 것으로 명확하게 고려되고, 투여에 대한 형태의 또 다른 예는 주사, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 드립(drip)을 위한 용액일 것이다. 통상적으로, 적합한 약제학적 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 인산염 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리솔베이트), 임의로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 교시와 상용성인 다른 방법에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 ActRII-결합 단백질은 섬유증 또는 종양의 기관 및/또는 부위로 직접 전달되고, 이에 의해서 치료제에 대한 질환이 있는 조직의 노출을 증가시킬 수 있다. 일 양상에서, 투여는 예를 들어, 흡입 또는 비내 투여에 의해서 직접 기도에 대한 것이다.
본 명세서에 논의된 바와 같이, ActRII-결합 단백질은 근육 장애, 예컨대, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태, 예컨대, 심근 섬유증, 및 특발성 폐 섬유증(IPF)); 대사 질환(예를 들어, 제II형 당뇨병 인슐린 저항성, 고혈당, 및 비만); 염증성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예를 들어, 울혈성 심부전, 및 고혈압); 안질환, 예컨대, 노인성 황반 변성; 폐 질환, 근골격 질환, 골격 질환, 예컨대, 골다공증; 신경학 질환; 상처 치유; 체중 감소; 및 암(예를 들어, 암종, 골수종, 골-손실 유도 암, 뇌하수체암, 및위장암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 ActRII-매개된 질환 및 병태의 생체내 치료를 위해서 약제학적으로 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 개시된 ActRII-결합 단백질은 투여를 용이하게 하고, 활성제의 안정성을 촉진시키도록 제형화될 수 있다. 본 개시내용에 따라서 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한, 비-독성, 멸균 담체, 예컨대, 생리학적 염수, 비-독성 완충제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 예의 응용의 목적을 위해서, 약제학적으로 유효량의 접합되거나 또는 비접합된 ActRII-결합 단백질은 ActRII에 대한 효과적인 결합을 달성하고, 이득을 달성하기에, 예를 들어, 질환 또는 병태의 증상을 개선시키거나 또는 물질 또는 세포를 검출하기에 충분한 양을 의미한다. 본 명세서에 개시된 치료 방법에서 사용하기에 적합한 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기술되어 있다.
본 명세서에 제공된 특정 약제학적 조성물은 예를 들어, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 비롯한, 허용 가능한 투여형으로 경구로 투여될 수 있다. 특정 약제학적 조성물은 또한 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해서 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체 이용률을 향상시키기 위한 흡수 프로모터 및/또는 다른 종래의 용해제 또는 분산제를 사용하여 염수 중의 용액으로서 제조될 수 있다.
단일 투여형을 생성하기 위해서 담체 물질과 조합될 수 있는 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRIIB에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 ActRIIA)의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 모드에 따라서 달라질 것이다. 조성물은 단일 용량, 다회 용량으로서 또는 주입으로 확립된 시간에 걸쳐서 투여될 수 있다. 투여량 요법은 또한 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질은 상기에 언급된 치료 방법에 따라서 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 인간 또는 다른 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질은 ActRII-결합 단백질을 공지된 기술에 따라서 종래의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 조합함으로써 제조된 종래의 투여형으로 그러한 인간 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 또는 특징은 그것이 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 널리 공지된 변수에 의해서 구술될 수 있다. 1종 이상의 상이한 ActRII-결합 단백질을 포함하는 칵테일이 또한 사용될 수 있다.
ActRII-매개된 질환 또는 병태, 예컨대, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태; 염증성, 자가면역, 심혈관, 폐, 근골격, 골격, 안, 신경학, 또는 대사 질환 또는 병태; 비만; 상처 치유; 및 암의 치료를 위한 ActRII-결합 조성물의 치료 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리학적 상태, 대상체가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부를 비롯한 다수의 상이한 인자에 따라서 다르다. 통상적으로, 대상체는 인간이지만, 유전자 이식된 포유동물을 비롯한 비-인간 포유동물이 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 역가될 수 있다.
ActRII-결합 단백질을 투여함으로써 특정 질환 또는 병태의 증상을 개선시키는 것은 ActRII-결합의 투여에 기인되거나 또는 이와 연관될 수 있는 영구적인지 일시적인지 지속적인지 순간적인지의 여부에 관계없이 임의의 경감을 지칭한다.
본 개시내용은 또한 예를 들어, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태; 염증성, 자가면역, 심혈관, 폐, 근골격, 골격, 안, 신경학, 또는 대사 질환 또는 병태; 비만; 상처 치유; 및 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRII 항체의 용도를 제공한다.
병용 요법
일부 양상에서, ActRII-결합 단백질(예를 들어, 항-ActRII 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)은 1종 이상의 다른 요법과 조합하여 투여된다. 이러한 요법은 추가적인 치료제뿐만 아니라 다른 의학적 개입을 포함한다. 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질과 조합하여 투여될 수 있는 예시적인 치료제는 항-SDI-섬유증, 코르티코스테로이드, 소염제, 안지오텐신 전환 효소 저해제, 안지오텐신 수용체 차단제, 이뇨제, 당뇨병치료제, 면역 억제제, 화학치료제, 항-대사산물, 및 면역조절제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다양한 양상에서, ActRII-결합 단백질은 외과 절제술/제거 절차 전에, 그 동안 및/또는 그 후에 대상체에게 투여된다.
진단
본 개시내용은 또한 ActRII-매개된 질환 및 병태(예를 들어, 근육 장애, 예컨대, 퇴행성 근육 질환, 근디스트로피, 근육 위축증, 또는 근육 손실 장애; 섬유증 병태(예를 들어, 간, 폐, 혈관 및/또는 안구 섬유증 병태, 예컨대, 심근 섬유증, 및 특발성 폐 섬유증(IPF)); 대사 질환(예를 들어, 제II형 당뇨병 인슐린 저항성, 고혈당, 및 비만); 염증성 질환 또는 병태, 자가면역 질환, 심혈관 질환(예를 들어, 울혈성 심부전, 및 고혈압); 안질환, 예컨대, 노인성 황반 변성; 폐 질환, 근골격 질환, 골격 질환, 예컨대, 골다공증; 신경학 질환; 상처 치유; 체중 감소; 및 암(예를 들어, 암종, 골수종, 골-손실 유도 암, 뇌하수체암, 및 위장암))의 진단 동안 유용한 진단 방법을 제공하고, 이것은 개체로부터의 단백질 조직 또는 체액에서 ActRII(예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB)의 발현 수준을 측정하고, 측정된 발현 수준을 정상 조직 또는 체액에서의 표준 ActRII(예를 들어, ActRIIA 또는 ActRIIB) 발현 수준과 비교하는 것을 포함하며, 이에 의해서 표준에 대한 ActRII 발현 수준의 증가가 본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 본 명세서에 제공된 바와 같은 전장 항-ActRIIB 항체 및 항원-결합 항체 단편에 의해서 치료될 수 있는 장애를 나타낸다.
