TW202126692A - 抗人Claudin18.2抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種結合人密連蛋白（Claudin）18.2的抗體或其片段，以及它們的編碼核酸等。本發明的抗人密連蛋白18.2抗體對抗原密連蛋白18.2具有強親和力，對靶點表達細胞具有顯著的補體依賴性細胞毒性（CDC）活性和抗體依賴性細胞毒性（ADCC）活性，並且表現出與人CLDN18.2的高特異性。

Description

抗人Claudin18.2抗體及其應用
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種新的抗人密連蛋白（Claudin）18.2抗體或其功能性片段。本發明還涉及所述抗體或其功能性片段的應用。
人密連蛋白18（Claudin18；CLDN18）屬於密連接蛋白家族，這類蛋白於生物學上，在構建細胞緊密連接、維持細胞屏障功能和參與細胞間分子傳遞等方面發揮作用。密連蛋白18之蛋白分子量約26KD，可以通過選擇性剪接使密連蛋白變成具有不同特性的密連蛋白亞型：CLDN18.1和CLDN18.2。CLDN18.1和CLDN18.2均由261個胺基酸組成，均具有四個跨膜結構域，NH2端和COOH端位於胞內，具有兩個胞外環（ExtracellularLoops：ECL1，ECL2）。CLDN18.1和CLDN18.2之胞外區1中僅存在8個胺基酸差別。
其中CLDN18.2在多種人上皮腫瘤類型的原發病灶和轉移病灶中表達，並在彌散性癌細胞中持續表達。在食管癌、胰腺癌、肺癌和胃癌細胞中，CLDN18.2的表達水準更是有顯著的增高。Sahin等人研究認為CLDN18.2是個重要的胃癌生物指標，它存在於70%的胃癌病人中，其中90%至95%被診斷為腺癌，另外5-10%包括淋巴瘤、胃腸道間質瘤（GIST）和類癌腫瘤。
德國的生物科技公司Ganymed開發了一種針對CLDN18.2的單株抗體IMAB362，目前處於臨床III期臨床試驗中，用於治療胃食管癌晚期患者。單獨的IMAB362抗體結合，在體外和體內均導致表達CLDN18.2之靶細胞的增殖抑制，其抑制腫瘤生長和清除癌細胞的作用機制一是通過補體依賴性細胞毒性（CDC），二是通過抗體依賴性細胞毒性（ADCC），各種作用模式被證明獨立存在但有協同作用。IMAB362抗體針對轉移性食管癌、轉移性胃癌適應症，目前在美國和歐盟處於臨床3期，預期將於2021年申請上市。
然而，IMAB362是一個嵌合抗體，還有較多的鼠源胺基酸，在人體內引起排斥免疫反應的機率相對比較高。因此，本領域仍然存在對人CLDN18.2具有更高特異性、親和力和生物活性的抗體、特別是人源化抗體的需要。此外，密連蛋白18的兩個亞型CLDN18.1和CLDN18.2的結構高度相似，而功能卻不相同，CLDN18.1和CLDN18.2的高度同源性及ECL1存在高級結構，篩選針對CLDN18.2的高品質抗體具有較大的難度，在抗體特異性方面存在高度的不確定性。
本發明要解決的技術問題是，通過單株抗體製備方法的優化，提高密連蛋白18.2特異性抗體的篩選效率，通過融合瘤篩選和人源化技術，獲得特異性結合人CLDN18.2的高親和力抗體，其中通過人源化設計，該抗體最大程度地減少了鼠源胺基酸的數目，預期擁有更好的體內安全性和應用前景。
針對上述技術問題，從免疫原方面，本發明採用了鼠源細胞表達人CLDN18.2。一方面，作為宿主的鼠源細胞對小鼠不具備免疫原性或具有極低的免疫原性，從而避免了宿主細胞對目的免疫原CLDN18.2的遮蔽效應，避免因引入異源免疫原所導致的對CLDN18.2特異性融合瘤產生效率的不良影響；另一方面，以鼠源細胞表達人CLDN18.2可以實現膜表面表達，使篩選獲得的單株抗體特異性結合CLDN18.2的胞外區，確保了CLDN18.2特異性抗體的生物活性。
從篩選策略方面，本發明採用了正反向篩選相結合的策略。首先，利用表達人CLDN18.2的重組細胞進行正向篩選，獲得對其具有高親和力的單抗殖株；然後，對於能夠以高親和力結合人CLDN18.2重組細胞的抗體殖株，進一步利用表達人CLDN18.1的重組細胞進行反向篩選，反向篩選能排除特異性結合CLDN18.2、CLDN18.1共同胞外區結構的單抗。此外，本發明使用的免疫原、正向篩選抗原、反向篩選抗原採用的均是相同的鼠源細胞平台，不僅簡化了方法、避免了引入異種抗原，而且能夠通過反向篩選步驟消除因鼠源細胞對小鼠個體的同種異體抗原效應而產生的抗體，進一步提高特異性結合CLDN18.2之胞外區2的單株抗體製備效率。
本發明的另一目的是提供一種特異性結合人CLDN18.2的抗體或其片段，並提供其用途。其中，本發明所述的抗體的片段涵蓋抗體的各種功能性片段，例如其抗原結合部分，如Fab、F(ab’)2 或scFv片段。
本發明的技術方案如下。 一方面，本發明提供一種抗人密連蛋白18.2抗體的製備方法，包括： （1）利用表面表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞作為免疫原來免疫動物； （2）利用步驟（1）中經過免疫的動物來製備能產生抗體的細胞殖株； （3）利用表面表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞作為正向篩選抗原，篩選對該正向篩選抗原具有結合活性的抗體及產生該抗體的細胞； （4）利用表面表達人密連蛋白18.1蛋白的細胞作為反向篩選抗原，排除對該反向篩選抗原具有結合活性的抗體及產生該抗體的細胞。
較佳的，本發明之製備方法，該步驟（1）中表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞係源自與該被免疫動物相同的物種，較佳地，該表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞為小鼠細胞、該被免疫動物為小鼠。
較佳的，本發明之製備方法，該步驟（2）係以選自以下之技術製備能產生抗體的細胞殖株：融合瘤技術、及單細胞擴增技術。
較佳的，本發明之製備方法，該步驟（3）中的正向篩選抗原與步驟（1）中的免疫原相同；該步驟（4）中的反向篩選抗原與步驟（1）中免疫原的區別僅在於其所表達的蛋白為人密連蛋白18.1。
較佳的，本發明之製備方法，該步驟（3）、（4）採用選自以下的方法進行篩選：酶聯免疫法（ELISA）、及螢光共振能量轉移（FRET）。
另一方面，本發明更提供根據本發明之抗人密連蛋白18.2抗體的製備方法所獲得的抗人密連蛋白18.2抗體。
較佳的，本發明之抗人密連蛋白18.2抗體，其特異性結合人密連蛋白18.2的N端，較佳特異性結合人密連蛋白18.2 N端的胞外區，包括第一胞外環（Extracellular Loop 1，ECL1）。
較佳的，本發明之抗人密連蛋白18.2抗體，其對人CLDN18.2有nM級的特異性結合；並且，其對人CLDN18.1的結合與同種型陰性抗體或無關抗體相比無顯著差異。
另一方面，本發明提供一種抗體或其片段，該抗體或其片段包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），其中該重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）包含選自以下的CDR組合（VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3）： (1) 如SEQ ID NO: 31所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 35所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 36所示的VL-CDR3； (2) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR3； (3) 如SEQ ID NO: 43所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 44所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 45所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 47所示的VL-CDR3； (4) 如SEQ ID NO: 48所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 49所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 50所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 51所示的VL-CDR3； (5) 如SEQ ID NO: 52所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 53所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 54所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 55所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 56所示的VL-CDR3； (6) 如SEQ ID NO: 57所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 