KR20220110177A - 항인간 클라우딘 18.2 항체 및 그의 적용 - Google Patents

항인간 클라우딘 18.2 항체 및 그의 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 클라우딘18.2 또는 그의 단편과 결합하는 항체 및 이들의 암호화된 핵산 등을 제공한다. 본 발명의 항-인간 클라우딘18.2 항체는 항원 클라우딘 18.2에 대해 강한 친화성을 갖고 표적 발현 세포에 대해 유의한 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 활성을 가지며, 인간 CLDN18.2에 대해 높은 특이성을 나타낸다.

Description

항-인간 클라우딘 18.2항체 및 그의 적용
본 개시 내용은 의학 분야에 속하며, 신규한 항-인간 클라우딘18.2 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다. 본 개시 내용은 항체 또는 그의 기능적 단편의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2019년 9월 29일에 출원된 중국 특허 출원 번호 CN201910929614.0의 우선권을 주장하며, 이는 전체가 참고로 여기에 포함된다.
발명의 배경
인간 밀착 접합 단백질 클라우딘18(CLDN18)은 밀착 세포 접합의 구성, 세포 장벽 기능의 유지 및 세포간 분자 수송에 관여하는 생물학적 기능을 하는 밀착 접합 단백질 패밀리에 속한다. 클라우딘18 단백질은 약 26KD의 분자량을 가지며 CLDN18.1 및 CLDN18.2 와 같은 다른 특성을 갖는 클라우딘 아형(subtype)으로 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 변경될 수 있다. CLDN18.1 및 CLDN 18.2는 각각 261개의 아미노산을 함유하고 4개의 막관통 도메인, 즉 세포 내에 위치한 NH2 말단 도메인 및 COOH 말단 도메인, 및 2개의 세포외 루프(ECL1, ECL2)를 갖는다. CLDN18.1 및 CLDN18.2의 세포외 영역 1은 8개의 아미노산이 서로 다르다.
CLDN18.2는 다수의 인간 상피 종양 유형의 원발성 병변 및 전이에서 발현되고 미만성 암종 세포에서 지속적으로 발현된다. CLDN18.2의 발현 수준은 식도암, 췌장암, 폐암 및 위암 세포에서 훨씬 더 유의하게 증가한다. Sahin et al의 연구에 따르면 CLDN18.2는 위암환자의 70%에 존재하는 위암의 중요한 바이오마커이며, 그 중 90%에서 95%가 선암종으로 진단되었고 또 다른5-10%는 림프종, 위장관 기질종양(GISTs) 및 카르시노이드 종양으로 구성되어 있다.
CLDN18.2에 대한 단일클론항체 IMAB362 는 독일 생명공학 기업 가니메드(Ganymed)가 개발한 것으로, 진행성 위식도암 환자 치료를 위한 임상 3상을 현재 진행중이다. IMAB362 항체 단독의 결합은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 CLDN18.2를 발현하는 표적세포의 증식을 억제하며, 이는 종양 성장을 억제하고 보체 의존성 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)의 작용 메커니즘을 통해 암세포를 제거하며, 다양한 작용 방식이 독립적이지만 시너지 효과를 낼 수 있는 것으로 나타났다. IMAB362항체는 전이성 식도암, 전이성 위암을 포함하는 적응증(indications)에 대한 항체이며, 현재 미국과 유럽연합에서 임상 3상을 진행중이며 2021년 시판 허가를 신청할 계획이다.
IMAB362 는 키메라(chimeric) 항체이지만 상대적으로 마우스 아미노산이 많고 인간에서 거부 면역 반응을 일으킬 가능성이 상대적으로 높다. 따라서, 인간 CLDN18.2에 대해 더 높은 특이성, 친화도 및 생물학적 활성을 갖는 항체, 특히 인간화 항체에 대한 필요성이 당업계에 남아있다. 또한 클라우딘18의 두 아형(subtype)은 구조가 매우 유사하지만 기능이 다르다. CLDN18.1 과 CLDN 18.2 사이의 높은 상동성과 ECL1의 상위 구조는 고품질의 CLDN18.2에 대한 항체를 선별하기가 어렵고 항체 특이성과 관련하여 높은 수준의 불확실성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명이 해결하고자 하는 기술적인 과제는 단일클론항체의 제조방법을 최적화하고 CLDN18.2 특이항체의 선별 효율을 향상시켜서 하이브리도마(hybridoma) 선별 및 인간화를 통해 인간 클라우딘18.2에 높은 친화성을 가지고 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 수득하는 것이다. 여기서 항체는 인간화 설계에 의해 가장 적은 마우스 아미노산을 갖고 더 나은 생체 내 안전성 및 적용 가능성을 가질 것으로 예상된다.
상기 기재된 기술적 문제에 있어서, 본 발명에서는 면역원과 관련하여 인간 CLDN18.2를 발현하는 마우스 유래 세포를 이용한다. 일 측면에서 숙주로서의 마우스 유래 세포는 비면역원성이거나 마우스에 대해 매우 낮은 면역원성을 갖고, 이에 의해 관심 면역원 CLDN18.2에 대한 숙주 세포의 그림자 효과(shadowing effect)를 피하고 이종(heterologous) 면역원의 도입으로 인한 CLDN18.2 특이적 하이브리도마의 생산 효율에 대한 역효과를 피한다. 또 다른 측면에서 마우스 유래 세포의 세포막 표면에서 인간 CLDN18.2의 발현은 달성될 수 있어, 선별에 의해 수득된 단일클론항체가 CLDN18.2의 세포외 영역에 특이적으로 결합하여 CLDN18.2 특이항체의 생물학적 활성을 보장한다.
선별 전략과 관련하여, 본 발명에서는 양성 선별과 음성 선별을 결합한 전략을 이용한다. 먼저, 인간 CLDN18.2를 발현하는 재조합 세포를 사용하여 양성 선별을 수행하여 세포에 높은 친화성을 갖는 단일클론항체를 수득한 후, 인간 CLDN18.2를 발현하는 재조합 세포에 결합할 수 있는 항체 클론에 대해 인간 CLDN18.1을 발현하는 재조합 세포를 이용하여 음성 선별을 수행하여, CLDN18.2 및 CLDN18.1의 공통으로 세포외 영역 구조에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 배제하였다. 또한, 본 발명에서 사용되는 양성 선별 항원 및 음성 선별 항원은 모두 동일한 마우스 유래 세포 플랫폼으로, 과정을 단순화하고 이종항원의 도입을 피할 뿐 아니라, 개별 마우스에 대한 마우스 유래 세포의 동종 항원 효과에 의해 생성된 항체를 제거하는 음성 선별 단계를 가능하게 하고 CLDN18.2의 세포 외 영역 2에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 생산 효율을 개선한다.
본 개시 내용의 추가 목적은 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편 및 그의 용도를 제공하는 것이다. 본 개시내용에 따른 항체의 단편은 그의 항원 결합 부분, 예를 들어 Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편과 같은 항체의 다양한 기능적 단편들을 포함한다.
본 발명은 다음과 같은 기술적 해결책을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 항-인간 클라우딘18.2 항체의 제조방법을 제공한다.
(1) 표면에 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 세포를 면역원으로 하여 동물을 면역시키는 단계;
(2) 단계(1)에서 면역화된 동물을 이용하여 항체를 생산할 수 있는 세포 클론을 제조하는 단계;
(3) 표면에 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 세포를 양성 선별 항원으로 사용하여, 양성 선별 항원에 결합 활성을 갖는 항체 및 항체를 생산하는 세포를 선별하는 단계;
(4) 음성 선별 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체 및 항체를 생산하는 세포를 제외하고, 표면에 인간 클라우딘18.1 단백질을 발현하는 세포를 음성 선별 항원으로 사용하는 단계.
바람직하게는, 본 발명에 따른 제조방법에서, 상기 단계(1)에서 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 세포는 면역된 동물과 동일한 종으로 유래되고; 바람직하게는, 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 세포는 마우스 세포이고, 면역화된 동물은 마우스이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계(2)에서 항체를 생산할 수 있는 세포 클론은 하이브리도마 기술 및 단일 세포 증폭 기술로 구성된 군에서 선택된 기술에 의해 제조된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 제조방법에서 단계(3)의 양성 선별 항원은 단계(1)의 면역원과 동일하고; 단계(4)의 음성 선별 항원은 발현된 단백질이 인간 클라우딘 18.1 단백질이라는 점에서만 단계(1)의 면역원과 상이하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (3) 및 단계 (4)는 각각 효소면역측정검사법(ELISA) 및 형광 공명 에너지 전달(FRET)로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개시 내용의 제조 방법에 따라 수득된 항-인간 클라우딘18.2 항체를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항-인간 클라우딘18.2 항체는 인간 클라우딘18.2의 N-말단, 바람직하게는 제1 세포외 루프(CEL1)를 함유하는 인간 클라우딘18.2의 N-말단에서 세포외 영역에 특이적으로 결합한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항-인간 클라우딘18.2 항체는 나노미터 규모에서 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하고; 동형(isotype) 음성 항체(또는 관련 없는 항체)와 비교하여 인간 CLDN18.1에 대한 결합에 유의미한 차이가 없다.
추가 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 함유하는 항체 또는 그의 단편을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 하기로 구성된 군에서 선택된 상보성결정부(CDRs: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3; 및 VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3)의 조합을 함유하는 것을 제공한다:
(1) 서열식별번호31에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호32에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 33에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 34에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 35에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 36에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(2) 서열식별번호37에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 39에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 40에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 42에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(3) 서열식별번호43에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호44에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 45에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 46에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 47에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(4) 서열식별번호48에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호49에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 50에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 40에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 51에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(5) 서열식별번호52에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호53에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 54에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 55에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 56에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(6) 서열식별번호57에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호58에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 33에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 34에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 59에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 60에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(7) 서열식별번호61에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호62에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 63에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 46에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 64에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(8) 서열식별번호65에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호66에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 67에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 68에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 69에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(9) 서열식별번호65에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호70에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 71에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 72에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 73에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(10) 서열식별번호74에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호75에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 76에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 77에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 78에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(11) 서열식별번호79에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호80에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 81에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 82에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 83에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(12) 서열식별번호37에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 39에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 85에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 42에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(13) 서열식별번호37에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 39에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 85에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 86에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(14) 서열식별번호37에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 39에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 85에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 87에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(15) 서열식별번호74에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호75에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 76에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 89에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 90에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
(16) 서열식별번호79에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호91에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호 81에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호 92에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호 41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호 93에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호1, 서열식별번호3, 서열식별번호5, 서열식별번호7, 서열식별번호9, 서열식별번호11, 서열식별번호13, 서열식별번호15, 서열식별번호17, 서열식별번호19, 서열식별번호21, 서열식별번호23, 서열식별번호27 및 서열식별번호29 중에서 어느 하나로 제시된 아미노산 서열 또는 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하고; 및/또는 경쇄 가변 영역은 서열식별번호2, 서열식별번호4, 서열식별번호6, 서열식별번호8, 서열식별번호10, 서열식별번호12, 서열식별번호14, 서열식별번호16, 서열식별번호18, 서열식별번호20, 서열식별번호22, 서열식별번호24, 서열식별번호25, 서열식별번호26, 서열식별번호28, 및 서열식별번호30 중에서 어느 하나로 제시된 아미노산 서열 또는 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 항체 또는 그의 단편은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 함유한다:
(1) 서열식별번호1에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호2에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(2) 서열식별번호3에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호4에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(3) 서열식별번호5에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호6에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(4) 서열식별번호7에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호8에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(5) 서열식별번호9에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호10에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(6) 서열식별번호11에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호12에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(7) 서열식별번호13에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호14에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호14에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(8) 서열식별번호15에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호16에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호16에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(9) 서열식별번호17에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호17에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호18에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호18에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(10) 서열식별번호19에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호19에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호20에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(11) 서열식별번호21에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호21에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호22에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(12) 서열식별번호23에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호24에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호24에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(13) 서열식별번호23에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호25에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(14) 서열식별번호23에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호26에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(15) 서열식별번호27에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호28에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(16) 서열식별번호29에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호29에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호30에 제시된 바와 같은 아미노산서열 또는 서열식별번호 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
본 발명의 맥락에서 적어도 75% 동일성은75%이상의 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성이다.