본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRII 항체(예를 들어, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체)는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 전통적인 면역조직학 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA) 수준을 검정하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참조). ActRII 단백질(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA) 발현을 검출하기에 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역검정, 예컨대, 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 면역침전 또는 웨스턴 블롯팅을 포함한다.
"ActRII 단백질의 발현 수준을 검정한다"는 것은 제1 생물학적 샘플에서 ActRII 단백질을 직접적으로(예를 들어, 절대 단백질 수준을 결정 또는 예측함으로써) 또는 상대적으로(예를 들어, 제2 생물학적 샘플에서 질환 연관된 폴리펩타이드 수준과 비교함으로써) 정성적으로 또는 정량적으로 측정 또는 예측하는 것으로 의도된다. 제1 생물학적 샘플에서 ActRII 단백질 발현 수준을 측정 또는 예측하고, 표준 ActRII 단백질 수준과 비교할 수 있고, 표준은 장애를 갖고 있지 않은 개체로부터 수득된 제2 생물학적 샘플로부터 취하거나 또는 장애를 갖지 않는 개체의 집단으로부터의 수준을 평균냄으로써 결정된다. 관련 기술 분야에서 인지될 바와 같이, "표준" ActRII 단백질 수준은 공지되면, 그것은 비교를 위해서 표준으로서 반복적으로 사용될 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 ActRII를 잠재적으로 발현하는 세포의 다른 기원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플인 것으로 의도된다. 포유동물로부터 조직 생검물 및 체액을 수득하는 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
ActRII-결합 단백질을 포함하는 키트
본 개시내용은 적합한 패키징 내의 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRII에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대, 전장 ActRII-항체 및 ActRII-결합 항체 단편, 및 이의 변이체 및 유도체), 및 본 명세서에 기술된 방법을 수행하는 데 사용될 수 있는 서면 자료를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 서면 자료는 하기 정보 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 사용 지시서, 임상 연구의 논의, 부작용의 목록, 과학적 문헌 참조, 패키지 삽입물, 임상 시험 결과 및/또는 이들의 요약 등. 서면 자료는 조성물의 활성도 및/또는 이점을 나타내거나 확립할 수 있고/있거나 투약, 투여, 부작용, 약물 상호작용 또는 헬쓰 케어 제공자에게 유용한 다른 정보를 기술할 수 있다. 이러한 정보는 다양한 연구, 예를 들어, 생체내 모델에 관련된 실험 동물을 사용하는 연구 및/또는 인간 임상 시험을 기반으로 하는 연구의 결과를 기반으로 할 수 있다. 키트는 또 다른 요법(예를 들어, 또 다른 작용제) 및/또는 다른 요법(예를 들어, 다른 작용제)에 관련된 정보를 제공하도록 제공된 상기에 기술된 것과 같은 서면 자료를 추가로 함유할 수 있다.
특정 양상에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 적어도 1종의 정제된 ActRII-결합 단백질을 포함한다. 일부 양상에서, 키트는 모든 대조군을 비롯한, 검출 검정을 수행하기에 필수적이고/이거나 충분한 구성성분 모두, 검정을 수행하기 위한 지시, 및 분석 및 결과 제시에 필수적인 임의의 소프트웨어를 함유한다.
면역검정
ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRII에 특이적으로 결합하는 항체, 및 ActRII에 특이적으로 결합하는 항체의 ActRII-결합 단편, 및 이의 변이체, 또는 유도체)은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서 면역특이적 결합에 대해서 검정될 수 있다. 사용될 수 있는 면역검정은 기술, 예컨대 웨스턴 블롯, 방사면역검정(REA), ELISA(효소 연결 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침강 반응, 젤 확산 침강 반응, 면역확산 검정, 교착 검정, 보체-고정화 검정, 면역방사 검정, 형광 면역검정, 또는 단백질 A 면역검정을 사용하는 경쟁 및 비-경쟁 검정 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 검정은 일상적이고, 관련 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1] 참조, 이것은 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨).
본 명세서에 제공된 ActRII-결합 단백질(예를 들어, ActRII에 특이적으로 결합하는 항체 및 ActRII에 특이적으로 결합하는 항체의 ActRII-결합 단편, 및 이의 변이체, 또는 유도체)은 ActRII(예를 들어, ActRIIB 및 ActRIIA) 또는 이의 보존된 변이체 또는 펩타이드 단편의 동일계 검출을 위해서, 면역형광, 면역전자 현미경 또는 비-면역학적 검정에서와 같이, 조직학적으로 사용될 수 있다. 동일계 검출은 관련 기술 분야에 공지된 방법에 따라서 성취될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험을 사용함으로써 각각의 결정에 대해서 조작 및 최적의 검정 조건을 결정할 수 있을 것이다. ActRII-결합 단백질의 결합 특징의 결정에 적합한 방법은 본 명세서에 기술되어 있거나 관련 기술 분야에 달리 공지되어 있다. 이러한 동력학적 분석을 위해서 설계된 장비 및 소프트웨어는 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, BIACORE(등록상표), BIAevaluation(등록상표) 소프트웨어, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare); KINEXA(등록상표) 소프트웨어, 사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments)).
달리 제시되지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래의 기술을 사용하며, 이는 관련 기술 분야의 기술에 포함된다.
하기 실시예는 제한의 방식이 아닌 예시의 방식에 의해서 제공된다.
실시예
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구체적인 실시형태의 상기 설명은 본 개시내용의 일반적인 특징을 완전히 나타낼 것이어서, 나머지는 관련 기술 분야의 기술 내의 지식을 적용함으로써, 과도한 실험 없이, 본 개시내용의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 이러한 구체적인 실시형태를 용이하게 변형시키고/시키거나 다양한 응용을 위해서 개작할 수 있다. 따라서, 이러한 개작 및 변형은 본 명세서의 교시 및 안내를 기반으로 하는, 개시된 실시형태의 등가물의 의미 및 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 어법 또는 용어는 설명의 목적을 위해서이고, 제한이 아니어서, 본 명세서의 용어 또는 어법은 교시 및 안내에 비추어 통상의 기술자에 의해서 해석되어야 한다.
본 개시내용의 범위 및 범주는 상기에 기술된 예시적인 실시형태 중 임의의 것에 의해서 제한되는 것이 아니어야 하고, 하기 청구범위 및 그의 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 다른 문헌은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해서 참조로 혼입되는 것을 개별적으로 나타내는 것과 같이 동일한 정도로 모든 목적을 위해서 이들의 전문이 참조로 포함된다.
실시예 1. 선택, 특징규명 및 ActRII-결합 항체의 생산
다회-라운드 선택 절차를 사용하여 높은 친화도로 ActRII에 결합하고, 인간 ActRII에 대한 결합에 대해서 액티빈 A와 경쟁하는 인간 IgG 항체를 선택하였고, 이것은 하기에 상술되어 있다.