58所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 59所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 60所示的VL-CDR3； (7) 如SEQ ID NO: 61所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 62所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 63所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 64所示的VL-CDR3； (8) 如SEQ ID NO: 65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 66所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 67所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 68所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 69所示的VL-CDR3； (9) 如SEQ ID NO: 65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 70所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 71所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 72所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 73所示的VL-CDR3； (10) 如SEQ ID NO: 74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 75所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 77所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 78所示的VL-CDR3； (11) 如SEQ ID NO: 79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 80所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 82所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 83所示的VL-CDR3； (12) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR3； (13) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 86所示的VL-CDR3； (14) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 87所示的VL-CDR3； (15) 如SEQ ID NO: 74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 75所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 89所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 90所示的VL-CDR3；以及 (16) 如SEQ ID NO: 79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 91所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 92所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 93所示的VL-CDR3。
較佳地，在本發明所提供的抗體或其片段中，該重鏈可變區包含： SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 29中任一個所示之胺基酸序列、或與所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；及／或 該輕鏈可變區包含： 選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30中任一個所示之胺基酸序列、或與所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
根據本發明的具體實施方式，該抗體或其片段包含的重鏈可變區及輕鏈可變區係選自以下組合： (1) 如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (2) 如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (3) 如SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (4) 如SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (5) 如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (6) 如SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (7) 如SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (8) 如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (9) 如SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 18所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 18所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (10) 如SEQ ID NO: 19所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 19所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 20所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 20所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (11) 如SEQ ID NO: 21所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 21所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 22所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 22所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (12) 如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 24所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 24所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (13) 如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (14) 如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (15) 如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 28所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 28所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (16) 如SEQ ID NO: 29所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 29所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 30所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 30所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
本發明的上下文中，該至少75%同一性為例如至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、進一步更佳至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性等≥75%的任何百分比的同一性。