본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편은 임의의 형태이며, 예를 들어 단일클론항체(monoclonal antibody), 단일사슬항체(single chain antibody), 이량항체(diabody), 단일 도메인 항체(single domain antibody), 나노체(nanobody), 완전 또는 부분적으로 인간화 항체(humanized antibody), 또는 키메라 항체(chimeric antibody)등이다; 대안적으로, 상기 항체 또는 그의 단편은 반쪽 항체(half-antibody)또는 반쪽 항체의 항원 결합 단편, 예를 들어 단일 사슬 가변 단편(scFv), 2가 단일 사슬 가변 단편(BsFv), 이황화 안정화 Fv 단편(dsFv), (이항화 안정화 Fv 단편)2 (dsFv)2, 항원 결합 단편(Fab), Fab' 단편, F(ab')2 단편, 또는 가변 단편(Fv)이다. 본 발명에 의해 제공되는 단편과 관련하여, 상기 항체 또는 그의 단편은 바람직하게는 인간 클라우딘18.2에 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편이다.
바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 마우스 불변 영역, 바람직하게는 인간 또는 마우스 경쇄 불변 영역(CL) 및/또는 중쇄 불변 영역(CH)을 추가로 함유하고; 더 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역 및/또는 카파, 람다 유형 경쇄 불변 영역을 함유한다.
바람직하게는, 상기 항체는 단일클론항체, 바람직하게는 마우스, 키메라 또는 인간화 단일클론항체; 바람직하게는, 단일클론항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 아형이고 단일클론항체의 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 타입이다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 단일클론항체의 중쇄 불변 영역은 서열식별번호124에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다. 본 발명의 특정 실시예에 따르면, 단일클론항체의 경쇄 불변 영역은 서열식별번호125에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개시 내용에 따르면 상기 항체 또는 그의 단편을 암호화하거나, 상기 항체 또는 그의 단편에 함유된 중쇄CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 핵산 분자는 본 발명에 따른 상기 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 예를 들어, 핵산 분자는 서열식별번호96 내지 125 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
본 발명에 따르면 핵산 분자는 차례로 숙주 세포를 형질감염시키거나(transfect) 형질전환시키는(transform) 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 개시 내용의 핵산 분자를 함유하는 벡터를 제공한다. 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터, 인공 염색체, 파지 벡터 등일 수 있다.
본 발명의 상기 벡터 또는 핵산 분자는 숙주세포를 형질전환(transform) 또는 형질감염(transfect)시키거나 항체 보존 또는 발현 등을 위해 임의의 방식으로 숙주세포에 들어가기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 개시 내용에 따른 핵산 분자 및/또는 벡터를 함유하는 숙주세포를 제공하거나, 본 발명에 따른 핵산 분자 및/또는 벡터로 형질전환(transform) 또는 형질감염(transfect)된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 박테리아 또는 곤충, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포와 같은 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항체는 당업계에 공지된 임의의 통상적인 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에 의해 제공되는 핵산 분자로부터 수득될 수 있고, 그 후 상기 항체는 항체의 선택적인 다른 도메인과 조립하여 수득될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 의해 제공되는 상기 숙주세포는 숙주세포가 상기 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하도록 하는 조건하에서 배양되고 이들을 항체로 조립한다. 선택적으로, 상기 방법은 생산된 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 상기 항체 또는 그의 단편은 다른 모이어티(moieties), 예를 들어, 세포 표면 수용체, 아미노산 및 탄수화물과 같은 소분자 화합물, 소분자 중합체, 또는 본 발명의 항체를 변형시키는 임의의 다른 모이어티, 또는 심지어 활성 단백질 또는 폴리펩티드와 조합될 수 있다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 개시 내용에 의해 제공된 항체 또는 그의 단편을 함유하는 접합체 또는 융합 단백질은 제공한다. 예를 들어, 상기 접합체 또는 융합 단백질은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편을 함유하는 이중특이적 항체일 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 상기 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 접합체 또는 융합 단백질은 약학적 조성물, 보다 구체적으로 실제로 필요한 다양한 목적에 사용되는 약학적 제제에 함유될 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 개시 내용에 따른 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 접합체 또는 융합 단백질 및 선택적으로 제약상 허용되는 부형제를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
임의의 사용 목적을 위해, 본 발명은 개시 내용의 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물 및/또는 접합체 또는 융합 단백질을 함유하는 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 암의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물, 및/또는 접합체 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 암은 췌장암(pancreatic cancer), 위암(gastric cancer), 결장암(colon cancer), 식도암(esophageal cancer), 간암(liver cancer), 난소암(ovarian cancer), 폐암(lung cancer), 담낭암(gallbladder cancer) 및 두경부암(head and neck cancer)으로 구성된 군에서 선택된다.
추가 측면에서, 본 발명은 암 진단을 위한 시약의 제조에 있어서 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물, 및/또는 접합체 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 췌장암, 위암, 결장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암, 담낭암 및 두경부암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 암을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 상기 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물 및/또는 접합체 또는 융합 단백질을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 다른 약물 또는 수단을 제공한다. 선택적인 다른 약물 또는 수단은 본 발명의 상기 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물 및/또는 접합체 또는 융합 단백질과 조합하여 투여될 수 있는 약물 및 수단을 지칭하며, 소분자 약물, 표적 약물, 항체와 같은 재조합 단백질 약물, 백신, 항체-약물 접합체(ADC), 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus), 유전자 또는 핵산 요법 약물 및 방사선 요법과 같은 본 개시내용이 포함된다. 상기 두가지를 공동 투여(co-administration)하는 것은 동시에, 순차적으로 또는 간격을 둔 것을 포함하여 임의의 방식이 될 수 있다.
바람직하게는, 상기 암은 췌장암, 위암, 결장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암, 담낭암 및 두경부암으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 대상체는 포유동물이고, 더 바람직하게는, 상기 대상체는 사람이다.
대안적으로, 본 발명은 또한 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물, 및/또는 대상체의 샘플을 포함하는 본 발명에 따른 접합체 또는 융합 단백질을 접촉시키는 것을 포함하는 암 진단하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 췌장암, 위암, 결장암, 식도암, 간암, 난소암, 폐암, 담낭암 및 두경부암으로 구성된 군에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 대상체는 포유동물이고, 더 바람직하게는, 상기 대상체는 사람이다.
본 발명에 따른 항-인간 클라우딘18.2 항체를 암호화하는 유전자를 렌티바이러스 벡터를 통해 건강한 공여자의 일차 T세포에 형질도입하였고(transduce), 제조된 키메라 항원 수용체 발현 T(Chimeric antigen receptor-T, CAR-T) 세포는 인간 클라우딘18.2를 발현하는 세포에 의해 효율적으로 활성화되는 것을 확인하였다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 CAR-T 세포의 제조에 있어서 본 발명에 따른 상기 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 약학적 조성물, 및/또는 접합체 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 인간 클라우딘18.2에 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 항체를 제공한다. 기존의 항-인간 클라우딘18.2 항체와 달리, 본 발명에 따른 상기 항체는 다음과 같은 특징을 갖는다.
본 발명에서 제공하는 항-인간 클라우딘18.2항체는 항원 클라우딘18.2에 대한 강한 친화성을 나타냈고, 표적 발현 세포에 대해 유의한 보체 의존적 세포독성(Complement Dependent Cytotoxicity, CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody dependent cytotoxicity, ADCC) 활성을 나타냈으며, 상기 두 활성은 IMAB362 보다 더 강하거나 유사하였다. 또한, 본 발명의 항-인간 클라우딘18.2 항체는 IMAB362에 비해 인간 CLDN18.2에 대해 더 높은 특이성을 나타냈다.
또한, 본 발명에 따른 항-인간 클라우딘18.2 항체를 암호화하는 유전자를 렌티바이러스 벡터를 통해 건강한 공여자의 일차 T세포에 형질도입하여 CAR-T세포를 제조하였다. 표적 세포의 자극 시, 제조된 CAR-T 세포는 CAR-T 세포 표면에서 단백질 CD25를 활성화하고 분비된 IFNγ이 검출되었으며, 인간 클라우딘18.2를 발현하는 세포에 의해 효율적으로 활성화되는 것으로 확인되어 인간 CLDN18.2에 대한 본 발명에 따른 항체의 표적 특이성을 입증하였다.
정의
본 명세서에서 사용되는 과학 및 기술 용어의 의미는 달리 정의되지 않는 한, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미이다. 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 단백질 및 올리고 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화에 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 일반적으로 사용된다. 표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 형질전환(transformation)(예: 전기천공, 지질 형질감염)에 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 일반적으로 사용되거나 본 명세서에 기재된 제조자의 설명 또는 절차에 따라 수행된다. 상기한 기술 및 절차는 당업계에 일반적으로 잘 알려져 있고 본 명세서에서 인용 및 논의된 다수의 포괄적이고 보다 구체적인 문헌에 기재된 바와 같이 사용된다. 예를 들어, 표제 "Molecular Cloning: Laboratory Manual"인 문헌을 참조할 수 있다(Sambrook et al. "Molecular Cloning: Laboratory Manual" 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). 본 명세서에 기재된 분석화학, 합성유기화학, 및 의료 및 약학 화학에 사용되는 명명법 및 실험실 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "항체(antibody)"는 일반적으로 2쌍의 폴리펩티드 쇄(각 쌍은 하나의 "경"(L) 쇄 및 하나의 "중"(H) 쇄를 갖음)로 구성된 면역글로불린 분자를 의미한다. 일반적인 의미에서, 중쇄는 항체에서 분자량이 큰 폴리펩티드 사슬로 해석될 수 있고, 경쇄는 항체에서 분자량이 작은 폴리펩티드 사슬을 의미한다. 경쇄는 κ 및 λ 경쇄로 분류된다. 중쇄는 일반적으로 μ, δ, γ, α 또는 ε으로 분류되며 항체의 동형(isotype)은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE으로 정의된다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의"J"영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 3개 이상의 아미노산의 "D"영역을 함유한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예: 효과기 세포(effector cells))와 고전적 보체 시스템의 첫번째 성분(c1q)의 결합을 포함하여 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역은 고도로 가변적인 영역(상보성 결정영역(CDRs)이라고 함)으로 더 세분화될 수 있으며, 그 사이에 프레임워크 영역(FRs)이라고 하는 보존적 영역이 분포되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복실 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 각 영역 또는 도메인에 아미노산 할당은 표제"Sequences of Proteins of Immunological Interest"인 문헌의 정의를 따른다 (Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883). 특히, 중쇄는 또한 3개를 초과하는 CDR, 예컨대 6, 9 또는 12개를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 중쇄는 IgG항체 중쇄의 N-말단이 다른 항체와 연결된 ScFv일 수 있으며, 이 때 중쇄는 9개의 CDR을 함유한다.