물질 및 방법
항원(ActRIIA, ActRIIB, ActRIIA-Fc, 및 ActRIIB-Fc)을 피어스(Pierce)로부터의 EZ-링크 설포-NHS-바이오틴일화 키트를 사용하여 바이오틴일화하였다. 염소 항-인간 F(ab')2 카파-FITC (LC-FITC), 엑스트라비딘(Extravidin)-PE(EA-PE) 및 스트렙타비딘-633(SA-633)은 각각 써던 바이오테크(Southern Biotech), 시그마(Sigma) 및 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)로부터 입수하였다. 스트렙타비딘 마이크로비드 및 MACS LC 분리 칼럼을 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec)로부터 구입하였다.
미경험 발견
8개의 미경험 인간 합성 효모 라이브러리 각각 약 109 다양성을 상기에 기술된 바와 같이 증식시켰다(예를 들어, 국제 특허 제WO09/036379호; 제WO10/105256호; 제WO12/009568호 참조). 제1 2라운드의 선택을 위해서, 밀테니이 MACs 시스템을 사용하는 자성 비드 분류 기술을 기술된 바와 같이 수행하였다(예를 들어, 문헌[Siegel et al., J. Immunol. Meth. 286(1-2):141-153 (2004)] 참조). 간략하면, 효모 세포(약 1010 세포/라이브러리)를 3㎖의 10nM 바이오틴일화된 단량체 ActRII-Fc 항원(ActRIIB-Fc 또는 ActRIIA-Fc)과 함께 15분 동안 실온에서 FACS 세척 완충제(인산염-완충 염수(PBS)/0.1% 소 혈청 알부민(BSA)) 중에서 인큐베이션시켰다. 50㎖ 얼음 냉각 세척 완충제로 1회 세척한 후, 세포 펠릿을 40㎖ 세척 완충제 중에 재현탁하고, 스트렙타비딘 마이크로비드(500㎕)를 효모에 첨가하고, 15분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 다음으로, 효모를 펠릿화하고, 5㎖ 세척 완충제 중에 재현탁하고, 밀테니이 LS 칼럼 상에 적재하였다. 5㎖를 적재한 후, 칼럼을 3㎖ FACS 세척 완충제로 3회 세척하였다. 이어서 칼럼을 자기장으로부터 제거하고, 효모를 5㎖의 성장 배지로 용리시키고, 이어서 밤새 성장시켰다. 그 다음 라운드의 분류를 유세포 분석법을 사용하여 수행하였다. 대략적으로 1Х108 효모를 펠릿화하고, 세척 완충제로 3회 세척하고, 실온에서 평형 조건 하에서 바이오틴일화된 단량체 또는 ActRII-Fc 융합 항원(100에서 1nM)의 농도를 감소시키면서 인큐베이션시켰다. 이어서 효모를 2회 세척하고, LC-FITC(1:100 희석됨) 및 SA-633(1:500 희석됨) 또는 EA-PE(1:50 희석됨) 2차 시약 중 어느 하나로 15분 동안 4℃에서 염색하였다. 얼음 냉각 세척 완충제로 2회 세척한 후, 세포 펠릿을 0.4㎖ 세척 완충제 중에 재현탁하고, 스트레이너-캡트 소트 튜브(strainer-capped sort tube)로 옮겼다. 분류를 FACS ARIA 분류기(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여 수행하고, 분류 게이트를 배정하여 배경 대조군에 대한 특이적 결합제를 선택하였다. CHO 세포로부터의 가용성 구성원 단백질을 사용하여 비-특이적 시약 결합제의 수를 감소시키기 위해서(예를 들어, 국제 특허 제 WO14/179363호 및 문헌[Xu et al., Protein Eng. Des. Sel. 26(10):663-670 (2013) 참조), 그리고 ActRII-Fc(각각 ActRIIB-Fc 및 ActRIIA-Fc 항원)를 사용하여 ActRII(ActRIIB 또는 ActRIIA)에 대해서 개선된 친화도를 갖는 결합제를 식별하기 위해서 후속 라운드의 선택을 사용하였다. 최종 라운드의 분류 후, 효모를 플레이팅하고, 각각의 집락을 특징규명 및 친화도 성숙을 위한 클론의 지명을 위해서 선별하였다.
친화도 성숙
3개의 성숙 전략: 경쇄 다양화; CDRH 및/CDRH2의 다양화; 및 순차적 VH 및 VL 돌연변이유발의 수행을 사용하여 미경험 클론의 결합 최적화를 수행하였다.
경쇄 다양화: 중쇄 플라스미드를 미경험 산출물(상기에 기술됨)로부터 추출하고, 1 x 106의 다양성을 갖는 경쇄 라이브러리로 형질전환시켰다. 각각의 라운드에 대해서 10nM 또는 1nM 바이오틴일화된 ActRII-Fc 항원(ActRIIB-Fc 또는 ActRIIA-Fc)을 사용하여 1 라운드의 MACS 분류 및 2 라운드의 FACS 분류를 사용하여 상기에 기술된 바와 같이 선택을 수행하였다.
CDRH1 및 CDRH2 선택: 경쇄 다양화 절차로부터 선택된 클론으로부터의 CDRH3을 1 x 108의 다양성의 CDRH1 변이체 및 CDRH2 변이체를 갖는 미리 제조된 라이브러리 내에 재조합하고, 각각 ActRIIB 및 ActRIIA 항원을 사용하여 평행 선택을 수행하였다. 상기에 기술된 바와 같음. 바이오틴일화된 항원-항체 효모 복합체를 최고 친화도 항체를 선택하기 위해서 상이한 양의 시간 동안 비바이오틴일화된 항원과 함께 인큐베이션시킴으로써 친화도 압력을 적용하였다.
VHmut/VKmut 선택: CDRH1 및 CDRH2 선택 절차로부터 수득된 클론을 중쇄 및/또는 경쇄의 실수 유발 PCR-기반 돌연변이유발을 통해서 친화도 성숙의 추가적인 라운드에 적용하였다. 일반적으로 상기에 기술된 바와 같지만 모든 선택 라운드를 위해서 FACS 분류를 사용하는 것을 부가하여 항원으로서 ActRIIB 또는 ActRIIA를 사용하여 선택을 수행하였다. 항원 농도를 감소시키고, 차가운 항원 경쟁 시간을 증가시켜 최적의 친화도에 대해서 추가로 강요하였다.
항체 생산 및 정제
추가 특징규명을 위해서 선택된 항체의 충분한 양을 생산하기 위해서, 효모 클론을 포화까지 성장시키고, 이어서 진탕하면서 48시간 동안 30℃에서 유도시켰다. 유도 후, 효모 세포를 펠릿화하고, 상청액을 정제를 위해서 수거하였다. IgG를 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제하고, 아세트산, pH 2.0으로 용리시켰다. Fab 단편을 파파인 소화에 의해서 생성하고, 카파셀렉트(KappaSelect)(지이 헬쓰케어 라이프사이언스(GE Healthcare LifeSciences)) 상에서 정제하였다.