本發明提供的抗體或其片段可以為單株抗體、單鏈抗體、雙功能抗體、單域抗體、奈米抗體、完全或部分人源化的抗體或者嵌合抗體等任意形式，或者，該抗體或其片段為半抗體或半抗體的抗原結合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2 、Fab、Fab’、F(ab’)2 或Fv；關於本發明提供的抗體的片段，較佳地，該片段為抗體的能夠特異性結合人密連蛋白18.2的任何片段。 較佳地，該抗體或其片段更包含人或鼠的恆定區，較佳包含人或鼠的輕鏈恆定區（CL）及／或重鏈恆定區（CH）；
更佳地，該抗體或其片段包含選自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重鏈恆定區及／或κ或λ型輕鏈恆定區。
較佳地，該抗體為單株抗體，較佳為鼠源、嵌合或人源化的單株抗體；更佳地，該單株抗體的重鏈恆定區為IgG1或IgG4亞型，輕鏈恆定區為κ型； 根據本發明的具體實施方式，該單株抗體的重鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 124所示之胺基酸序列、或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； 根據本發明的具體實施方式，該單株抗體的輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 125所示胺基酸序列、或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
另一方面，本發明提供一種核酸分子，其編碼本發明之抗體或其片段、或者編碼該抗體或其片段中所包含的重鏈CDR、輕鏈CDR、輕鏈可變區、重鏈可變區、重鏈或輕鏈。
根據本發明的具體實施方式，該核酸分子編碼本發明之抗體或其片段中的重鏈可變區或輕鏈可變區，例如，該核酸分子包含如SEQ ID NOs: 96-125中任一個所示的核苷酸序列。
本發明的核酸分子可以被轉殖到載體中，進而轉化或轉染宿主細胞。因此，還一方面，本發明提供一種載體，其包含本發明的核酸分子。該載體可以為真核表達載體、原核表達載體、人工染色體及噬菌體載體等。
本發明的載體或核酸分子可以用於轉化或轉染宿主細胞或以任何方式進入宿主細胞內，用於保存或表達抗體等目的。因此，又一方面，本發明提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含本發明的核酸分子及／或載體，或者該宿主細胞被本發明的核酸分子及／或載體轉化或轉染。宿主細胞可以是任何原核或真核細胞，例如細菌或昆蟲、真菌、植物或動物細胞。
本發明提供的抗體可以利用本領域已知的任何方法獲得。例如，可以先由本發明提供的核酸分子獲得該抗體的重鏈可變區及／或輕鏈可變區，或者獲得該抗體的重鏈及／或輕鏈，然後與該抗體的任選其他結構域組裝成抗體；或者，在允許本發明提供的宿主細胞表達該抗體的重鏈可變區及／或輕鏈可變區或者該抗體的重鏈及／或輕鏈以組裝成該抗體的情況下，培養該宿主細胞。任選地，該方法還包括回收所產生的抗體的步驟。
本發明提供的抗體或其片段還可與其他部分結合，例如細胞表面受體、小分子化合物如胺基酸和糖類、小分子聚合物或對本發明之抗體進行修飾的任何其它部分，或者甚至是活性蛋白或多肽。因此，另一方面，本發明提供一種共軛物或融合蛋白，其包含本發明提供的抗體或其片段。例如，該共軛物或融合蛋白可以是包含本發明之抗體或其片段的雙特異性抗體。
本發明提供的抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞及／或共軛物或融合蛋白可以被包含在藥物組成物中，更特別地被包含在藥物製劑中，從而根據實際需要用於各種目的。因此，在又一方面，本發明還提供一種藥物組成物，所述藥物組成物包含本發明之抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞及／或共軛物或融合蛋白，以及視需要的藥學上可接受的輔料。
出於任何使用目的，本發明更提供一種試劑盒，該試劑盒包括本發明的抗體分子或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、藥物組成物及／或共軛物或融合蛋白。
另一方面，本發明提供上述抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、藥物組成物及／或共軛物或融合蛋白在製備用於預防及／或治療癌症的藥物中的用途。較佳地，該癌症選自胰腺癌、胃癌、結腸癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、膽囊癌和頭頸癌。
再一方面，本發明更提供該抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、藥物組成物及／或共軛物或融合蛋白在製備用於診斷癌症的試劑中的用途。較佳地，該癌症選自胰腺癌、胃癌、結腸癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、膽囊癌和頭頸癌。
另一方面，本發明更提供一種預防及／或治療癌症的方法，該方法包括給有此需要的受試者施用本發明的抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、藥物組成物及／或共軛物或融合蛋白，以及任選的其他藥物或手段。該任選的其他藥物或手段是指可以與本發明抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、藥物組成物及／或共軛物或融合蛋白聯合施用的其他藥物或手段，例如小分子化療藥、標靶藥、抗體等重組蛋白藥、疫苗、ADC、溶瘤病毒、基因和核酸治療藥物和放射療法。二者的聯合施用可以採取任意形式進行，例如同時、連續或間隔一定時間進行。
較佳地，該癌症選自胰腺癌、胃癌、結腸癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、膽囊癌和頭頸癌。較佳地，該受試者為哺乳類動物；更佳地，該受試者為人。
或者，本發明更提供一種診斷癌症的方法，該方法包括使本發明的抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、藥物組成物及／或共軛物或融合蛋白與來自受試者的樣品相接觸。較佳地，該癌症選自胰腺癌、胃癌、結腸癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、膽囊癌和頭頸癌。
較佳地，該受試者為哺乳類動物；更佳地，該受試者為人。
將本發明的抗人密連蛋白18.2抗體的編碼基因通過慢病毒載體轉導到原代健康供者的T細胞上，發現所製備的CART細胞能夠被表達人密連蛋白18.2的細胞有效活化。因此，還一方面，本發明更提供本發明的抗體或其片段、核酸分子、載體、宿主細胞、藥物組成物及／或共軛物或融合蛋白在製備CART細胞中的用途。
本發明提供了一種新型之能夠特異性結合人密連蛋白18.2的抗體。與現有抗人密連蛋白18.2抗體相比，本發明的抗體具有以下特點： 本發明提供的抗人密連蛋白18.2抗體對抗原密連蛋白18.2具有強親和力，對靶點表達細胞具有顯著的補體依賴性細胞毒性（CDC）活性和抗體依賴性細胞毒性（ADCC）活性，且該性質強於IMAB362或與其相當。此外，與IMAB362相比，本發明的抗體表現出與人CLDN18.2更高的特異性。
此外，將本發明的抗人密連蛋白18.2抗體的編碼基因通過慢病毒載體轉導到原代健康供者的T細胞上，製備CART細胞。經靶細胞刺激後，檢測CART細胞的表面活化蛋白CD25和分泌的IFNγ，發現製得的CART細胞能夠被表達人密連蛋白18.2的細胞有效活化，同樣證明了本發明的抗體與人CLDN18.2的靶點特異性。 定義
除非另有定義，本文中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。本文中所述的細胞和組織培養、分子生物學以及蛋白質、及寡核苷酸或多核苷酸化學及雜交中使用的命名和技術是本領域公知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養與轉化（如電穿孔、脂質轉染），使用了標準技術。酶促反應和純化技術係根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域所公知且本說明書中所引用及討論的多部綜合和較具體的文獻中所描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，紐約冷泉港(1989))。本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥學化學中使用的命名以及實驗室方法和技術是本領域所公知且普遍使用的。