본 발명에 사용된 용어"항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 전장 항체(full-length antibody)의 단편을 함유하는 폴리펩티드를 의미하며, 이는 전장 항체가 결합하는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고, 및/또는 항원에 특이적으로 결합하기 위해 전장 항체와 경쟁하며, 이는 "항원 결합 부분"으로도 알려져 있다. 일반적으로, 면역학 서적인 "Fundamental Immunology", Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, N.Y. (1989)을 참조하며, 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본 발명에 포함되었다. 상기 항체의 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 사슬 항체 단편(예를 들어, scFV), 키메라 항체(chimeric antibody), 이량항체(diabody) 및 폴리펩티드를 포함하며, 이들은 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 함유한다.
본 발명에 사용된 용어"Fv 단편(Fv fragment)"은 항체의 단일 팔(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하고; 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 (or CH) 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미하고; 용어 "F(ab')2"는 힌지 영역(hinge region) 상의 이황화 가교(disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 함유하는 항체 단편을 의미한다.
일부 경우에, 상기 항체의 항원 결합 단편은 상기 VL 및 VH 도메인이 짝을 이루어 단일 폴리펩티드 사슬을 생성할 수 있게 하는 링커를 통해 1가 분자를 형성하는 단일 사슬 결합 단편(예를 들어, scFv)이다(참조, e.g., Bird et al., Science 242:423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). 이러한 scFV분자는 NH2-VL-linker-VH-COOH 또는 NH2-VH-linker-VL-COOH와 같은 일반적인 구조를 가질 수 있다. 적절한 선행 기술 링커는 반복 G4S아미노산 서열 또는 그의 변이체로 구성된다. 예를 들어, 아미노산 서열(G4S)4를 갖는 링커가 사용될 수 있지만, 그의 변이체도 사용될 수 있다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448).
항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 상기 언급된 항체 단편)은 당업자에게 공지된 통상적인 기술(예를 들어, 재조합DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 절단)을 사용하여 수득된 항체로부터 얻을 수 있고, 상기 항체는 온전한 항체와 동일한 방식으로 특이성에 대해 선별된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명확하게 정의되지 않는 한, "항체(antibody)"라는 용어는 온전한 항체뿐만 아니라 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "분리된(isolated)"은 인공적인 수단에 의해 자연 상태로부터 얻은 상태를 의미한다. 어떤 "분리된"물질 또는 성분이 자연에 존재하는 경우, 그것은 자연 환경이 변화하거나, 물질이 자연환경으로부터 분리되거나 또는 둘 다에 의해 가능하다. 예를 들어, 어떤 분리되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 어떤 살아있는 동물의 체내에서 자연적으로 존재하며, 이러한 자연 상태로부터 분리된 순도가 높은 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드라고 한다. 용어 "분리된"은 분리된 물질의 활성에 영향을 미치지 않는 혼합 인공 또는 합성 물질 또는 기타 불순한 물질을 배제하지 않는다.
용어 "숙주 세포(host cell)"는 벡터가 도입될 수 있는 세포를 의미하며, 이는 대장균 세포(Escherichia coli cells)와 같은 원핵 세포(prokaryotic cell), 효모 세포(yeast cell)와 같은 진균 세포(fungal cell), 노랑초파리(Drosophila melanogaster) S2세포 또는 담배거세미나방종(Spodoptera frugiperda) Sf9 세포와 같은 곤충세포 또는 섬유아세포(fibroblasts), CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK293 세포 또는 인간세포 등과 같은 동물세포이며 이에 제한되지 않는다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호 작용의 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant, KD)를 의미하며, 이는 항체와 항원 사이의 결합 친화도(binding affinity)를 설명하는 데 사용된다. 평형 해리 상수가 작을수록, 항체-항원 결합이 더 가깝고 항체와 항원 사이의 친화도가 높다. 일반적으로, 항체는 약 10-5 M 미만의 평형해리상수, 예를 들어 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 예를 들어 BIACORE 기기에서 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)에 의해 결정된 바와 같이 항원에 결합한다. 예를 들어, 항체와 세포와의 친화도는 KINEXA 방법을 사용하여 KINEXA 400 기기에서 감지된다.
용어 "특이적 결합(Specific binding)"은 항체가 항원의 하나 이상의 항원 결정기(antigenic determinants)와 반응하지만 다른 폴리펩티드와 반응하지 않거나 매우 낮은 친화도로(Kd>10-6) 다른 폴리펩티드에 결합함을 의미한다. 항체는 다중클론(polyclonal)항체, 단일클론(monoclonal)항체, 키메라(chimeric) 항체, dAb (도메인 항체), 단일 항체, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, Fv, scFv 및 Fab 발현 라이브러리(Fab expression library)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 단일클론항체(mAb)는 단일클론 세포주로부터 수득된 항체이고, 세포주는 진핵(eukaryotic), 원핵(prokaryotic) 또는 파지 클론(phage clonal) 세포주에 제한되지 않는다. 단일클론항체 또는 그의 항원 결합 단편(antigen-binding fragment)은 예를 들어, 하이브리도마(hybridoma) 기술, 재조합(recombination) 기술, 파지 디스플레이(phage display)기술, 및 CDR 이식(CDR grafting)과 같은 합성 기술, 또는 기타 공지된 기술을 사용하여 재조합(recombination)에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 "마우스 항체(murine antibody)"는 당업계의 지식 및 기술에 따라 생산된 인간 CLDN18.2에 대한 단일클론항체이다. 생산 과정에서 시험 대상체에 CLDN18.2 항원을 주입한 후 원하는 서열이나 기능적 특성을 가진 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다.
본 발명의 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 마우스 유래 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역을 융합시켜 형성된 항체로서, 마우스 유래 항체에 의해 유도되는 면역반응을 감소시킬 수 있다. 키메라 항체를 확립하기 위해서는 먼저 마우스 유래 특이 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마를 확립하고, 마우스 하이브리도마 세포에서 가변영역 유전자를 클로닝한 후 필요에 따라 인간 항체의 불변영역 유전자를 클로닝해야 하고, 키메라 유전자는 마우스 가변영역과 인간 불변영역 유전자를 연결하여 발현 벡터에 삽입하여 형성된다. 마지막으로, 키메라 항체는 진핵생물 시스템 또는 원핵생물 시스템에서 발현된다.
본 발명의 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 항체의 가변 영역 프레임워크(FR)에 마우스 CDR 서열을 이식하여 생산된 항체인 CDR 이식 항체(CDR grafted antibody )라고도 한다. 이러한 가변 영역 프레임워크(FR) 서열은 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개 참조, 예를 들어 ImMunoGeneTics(IMGT) 웹사이트인 http://imgt.cines.fr 또는 Journal of Immunoglobulin, 2001ISBN012441351에서 얻을 수 있다.
용어 "CLDN18.2"는 이소형(isoforms), 포유동물(예: 인간) CLDN18.2, 인간 CLDN18.2의 종 상동체(species homologs), 및 인간 CLDN18.2와 공통적인 적어도 하나의 항원결정기(epitope)를 갖는 유사체를 포함한다. CLDN18.2(예: 인간 CLDN18.2)의 아미노산 서열은 예를 들어 NCBI 데이터베이스에 나타난 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
용어 "CLDN18.1"은 이소형(isoforms), 포유동물(예: 인간) CLDN18.1, 인간 CLDN18.1의 종 상동체(species homologs), 및 인간 CLDN18.1과 공통적인 적어도 하나의 항원결정기(epitope)를 갖는 유사체를 포함한다. CLDN18.1(예를 들어, 인간 CLDN18.1)의 아미노산 서열은 예를 들어 NCBI 데이터베이스에 나타난 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
"선택적인", "선택적으로", "임의의" 또는 "어느 하나"는 다음과 같은 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 그런 것은 아님을 의미하며, 설명에는 해당 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우가 포함된다. 예를 들어, "선택적으로 1개의 항체 중쇄 가변 영역을 함유함"은 특정 서열을 갖는 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만 반드시 존재할 필요는 없음을 의미한다.
용어 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 그의 생리학적/약학적으로 허용되는 염 또는 전구약물(prodrug)을 다른 화학적 성분과 함께 포함하는 혼합물 뿐만 아니라, 생리학적/약학적으로 허용되는 담체(carrier) 및 부형제(excipient)와 같은 기타 성분과 함께 포함하는 혼합물을 의미한다. 약학적 조성물은 유기체에 대한 투여를 용이하게 하고, 활성 성분의 흡수를 촉진하여 생물학적 활성을 발휘하도록 사용된다. 치료적 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 조건 하에서 무균이어야 하고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액(solution), 마이크로에멀젼(microemulsion), 분산액(dispersion), 리포솜(liposome) 또는 높은 항체 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사 용액은 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 부분)을 상기에 나열된 한 가지 성분 또는 성분들의 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 혼입한 후 필요에 따라 멸균을 위해 여과하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 방법, 조성물 및 병용 요법(combination therapy)은 다른 활성제(active agents) 또는 치료 방법과 조합될 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 CLDN18.2항체 분자를 질환(예를 들어, 암)의 치료 또는 예방에 유효한 양으로, 선택적으로 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, CTLA-4, 또는 Tim-3 항체(면역 요법(immunotherapy)) 또는 Her-2, EGFR, VEGF, VEGFR 항체 등과 같은 기타 종양 치료 항체뿐만 아니라 ADC(T-DM1과 같은 항체 약물 접합체), 이중특이성 항체, 화학요법 약물 등으로부터 선택된 하나 이상의 억제제와 조합하여 대상체에 투여되는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 CLDN18.2 항체 분자, 추가 활성제 또는 모두를 투여하는 것이 각 활성제의 양 또는 용량(예를 들어 단독요법(monotherapy)으로서)보다 높거나 낮거나 같은 양 또는 용량으로 투여할 수 있는 것을 포함한다. CLDN18.2 항체 분자, 추가적인 활성제 또는 이들 모두의 투여량 또는 용량은 단독으로 사용되는 각 활성제의 양 또는 용량(예를들어, 단독요법으로서)보다 낮다(예를 들어, 적어도 20% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 50% 이상).