포르테바이오(ForteBio) KD 측정
선택된 항체의 포르테바이오 친화도 측정을 상기에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행하였다(예를 들어, 문헌[Estep et al., Mabs, 5(2):270-278 (2013)] 참조). 간략하면, IgG를 온-라인으로 AHQ 센서 상에 적재함으로써 포르테바이오 친화도 측정을 수행하였다. 센서를 검정 완충제 중에서 30분 동안 오프-라인으로 평형화시키고, 이어서 기준선 확립을 위해서 60초 동안 온-라인으로 모니터링하였다. 적재된 IgG를 갖는 센서를 100nM 항원에 5분 동안 노출시키고, 그 후 그것을 오프-레이트 측정을 위해서 5분 동안 검정 완충제로 옮겼다. 동력학을 1:1 결합 모델을 사용하여 분석하였다.
MSD-SET KD 측정
선택된 항체의 평형 친화도 측정을 상기에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행하였다(Estep et al., Mabs 5(2):270-278 (2013)). 간략하면, 용액 평형 적정(SET)을 10 내지 100pM에서 일정하게 유지되는 항원(ActRIIB 단량체 또는 ActRIIA 단량체)을 갖는 PBS + 0.1% IgG-무함유 BSA(PBSF) 중에서 수행하고, 10pM 내지 10nM에서 시작하는 Fab 또는 mAb의 3-내지 5-배 연속 희석물과 인큐베이션시켰다. 항체(PBS 중의 20nM)를 표준 결합 MSD-ECL 플레이트 상에 밤새 4℃에서 또는 실온에서 30분 동안 코팅하였다. 이어서, 700rpm으로 진탕하면서 플레이트를 BSA에 의해서 30분 동안 차단하고, 그 후 세척 완충제(PBSF + 0.05% 트윈 20)로 3회 세척하였다. SET 샘플을 플레이트 상에 적용하고, 700rpm에서 진탕하면서 150초 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 1회 세척하였다. 플레이트 상에 포획된 항원을 3분 동안의 플레이트 상에서의 인큐베이션에 의해서 PBSF 중의 250ng/㎖ 설포태그-표지된 스트렙타비딘으로 검출하였다. 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고, 이어서 MSD 섹터 이미저(Sector Imager) 2400 장비 상에서 계면활성제를 갖는 1x 리드 버퍼(Read Buffer) T를 사용하여 판독하였다. 자유 항원 백분율을 프리즘(Prism)으로 적정된 항체의 함수로서 플롯팅하고, 이차식에 핏팅하여 KD를 추출하였다. 처리량을 개선시키기 위해서, 액체 취급 로봇을 SET 샘플 제조를 비롯한, MSD-SET 실험 전체에서 사용하였다.
옥텟(Octet) Red384 에피토프 비닝(Binning)/리간드 차단
선택된 항체의 에피토프 비닝/리간드 차단을 표준 샌드위치 포맷 교차-차단 검정을 사용하여 수행하였다. 대조군 항-표적 IgG를 AHQ 센서 상에 적재하고, 센서 상의 비점유된 Fc-결합 부위를 무관한 인간 IgG1 항체로 차단시켰다. 이어서, 센서를 100nM 표적 항원에 노출시키고, 그 다음 제2 항-표적 항체 또는 리간드에 노출시켰다. 데이터를 포르테바이오 데이터 분석법 소프트웨어 7.0을 사용하여 처리하였다. 항원 회합 후 제2 항체 또는 리간드에 의한 추가적인 결합은 비점유된 에피토프를 나타낸 반면(비-경쟁자), 결합 없음은 에피토프 차단을 나타낸다(경쟁자 또는 리간드 차단).
크기 배제 크로마토그래피
TSKgel SuperSW mAb HTP 칼럼(22855)을 6분/실시의 사이클 시간으로 0.4㎖/분에서 효모-생산된 mAb의 신속 SEC 분석법을 위해서 사용하였다. 200mM의 인산나트륨 및 250mM의 염화나트륨을 이동상으로서 사용하였다.
동적 주사 형광측정법
10uL의 20x 사이프로 오렌지(Sypro Orange)를 20uL의 0.2 내지 1㎎/㎖ mAb 또는 Fab 용액에 첨가하였다.
RT-PCR 장비(바이오라드(BioRad) CFX96 RT PCR)를 사용하여 샘플 플레이트 온도를 40°부터 95℃까지 0.5℃ 증분으로 상승시켰고, 각각의 온도에서 2분의 평형이 존재하였다. 원 데이터에 대한 1차 도함수의 음수를 사용하여 Tm을 추출하였다. 상기 분석을 기반으로, 바람직한 특징으로 갖는 8개의 미경험 ActRII-결합 항체의 서열을 확인하고, 상기에 기술된 성숙 전략을 사용하여 결합 최적화에 대해서 선택하였다.
실시예 2. ActRII-결합 미경험 항체 및 최적화된 항체의 특징규명
상기 실시예에 따라서 생성된 예시적인 미경험 ActRII-결합 단백질 및 결합 최적화된 ActRII-결합 단백질을 서열, SPR, 및 세포-기반 리포터 검정 분석법에 의해서 추가로 특징규명하였다.
실시예 1에 기술된 방법에 따라서 생성된 예시적인 미경험 ActRII-결합 항체 및 결합 최적화된 ActRII-결합 항체의 서열을 표 1에 제시한다(예시적인 CDR 서열은 밑줄 그어져 있다).
SPR(BIACORE(상표명)-기반 분석법) 및 세포-기반 리포터 검정을 사용하여 표 1에 기술된 ActRII-결합 단백질의 결합을 보다 완전하게 특징규명하였다.
A01 계통 항체
단량체 및 이량체 hActRIIB 및 hActRIIA에 결합하는 A01 항체 계통(A01(미경험 모), B01, C01, D01, E01 및 F01)의 동력학적 특징규명을 표준 BIACORE(등록상표)-기반 분석법을 사용하여 37℃에서 수행하였다. 간략하면, 항체를 항-hFcIgG 바이아코어 칩 상에 포획하고, 상이한 농도의 이량체 및 단량체 ActRIIB 또는 ActRIIA를 포획된 항체 및 대조군 표면 상에 2회 반복하여 주사하였다. 동력학적 속도 상수를 수득하기 위해서, 데이터를 이중 참조하고, 바이아밸류에이션(BiaEvaluation) 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 사용하여 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 결합 속도 상수 kd/ka의 비에 의해서 평형 결합 상수 KD를 결정하였다.
A01 계통 항체 A01 내지 F01의 결합 파라미터 분석법의 결과를 표 2 및 도 1A 내지 1N에 제시한다.
최적화된 A01 계통 항체 B01, C01, D01, E01 및 F01 각각은 A01 모 항체보다 ActRIIB 단량체 및 이량체 결합에 대해서 개선된 평형 해리 상수(KD) 동력학적 파라미터를 나타내었다.