術語「抗體」是指，是指通常由兩對多肽鏈（每對具有一條輕(L)鏈和一條重(H)鏈）所組成的免疫球蛋白分子。從一般意義上，重鏈可以理解為抗體中分子量較大的多肽鏈，輕鏈是指抗體中分子量較小的多肽鏈。輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈通常可分類為μ、δ、γ、α或ε，並且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區通過大約12或更多個胺基酸的「J」區連接，重鏈還包含大約3個或更多個胺基酸的「D」區。各重鏈由重鏈可變區（VH）和重鏈恆定區（CH）組成。重鏈恆定區由3個結構域（CH1、CH2和CH3）組成。各輕鏈由輕鏈可變區（VL）和輕鏈恆定區（CL）組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞（例如，效應細胞）和經典補體系統的第一組分（C1q）的結合。VH和VL區還可被細分為具有高變性的區域（稱為互補決定區（CDR）），其間散佈有較保守的稱為構架區（FR）的區域。各VH和VL由按照下列順序從胺基末端至羧基末端排列的3個CDR和4個FR所組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各重鏈／輕鏈對應的可變區（VH和VL）分別形成抗體結合部位。胺基酸至各區域或結構域的分配遵循Kabat EA. Et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest [National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 and 1991)]，或Chothia & Lesk 1987)]. Mol. Biol. 196: 901-917；Chothia等人(1989) Nature342:877-883的定義。特別地，重鏈還可以包含3個以上CDR，例如6、9或12個。例如在本發明的雙特異性抗體中，重鏈可以是IgG抗體的重鏈的N端連接另一個抗體的ScFv，這種情況下重鏈含有9個CDR。
術語抗體的「抗原結合片段」是指包含全長抗體之片段的多肽，其保持特異性結合至全長抗體所結合之相同抗原的能力，及／或與全長抗體競爭對抗原的特異性結合，其也被稱為「抗原結合部分」。通常參見Fundamental Immunology, Ch.7，Paul, W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其以其全文通過引用合併入本文，用於所有目的。可通過重組DNA技術或通過完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗體的抗原結合片段。在一些情況下，抗原結合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fd、Fv、dAb和互補決定區（CDR）片段、單鏈結合片段（例如，scFv）、嵌合抗體、雙抗體（diabody）和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。
術語「Fv」意指由抗體的單臂的VL和VH結構域所組成的抗體片段；術語「Fab」意指由VL、VH、CL和CH1（或者CH）結構域所組成的抗體片段；術語「F(ab’)2 」意指包含通過鉸鏈區上之二硫橋連接的兩個Fab片段的抗體片段。
在一些情況下，抗體的抗原結合片段是單鏈結合片段（例如，scFv），其中VL和VH結構域通過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子（參見，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883(1988)）。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的G4S胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(G4S)4接頭，但也可使用其變體（Holliger等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448）。
可使用本領域技術人員已知的常規技術（例如，重組DNA技術或酶促或化學斷裂法）從給定的抗體獲得抗體的抗原結合片段（例如，上述抗體片段），並且以與用於完整抗體之方式相同的方式，就特異性篩選抗體的抗原結合片段。
在本文中，除非上下文明確指出，否則當提及術語「抗體」時，其不僅包括完整抗體，而且包括抗體的抗原結合片段。
術語「分離的」或「被分離的」指的是，從天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種「分離」的物質或成分，那麼可能是其所處的天然環境發生了改變，或從天然環境下分離出該物質，或二者情況均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度之相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為分離的。術語「分離的」或「被分離的」不排除混有人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。
術語「宿主細胞」是指，可用於導入載體的細胞，其包括但不限於，如大腸桿菌等原核細胞，如酵母細胞等的真菌細胞，如S2果蠅細胞或Sf9等的昆蟲細胞，或者如纖維原細胞，CHO細胞，COS細胞，NSO細胞，HeLa細胞，BHK細胞，HEK 293細胞或人細胞等的動物細胞。
術語「KD」是指特定抗體一抗原相互作用的解離平衡常數（KD），其用於描述抗體與抗原之間的結合親和力。平衡解離常數越小，抗體一抗原結合越緊密，抗體與抗原之間的親和力越高。通常，抗體以小於大約10-5M，例如小於大約10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解離平衡常數結合抗原，例如，如使用表面等離子體共振術（SPR）在BIACORE儀中所測定的。例如用KINEXA方法KINEXA 400儀器上檢測到的抗體和細胞結合的親和力。
術語「特異性結合」指抗體與抗原的一種或多種抗原決定簇反應而不與其他多肽反應、或以很低的親和性（Kd＞10-6 ）結合其他多肽。抗體包括但不限於多株、單株、嵌合、dAb（結構域抗體）、單鏈、Fab、Fab’和F(ab’)2 片段、Fv、scFv及Fab表達庫。單株抗體（mAb）是由單一的選殖細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的選殖細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術及合成技術如CDR移植（grafting）或其它現有技術進行重組得到。
本發明所述的「鼠源抗體」為根據本領域知識和技能製備之對人CLDN18.2的單株抗體。製備時用CLDN18.2抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性之抗體的融合瘤。
本發明所述的「嵌合抗體」是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。
本發明所述的「人源化抗體」也稱為CDR移植抗體，是將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架（FR）中產生的抗體。此類可變區框架序列可以從公共的DNA資料庫或公開的參考文獻獲得，例如從ImMunoGeneTics(IMGT)網站http://imgt.cines.fr得到或從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語「CLDN18.2」包括同種型、哺乳動物（例如人）的CLDN18.2 、人CLDN18.2 的物種同源物和包含至少一個與CLDN18.2 的共同表位的類似物。CLDN18.2（例如人CLDN18.2）的胺基酸序列是本領域中己知的，如NCBI資料庫顯示。
術語「CLDN18.1」包括同種型、哺乳動物（例如人）的CLDN18.1、人CLDN18.1的物種同源物和包含至少一個與CLDN18.1的共同表位的類似物。CLDN18.1（例如人CLDN18.1）的胺基酸序列是本領域中己知的，如NCBI資料庫顯示。
「任選」、「任選地」、「任意」或「任一」意味著隨後所描述地事件或環境可以、但不必須發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，「任選包含1個抗體重鏈可變區」意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以、但不必須存在。
術語「藥物組成物」表示含有一種或多種本發明之化合物或其生理學上／可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學／可藥用的載體和賦形劑。藥物組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。治療性組成物一般應當是無菌的並且在製造和儲存條件下穩定。可以將組成物配製為溶液、微乳液、分散劑、脂質體或適合高抗體濃度的其他有序結構。可以通過將活性化合物（即抗體或抗體部分）以要求的量連同上文所列舉的一種成分或成分組合在適宜的溶劑中併入，根據需要，隨後過濾消毒，製備無菌可注射溶液劑。
本發明所述的方法、組成物、聯合治療可以與其他活性劑或治療方式併用，所述的方法包括向對象以有效治療或預防疾病（例如，癌症）的量，施用本發明之抗CLDN18.2 抗體分子，任選地，與PD-1 、PD-L1、PD-L2、LAG-3、CTLA-4、Tim-3抗體（免疫治療）或其它腫瘤治療抗體，Her-2、EGFR、VEGF、VEGFR抗體等，以及ADC（抗體藥物偶聯，如T-DM1），雙特異抗體，化療藥物等的一種或多種抑制劑的組合，還包括施用抗CLDN18.2抗體分子、額外的活性劑或全部可以按這樣的量或劑量施用，該量或劑量高於、低於或等於單獨（例如，作為單一療法）使用的每種活性劑的量或劑量。抗CLDN18.2抗體，額外的活性劑或全部的施用量或劑量比單獨（例如，作為單一療法）使用的每種活性劑的量或劑量低（例如，至少20%、至少30%、至少40%或至少50%）。