또한, 본 발명의 항-CLDN18.2 항체는 CLDN18.2에 결합하여 표적세포(종양 세포)의 세포자멸사(apoptosis)를 유도하고, 종양 세포의 성장을 억제하고, 생체내 효과기 세포(effector cells)에 의한 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)를 증가시키고, 암 환자를 치료하기 위한 보체 의존성 세포독성(CDC) 사멸 효과를 증가시킬 수 있다. 따라서, 특정 실시예에서, 본 발명에 기재된 항-CLDN18.2항체 분자는 이러한 기전을 통해 본 발명의 항체의 항종양 효과를 나타낸다. 본 발명에 기재된 항-CLDN18.2 항체 분자의 치료학적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 종양 세포의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 암의 생체내 치료에 적합하다. 표적 특이 치료학적 양을 얻기 위해, 항-CLDN18.2 항체 분자를 다른 항체와 함께 투여할 수 있다. CLDN18.2 항체가 하나 이상의 활성제와 조합하여 투여되는 경우, 상기 조합은 암 유형, 특히 CLDN18.2 발현 종양을 갖는 환자에게 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 대상체에서 과증식성(hyperproliferative) 상태 또는 질환(예를 들어, 암) 예컨대 고형 종양(solid tumor), 혈액암(hematological cancers), 연조직 종양(soft tissue tumor) 또는 전이성 병변(metastatic lesion)을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본 발명에 기재된 하나 이상의 항-CLDN18.2 항체 분자를 단독으로 또는 다른 활성제 또는 치료와 조합하여 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "암종(carcinomas)", "암(cancer)", "암 환자(cancer patient)"는 조직병리학적 유형 또는 공격 단계에 상관 없이, 모든 유형의 암성 성장 또는 종양형성 과정, 전이성 조직 또는 악성 형질 전환된(transform) 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 것으로 의도된다. 예로는 고형 종양(solid tumor), 혈액암(hematological cancers), 연조직 종양(soft tissue tumor) 및 전이 병변(metastatic lesion)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 고형 종양의 예에는 악성종양이 포함되며, 예를 들어 간, 폐, 유방, 림프, 위장관(예: 결장), 비뇨생식기(예: 신장, 방광 상피 세포), 전립선 및 인두를 침범하는 것과 같은 여러 기관계의 육종(sarcomas) 및 암종(선암종 및 편평 세포 암종 포함)이 있다. 선암종(Adenocarcinomas)에는 대부분의 결장암, 직장암, 위암, 신세포암, 간암 및 폐암, 소장암 및 식도암에서 발생하는 비소세포암종(non-small cell carcinomas)과 같은 악성종양을 포함된다. 편평 세포 암종(Squamous cell carcinomas)에는 폐, 식도, 피부, 두경부 부위, 구강, 항문 및 자궁경부와 같은 악성 종양이 포함된다. 상기한 암의 전이성 병변(Metastatic lesions)은 또한 본 발명의 상기 방법 및 조성물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다. CLDN18.2에 대한 항체 분자는 암 세포, 정제된 종양 항원(재조합 단백질, 펩티드 및 당 분자를 포함), 세포 및 면역자극성 사이토카인(immunostimulatory cytokine)을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포와 같은 면역원성 제제(immunogenic agent)와 조합될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)"은 바람직하게는 표적 세포가 항체에 의해 표시되는 것을 요구하는 효과기 세포(특히 림프구)의 세포 사멸 능력을 설명한다. ADCC는 바람직하게는 항체가 종양 세포 상의 항원에 결합하고 항체 Fc 도메인이 면역 효과기 세포(effector cells)의 표면 상의 Fc 수용체(FcR)와 결합할 때 발생한다. Fc 수용체의 여러 패밀리가 확인되었으며 특정 세포 집단은 정의된 Fc 수용체를 특징적으로 발현한다. ADCC는 다양한 정도의 즉각적인 종양 파괴를 직접 유도하여 항원 제시 및 종양 지향적 T 세포 반응의 유도를 유도하는 메커니즘으로 볼 수 있다. 바람직하게는, ADCC의 생체내 유도는 종양-유도 T-세포 반응(tumor- directed T-cell responses) 및 숙주-유래 항체 반응(host-derived antibody responses)을 유도할 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "보체 의존적 세포독성(Complement-dependent cytotoxicity, CDC)"은 항체에 의해 지시될 수 있는 또 다른 세포 사멸 방법이다. IgM은 보체 활성화에 가장 효과적인 동형(isotype)이다. IgG1 및 IgG3은 또한 고전적 보체 활성화 경로를 통해 CDC를 지시하는 데 매우 효과적이다. 바람직하게는, 이 연쇄반응(cascade)에서, 항원-항체 복합체의 형성은 IgG 분자(C1q는 보체 C1의 3개의 하위 구성요소 중 하나임)와 같은 참여 항체 분자의 CH2 도메인에서 매우 근접한 다중 C1q 결합 부위의 언클로킹(uncloaking)을 초래한다. 바람직하게는 이러한 언클로킹된(uncloaked) C1q 결합 부위는 이전에 낮은 친화도의 C1q-IgG 상호작용을 높은 결합력의 하나로 전환시키며, 이는 일련의 다른 보체 단백질을 포함하는 일련의 사건을 촉발하고 효과기 세포(effector cells) 주화성(chemotactic)/활성화(activating) 인자 C3a 및 C5a의 단백 분해 방출을 유도한다. 바람직하게는, 보체연쇄작용(complement cascade)은 막 공격 복합체(membrane attack complex)의 형성으로 끝나며, 이는 세포막에 기공을 형성하여 세포 안팎으로 물과 용질의 자유로운 통과를 촉진한다.
본 발명의 항-CLDN18.2 항체로 제조된 항체-약물 접합체가 보체 의존적 세포독성(CDC) 매개 용해 및/또는 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 매개 용해를 유도함으로써 암세포와 같은 특히 CLDN18.2를 발현하는 세포의 사멸을 매개할 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 따라서, 한 실시예에서, 본 발명의 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugates)는 보체 의존성 세포독성(CDC) 매개 용해 및/또는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 매개 용해를 유도함으로써, 바람직하게는 보체 의존성 세포독성(CDC) 매개 용해 및 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 매개 용해를 유도함으로써 세포 사멸을 매개한다.
본 발명의 실시예는 첨부된 도면을 참조하여 하기에 상세히 설명된다.
도 1은 항-인간 CLDN18.2 키메라 항체의 시험관내 세포 결합 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 항-인간 CLDN18.2인간화 항체의 보체 의존적 세포독성(CDC)의 결과를 나타낸다. 도 2a: CHOK1세포, 도2b: BxPC3세포, 도2c: NCI-N87세포이다.
도 3은 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 분석 결과를 나타내다. 도3a: CHOK1 세포, 도3b: BxPC3 세포, 도3c: NCI-N87세포이다.
도 4는 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 동족 단백질에 대한 결합 특성을 분석한 결과이다.
도 5는 인간 CLDN18.1 발현 세포에 대한 상이한 농도의 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 결합을 나타낸다.
도 6은 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 종 교차 결합 특성을 분석한 결과이다.
도 7은 상이한 군에서 제조된 CAR-T 세포의 검출된 양성 백분율의 결과를 나타낸다.
도 8은 구축된 상이한 CHO 세포주의 상이한 항원 발현 프로파일을 나타낸다.
도 9는 상이한 군의 CAR-T 세포를 표적 세포와 인큐베이션한 후 상층액에서 검출된 IFN-γ의 결과를 나타낸다.
도 10은 표적 세포와의 인큐베이션 후 상이한 군의 CAR-T 세포 상에서 검출된 CD25 발현의 결과를 나타낸다.
바람직한 실시예의 상세한 설명
이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명의 예시일 뿐이고 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
하기 실시예의 실험 절차는 달리 명시되지 않는 한 모두 통상적인 절차이다. 하기 실시예에 사용된 원료 및 시약은 별도로 명시되지 않는 한 모두 시판 제품이다.
IMAB362의 중쇄 및 경쇄 서열은 서열식별번호 126 및 서열식별번호 127로 제시된다.
항원 인간 CLDN18.2는 NP_001002026.1에 제시된 바와 같고, 항원 인간 CLDN18.1은 NP_057453.1에 제시된 바와 같다.
도면의 음성 대조군(동형 대조군)은 전체 길이의 항-CD33 IgG 항체 Lintuzumab이다.
<실시예 1> 마우스 단일클론항체에 대한 선별
Balb/c 마우스는 세포 표면에서 인간 CLDN18.2 단백질을 안정적으로 발현하는 CHOK1 세포로 면역화되었다. 1개월 후, 마우스의 혈청을 유세포분석기(FACS)로 분석하고, 혈청 내 항체 역가가 높은 마우스로부터 비장을 채취하였다. 표준 방법에 의해 분리된 비장 세포를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 전기 융합(electrofusion) 방법을 사용하여 골수종 세포 P3X63Ag8.653와 융합시켰다. 융합된 하이브리도마 세포를 384웰 플레이트에 분주하고 배양 10-14일 후, 수득된 상층액을 하이브리도마 세포에 의한 항체 분비에 대해 FACS로 분석하였다. 세포 표면에서 인간 CLDN18.2 단백질을 안정적으로 발현하는 CHOK1 세포에는 결합할 수 있고 세포 표면에서 인간 CLDN18.1 단백질을 안정적으로 발현하는 CHOK1 세포에는 결합할 수 없는 여러 클론을 획득했다. 한계 희석법(Limiting Dilution)을 통해 획득된 클론의 단일 세포를 얻었고, 3배로 희석한 후 얻은 단일클론성 하이브리도마 세포 클론은 각각 하나의 항체만을 분비하였다.
항-인간 CLDN18.2를 분비하는 단일클론성 하이브리도마 세포를 확장 배양하고, RNAfast200 Kit(Shanghai Flytech Biotechnology Co., Ltd.)를 사용하여 Kit 지침에 설명된 단계에 따라 세포의 전체 RNA를 추출했다. 얻은 하이브리도마 세포의 총 RNA는 5xPrimeScript RT Master Mix(Takara)를 사용하여 cDNA로 역전사되었다. 항체 경쇄 가변 영역 IgVL(κ) 및 중쇄 가변 영역 VH의 서열은 축퇴 프라이머(degenerate primer; Anke Krebber., 1997) 및 Extaq PCR 시약(Takara)을 사용하여 증폭되었다. PCR 증폭 산물은 PCR Clean-up Gel Extraction Kit(Macherey-Nagel GmbH & Co.)를 사용하여 정제되었다. 그리고 Kit 지침에 따라 pClone007 Simple Vector Kit(Tsingke Biotechnology Co., Ltd.)를 사용하여 T-벡터(T-vector)에 연결하고 수용성 대장균 세포(Competent Escherichia coli cells)로 형질전환(transform)시켰다. 단일 클론 항체의 가변 영역 서열은 균주 증폭 및 플라스미드 추출 후 DNA 시퀀싱에 의해 획득되었다.
마우스 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역
마우스 항체 중쇄 가변 영역(VH) 경쇄 가변 영역(VL)
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>8K13_vl (서열식별번호: 22)
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<실시예 2> 항-인간 CLDN18.2 키메라 항체의 제조
각각의 마우스 항-인간 CLDN18.2 단일클론항체의 중쇄 가변 영역 서열 및 공개된 인간 단일클론항체 IgG1 하위분류(subclass; 서열식별번호 124 참조)의 중쇄 불변 영역 서열을 함께 스플라이싱하고 포유동물 세포 발현 벡터로 구성하였다. 각각의 마우스 항-인간 CLDN18.2 단일클론항체의 경쇄 가변 영역 서열 및 공개된 인간 단일클론항체 카파 하위분류(subclass; 서열식별번호 125 참조)의 경쇄 불변 영역 서열을 함께 스플라이싱하고 포유동물 세포 발현 벡터로 구성하였다. 구성된 항-인간 CLDN18.2 키메라 항체의 중쇄 및 경쇄 벡터를 쌍으로 혼합하고, HEK293 세포에 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 벡터를 형질감염(transfect)시키고, 약 7일 후에 세포 상층액을 수집하였다. 항-인간 CLDN18.2 키메라 항체 단백질을 단백질 정제를 통해 얻었다.