A01 계통 항체 A01, B01, C01, D01, E01 및 F01의 ActRIIB 중화 능력을 293FT 세포의 CRISPE-Cas9 변형에 의해서 수득된 F2.35(IIA 넉아웃) 세포에서 세포-기반 액티빈 A 신호전달 검정으로 평가하였다. 세포에 Smad2/3 반응 요소 pGL3(CAGA)12를 함유하는 실험 루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 대조군 루시퍼라제 리포터 플라스미드 pRL-CMV를 공동-형질주입하였다. 다음 날, mAb의 연속 희석물을 제조하고, 형질주입된 세포에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시키고, 그 후 활성화 인자, 예컨대, 액티빈 A를 추가적인 6시간 인큐베이션 동안 첨가하였다(최종 농도 5ng/㎖). 세포를 PBS 중에서 1x 세척하고, 용해시키고, 듀얼-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(프로메가)을 사용하여 제조사의 지시서에 따라서 검정하였다. 화학발광을 인피니트(Infinite) M200 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 실험 리포터의 루시퍼라제 활성도를 대조군 리포터로부터 수득된 루시퍼라제 활성도에 의해서 정규화하였다. 항-ActRIIA 중화 활성도를 평가하기 위해서, A204 세포에 동일한 리포터 유전자를 형질주입하였다. A204는 ActRIIA를 발현하고, 내인성 ActRIIB를 낮은 수준으로 발현한다. 형질주입된 세포를 상기와 같이 검정하였다.
최적화된 A01 계통 항체, B01, C01, D01, E01 및 F01 각각은 A01 모 항체에 비해서 증가된 ActRIIB-매개된 신호 저해를 나타내었다. 도 2 참조.
G01 계통 항체
단량체 및 이량체 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 G01(미경험 모) 및 최적화된 H01 항체의 동력학적 특징규명을 표준 BIACORE(등록상표)-기반 분석법을 사용하여 37℃에서 수행하였다.
G01 및 H01 항체의 결합 파라미터 분석법의 결과를 표 3 및 도 3A 내지 3F에 제시한다.
H02 최적화된 항체는 G01 모 항체보다 ActRIIB 단량체 및 이량체 결합에 대해서 개선된 평형 해리 상수(KD) 동력학적 파라미터를 나타내었다.
모 G01 및 최적화된 H01 항체의 ActRIIB 중화 능력을 F2.35 (IIA 넉아웃) 세포에서 세포-기반 액티빈 A 신호전달 검정으로 평가하였다. H01 최적화된 항체는 G01 모 항체에 비해서 증가된 ActRIIB-매개된 신호 저해를 나타내었다. 도 4 참조.
A02 계통 항체
단량체 및 이량체 hActRIIB 및 hActRIIA에 결합하는 A02 항체 계통(A01(미경험 모), B02, C02, D02, 및 D03)의 동력학적 특징규명을 표준 BIACORE(등록상표)-기반 분석법을 사용하여 37℃에서 수행하였다.
A02 계통 항체 A02 내지 D02의 결합 파라미터 분석법의 결과를 표 4 및 도 5A 내지 5T에 제시한다.
최적화된 A02 계통 항체 B02, C02, D02 및 D03 각각은 A02 모 항체보다 ActRIIB 및 ActRIIA 단량체, 및 ActRIIA 이량체에 대한 결합에 대해서 개선된 평형 해리 상수(KD)를 나타내었다.
항체 A02, B02, C02, D02 및 D03의 ActRIIB 중화 능력을 F2.35 (IIA 넉아웃) 세포에서 세포-기반 액티빈 A 신호전달 검정으로 평가하였다. 최적화된 항체, B02, C02, D02 및 D03 각각은 A02 항체에 비해서 증가된 ActRIIB-매개된 신호 저해를 나타내었다. 도 6A 내지 6B 참조.
E02 계통 항체
단량체 및 이량체 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 E02(미경험 모) 및 최적화된 F02 항체의 동력학적 특징규명을 표준 BIACORE(등록상표)-기반 분석법을 사용하여 37℃에서 수행하였다.
E02 및 F02 항체의 결합 파라미터 분석법의 결과를 표 5 및 도 7A 내지 7F에 제시한다.
F02 최적화된 항체는 E02 모 항체보다 ActRIIB 단량체 및 이량체 결합에 대해서 개선된 동력학적 파라미터 평형 해리 상수(KD)를 나타내었다.
E02 및 F02 항체의 ActRIIB 중화 능력을 F2.35 (IIA 넉아웃) 세포에서 세포-기반 액티빈 A 신호전달 검정으로 평가하였다. 도 9는 검정에서 E02 모 및 F02 변이체 항체의 중화 활성도를 도시한다. 예시된 바와 같이, F02 항체는 E02에 비해서 증가된 신호 저해를 나타내었다.
G02 항체
단량체 및 이량체 hActRIIB 및 hActRIIA에 대한 G02 항체 결합의 동력학적 특징규명을 표준 BIACORE(등록상표)-기반 분석법을 사용하여 37℃에서 수행하였다. 도 8A 내지 8D는 BIACORE(등록상표)-기반 분석법에 의해서 37℃에서 결정된 바와 같은 단량체 및 이량체 hActRIIB 및 hActRIIA에 결합하는 G02 항체의 동력학적 특징규명을 나타낸다(각각 도 8A 내지 8D). G02 항체의 결합 파라미터 분석법의 결과를 표 6에 제시한다.
실시예 3. A204 세포에서의 리포터 유전자 검정
A204 세포에서의 리포터 유전자 검정을 사용하여 ActRII(예를 들어, ActRIIB)를 중화시키는 ActRII-결합 단백질, 예컨대, 항-ActRII Fab 및 재조합 항체의 능력을 결정할 수 있다. 이러한 검정은 pGL3(CAGA)12 리포터 플라스미드로 형질주입된 인간 횡문근육종 세포주(Dennler et al., EMBO 17:3091-3100 (1998))뿐만 아니라 형질주입 효율을 위한 대조군에 대한 ReniUa 리포터 플라스미드(pRLCMV)를 기반으로 한다. CAGA12 모티프는 TGF-베타 반응성 유전자(PAI-1 유전자) 내에 존재하여, 따라서 이러한 벡터는 일반적으로 Smad2 및 Smad3을 통한 신호전달 인자에 사용된다. A204 세포주는 ActRIIB보다는 주로 ActRIIA를 발현하기 때문에, 잠재적인 ActRIIB 중화 능력에 대해서 항체를 직접 시험하는 것이 가능하지 않다. 대신에, 이러한 검정은 ActRIIB 및 ActRIIA 둘 모두에 대해서 높은 친화도로 결합할 수 있는 리간드(예컨대, 액티빈 A, GDF11 또는 마이오스타틴)에 의해서 내인성 ActRIIA의 활성화에 대한 가용성 융합 단백질 ActRIIB-Fc의 저해 효과를 중화시키는 시험품의 능력을 검출하도록 설계될 수 있다.