此外，本發明抗CLDN18.2抗體可以結合CLDN18.2誘導靶細胞（腫瘤細胞）凋亡，抑制腫瘤細胞生長，增加體內效應細胞對腫瘤細胞ADCC，CDC殺傷作用來達到治療癌症患者的目的。因此，在某些實施方案中，本發明所描述的抗CLDN18.2抗體分子通過這些機理顯示本發明抗體抗腫瘤效應。以及抑制腫瘤細胞生長的方法，包括將治療有效量的本發明中所述的抗CLDN18.2抗體分子施用於受試者。該方法適用於癌症的體內治療。為了獲得靶向特異性治療效果，抗CLDN18.2抗體分子可以與其它抗體一起施用。在將CLDN18.2抗體組合一種或多種活性劑施用時，該組合可以以任何順序或同時施用癌症類型，特別是CLDN18.2高表達的腫瘤患者。在某些方面中，提供在對象中治療對象（例如，減少或緩解）過度增生性病狀或疾病（例如，癌症），例如，實體瘤、血液學癌、軟組織腫瘤或轉移性病灶的方法。該方法包括向對象單獨、或與其他活性劑或治療方式組合地施用本發明之一種或多種抗CLDN18.2抗體分子。
術語「癌」、「癌症」、「癌症病人」意在包括全部類型的癌性生長物或致瘤過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，無論組織病理學類型或侵襲力階段是什麼。例子包括，但不限於實體瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。實體瘤的例子包括惡性腫瘤，例如，多個器官系統的肉瘤和癌（包括腺癌和鱗狀細胞癌），如侵襲肝、肺、乳腺、淋巴、胃腸道（例如，結腸）、生殖泌尿道（例如，腎、膀胱上皮細胞）、前列腺和咽的那些。腺癌包括惡性腫瘤，如大部分結腸癌、直腸癌、胃癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌中的非小細胞癌、小腸癌和食道癌。鱗狀細胞癌包括惡性腫瘤，如在肺、食道、皮膚、頭部和頸部區域、口腔、肛門和子宮頸中。前述癌的轉移性病灶也可以使用本發明之方法和組成物治療或預防。針對CLDN18.2的抗體分子可以與免疫原性劑如癌細胞、純化的腫瘤抗原（包括重組蛋白、肽和糖分子）、細胞和用編碼免疫剌激性細胞因子之基因轉染的細胞組合。
術語「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」（ADCC）描述了較佳需要靶細胞被抗體標記的效應細胞（特別是淋巴細胞）的細胞殺傷能力。當抗體與腫瘤細胞上的抗原結合並且抗體Fc結構域與免疫效應細胞表面上的Fc受體（FcR）接合時，較佳發生ADCC。已經鑒定了數個Fc受體家族，並且特定細胞群特徵性地表達限定的Fc受體。ADCC可被視為直接誘導導致抗原呈遞、和誘導腫瘤導向之T細胞應答之可變程度的立即腫瘤破壞的機制。較佳地，ADCC的體內誘導將導致腫瘤導向的T細胞應答和宿主源性抗體應答。
術語「補體依賴性細胞毒性」（CDC），是可由抗體指導的另一種細胞殺傷方法。IgM是補體啟動最有效的同種型。IgG1和IgG3二者在通過經典補體啟動途徑指導CDC方面也非常有效。較佳地，在該級聯反應中，抗原-抗體複合物的形成導致參與抗體分子（例如IgG分子）的CH2結構域上緊密接近的多個C1q結合位點暴露（C1q是補體C1的三種亞組分之一）。較佳地，這些暴露的C1q結合位點將先前低親和力的C1q-IgG相互作用轉化為高親合力相互作用，其觸發涉及一系列其他補體蛋白的級聯事件並導致效應細胞趨化／活化劑C3a和C5a的蛋白水解釋放。較佳地，補體級聯以形成膜攻擊複合物結束，該複合物在細胞膜中產生有利於水和溶質自由進入和離開細胞的孔。
令人吃驚地發現，以本文中抗CLDN18.2抗體製備的抗體-藥物共軛物能夠通過誘導補體依賴性細胞毒性（CDC）介導的裂解及／或抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC）介導的裂解來介導殺傷細胞，特別是表達CLDN18.2的細胞，例如癌細胞。因此，在一個實施方案中，本發明的抗體-藥物共軛物通過誘導補體依賴性細胞毒性（CDC）介導的裂解及／或抗體依賴性細胞的細胞毒性（ADCC）介導的裂解（較佳通過誘導CDC介導的裂解和ADCC介導的裂解）來介導細胞殺傷。
以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。其中： IMAB362的重鏈和輕鏈序列參見SEQ ID NO: 126和SEQ ID NO: 127。 抗原人CLDN18.2參見NP_001002026.1，抗原人CLDN18.1參見NP_057453.1。 附圖中的陰性對照Isotype control（同型對照）為抗CD33全長IgG抗體Lintuzumab。
實施例 1 ：鼠源單株抗體的篩選
使用細胞表面穩定表達人CLDN18.2蛋白的CHOK1細胞免疫Balb/c小鼠，1個月後用流式細胞儀術（FACS）分析小鼠血清，取血清抗體滴度高的小鼠取其脾臟，標準方法分離得到的脾細胞與骨髓瘤細胞P3X63Ag8.653使用PEG或者電融合方法進行融合。將融合後的融合瘤細胞接種於384孔板中，培養10-14天後，取上清液用FACS分析融合瘤細胞分泌的抗體，篩選得到若干殖株，該殖株能夠結合細胞表面穩定表達人CLDN18.2蛋白的CHOK1細胞而不能夠結合細胞表面穩定表達人CLDN18.1蛋白的CHOK1細胞。通過有限稀釋的方法將篩選到的殖株單細胞化，3輪之後得到的每個融合瘤細胞殖株只分泌一個抗體。
將分泌抗人CLDN18.2抗體的融合瘤細胞擴大培養後，按照RNAfast200試劑盒（上海飛捷生物技術有限公司）之說明書步驟提取細胞總RNA；利用5×PrimeScript RT Master Mix (Takara)將融合瘤細胞總RNA反轉錄成cDNA；使用退化性引子（Anke Krebber.1997）和Extaq PCR試劑（Takara）擴增抗體輕鏈可變區IgVL(κ)和重鏈可變區VH序列；利用PCR clean-up Gel extraction試劑盒（Macherey-Nagel公司）純化PCR擴增產物；按照pClone007 Simple Vector Kit試劑盒（擎科生物科技有限公司）之說明書將擴增PCR產物連接至T載體並轉化大腸桿菌感受態細胞，菌株擴增、抽提質體後進行DNA測序獲得單株抗體可變區序列。 表1. 鼠源抗體的輕重鏈可變區
鼠源抗體 重鏈可變區（VH） 輕鏈可變區（VL）
11M23 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2
16K15 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
18B21 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
20L17 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8
43B5 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10
43L6 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12
46J05 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14
48G12 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16
50C14 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18
52E22 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20
8K13 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22