본 발명의 키메라 항체(chimeric antibodies)는 "마우스 항체 약어- xiIgG(murine antibody abbreviation-xiIgG)"형식에 따라 명명되었다.
<실시예3> 항-인간 CLDN18.2키메라 항체의 시험관 내 세포 결합 분석
키메라 항-인간 CLDN18.2 항체를 100nM의 초기 농도로부터 구배로 2배 희석하고 16개 농도의 각 항체의 용액을 전체적으로 얻었다. 각 농도의 각 항체 용액 10㎕를 384-웰 플레이트에 첨가하였다. 세포 표면에 CLDN18.2를 발현하는 CHOK1 세포를 실온에서 100g에서 5분간 원심분리하여 수집하고, 세포를 0.5% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)가 포함된 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 1회 세척한 후 실온에서 100g에서 5분간 원심분리하였다. 상기 세포를 약 2 x 106 cells/ml의 밀도로 재현탁하고, 상기 항체가 첨가된 384-웰 플레이트의 각 웰에 10 ㎕를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 형광 표지된 이차 염소 항-인간 IgG 항체(fluorescently labeled secondary goat anti-human IgG antibody)를 첨가하였다. 4°C에서 1시간 동안 계속 배양한 후, 세포 집단의 평균 형광 판독값을 유세포 분석기로 분석했다.
분석 결과에 따르면 키메라 항체(chimeric antibodies)가 나노미터 규모에서 인간 CLDN18.2를 발현하는 세포에 특이적 결합을 가짐을 보여주었다(도 1참조).
<실시예 4> 항-인간 CLDN18.2 마우스 항체의 인간화
Kabat 및 Chothia 항체 암호화 체계(antibody coding schemes)의 포괄적인 분석을 기반으로, 6개의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열 영역 및 각 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄의 보존된 3차원 입체 구조를 지원하는 프레임워크 영역(framework region)이 결정되었다. 이어서, IGHV1| IGHJ4*01과 같은 마우스 항체와 대부분 유사한 인간 항체의 중쇄 가변 영역은 알려진 인간 항체 서열에서 검색 및 선택되었다. 프레임워크 영역(framework region) 서열을 주형으로 선택하고, 마우스 항체의 중쇄 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역을 조합하여 최종적으로 인간화 중쇄 가변영역 서열을 제작하였다. 동일한 방법으로 인간화 경쇄 가변영역 서열을 제작하였다.
인간 프레임워크 영역에 직접 이식된 마우스 상보성 결정 영역(CDR)이 있는 항체는 종종 결합 활성의 극적인 감소를 나타내므로 프레임워크 영역의 개별 아미노산을 인간에서 다시 마우스로 전환해야 한다. 원래 마우스 잔기로 되돌려야 하는 위치를 결정하려면, 설계된 인간화 항체 서열과 원래 마우스 항체 서열을 비교하여 아미노산의 차이를 확인하고 이러한 다른 아미노산이 항체 구조 지지하거나 항원에 결합하는데 중요한지 여부를 확인해야 한다. 인간화 디자인으로 얻은 서열은 N(아스파라긴) 글리코실화 부위, N-탈아미드화 부위, D(아스파라긴산) 이성질체화 부위 등과 같은 잠재적인 번역 후 변형 부위(post-Translational Modification Sites, PTM)를 확인해야 한다.
각각의 인간화 중쇄 가변 영역 서열의 유전자는 인간 단일클론항체 IgG1 하위분류(subclass)의 중쇄 불변 영역 서열의 유전자를 함유하는 포유동물 세포 발현 벡터로 구성되었고; 각 인간화 경쇄 가변 영역 서열의 유전자는 인간 단일클론항체 카파 하위분류(subclass)의 경쇄 불변 영역 서열의 유전자를 함유하는 포유동물 세포 발현 벡터로 구성되었다. 인간화 항-인간 CLDN18.2 항체의 구성된 중쇄 및 경쇄 벡터를 쌍으로 혼합하고, HEK293 세포에 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 벡터를 형질감염(transfect)시키고, 약 7일 후에 세포 상층액을 수집하였다. 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체 단백질을 단백질 정제를 통해 얻었다.
본 발명의 인간화 항체는 "마우스 항체 약어-hz(murine antibody abbreviation-hz)" 형식에 따라 명명되었다. 인간 프레임워크 영역에 직접 이식된 마우스 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 항체는 "마우스 항체 약어-hz00(murine antibody abbreviation-hz00)"형식에 따라 명명되었으며, 추가로 조작된 항체는 인간화된 서열의 번호로 번호가 매겨졌다.
항원 인간 CLDN18.2에 대한 키메라 항체 및 그의 인간화 항체의 결합 동역학 매개변수(Binding kinetic parameters)를 Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28) 기기로 분석하였다. 분석을 수행하기 전에 나이트릴로트라이아세트산(nitrilotriacetic acid, NTA) 바이오프로브를 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 10분 동안 담가두었다. 그런 다음 프로브를 100nM 항원을 포함하는 인산염완충식염수(PBS)에 300초 동안 배치하여 His 태그된 항원(His-tagged antigen)을 포획했다. 상기 프로브는 400초의 결합 시간 동안 100nM 항체와 결합 반응을 더 거쳤다. 그런 다음 상기 프로브를 인산염완충식염수(PBS)로 옮기고 600초 동안 해리 반응을 수행했다. 분석이 완료되면 블랭크 대조군(blank control)의 반응값을 뺀 데이터를 소프트웨어를 이용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 맞춘 후 항원-항체 결합에 대한 동역학상수를 계산하였다. 결과는 표 2에 나와 있다.
마우스 항체의 인간화 후 결합 동역학 매개변수의 비교
항체 번역 후 변형 부위
(PTM)		 반응
(Response)		 친화상수
KD (M)		 결합상수
Kon 		해리상수
koff (s-1)		 해리상수/
Koff/
(1/Ms) 해리상수
Koff(Xi-IgG)
8K13-xiIgG 있음 0.134 3.82E-10 2.98E+05 1.14E-04 1.00
8K13-hz00 있음 0.133 7.44E-10 2.66E+05 1.98E-04 1.74
8K13-hz11 있음 0.139 2.97E-10 2.27E+05 6.73E-05 0.59
8K13-hz24 없음 0.133 1.51E-09 2.64E+05 3.99E-04 3.50
11M23-xiIgG 있음 0.184 2.93E-10 3.66E+05 1.07E-04 1.00
11M23-hz00 있음 0.164 1.49E-09 2.18E+05 3.24E-04 3.03
11M23-hz11 있음 0.174 1.29E-09 3.56E+05 4.60E-04 4.30
11M23-hz22 없음 0.136 2.92E-09 6.70E+05 1.95E-03 18.22
16K15-xiIgG 있음 0.261 5.57E-10 2.76E+05 1.54E-04 1.00
16K15-hz00 있음 0.176 8.95E-11 2.40E+05 2.15E-05 0.14
16K15-hz11 있음 0.17 5.35E-10 1.88E+05 1.00E-04 0.65
16K15-hz22 없음 0.266 1.10E-09 2.59E+05 2.86E-04 1.86
52E22-xiIgG 있음 0.223 9.96E-11 3.57E+05 3.55E-05 1.00
52E22-hz00 있음 0.188 3.09E-10 1.98E+05 6.11E-05 1.72
52E22-hz11 있음 0.238 5.42E-10 3.63E+05 1.97E-04 5.55
52E22-hz12 없음 0.226 3.60E-10 2.18E+05 7.83E-05 2.21
결과는 마우스 키메라 항체에 비해 11M23-hz22의 해리 상수(dissociation constant)가 인간화 및 중요한 번역 후 변형 부위(PTM) 제거 후 10배 이상 증가하여 후보 목록에서 제거되었음을 보여주었다. 나머지 8K13-hz24, 16K15-hz22 및 52E22-hz12의 해리 상수(dissociation constant)는 원래의 마우스 키메라 항체와 비교하여 1~4배 증가했으며 후속 연구를 위한 선도 분자(lead molecules)로 사용할 수 있다. 16K15-hz22의 경쇄 아미노산 서열은 2개의 연속적인 "NN" 잔기를 포함하고 있으며, "NN" 잔기를 각각 "SN" 및 "QN" 잔기로 변경함으로써 더욱 최적화된 돌연변이 항체 16K15-hz22_2 및 16K15-hz22_3을 얻었다.
인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역
마우스 항체 인간화 경쇄 가변 영역 인간화 중쇄 가변 영역 인간화 항체
16K15 서열식별번호128 서열식별번호129 16K15-hz00
서열식별번호128, 위치52 및89에서 복귀 돌연변이(reverse mutation)를 가짐. 서열식별번호129, 위치24에서 복귀 돌연변이(reverse mutation)를 가짐. 16K15-hz11
서열식별번호24 서열식별번호23 16K15-hz22
서열식별번호25 16K15-hz22_2
서열식별번호26 16K15-hz22_3
52E22 서열식별번호130 서열식별번호131 52E22-hz00
서열식별번호130, 위치 89에서 복귀 돌연변이(reverse mutation)를 가짐. 서열식별번호27 52E22-hz11
서열식별번호28 서열식별번호27 52E22-hz12
8K13 서열식별번호132 서열식별번호133 8K13-hz00
서열식별번호132, 위치4 및89에서 복귀 돌연변이(reverse mutations)를 가짐. 서열식별번호133, 위치74 및 77에서 복귀 돌연변이(reverse mutations)를 가짐 8K13-hz11
서열식별번호30 서열식별번호29 8K13-hz24
11M23 서열식별번호88 서열식별번호84 11M23-hz00
서열식별번호88, 위치41에서 복귀 돌연변이(reverse mutations)를 가짐 서열식별번호84, 위치 71에서 복귀 돌연변이(reverse mutations)를 가짐 11M23-hz11
서열식별번호88, 위치N31S 및 N33S 뿐만 아니라 41에서 복귀 돌연변이(reverse mutations)를 가짐 서열식별번호84, 위치D54E 및 N60Q 뿐만 아니라 71에서 복귀 돌연변이(reverse mutations)를 가짐 11M23-hz22
>16K15_vl_hz2（서열식별번호: 24）
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>16K15_vl_hz2_N-Q（서열식별번호: 26）
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>16k15_vh_hz2（서열식별번호: 23）
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>8K13_vh_hz2（서열식별번호: 29）
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<실시예 5> 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 시험관 내 결합 친화력의 동역학 실험
항체-항원 상호작용은 GE Healthcare의 BIAcore S200을 사용하여 측정되었다.
GE Healthcare의 Human Antibody Capture Kit(cat No. BR-1008-39, Lot 10261753)에 제공된 지침을 참조하여 CM5 센서 칩의 분석 채널과 대조 샘플 채널을 먼저 포화시키고 최대량의 항-인간 Fc 항체와 결합시키고, 그 다음 항-인간 CLDN18.2 키메라 항체, 인간화 항체 또는 대조군 항체 IMAB362를 7.5㎍/ml로 함유하는 완충액을 분석 채널을 통해 흐르게 하고 균일하게 분포시켰다; 그리고 마지막으로 구배 희석된 항원 샘플(초기 농도는 20nM이고 1:3으로 희석하여 8개의 농도를 얻었으며 농도 0.741nM은 반복되도록 설정됨)을 분석 채널과 샘플 채널 모두를 통해 흐르게 하고, 항체가 항원에 결합할 때의 광반응(photoreactions)을 측정하였다. 이어서, 최종적으로 각 항체의 결합상수 Kon 및 해리상수 Koff 및 친화상수 KD를 기기 소프트웨어 피팅 분석에 의해 구하였다.