따라서, 이러한 검정에서, 항-ActRIIB Fab 또는 항체가 중화되면 ActRIIB-Fc의 존재에도 불구하고 ActRIIA의 리간드-매개된 활성화가 일어날 것이다. 검정 제1일에, A204 세포(ATCC HTB-82)를 웰당 105 세포로 48-웰 플레이트에 분포시킨다. 제2일에, 10㎍ pGL3(CAGA)12, 1㎍ pRLCMV, 30㎕ 퓨젠 6(로슈 다이어그나스틱스), 및 970㎕ OptiMEM(인비트로젠)을 30분 동안 사전인큐베이션시키고, 이어서 맥코이 성장 배지를 첨가하고, 이것을 실온에서 밤새 인큐베이션을 위해서 플레이팅된 세포(500㎕/웰)에 적용한다. 제3일에, 배지를 제거하고, 세포를 6시간 동안 37℃에서 리간드 및 하기에 기술된 바와 같이 제조된 저해제의 혼합물과 함께 인큐베이션시킨다.
시험 ActRII-결합 단백질의 중화 효력을 평가하기 위해서, 시험품의 연속 희석물을 48-웰 플레이트에서 검정 완충제(맥코이 배지 +0.1 % BSA)의 200㎕ 부피로 제조한다. 검정 완충제 중의 동일 부피의 ActRIIB-Fc(200㎍/㎖)를 첨가한다. 시험 용액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 400㎕의 GDF11(10ng/㎖) 또는 액티빈 A(10ng/㎖)를 모든 웰에 첨가하고, 350㎕의 이 혼합물을 A204 세포의 48-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다. 시험 ActRII-결합 단백질의 각각의 농도를 2회 시험한다. ActRIIB-Fc의 최종 농도는 50ng/㎖(이것은 액티빈 A의 최종 농도가 5ng/㎖인 경우 액티빈 A 신호전달의 이러한 저해제에 대한 IC50임)이다. 시험 용액과 6시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 0.1% BSA를 함유하는 인산염-완충 염수로 헹구고, 이어서 능동 용해 완충제(프로메가 E1941)로 용해시키고, 밤새 -70℃에서 저장한다. 제4일 및 마지막 날에, 플레이트를 약하게 진탕하면서 실온까지 가온시킨다. 세포 용해물을 2회 반복물로 화학발광 플레이트(96-웰)로 옮기고, 루미노미터에서 듀얼-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(프로메가 E1980)으로부터의 시약을 사용하여 분석하여 정규화된 루시퍼라제 활성도를 결정한다. 시험품과 대조군(여기서 시험품은 존재하지 않음) 간의 루시퍼라제 활성도 차이는 시험품의 존재로부터 기인된 세포 신호전달의 차이를 반영한다.
실시예 4. 정밀 에피토프 맵핑
항체에 의해서 인식된 ActRIIB 및 ActRIIA ECD 에피토프의 맵핑을 주문 제작된 펩타이드 라이브러리를 사용하여 펩스칸 프레스토(Pepscan Presto) BV에 의해서 수행하였다. 인간 ActRIIB 및 ActRIIA의 ECD의 서열을 조합 매트릭스 설계를 사용하여 중첩 선형 15-머 및 환형 15-머 CLIPS의 라이브러리로 전환시켰다. CLIPS(펩타이드의 스캐폴드 상의 화학적 링키지) 기술은 펩타이드를 정의된 3차원 구조(단일, 이중, 삼중 등, 루프)로 구조적으로 고정시켜 복합체 결합 부위의 기능적 모방체를 생성한다. 펩타이드를 고체 지지체 상에서 합성하였다. 합성된 펩타이드 각각에 대한 항체의 결합을 ELISA에 의해서 시험하였고, 결합 친화도를 정량화하였다. 올바른 컨포메이션의 불연속적 에피토프의 부분 둘 모두를 나타내는 펩타이드 작제물은 최고 친화도로 특이적 항체에 결합한다. 불완전 에피토프를 나타내는 펩타이드 작제물은 더 낮은 친화도로 특이적 항체에 결합하는 반면, 올바른 에피토프를 함유하지 않는 작제물은 전혀 결합하지 않는다. 각각의 펩타이드에 친화도를 기반으로 점수를 매겼다.
항체 D04는 AcRIIA 상의 3개의 서열 스트레치에 결쳐서 결합하는 것으로 결정되었으며, 결합 에피토프는 서열번호 138의 아미노산 잔기 9 내지 20(ECLFFNANWEKD(서열번호 162)), 아미노산 잔기 58 내지 69(CWLDDINCYDRT(서열번호 163)) 및 아미노산 잔기 84 내지 93(CCEGNMCNEK(서열번호 161))에 맵핑된다.
항체 D04는 또한 AcRIIB 상의 3개의 서열 스트레치에 걸쳐서 결합하는 것으로 결정되었으며, 결합 에피토프는 서열번호 138의 아미노산 9 내지 17(NANWELERT(서열번호 157)), 아미노산 52 내지 63(GCWLDDFNCYDR(서열번호 160)) 및 아미노산 79 내지 88(CCEGNFCNER(서열번호 59))의 결합 부위에 맵핑된다.
항체 I01 은 AcRIIB 상의 2개의 스트레치 부위에 걸쳐서 결합하는 것으로 결정되었으며, 결합 에피토프는 서열번호 139의 아미노산 9 내지 17(NANWELERT(서열번호 157)) 및 아미노산 49 내지 63(VKKGCWLDD(서열번호 158))에 맵핑된다.