＞11M23_vh (SEQ ID NO: 1) QVQLKESGPDLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVH WVRQPPGKGLEWLVVIWSDGRINYNSALKS RLSITKDNSKRQVFLKMNSLQIDDTAIYYCVRHPAFGPHAMDY WGQGISVTVSS ＞11M23_vl (SEQ ID NO: 2) DIVMTQDAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLY WFLQRPGQSPHLLLYRMSNPAS GAPDRFSGSGSGTEFTLRISRVEAEDVGVYYCMQYLEYPPT FGAGTRLELK ＞16K15_vh (SEQ ID NO: 3) EVMLVESGGGLVRPGGSLKLSCAGSGITLSTYAMS WVRQTPERRLEWVASIISGGITYYLDSVKG RFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAIYYCARKYHGNALDY WGQGTSVTVSL ＞16K15_vl (SEQ ID NO: 4) DIVMTQSPSSLPVTAGETVTMRCKSSQSLLNSGNQRNYLT WYQRKPGQPPKKLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISGVQAEDLAVYYCQNNYFYPLT FGAGTKLELK ＞18B21_vh (SEQ ID NO: 5) QIQMVQSGPELKKPGETVRISCKASGYSFTTAGMQ WVRKMPGEGLKWIGWIIAHSGEPKYTEDFKG RFAFSLETSASTTYLQISNLKNEDTATYFCARWGKGNTMDY WGQGTSVIVSS ＞18B21_vl (SEQ ID NO: 6) DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNGGNQRNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTHFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAYFFPLT FGAGTKLELK ＞20L17_vh (SEQ ID NO: 7) DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMH WVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYPDTVKG RFTVSRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCVRLGPRGNVMDH WGQGTSVTVSS ＞20L17_vl (SEQ ID NO: 8) DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQRNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNVYFYPLT FGTGTKLELR ＞43B5_vh (SEQ ID NO: 9) DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVSGYSISGAYNWH WIRQFPGNKLEWLAYMQYSGSSNYNPSFKS RISISRDTSKNQFFLQLKSVTTEDTATYYCARMYNGNSFLY WGQGTLVTVSA ＞43B5_vl (SEQ ID NO: 10) DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMNCKSSQSLFNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPRLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLSLYYCQNSYSYPLT FGAGTKLELK ＞43L6_vh (SEQ ID NO: 11) QVQLKESGPDLVAPSQSLSLTCSVSGFSLTSYGIH WVRQPPGKGLEWLVVIWSDGRTTYNSGLKS RLSISKDNSKSQVLLKMNSLRTDDTAIYYCVRHPAFGPHAMDY WGQGTSVTVSS ＞43L6_vl (SEQ ID NO: 12) DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLY WFLQRPGQSPQLLIYRMSNLAS GVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAGDVGVYYCMQYLEYPVT FGAGTKLELK ＞46J05_vh (SEQ ID NO: 13) DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSRFGMH WVRQAPKKGLEWVAYISSGSNTIYYADTVKG RFTISRDNPKNTLFLQTTSLRSEDTAIYYCGRLGFYGNSFDH WGQGTLVTVSA ＞46J05_vl (SEQ ID NO: 14) NILMTQSPSSLTVTAGEKVTMNCKSSQSLLNGGNQRNYLT WYQQKAGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFTGGGSGTDFTLTISSVQAEDLALYYCQNSYYYPLT FGAGTKLELK ＞48G12_vh (SEQ ID NO: 15) EVQLRQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYIIN WVKQKPGQGLEWIGYINPYNDDTRYNERVKG KATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARFYFGNSFTY WGQGTLVTVSA ＞48G12_vl (SEQ ID NO: 16) DIVMTQSPSSLPVTVGERVTMTCKSSQGLFNSGNQRNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNNYIYPLT FGAGTKLELK ＞50C14_vh (SEQ ID NO: 17) EVQLRQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYIIN WVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTRYNERVKG KATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARFHFGNSFTY WGQGTLVTVSA ＞50C14_vl (SEQ ID NO: 18) DIVMTQSPSSLPVTTGEKVTMTCKSSQGLFNNGNQRNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQNNYIFPLT FGAGTKLELK ＞52E22_vh (SEQ ID NO: 19) QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTLTNYGMN WVRQAPGKGLKWMGWIRPNTGEPTYAEDFKG RFVFSLETSAATAYLQITNLKSEDTSTYFCARLYRGNTLDN WGQGTSVIVSS ＞52E22_vl (SEQ ID NO: 20) DIVMTQSPSSLTVTTGEKVTMSCKSSQNLLNSGNQRNYLT WYQQKPGQSPKLLIYWASTRES GVPYRFTGSGSGTDFTLTISSVQTDDLAIYYCQNGYSFPFT FGSGTKLEIK ＞8K13_vh (SEQ ID NO: 21) QVHLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSNYWMN WVRQRPGQGLEWIGQIYPGNGDTKYSGKFNS KDTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYFCARFYYGNVMDY WGQGTSVTVSS ＞8K13_vl (SEQ ID NO: 22) DIVLTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQTLLNGGNQKNYLT WYQQKSGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNGYSYPLT FGVGTKLELK
實施例 2 ：抗人CLDN18.2嵌合抗體的製備
將鼠源抗人CLDN18.2單株抗體的重鏈可變區序列和公開發表的人單株抗體IgG1亞類的重鏈恆定區序列（參見SEQ ID NO: 124）拼接在一起，構建到哺乳動物細胞表達載體中；將鼠源抗人CLDN18.2單株抗體的輕鏈可變區序列和公開發表的人單株抗體κ亞類的輕鏈恆定區序列（參見SEQ ID NO: 125）拼接在一起，構建到哺乳動物細胞表達載體中。構建好的抗人CLDN18.2嵌合抗體的重鏈載體和輕鏈載體配對混合，使用聚乙烯亞胺（PEI）轉染HEK293細胞，約7天後收集細胞上清液，使用ProteinA純化得到抗人CLDN18.2嵌合抗體蛋白。
本發明的嵌合抗體命名為「鼠源抗體簡稱-xiIgG」。
實施例 3 ：抗人CLDN18.2嵌合抗體的體外細胞結合實驗
將抗人CLDN18.2嵌合抗體從100nM的起始濃度開始做2倍的梯度倍比稀釋，共16個濃度點，各個濃度點的抗體取10μl加入384孔板。100g室溫離心5分鐘收集細胞表面表達CLDN18.2的CHOK1細胞，用含0.5% BSA的PBS洗滌細胞一次，100g室溫離心5分鐘，重懸細胞為密度約2x106 個細胞／毫升，取10μl加入到已加抗體之384孔板的孔中。4℃孵育1小時後，加入螢光標記的羊抗人IgG二抗。繼續於4℃孵育1小時後，用流式細胞儀分析細胞群的平均螢光讀值。
結果顯示嵌合抗體與表達人CLDN18.2細胞有nM級別的特異結合，見圖1。
實施例 4 ：抗人CLDN18.2鼠源抗體的人源化
綜合卡巴特（Kabat）、喬西亞（Chothia）的抗體編碼方案，確定鼠源抗體的重鏈和輕鏈的6個抗原互補決定簇（CDR）的胺基酸序列區域、及支撐抗體保守三維構象的框架區域（framework region）。隨後通過分析搜索已知人源抗體序列，選擇與鼠源抗體最為相似接近的人源抗體重鏈可變區序列，如IGHV1|IGHJ4*01，選擇其抗體框架區序列作為範本，將鼠源抗體重鏈CDR與人源抗體框架區結合，最終生成人源化抗體重鏈可變區序列。同樣過程，生成人源化抗體輕鏈可變區序列。