결과는 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 시험관내 결합 친화 상수가 원래의 마우스 항체의 결합 친화 상수와 유의하게 다르지 않은 반면, IMAB362의 것보다 한 자릿수 더 낮음을 보여주었다(표 4 참조).
본 발명의 항체의 결합 동역학
항체 결합상수
ka (M-1s-1) 		해리상수
kd (s-1) 		친화상수
KD (M)
8K13-xiIgG 8.19E+04 5.73E-04 6.99E-09
8K13-hz24 7.09E+04 2.02E-03 2.85E-08
16K15-xiIgG 1.07E+05 1.44E-03 1.35E-08
16K15-hz22 5.71E+04 5.63E-04 9.85E-09
52E22-xiIgG 4.90E+05 5.45E-04 1.11E-09
52E22-hz12 1.46E+05 1.72E-04 1.18E-09
IMAB362 1.48E+06 0.201 1.36E-07
<실시예 6> 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 시험관내 세포학 검정(Cytology assay)
6.1 보체 의존성 세포독성(CDC)
본 발명의 인간화 항체는 Quidel, Inc.에서 입수할 수 있는 상업용 인간 혈청 전체 보체를 사용하여 인간 CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 CHOK1, BxPC3 및 NCI-N87 세포에서 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도하는 능력에 대해 분석하였다.
세포를 250㎍/ml 내지 3.8ng/ml 범위의 최종 농도에서 시험할 항체와 혼합하였다; 세포 배양 배지 RPMI-1640에 용해된 6.25% 농도의 전 인간 혈청을 혼합물에 첨가한 다음 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성은 CCK-8 키트로 측정했다. 마지막으로, 450 nm에서의 흡광도를 MD 플레이트 리더로 측정하였다. 샘플의 EC50 값은 softmax pro7 소프트웨어를 사용하여 흡광도 값으로 4-매개변수 피팅 곡선을 플로팅(plotting)하여 계산했다.
결과는 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체가 표적 발현 세포에 대해 특이적 보체 의존적 세포독성(CDC)을 가졌고 이들의 세포 사멸 활성이 IMAB362보다 유의하게 우수함을 보여주었다(도 2 및 표 5 참조).
본 발명의 항체의 보체 의존적 세포독성(CDC)
표적 발현 세포 CHOK1 BxPC3 NCI-N87
항체 EC50 (nM) EC50 (nM) EC50 (nM)
8K13-hz24 IgG 21.27 28.53 57.7
16K15-hz22 IgG 5.2 12.22 17.36
52E22-hz12 IgG 2.08 NA NA
IMAB362 30.45 52.23 474.2
6.2 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)
FcγRIIIa-FcεRIaγ 하이브리드 수용체를 안정적으로 발현하고 활성화된 T 세포의 핵 인자 (Nuclear factor of activated T-cells, NFAT) 반응 요소에 의한 구동 하에 반딧불이 루시퍼라아제(Luciferase)를 발현하는 조작된 저카트(Jurkat) 세포를 효과기 세포(effector cells)로 사용하였다. 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 메커니즘에서 항체의 생물학적 활성은 NFAT 경로의 활성화에 의해 생성된 루시퍼라아제에 의해 정량화된다. 1.5E5 효과기 세포를 33㎍/ml 내지 85pg/ml 범위의 최종 농도에서 시험할 항체와 혼합한 다음, 2.5E4 표적 세포를 혼합물에 첨가하였다(효과기 세포(E) 대 표적세포(T) 비율은 6: 1) 그런 다음 37°C에서 16시간 동안 인큐베이션했다. 세포 독성(Cytotoxicity)은 Promega의 Bio-GloTM Luciferase Assay System 키트로 측정했다. 밝기 값(LUM value)은 MD 플레이트 판독기에 의해 최종적으로 결정되었다.
데이터는 다음과 같이 처리되었다: 폴드 유도(Fold induction) = (검출된 웰의 판독값 - 배경값)/(음성 대조군 웰의 판독값 - 배경값). 샘플의 EC50 값은 데이터와 함께 4-매개변수 피팅 곡선(4-parameter fitting curves )을 플로팅(plotting)하여 계산되었다.
결과는 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체가 표적 발현 세포에 대해 특이적 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 가졌고 이들의 세포 사멸 활성이 IMAB362와 유사함을 보여주었다(도 3 및 표 6 참조)
본 발명 플롯 곡선(plot curve)의 항체의 ADCC
표적 발현 세포 a. CHOK1 b. BxPC3 c. NCI-N87
항체 EC50（nM） EC50（nM） EC50（nM）
8K13-hz24 IgG 0.5894 0.3045 0.1499
16K15-hz22 IgG 0.7122 0.1759 0.0677
52E22-hz12 IgG 0.5672 NA NA
IMAB362 0.5929 0.1056 0.0909
<실시예 7> 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 동종 단백질에 대한 결합 특성 분석
인간 CLDN18.2 및 CLDN18.1의 유전자를 각각 진핵생물 발현 벡터로 구성하고 HEK293 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 벡터로 형질감염(transfect)시켰다. 형질감염 3일 후, 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 인산염완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 1회 세척하고, 2 x 106/ml의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 384-웰 플레이트의 각 웰에 10 ㎕씩 첨가한 후, 상이한 농도의 인간화 항체를 웰에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 형광 표지된 이차 염소 항-인간 IgG 항체(fluorescently labeled secondary goat anti-human IgG antibody)를 첨가하였다. 4°C에서 1시간 동안 계속 배양한 후, 384웰 플레이트의 평균 형광 판독값을 유세포 분석기로 판독했다. 데이터를 분석하여 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체에 대한 세포의 결합 특성을 얻었다. 실험에 사용된 양성 대조군은 상업용 항-인간 CLDN18 토끼 mAb 34H14L15(Abcam Corporation에서 입수 가능)이고 음성 동형(Isotype) 대조군은 전체 길이의 항-CD33 IgG 항체 Lintuzumab이었다.
결과는 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체가 인간 CLDN18.2에 결합하지만 인간 CLDN18.1에는 결합하지 않는 특성을 나타내었다는 것을 보여주었다(도 4 참조). 또한 저농도, 중농도, 고농도에서 인간 CLDN18.1 세포에 대한 비특이적 결합은 모두 IMAB362보다 낮았다(도 5 참조).
<실시예 8> 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체의 인간, 원숭이 및 마우스 종 교차 결합 특성의 분석
인간, 마우스 및 붉은털 원숭이(Rhesus) CLDN18.2의 유전자를 각각 진핵생물 발현 벡터로 구성하고, HEK293 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 벡터로 형질감염(transfect)시켰다. 2일 후에 상기 세포를 수집하였다. 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체에 대한 세포의 결합 특이성을 유세포 분석(flow cytometry)을 사용하여 분석하였다. 유세포 분석 절차는 실시예 7을 참조한다.
결과는 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체 16K15-22 IgG가 3종 모두의 CLDN18.2에 결합하고, 8K13-24 IgG 및 52E22-12 IgG가 붉은털 원숭이(Rhesus) CLDN18.2에 결합하지만 마우스 CLDN18.2에는 결합하지 않는다는 것을 보여주었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
<실시예 9> 항-인간 CLDN18.2 인간화 항체를 사용한 CAR-T 세포의 제조 및 그의 활성화
9.1 렌티바이러스 패키징
렌티바이러스 패키징(Lentivirus Packaging)은 표 7에 제시된 군(group)에 따라 수행하였다. 먼저 서로 다른 항체 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터 플라스미드 pLTR(Lentiviral vector plasmid pLTR)을 구성하고, 염기서열분석(sequencing)으로 DNA가 올바른지 확인한 후 Qiagen의 플라스미드 추출 키트(plasmid extraction kit)를 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 멸균 TE에 용해하고 UV광 흡수에 의해 농도 및 순도를 결정하여 추출된 플라스미드 DNA의 A260/A280이 1.8과 2.0 사이임을 확인했다. 2개의 헬퍼 패키징 요소 플라스미드(helper packaging element plasmids)인 pCMV-VSV-G 및 pCMV-dR8.2의 DNA도 추출되었다. 형질감염을 위한 HEK293T 세포는 약 60%의 컨플루언시(confluency)까지 성장해야 하는 갓 계대된 세포를 얻기 위해 준비되었다. 3개의 플라스미드를 형질감염 시약(transfection reagent)으로서 인산칼슘을 사용하여 HEK293T 세포로 공동-전이(co-transfer)시켰다. 형질감염(Transfection) 48시간 후, 포장된 바이러스를 포함하는 세포 상층액을 저온에서 원심분리하여 수집하고, 0.45μm 필터를 이용하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 한외여과(ultrafiltration) 원심분리관을 이용하여 바이러스를 농축하고, 소포장하여 -80℃의 냉장고에 보관하였다. 소량의 바이러스 농축액을 취하여 유세포분석기(FACS)에 의해 바이러스 역가를 결정하였다.
렌티바이러스의 그룹화(groupings)
번호 바이러스 바이러스 역가 군(group)
135 LV-135.N 8.75E+06 음성 대조군
417 LV-417.N 1.65E+07 16k15 (16K15-hz22) scfv*
418 LV-418.N 1.38E+07 52E22 (52E22-hz12) scfv*
419 LV-419.N 5.13E+07 8K13 (8K13-hz24) scfv*
420 LV-420.N 1.50E+07 양성 대조군
표 7에 제시된 음성 대조군은 CLDN18.2에 결합하지 않는 또 다른 항체이고 양성 대조군은 Carsgen Therapeutics의 항체 hu8E5였다(WO2018006882A1 참조). *: 짧은 펩티드(GSTSGGGSGGGSGGGGSS)를 통해 인간화 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 연결하여 단일 사슬 항체를 형성했다.
9.2 CAR-T 세포의 준비
B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 인간면역결핍바이러스(HIV)에 대해 음성이 검출된 건강한 기증자가 선택되었다. 전주 정맥(antecubital vein)에서 100ml의 혈액을 채취하고 피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심 분리를 수행하여 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 포함하는 흰색 층을 분리했다. CD3+ T 세포는 다이나비드(DynaBeads)/CD3+ T 세포의 3:1 비율로 다이나비드 CD3/CD28(LifeTechnologies, Cat. No. 40203D)을 사용하여 분리되었다. 활성화 24시간 후, CD25+ CD69+ T 세포의 백분율이 유세포 분석에 의해 검출되었다. 활성화되면 CD3+ T 세포를 감염다중도 (Multiplicity of Infection, MOI) 5의 렌티바이러스로 형질도입했다. 24웰 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 노보넥틴(Novonectin)으로 코팅했다. 상기 절차에 의해 얻은 세포 현탁액을 다양한 렌티바이러스(MOI = 5), Synperonic® F108(Sigma, 제품 번호 07579-250G-F) 및 줄기세포 기억 T세포(stem cell memory T cell, Tscm)(2 U/ml)로 형질도입하기 위한 현탁액으로 제형화하였다. 형질도입용 현탁액을 1.0E +06/ml로 조정된 세포 밀도로 24-웰 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 500g에서 30분 동안 원심분리하고 48시간 동안 정적 배양(static culture)을 위해 37°C, 5% CO2의 인큐베이터에 두었다. 형질도입(transduction) 후, 세포를 격일에 Tscm(최종 농도 2U/ml)가 보충된 5% 소 태아혈청(fetal bovine serum, FBS) X-vivo15 배지(LONZA, 제품 번호 04-418Q)에서 배양하였다. 세포를 계수하고, 0.5E +06/ml로 조정하고, 배양 8-10일에 수확하였다.