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<400> 1
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt acgcatgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagac 300
tcaggaatag gatacagcta cgcctcatca catggctact actactacat ggacgtatgg 360
ggcaagggta caactgtcac cgtctcctca 390
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 2
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Tyr Ala Ser Ser His Gly
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapian
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Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr
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<213> Homo sapian
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Tyr Tyr Ser Gly Ser
1 5
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<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 5
Asp Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Tyr Ala Ser Ser His Gly Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Met Asp Val
20
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<212> DNA
<213> Homo sapian
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<212> PRT
<213> Homo sapian
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Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
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Ser Tyr Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Asp Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Tyr Ala Ser Ser His Gly
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
130 135 140
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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<212> PRT
<213> Homo sapian
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn Leu Ala
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<212> DNA
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<213> Homo sapian
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe His Phe Pro Leu
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<210> 15
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<212> DNA
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<213> Homo sapian
<400> 16
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Gly
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Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
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1
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<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 19
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Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
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Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
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Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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<212> DNA
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<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Lys Ser Gly
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Asp Ser Gly Ile Gly Tyr Ser Tyr Ala Ser Ser His Gly
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<212> PRT
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Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 44
<211> 363
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 44
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt acgcatgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagct 300
ggaaaatacc gatggcacgg aatggacgta tggggccagg gaacaactgt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 45
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 45
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Gly Lys Tyr Arg Trp His Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 46
Ala Gly Lys Tyr Arg Trp His Gly Met Asp Val
1 5 10
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<211> 1353
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 47
cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt acgcatgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180
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<211> 451
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 48
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Ala Gly Lys Tyr Arg Trp His Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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<212> DNA
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gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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<212> PRT
<213> Homo sapian
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapian
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Pro Asp Leu Pro Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 56
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
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<212> PRT
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<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
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Val Tyr Trp Met Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly Ser Ile Val His Ser Gly His Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ala Gly Lys Tyr Arg Trp His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly Val
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 59
Val His Ser Gly His
1 5
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<211> 1350
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 60
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctctggtta ctccatcagc agtggtgttt actggatgtg gatccggcag 120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg agtatcgttc atagtgggca tacctactac 180
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 240
ctgaagctga gttctgtgac cgccgcagac acggcggtgt actactgcgc cagagctgga 300
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<213> Homo sapian
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
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Val Tyr Trp Met Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly Ser Ile Val His Ser Gly His Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
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65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ala Gly Lys Tyr Arg Trp His Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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<213> Homo sapian
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<400> 63
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Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<400> 66
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<213> Homo sapian
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Leu Ser Leu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
450
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<212> DNA
<213> Homo sapian
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gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 70
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg His Ser Pro
85 90 95
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<212> PRT
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<212> PRT
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<400> 72
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 73
Gln Gln Tyr Asn Arg His Ser Pro Thr
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<212> DNA
<213> Homo sapian
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gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccagcag tacaatcgcc actctcctac ttttggcgga 300
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ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgctt gtgaagtcac ccaccaaggc 600
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<212> PRT
<213> Homo sapian
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<211> 451
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 82
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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Pro Gly Lys
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<210> 83
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 84
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Homo sapian
<400> 89
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<400> 91
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<213> Homo sapian
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gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcagcag gcattctccc acccttggac ttttggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa acgtacggtg gctgcacctt ccgtctttat ctttccacct 360
tccgatgagc agctgaagag cggaacagca agcgtggtgt gtctgctgaa caacttttat 420
ccccgggagg caaaggtgca gtggaaagtc gacaatgctc tccagtccgg caattcccaa 480
gagagcgtga cagagcaaga ttccaaggac tccacttaca gcctgtccag caccctcaca 540
ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgctt gtgaagtcac ccaccaaggc 600
ctgagcagcc cagtcactaa gtcctttaac cggggcgaat gt 642
<210> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Phe Ser His Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 97
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 97
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggccataaga tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctg ctagtggttg gacaaactat 180
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atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggcggtgt actactgcgc cagagtatct 300
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly His
20 25 30
Lys Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ala Ser Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 99
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly His Lys Met His
1 5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapian
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Asn Pro Ala Ser Gly Trp
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 101
Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val
1 5 10
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<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 102
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
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atgtacgccc cagagccaat ggacgtatgg ggccagggaa caactgtcac cgtctcctca 360
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ggactgtata gcctcagctc cgtcgtgaca gtcccttcca gcagcctggg cacacagact 600
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ccttccgtct ttctgtttcc tccaaaacca aaagacacac tcatgatcag ccggaccccc 780
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caaaagtccc tctccctcag cccaggaaag 1350
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly His
20 25 30
Lys Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ala Ser Gly Trp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 104
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 104
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Arg Pro Ser Val Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<213> Homo sapian
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 107
Arg Pro Ser Val Gly Ser
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 108
Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val
1 5 10
<210> 109
<211> 1350
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 109
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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<210> 110
<211> 450
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Arg Pro Ser Val Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 111
<211> 360
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 111
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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<210> 112
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 112
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 113
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 114
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 114
Val Pro Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 115
Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val
1 5 10
<210> 116
<211> 1350
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 116
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tacatttgca acgtgaacca caaaccttcc aacactaagg tggacaaaaa ggtggaaccc 660
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tacgtggatg gagtggaagt ccacaacgca aaaaccaaac ctagagaaga acagtacaat 900
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<211> 450
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Met Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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245 250 255
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260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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355 360 365
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<213> Homo sapian
<400> 118
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc tcgtaccgta tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggattt atcgtgccta gtggtggtag cacaggctac 180
gcacagaagt tccagggcag agttaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagagtatct 300
aggtacgccc cagagccaat ggacgtatgg ggccagggaa caactgtcac cgtctcctca 360
<210> 119
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 119
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 120
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 120
Val Pro Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 121
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 121
Val Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val
1 5 10
<210> 122
<211> 1350
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 122
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc tcgtaccgta tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggattt atcgtgccta gtggtggtag cacaggctac 180
gcacagaagt tccagggcag agttaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagagtatct 300
aggtacgccc cagagccaat ggacgtatgg ggccagggaa caactgtcac cgtctcctca 360
gctagcacaa aaggaccaag cgtgtttcca ctggcaccta gcagcaaatc caccagcggc 420