鼠源抗體CDR直接移植至人框架區的抗體常出現結合活性急劇下降，因此需要將框架區個別胺基酸從人源的改回鼠源的。確定回復突變位點，一是對照設計好的人源化抗體序列和原始的鼠源抗體序列，檢查有哪些胺基酸的不同；二是檢查這些胺基酸是否對支援抗體結構起到重要作用或者對與抗原的結合起到重要作用。人源化設計後的序列的同時需要檢查是否有一些潛在的翻譯後修飾位點（PTM），如N（天門冬醯胺）糖基化位點、N脫醯胺化位點、D（天門冬胺酸）異構化位點等。
將人源化抗體重鏈可變區基因構建到含人單株抗體IgG1亞類的重鏈恆定區基因的哺乳動物細胞表達載體中；輕鏈可變區基因構建到含人單株抗體κ亞類的輕鏈恆定區基因的哺乳動物細胞表達載體中。構建好的抗人CLDN18.2人源化抗體的重鏈載體和輕鏈載體配對混合，使用聚乙烯亞胺（PEI）轉染HEK293細胞，約7天後收集細胞上清液，使用ProteinA純化得到抗人CLDN18.2人源化抗體蛋白。
本發明的人源化抗體命名為「鼠源抗體簡稱-hz」。鼠源抗體CDR直接移植至人框架區的抗體命名為「鼠源抗體簡稱-hz00」。進一步改造得到的抗體根據序列不同進行編號。
利用Fortebio (BLITZ pro1.1.0.28)儀器分析鼠源嵌合抗體及其人源化抗體與抗原人CLDN18.2的結合動力學參數。測定前先將NTA生物探針浸泡於PBS中10分鐘；然後將該探針置於含100nM的抗原的PBS中300秒，捕獲帶His標籤的抗原；進一步將探針與100nM抗體進行結合反應，結合時間400秒；之後將探針轉移至PBS中，進行解離反應，時間為600秒。實驗完畢，扣除空白對照回應值，用軟體進行1：1 Langmuir結合模式擬合，計算抗原抗體結合的動力學常數。結果見表2。 表2. 鼠源抗體人源化後的結合動力學參數比較
抗體名（Ab ID） 翻譯後修飾位點（PTM） 回應 親和力常數（KD ）(M) 結合常數（Kon ） 解離常數（koff ）(s-1 ) Koff /
(1/Ms) Koff (Xi-IgG)
8K13-xiIgG 有 0.134 3.82E-10 2.98E+05 1.14E-04 1.00
8K13-hz00 有 0.133 7.44E-10 2.66E+05 1.98E-04 1.74
8K13-hz11 有 0.139 2.97E-10 2.27E+05 6.73E-05 0.59
8K13-hz24 無 0.133 1.51E-09 2.64E+05 3.99E-04 3.50
11M23-xiIgG 有 0.184 2.93E-10 3.66E+05 1.07E-04 1.00
11M23-hz00 有 0.164 1.49E-09 2.18E+05 3.24E-04 3.03
11M23-hz11 有 0.174 1.29E-09 3.56E+05 4.60E-04 4.30
11M23-hz22 無 0.136 2.92E-09 6.70E+05 1.95E-03 18.22
16K15-xiIgG 有 0.261 5.57E-10 2.76E+05 1.54E-04 1.00
16K15-hz00 有 0.176 8.95E-11 2.40E+05 2.15E-05 0.14
16K15-hz11 有 0.17 5.35E-10 1.88E+05 1.00E-04 0.65
16K15-hz22 無 0.266 1.10E-09 2.59E+05 2.86E-04 1.86
52E22-xiIgG 有 0.223 9.96E-11 3.57E+05 3.55E-05 1.00
52E22-hz00 有 0.188 3.09E-10 1.98E+05 6.11E-05 1.72
52E22-hz11 有 0.238 5.42E-10 3.63E+05 1.97E-04 5.55
52E22-hz12 無 0.226 3.60E-10 2.18E+05 7.83E-05 2.21
結果顯示，人源化並移除了關鍵的翻譯後修飾位點（PTM）後，11M23-hz22相對鼠源嵌合抗體，解離常數值上升了10倍以上，因此將其從候選分子名單中去除。其餘的8K13-hz24、16K15-hz22和52E22-hz12的解離常數值與原始鼠源嵌合抗體相比，上升幅度在1-4倍之間，可以選做先導分子繼續開展後續的研究。其中16K15-hz22輕鏈胺基酸序列中包含2個連續的「NN」殘基，做了進一步優化的16K15-hz22_2和16K15-hz22_3突變抗體，分別將「NN」殘基變為「SN」和「QN」殘基。 表3. 人源化抗體的輕重鏈可變區
鼠源抗體 人源化的輕鏈可變區 人源化的重鏈可變區 人源化抗體
16K15 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 129 16K15-hz00
SEQ ID NO: 128，同時在第52位和89位具有回復突變 SEQ ID NO: 129，同時在第24位具有回復突變 16K15-hz11
SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 23 16K15-hz22
SEQ ID NO: 25 16K15-hz22_2
SEQ ID NO: 26 16K15-hz22_3
52E22 SEQ ID NO: 130 SEQ ID NO: 131 52E22-hz00
SEQ ID NO: 130，同時在第89位具有回復突變 SEQ ID NO: 27 52E22-hz11
SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 27 52E22-hz12
8K13 SEQ ID NO: 132 SEQ ID NO: 133 8K13-hz00
SEQ ID NO: 132，同時在第4位和第89位具有回復突變 SEQ ID NO: 133，同時在第74位和第77位具有回復突變 8K13-hz11
SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 29 8K13-hz24
11M23 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 84 11M23-hz00
SEQ ID NO: 88，同時在第41位具有回復突變 SEQ ID NO: 84，同時在第71位具有回復突變 11M23-hz11
SEQ ID NO: 88，同時在第41位具有回復突變，第31位和第33位N-S SEQ ID NO: 84，同時在第71位具有回復突變，第54位D-E和第60位N-Q 11M23-hz22
＞16K15_vl_hz2（SEQ ID NO: 24） DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSGNQRNYLT WYQQKPGQPPKKLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQNNYFYPLT FGQGTKLEIK ＞16K15_vl_hz2_N-S（SEQ ID NO: 25） DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSGNQRNYLT WYQQKPGQPPKKLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQSNYFYPLT FGQGTKLEIK ＞16K15_vl_hz2_N-Q（SEQ ID NO: 26） DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLSSGNQRNYLT WYQQKPGQPPKKLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQQNYFYPLT FGQGTKLEIK ＞16k15_vh_hz2（SEQ ID NO: 23） EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGITLSTYAMS WVRQAPGKGLEWVSSIISGGITYYLDSVKG RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARKYHGNALDY WGQGTLVTVSS ＞52E22_vl_hz2（SEQ ID NO: 28） DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNLLSSGNQRNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQQGYSFPFT FGQGTKLEIK ＞52E22_vh_hz1（SEQ ID NO: 27） QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTLTNYGMN WVRQAPGQGLEWMGWIRPNTGEPTYAEDFKG RFVFSLDTSVATAYLQITSLKAEDTAVYYCARLYRGNTLDN WGQGTLVTVSS ＞8K13_vl_hz4_N-S_N-Q（SEQ ID NO: 30） DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTLLSGGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQQGYSYPLT FGQGTKLEIK ＞8K13_vh_hz2（SEQ ID NO: 29） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYWMN WVRQAPGQGLEWMGQIYPGSGDTKYSGKFQS RVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARFYYGNVMDY WGQGTLVTVSS