수득된 각 군의 CAR-T 세포의 양성 백분율의 결과를 도 7에 나타내었다.
9.3 CAR-T 세포의 활성화
항원 인간 CLDN18.1 및 항원 인간 CLDN18.2를 발현하는 CHO 세포를 구성하고 표적 세포로 사용하였다.
상기 세포의 항원 발현 검출 결과를 도 8에 제시하였다. CHO-BLANK(블랭크 대조군) 및 CHO-CLDN18.1은 항원 CLDN18.2의 발현이 없었고, CHO-CLDN 18.2는 항원 CLDN18.2의 발현이 높았다.
CAR-T 세포 및 렌티바이러스 형질도입이 없는 T 세포의 각 군을 포함하여 상기한 바와 같이 밀도가 조정된 효과기 세포(effector cells)를 16:1의 효과 대 표적 비율로 각각 1.5mL 원심분리기 튜브에서 표적 세포와 혼합했다. T 세포 배지 X-vivo15(자가 혈청 및 Tscm가 없음)를 사용하여 총 부피를 200μL로 보충했다. 그런 다음 200 μL의 시스템을 각각 24시간 공동 인큐베이션을 위해 96-웰 플레이트 V-바닥으로 옮겼다.
인큐베이션 후, 인간 IFNγ의 검출을 위해 각 배양 시스템의 상층액을 취하였다. IFNγ 방출의 유의한 증가는 CHO-CLDN18.1 및 CHO-CLDN18.2와 함께 인큐베이션한 후 군(group) 417의 CAR-T 세포에서 발견되었으며; IFNγ 방출의 증가는 CHO-CLDN18.2와의 인큐베이션 후에만 군(group) 418, 419 및 420의 CAR-T 세포에서 발견되었다. 그 결과를 표 8 및 도 9에 나타내었다.
배양 시스템의 상층액에서 검출된 인간 IFNγ
군(grourp) T: CHO-BLANK T: CHO-클라우딘18.1 T: CHO-클라우딘18.2
음성대조군 1020.1 912 1095.2
135 1441.2 1458.6 1877
417 9016 60328.2 79178.6
418 3940.8 4540 78903.4
419 4486.2 4670.6 75516.8
420 7381.1 6973.2 78247
각 군(group)의 CAR-T 세포는 T 세포 활성화 마커 단백질 CD3/CD25에 대해 검출되었다. CD25 발현은 CHO-CLDN18.1 및 CHO-CLDN18.2와 함께 인큐베이션한 후 군(group) 417의 CAR-T 세포에서 상향 조절되고 군(group) 418, 419 및 420 CART에서만 CAR-T 세포에서 CHO-CLDN18.2와 배양 후에 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다(도 10 참조).
본 발명의 실시예들에 대한 상기 설명은 본 발명을 제한하려는 것이 아니며, 당업자는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 본 발명에 다양한 변경 및 수정을 가할 수 있으며, 이는 본 첨부된 청구항의 범위 내에 있어야 한다.
<110> MABWELL (SHANGHAI) BIOSCIENCE CO., LTD. <120> ANTI-HUMAN CLAUDIN 18.2 ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> LC20210007P-KR <150> CN201910929614.0 <151> 2019-09-29 <160> 133 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Arg Ile Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Arg Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg His Pro Ala Phe Gly Pro His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ile Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Asp Ala Pro Ser 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aaaatgaaca gtctccaaat tgatgacaca gccatttatt attgtgtcag acatcccgcc 300 ttcggtcccc atgctatgga ctactggggt caaggaatct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 95 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 95 gatattgtga tgactcagga tgcaccctct atacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg aatagtaatg gcaacactta cttatattgg 120 ttcttgcaga ggccaggcca gtctcctcac ctcctgcttt atcggatgtc caaccctgcc 180 tcaggagccc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga ctgaattcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgaaga tgtgggtgtt tattactgta tgcaatatct ggaatatccg 300 cccacgttcg gtgctgggac caggctggag ctgaaa 336 <210> 96 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 96 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag gctctggaat cactctcagt acctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagagga ggctggagtg ggtcgcatcc attattagtg gtggtatcac ctattattta 180 gacagtgtga agggccgctt caccatctcc agagataatg 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gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactacatat 240 ttacagataa gtaacctcaa aaatgaggac acggctacgt atttctgtgc gagatgggga 300 aagggaaata ctatggacta ttggggtcaa ggaacctcag tcatcgtctc ctca 354 <210> 99 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 99 gacattgtga tgacacagtc gccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacggtggaa atcagaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aaacttttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacacattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatgc ttattttttt 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagcta gagctgaaa 339 <210> 100 <211> 358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 100 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtagtac catctactat 180 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acagtggtag ctctaactac 180 aacccatctt tcaaaagtcg aatctctatc agtcgagaca cgtccaagaa ccaattcttc 240 ctgcagttga aatctgtgac tactgaagac acagccacat attactgtgc aagaatgtat 300 aacggaaact cgtttcttta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 103 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 103 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggcga gaaggtcact 60 atgaactgca agtccagtca gagtctgttt aacagtggaa atcaaaagaa ctatttgacc 120 tggtatcagc aaaaaccagg gcagcctcct agattgttga tctattgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctgtca ctttattact gtcagaattc ttatagttat 300 cctctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagttgaaa 339 <210> 104 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 104 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctgac ctggtggcgc cctcacagag cctgtccctc 60 acatgctccg tctcagggtt ctccttaacc agctatggta ttcactgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctggtggtg atatggagtg atggaagaac aacctataat 180 tcaggtctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttctctta 240 aaaatgaaca gtctccgaac tgatgacaca gccatttact actgtgtcag acatcccgcc 300 ttcggtcccc atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 105 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 105 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg aatagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgggga tgtgggtgtt tattactgta tgcaatatct agaatatccg 300 gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 106 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 106 gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt cgctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120 ccaaaaaagg gactggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtaatac catctactat 180 gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240 ctgcaaacga ccagtctaag gtctgaggac acggccatat attactgtgg aagattgggc 300 ttctatggta actcgtttga tcactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 107 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 107 aacattttga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcgggaga gaaggtcact 60 atgaactgca agtccagtca gagtctgtta aacggtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaagcagg gcagcctccc aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gagtctgggg tccctgatcg cttcacaggc ggtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca ctttattact gtcagaattc ttattattat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg taccaagctg gagctgaaa 339 <210> 108 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 108 gaggtccagc tgcggcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatatta taaactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatga tacaaggtac 180 aatgagaggg tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cactgcctac 240 atggagctca gcagcctgac ctctgaagac tctgcggtct attactgtgc aagattttac 300 tttggtaact cgtttactta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 109 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 109 gacattgtga tgacacagtc tccgtcctcc ctgcctgtga cagtaggaga gagggtcact 60 atgacctgca agtccagtca gggtctgttt aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca atttattact gtcagaataa ttatatttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg gagctgaaa 339 <210> 110 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 110 gaggtccagc tgcggcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact acctatatta taaactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaggtac 180 aatgagaggg tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag tacagcctac 240 atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct actactgtgc aagatttcac 300 tttggtaatt cgtttactta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354 <210> 111 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 111 gacattgtga tgacacagtc tccgtcctcc ctgcctgtga caacaggaga gaaggtcact 60 atgacttgca agtccagtca gggtctgttt aacaatggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca atttattact gtcagaataa ttatattttt 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagttg gagctgaaa 339 <210> 112 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 112 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggata taccctcaca aactatggaa tgaattgggt gaggcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaggccca acactggaga gccaacatat 180 gctgaagact tcaagggacg atttgtcttc tctttggaaa cctctgccgc cactgcctat 240 ttacagatca ccaacctcaa aagtgaggac acgtctacat atttctgtgc aagactgtac 300 aggggaaata ctttggacaa ctggggtcaa ggaacctcag tcatcgtctc ctca 354 <210> 113 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 113 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga caacagggga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gaatctgtta aacagtggaa atcaaaggaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaagccagg acagtctcct aaactattga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tcccttatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tacagactga tgacctggct atttattact gtcagaatgg ttatagtttt 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 114 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 114 caggttcacc tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt aattactgga tgaactgggt gaggcagagg 120 cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gaaatggtga tactaagtac 180 agtggaaagt tcaacagtaa agacacactg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca acagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagattttac 300 tacggtaatg ttatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcg 354 <210> 115 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 115 gacattgtgt tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gactctgtta aacggtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaatcagg gcagcctcct aaactgttga tctattgggc atcaactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 attagcagtg tccaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatgg ttatagttat 300 ccgctcacgt tcggtgttgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 116 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 116 gaggtgcagc tggtggagag cgggggggga ctggtgcagc caggaggaag cctgagactg 60 agctgtgccg gcagtggcat taccctgagc acatatgcca tgagctgggt gagacaggcc 120 cctggcaaag gactggagtg ggtgagcagc attatcagcg gaggaatcac ctactatctg 180 gatagcgtga agggacggtt cacaatcagc agggataacg ccaagaacac actgtatctg 240 cagatgagct ctctgagggc cgaagacacc gccgtgtatt attgcgccag aaagtaccac 300 ggaaacgccc tggactactg gggccagggg accctggtga cagtgagctc c 351 <210> 117 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 117 gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120 tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaaaagctga tctactgggc ctccacccgg 180 gaatccggcg tgccagacag attctccggc tccggctccg gaaccgactt caccctgacc 240 atcagctccc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagaacaa ctacttctac 300 cccctgacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaag 339 <210> 118 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 118 gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120 tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaaaagctga tctactgggc ctccacccgg 180 gaatccggcg tgccagacag attctccggc tccggctccg gaaccgactt caccctgacc 240 atcagctccc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagagcaa ctacttctac 300 cccctgacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaag 339 <210> 119 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 119 gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120 tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaaaagctga tctactgggc ctccacccgg 180 gaatccggcg tgccagacag attctccggc tccggctccg gaaccgactt caccctgacc 240 atcagctccc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagcagaa ctacttctac 300 cccctgacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaag 339 <210> 120 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 120 cagatccagc tggtgcagag cggcagcgaa ctgaagaagc ccggcgccag cgtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccctgacc aactacggca tgaactgggt gagacaggct 120 cccggccagg ggctggaatg gatgggatgg atcagaccca acaccggaga gccaacctac 180 gccgaggact tcaagggcag attcgtgttc agcctggaca cctctgtggc caccgcttac 240 ctgcagatca ccagcctgaa agccgaggac accgccgtgt actactgtgc ccgcctgtat 300 agaggaaaca ccctggacaa ctggggccag ggcactctgg tgaccgtgag ctcc 354 <210> 121 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 121 gacattgtga tgacccagag ccccgactcc ctggccgtga gcctgggaga aagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gaacctgctg agcagcggca accagagaaa ctacctgacc 120 tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaactgctga tctactgggc ctccaccaga 180 gaaagcggcg tgcccgacag attctccgga agcggcagcg gcaccgactt caccctgact 240 atcagcagcc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagcaggg ctacagcttc 300 cccttcacct tcggccaggg caccaaactg gagatcaaa 339 <210> 122 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 122 caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaaaaagc ccggctcctc agtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcta cgccttctcc aactactgga tgaactgggt gagacaggcc 120 ccaggccagg gcctggaatg gatgggacag atctaccccg gcagcggcga tacaaagtac 180 agcggaaagt tccagagcag agtgaccatc accgccgaca aaagcaccaa caccgcctac 240 atggagctga gcagcctgag aagtgaggac accgccgtgt actactgcgc cagattctac 300 tacggcaacg tgatggacta ttggggccag ggaaccctgg tgaccgtgag ctct 354 <210> 123 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 123 gacattgtgc tgacccagag ccccgactcc ctggctgtga gcctgggaga gagagccacc 60 atcaactgca agagcagcca gaccctgctg agtggaggaa accagaaaaa ctacctgact 120 tggtaccagc agaaacccgg ccagcccccc aaactgctga tctactgggc ctccacaaga 180 gaaagcggag tgcccgacag attcagcggc agcggcagcg gaaccgactt caccctgact 240 atcagcagcc tgcaggctga ggacctggcc gtgtactact gccagcaggg ctacagctac 300 ccactgacct tcggacaggg caccaagctg gagattaaa 339 <210> 124 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain constant region <400> 124 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 125 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain constant region <400> 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 126 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 126 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 127 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 127 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 128 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 128 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asn Tyr Phe Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 129 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 129 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ile Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Lys Tyr His Gly Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 130 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 131 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 131 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Arg Pro Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Arg Gly Asn Thr Leu Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 132 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region <400> 132 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Asn Gly 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 133 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region <400> 133 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ser Gly Lys Phe 50 55 60 Asn Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Tyr Gly Asn Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (24)