ggaacagcag ccctcgggtg cctggtgaag gattacttcc ctgagccagt cacagtgtcc 480
tggaactccg gagccctgac atccggcgtg cacaccttcc ccgctgtgct gcaatccagc 540
ggactgtata gcctcagctc cgtcgtgaca gtcccttcca gcagcctggg cacacagact 600
tacatttgca acgtgaacca caaaccttcc aacactaagg tggacaaaaa ggtggaaccc 660
aaatcctgtg ataagaccca tacatgccca ccttgtcccg ctcctgagct gctgggggga 720
ccttccgtct ttctgtttcc tccaaaacca aaagacacac tcatgatcag ccggaccccc 780
gaagtcacct gtgtggtggt ggacgtcagc cacgaagatc cagaggtcaa gttcaattgg 840
tacgtggatg gagtggaagt ccacaacgca aaaaccaaac ctagagaaga acagtacaat 900
agcacataca gggtggtgtc cgtcctgaca gtgctccacc aggactggct caatggcaaa 960
gagtataagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcctgcac caattgagaa aacaattagc 1020
aaggcaaagg ggcagccacg ggaaccccag gtgtataccc tgcccccaag ccgggatgaa 1080
ctgaccaaaa accaggtcag cctgacatgc ctggtgaaag ggttttaccc aagcgatatt 1140
gccgtcgagt gggagagcaa cggacagcca gaaaacaatt acaaaaccac cccacctgtg 1200
ctggactccg atgggagctt tttcctgtac agcaagctca cagtggacaa gtccagatgg 1260
caacagggca acgtgttttc ctgctccgtg atgcacgagg ccctccacaa ccactataca 1320
caaaagtccc tctccctcag cccaggaaag 1350
<210> 123
<211> 450
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 124
<211> 366
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 124
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgtactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtagct actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagga 300
ctaggaatgt actaccacgt gccattcgac atatggggtc agggtacaat ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 125
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 125
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Leu Gly Met Tyr Tyr His Val Pro Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 126
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Tyr
1 5
<210> 127
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 127
Tyr Tyr Ser Gly Ser
1 5
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 128
Gly Leu Gly Met Tyr Tyr His Val Pro Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 129
<211> 1356
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 129
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgtactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtagct actactggag ctggatccgc 120
cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagga 300
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tcctcagcta gcacaaaagg accaagcgtg tttccactgg cacctagcag caaatccacc 420
agcggcggaa cagcagccct cgggtgcctg gtgaaggatt acttccctga gccagtcaca 480
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tccagcggac tgtatagcct cagctccgtc gtgacagtcc cttccagcag cctgggcaca 600
cagacttaca tttgcaacgt gaaccacaaa ccttccaaca ctaaggtgga caaaaaggtg 660
gaacccaaat cctgtgataa gacccataca tgcccacctt gtcccgctcc tgagctgctg 720
gggggacctt ccgtctttct gtttcctcca aaaccaaaag acacactcat gatcagccgg 780
acccccgaag tcacctgtgt ggtggtggac gtcagccacg aagatccaga ggtcaagttc 840
aattggtacg tggatggagt ggaagtccac aacgcaaaaa ccaaacctag agaagaacag 900
tacaatagca catacagggt ggtgtccgtc ctgacagtgc tccaccagga ctggctcaat 960
ggcaaagagt ataagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ctgcaccaat tgagaaaaca 1020
attagcaagg caaaggggca gccacgggaa ccccaggtgt ataccctgcc cccaagccgg 1080
gatgaactga ccaaaaacca ggtcagcctg acatgcctgg tgaaagggtt ttacccaagc 1140
gatattgccg tcgagtggga gagcaacgga cagccagaaa acaattacaa aaccacccca 1200
cctgtgctgg actccgatgg gagctttttc ctgtacagca agctcacagt ggacaagtcc 1260
agatggcaac agggcaacgt gttttcctgc tccgtgatgc acgaggccct ccacaaccac 1320
tatacacaaa agtccctctc cctcagccca ggaaag 1356
<210> 130
<211> 452
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 130
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Leu Gly Met Tyr Tyr His Val Pro Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 131
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 131
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tacttccact ggcctcctac ttttggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa a 321
<210> 132
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 132
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe His Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 133
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 133
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 134
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 135
Gln Gln Tyr Phe His Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 136
<211> 642
<212> DNA
<213> Homo sapian
<400> 136
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
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aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
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tccgatgagc agctgaagag cggaacagca agcgtggtgt gtctgctgaa caacttttat 420
ccccgggagg caaaggtgca gtggaaagtc gacaatgctc tccagtccgg caattcccaa 480
gagagcgtga cagagcaaga ttccaaggac tccacttaca gcctgtccag caccctcaca 540
ctgagcaagg ctgattacga gaaacacaaa gtgtacgctt gtgaagtcac ccaccaaggc 600
ctgagcagcc cagtcactaa gtcctttaac cggggcgaat gt 642
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 137
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe His Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 138
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 138
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
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Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn
115
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapian
<400> 139
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
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Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu
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Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro
100 105
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human antigen binding domain of DO3 antibody
<400> 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Arg Met His
1 5
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human antigen binding domain of DO3 antibody
<400> 141
Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 142
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human antigen binding domain of DO3 antibody
<400> 142
Ala Arg Val Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val
1 5 10
<210> 143
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH sequence
<400> 143
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttggg agctatggca tgacttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attagtggaa gtggtggtgg gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt actactgcgc caagggtcct 300
agaatagtgg gcatggatgt gtggggccag ggaacaactg tcaccgtctc ctca 354
<210> 144
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH sequence
<400> 144
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Arg Ile Val Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser
115
<210> 145
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 amino acid residues 31-35 of SEQ ID NO 144
<400> 145
Ser Tyr Gly Met Thr
1 5
<210> 146
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 amino acid residues 50-65 of SEQ ID NO 144
<400> 146
Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 amino acid residues 95-102 of SEQ ID NO 144
<400> 147
Gly Pro Arg Ile Val Gly Met Asp Val
1 5
<210> 148
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H sequence
<400> 148
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttggg agctatggca tgacttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attagtggaa gtggtggtgg gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt actactgcgc caagggtcct 300
agaatagtgg gcatggatgt gtggggccag ggaacaactg tcaccgtctc ctcagcttcc 360
accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc 600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gtccaaatat 660
ggtcccccat gcccaccctg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg 720
ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780
gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1320
ctgtctctgg gtaaatga 1338
<210> 149
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H sequence
<400> 149
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Arg Ile Val Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 150
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL sequence
<400> 150
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcagcag gtattcagtt accctctcac ttttggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa a 321
<210> 151
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL sequence
<400> 151
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Phe Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 amino acid residues 24-34 of SEQ ID NO 151
<400> 152
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 amino acid residues 50-56 of SEQ ID NO 151
<400> 153
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 amino acid residues 89-97 of SEQ ID NO 151
<400> 154
Gln Gln Val Phe Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 155
<211> 645
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L sequence
<400> 155
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcagcag gtattcagtt accctctcac ttttggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 156
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L sequence
<400> 156
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Phe Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 157
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide sequence of human ActRIIB
<400> 157
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr
1 5
<210> 158
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide sequence of human ActRIIB
<400> 158
Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp
1 5
<210> 159
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide sequence of human ActRIIB
<400> 159
Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
1 5 10
<210> 160
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide sequence of human ActRIIB
<400> 160
Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg
1 5 10
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide sequence of human ActRIIA
<400> 161
Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys
1 5 10
<210> 162
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide sequence of human ActRIIA
<400> 162
Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp
1 5 10
<210> 163
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide sequence of human ActRIIA
<400> 163
Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr
1 5 10
<210> 164
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH sequence
<400> 164
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc tcgtaccgta tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggattt atcgtgccta gtggtggtag cacaggctac 180
gcacagaagt tccagggcag agttaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagagtatct 300
aggtacgccc cagagccaat ggacgtatgg ggccagggaa caactgtcac cgtctcctca 360
<210> 165
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH sequence
<400> 165
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 166
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 amino acid residues 31-35 of SEQ ID NO 165
<400> 166
Ser Tyr Arg Met His
1 5
<210> 167
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 amino acid residues 50-66 of SEQ ID NO 165
<400> 167
Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 amino acid residues 99-109 of SEQ ID NO 165
<400> 168
Val Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val
1 5 10
<210> 169
<211> 1344
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H sequence
<400> 169
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc tcgtaccgta tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggattt atcgtgccta gtggtggtag cacaggctac 180
gcacagaagt tccagggcag agttaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggcggtgt actactgcgc tagagtatct 300
aggtacgccc cagagccaat ggacgtatgg ggccagggaa caactgtcac cgtctcctca 360
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctgggtaa atga 1344
<210> 170
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H sequence
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Phe Ile Val Pro Ser Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Arg Tyr Ala Pro Glu Pro Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 171
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL sequence
<400> 171
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcagcag gcattctccc acccttggac ttttggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa a 321
<210> 172
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL sequence
<400> 172
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Phe Ser His Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 amino acid residues 24-34 of SEQ ID NO 172
<400> 173
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 amino acid residues 50-56 of SEQ ID NO 172
<400> 174
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 amino acid residues 89-97 of SEQ ID NO 172
<400> 175
Gln Gln Ala Phe Ser His Pro Trp Thr
1 5
<210> 176
<211> 727
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L sequence
<400> 176
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aggtggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcagcag gcattctccc acccttggac ttttggcgga 300
gggaccaagg ttgagatcaa acgtaagggg ctcacagtta attaattgag gtctggacat 360
atacatgggt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc acaggaactg tggctgcacc 420
atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 480
gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc 540
cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta 600
cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc 660
ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga 720
gtgttag 727
<210> 177
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L sequence
<400> 177
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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