  1. 항-인간 클라우딘18.2 항체의 제조방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 제조방법:
    (1) 표면에 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 세포를 면역원으로 하여 동물을 면역시키는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 면역화된 동물을 이용하여 항체를 생산할 수 있는 세포 클론을 제조하는 단계;
    (3) 표면에 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 세포를 양성 선별 항원으로 사용하여, 양성 선별 항원에 결합 활성을 갖는 항체 및 항체를 생산하는 세포를 선별하는 단계;
    (4) 음성 선별 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체 및 항체를 생산하는 세포를 제외하고, 음성 선별 항원으로서 표면에 인간 클라우딘18.1 단백질을 발현하는 세포를 사용하는 단계를 포함하는 항-인간 클라우딘18.2 항체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 단계 (1)에서 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 세포는 면역된 동물과 동일한 종에서 유래하고; 바람직하게는, 인간 클라우딘18.2 단백질을 발현하는 상기 세포는 마우스 세포이고, 면역화된 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는, 항-인간 클라우딘18.2 항체의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 단계 (2)에서 항체를 생산할 수 있는 세포 클론은 하이브리도마 기술 및 단일 세포 증폭 기술로 구성된 군에서 선택된 기술에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 항-인간 클라우딘18.2 항체의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 단계 (3)의 양성 선별 항원은 단계 (1)의 면역원과 동일하고; 단계 (4)의 음성 선별 항원은 발현된 단백질이 인간 클라우딘18.1 단백질이라는 점에서만 단계 (1)의 면역원과 상이한 것을 특징으로 하는, 항-인간 클라우딘18.2 항체의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 단계 (3) 및 단계 (4) 는 각각 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 및 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)로 구성된 군에서 선택된 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 항-인간 클라우딘18.2 항체의 제조방법.
  6. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 수득된 항-인간 클라우딘18.2 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2는 인간 클라우딘18.2의 N-말단, 바람직하게는 제1 세포외 루프(ECL1)를 함유하는 인간 클라우딘18.2의 N-말단에서 세포외 영역에 특이적으로 결합하는, 항-인간 클라우딘18.2 항체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 항-인간 클라우딘18.2항체는 나노미터(nM) 규모에서 인간 CLDN18.2에 대한 특이적 결합을 갖으며, 동형 음성 항체(또는 관련 없는 항체)와 비교하여 인간 CLDN18.1에 대한 결합에 유의한 차이가 없는 것을 특징으로 하는, 항-인간 클라우딘18.2항체.
  9. 항체 또는 그의 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 함유하고, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)은 하기의 군으로부터 선택되는 CDR(VH- CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 및 VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3)의 조합을 함유하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편:
    (1) 서열식별번호31에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호32에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호33에 제시된 바와 같은VH-CDR3; 및 서열식별번호34에 제시된 바와 같은VL-CDR1, 서열식별번호35에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호36에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (2) 서열식별번호37에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호39에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호40에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호42에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (3) 서열식별번호43 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호44 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호45 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호46 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호47 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (4) 서열식별번호48 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호49 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호50 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호40 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호51 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (5) 서열식별번호52 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호53 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호54 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호55 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호56 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (6) 서열식별번호57 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호58 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호33 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호34 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호59 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호60 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (7) 서열식별번호61 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호62 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호63 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호46 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호64 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (8) 서열식별번호65 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호66 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호67 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호68 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호69 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (9) 서열식별번호65 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호70 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호71 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호72 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호73 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (10) 서열식별번호74 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호75 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호76 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호77 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호78 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (11) 서열식별번호79 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호80 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호81 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호82 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호83 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (12) 서열식별번호37 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호39 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호85 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호42 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (13) 서열식별번호37 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호39 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호85 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호86 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (14) 서열식별번호37 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호38 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호39 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호85 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호87 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3;
    (15) 서열식별번호74 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호75 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호76 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호89 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호90 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3; 및
    (16) 서열식별번호79 에 제시된 바와 같은 VH-CDR1, 서열식별번호91 에 제시된 바와 같은 VH-CDR2, 및 서열식별번호81 에 제시된 바와 같은 VH-CDR3; 및 서열식별번호92 에 제시된 바와 같은 VL-CDR1, 서열식별번호41 에 제시된 바와 같은 VL-CDR2, 및 서열식별번호93 에 제시된 바와 같은 VL-CDR3.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편의 중쇄 가변영역은 서열식별번호 1, 서열식별번호 3, 서열식별번호 5, 서열식별번호 7, 서열식별번호 9, 서열식별번호 11, 서열식별번호 13, 서열식별번호 15, 서열식별번호 17, 서열식별번호 19, 서열식별번호 21, 서열식별번호 23, 서열식별번호 27 및 서열식별번호 29 중에서 어느 하나로 제시된 아미노산 서열 또는 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하고; 및/또는 상기 항체 또는 그의 단편의 경쇄 가변 영역은 서열식별번호 2, 서열식별번호 4, 서열식별번호 6, 서열식별번호 8, 서열식별번호 10, 서열식별번호 12, 서열식별번호 14, 서열식별번호 16, 서열식별번호 18, 서열식별번호 20, 서열식별번호 22, 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 서열식별번호 26, 서열식별번호 28 및 서열식별번호 30 중에서 어느 하나로 제시된 아미노산 서열 또는 제시된 바와 같은 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 함유하는 것인 항체 또는 그의 단편:
    (1) 서열식별번호1 에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호1에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호2로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호2에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (2) 서열식별번호3 에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호3에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호4로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (3) 서열식별번호5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호5에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호6로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호6에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (4) 서열식별번호7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호7에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호8로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (5) 서열식별번호9에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호9에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호10으로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호10에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (6) 서열식별번호11에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호11에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호12로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호12에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (7) 서열식별번호13에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호13에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호14로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호14에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (8) 서열식별번호15에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호15에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호16으로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호16에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (9) 서열식별번호17에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호17에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호18로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호18에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (10) 서열식별번호19에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호19에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호20에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호20에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (11) 서열식별번호21에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호21에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번22로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호22에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (12) 서열식별번호23에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호23에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호24로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호24에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (13) 서열식별번호23에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호23에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호25로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호25에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (14) 서열식별번호23에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호23에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호26에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호26에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (15) 서열식별번호27에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호27에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호28로 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호28에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
    (16) 서열식별번호29에 제시된 아미노산 서열 또는 서열식별번호29에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열식별번호30에 제시되는 아미노산 서열 또는 서열식별번호30에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열;
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 임의의 형태로, 예를 들어 단일클론항체(monoclonal antibody), 단일사슬항체(single chain antibody), 이량항체(diabody), 단일 도메인 항체(single domain antibody), 나노체(nanobody), 완전 또는 부분적으로 인간화 항체(humanized antibody), 또는 키메라 항체(chimeric antibody) 등이고; 대안적으로, 상기 항체 또는 그의 단편은 반쪽 항체 또는 반쪽 항체의 항원 결합 단편, 예를 들어, scFv, BsFv, dsFv, (dsFv)2, Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv이고;
    바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 마우스 불변 영역, 바람직하게는 인간 또는 마우스 경쇄 불변 영역(CL) 및/또는 중쇄 불변 영역(CH)을 추가로 포함하고;
    보다 바람직하게는, 상기 항체 또는 그의 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 및/또는 카파 또는 람다 유형 경쇄 불변 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 하는 항체 또는 그의 단편.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 단일클론항체, 바람직하게는 마우스, 키메라 또는 인간화 단일클론항체이고; 바람직하게는, 단일클론항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1 또는 IgG4 아형(subtype)이고 단일클론항체의 경쇄 불변 영역은 카파 타입이고;
    바람직하게는, 단일클론항체의 중쇄 불변 영역은 서열식별번호 124에 제시된 아미노산 서열 또는 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 단일클론항체의 경쇄 불변 영역은 서열식별번호 125에 제시된 아미노산 서열 또는 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
  14. 제6 항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 항체 또는 그의 단편을 함유하는 중쇄CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  16. 제14항에 따른 핵산 분자 및/또는 제15항에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 제14항에 따른 핵산 분자 및/또는 제15항에 따른 벡터로 형질전환(transform) 또는 형질감염(transfect)된 숙주 세포.
  17. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편을 함유하는 접합체(conjugate) 또는 융합 단백질(fusion protein).
  18. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편을 포함하고, 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 및/또는 제17항에 따른 접합체 또는 융합 단백질 및 선택적으로 제약상 허용되는 부형제(excipient)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편을 포함하고, 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 제17항에 따른 접합체 또는 융합 단백질, 및/또는 제18항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트.
  20. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편의 용도는 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 제17항에 따른 약학적 조성물, 및/또는 예방 및/또는 암 치료를 위한 의약의 제조에서의 제18항에 따른 접합체 또는 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편의 용도.
  21. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편의 용도는, 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 제17항에 따른 약학적 조성물, 및/또는 암 진단용 제제의 제조에서의 제18항에 따른 접합체 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편의 용도.
  22. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편의 용도는 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 제17항에 따른 약학적 조성물, 및/또는 CAR-T 세포의 제조에서 제18항에 따른 접합체 또는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편의 용도.
  23. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편, 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 제17항에 따른 약학적 조성물, 및/또는 제18항에 따른 접합체 또는 융합 단백질, 및 선택적으로 다른 약물 또는 수단을 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법.
  24. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편, 제14항에 따른 핵산 분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 제17항에 따른 약학적 조성물, 및/또는 제18항에 따른 접합체 또는 융합 단백질을 대상체의 샘플과 접촉시키는 것을 포함하는, 암을 진단하는 방법.
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