實施例 5 ：抗人CLDN18.2人源化抗體的體外結合親和力的動力學實驗
採用GE公司BIAcore儀器S200測定抗體抗原相互作用力。
參考GE公司Human antibody capture kit（貨號BR-1008-39，Lot10261753）之操作說明，首先在傳感晶片CM5分析通道和對照樣品通道都飽和地偶聯最大量之抗人Fc抗體，然後在分析通道流過含有7.5μg/ml抗人CLDN18.2嵌合抗體、人源化抗體或對照抗體IMAB362的緩衝液使其均勻分佈，最後在分析通道和對照樣品通道一起流過經梯度稀釋的抗原樣品（起始濃度20nM，1:3稀釋8個濃度點，並且設定0.741nm濃度點重複），測定抗體抗原結合後發生的光反應值。經儀器軟體擬合分析，最終得到抗體的結合常數Kon 和解離常數Koff ，以及親和力常數KD。
結果表明，抗人CLDN18.2人源化抗體的體外結合親和力常數與原始鼠源抗體相比沒有顯著的改變，與IMAB362相比低了1個數量級，見表4。 表4. 本發明抗體的結合動力學
抗體 結合速率常數（ka）(M-1s-1) 解離速率常數（kd）(s-1) 親和力常數（KD）(M)
8K13-xiIgG 8.19E+04 5.73E-04 6.99E-09
8K13-hz24 7.09E+04 2.02E-03 2.85E-08
16K15-xiIgG 1.07E+05 1.44E-03 1.35E-08
16K15-hz22 5.71E+04 5.63E-04 9.85E-09
52E22-xiIgG 4.90E+05 5.45E-04 1.11E-09
52E22-hz12 1.46E+05 1.72E-04 1.18E-09
IMAB362 1.48E+06 0.201 1.36E-07
實施例 6 ：抗人CLDN18.2人源化抗體的體外細胞學試驗
6.1 補體依賴性細胞毒性（CDC）
使用Quidel公司的商品化人血清全補體對本發明人源化抗體進行分析，分析其對穩定表達人CLDN18.2的CHOK1、BxPC3和NCI-N87細胞誘導補體依賴性細胞毒性（CDC）的能力。
將細胞與終濃度為250μg/ml至3.8ng/ml的待測抗體混勻；加入溶於細胞培養基RPMI-1640中的6.25%人血清全補體，在37℃下孵育3小時；然後通過CCK-8試劑盒進行細胞毒性檢測；最終通過MD酶標儀檢測450nm吸光度。通過吸光值採用softmax pro7軟體進行4參數擬合曲線，計算樣品的EC50值。
結果表明，抗人CLDN18.2人源化抗體針對靶點表達細胞有特異的補體依賴性細胞毒性（CDC）活性，並且細胞殺傷活性顯著優於IMAB362，見圖2和表5。 表5. 本發明抗體的CDC
靶點表達細胞 a.    CHOK1 b.   BxPC3 c.    NCI-N87
抗體 EC50 (nM) EC50 (nM) EC50 (nM)
8K13-hz24 IgG 21.27 28.53 57.7
16K15-hz22 IgG 5.2 12.22 17.36
52E22-hz12 IgG 2.08 NA NA
IMAB362 30.45 52.23 474.2
6.2 抗體依賴性細胞毒性（ADCC）
使用工程改造的Jurkat細胞作為效應細胞，該細胞穩定表達FcγRIIIa-FcεRIaγ雜合受體，由NFAT應答元件驅動表達螢火蟲螢光素酶。抗體在ADCC作用機制中的生物活性通過NFAT通路活化產生的螢光素酶定量。將1.5E5個效應細胞與終濃度為33μg/ml至85pg/ml的待測抗體混勻，然後將2.5E4個靶細胞加入其中（效應細胞與靶細胞E:T比例6:1），在37℃下孵育16小時；然後通過Promega公司試劑盒Bio-Glo™ Luciferase Assay System進行檢測；最終通過MD酶標儀檢測LUM值。
資料處理方式如下，誘導倍數=（受檢孔讀值–背景值）／（陰性對照孔讀值–背景值），用prism軟體進行4參數擬合曲線，計算出樣品的EC50值。
結果表明，抗人CLDN18.2人源化抗體針對靶點表達細胞有特異的抗體依賴性細胞毒（ADCC）活性，細胞殺傷活性與IMAB362相當，見圖3和表6。 表6. 本發明抗體的ADCC
靶點表達細胞 a.    CHOK1 b.   BxPC3 c.    NCI-N87
抗體 EC50（nM） EC50（nM） EC50（nM）
8K13-hz24 IgG 0.5894 0.3045 0.1499
16K15-hz22 IgG 0.7122 0.1759 0.0677
52E22-hz12 IgG 0.5672 NA NA
IMAB362 0.5929 0.1056 0.0909
實施例 7 ：抗人CLDN18.2人源化抗體的同簇蛋白結合特徵分析
將人CLDN18.2和CLDN18.1的基因分別構建到真核表達載體中，使用聚乙烯亞胺（PEI）轉染HEK293細胞。轉染後第三天離心收集細胞，用PBS洗滌細胞1次，重懸細胞密度為2×106 /ml，每個384孔板中加入10μl的細胞；第二步往384孔板中加入不同濃度的人源化抗體，4℃孵育1小時；第三步加入螢光標記的羊抗人IgG二抗，4℃孵育1小時；使用流式細胞儀讀取384孔板的螢光值。分析資料獲得細胞與抗人CLDN18.2人源化抗體的結合特徵。實驗用的陽性對照為商品化抗人CLDN18兔單抗34H14L15（購自Abcam公司），陰性同型對照（Isotype control）為抗CD33全長IgG抗體Lintuzumab。
結果表明，抗人CLDN18.2人源化抗體表現出結合人CLDN18.2而不結合人CLDN18.1的特徵，見圖4；並且，在低、中、高三種濃度下與人CLDN18.1細胞的非特異結合均比IMAB362低，見圖5。
實施例 8 ：抗人CLDN18.2人源化抗體的人、猴、鼠種屬交叉結合特徵分析
將人、鼠和恆河猴（Rhesus）的CLDN18.2基因分別構建到真核表達載體中，使用聚乙烯亞胺（PEI）轉染HEK293細胞，2天後收集細胞。使用流式細胞儀術分析細胞與抗人CLDN18.2人源化抗體的結合特異性。流式細胞實驗方法參見實施例7。
結果表明，抗人CLDN18.2人源化抗體16K15-22 IgG和三個種屬的CLDN18.2均有結合，8K13-24 IgG和52E22-12 IgG與猴子的CLDN18.2結合但不與小鼠的CLDN18.2結合。結果見圖6。
實施例 9 ：採用抗人CLDN18.2人源化抗體的CART細胞製備及其活化
9.1 慢病毒包裝
按照表7分組情況，進行慢病毒包裝。首先構建了包含不同抗體基因的慢病毒載體質體pLTR，測序正確以後使用Qiagen公司的質體抽提試劑盒提取它們的質體DNA，質體DNA溶於除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提取之質體DNA的A260/A280在1.8～2.0之間。同時提取兩種輔助包裝元件載體質體pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.2的DNA。準備轉染用的HEK293T細胞，需新鮮繼代，生長至約60%的匯合度。使用磷酸鈣作為轉染試劑將3種質體共轉入HEK293T細胞。轉染48小時後，低溫離心收集含有包裝好病毒的細胞上清液，使用0.45μm的篩檢程式去除細胞碎片。使用超濾離心管對病毒進行濃縮換液，分裝後保存在-80℃冰箱。取少量病毒濃縮液用FACS法測定病毒滴度。 表7. 慢病毒分組
編號 病毒 病毒滴度 組別
135 LV-135.N 8.75E+06 陰性對照
417 LV-417.N 1.65E+07 16k15 (16K15-hz22) scfv*
418 LV-418.N 1.38E+07 52E22 (52E22-hz12) scfv*
419 LV-419.N 5.13E+07 8K13 (8K13-hz24) scfv*
420 LV-420.N 1.50E+07 陽性對照
表7中陰性對照是不結合CLDN18.2的其他抗體，陽性對照是科濟生物hu8E5抗體（參見WO2018006882A1）。*所示單鏈抗體為相應的人源化VH、VL通過短肽（GSTSGGGSGGGSGGGGSS）連接形成。
9.2 CART細胞製備
選擇HBV、HCV和HIV檢測陰性的健康提供者，於肘正中靜脈抽血100ml，Ficoll密度梯度離心分離PBMC白膜層，按DynaBeads CD3/CD28（Lifetechnologies，貨號：40203D）與CD3+ T細胞為3:1之比例，分離CD3+ T細胞，活化24小時後流式檢測CD25+CD69+T細胞比例。CD3+T活化後，進行慢病毒轉導，MOI為5。用Novonectin塗覆24孔板，於37℃孵育2小時，將上述操作後所得到的細胞懸浮液分別與製備所得到的各種慢病毒（MOI=5）、Synperonic® F108（Sigma，貨號：07579-250G-F）、Tscm（2U/ml）配製成轉導體系置於塗覆的24孔板中，細胞密度調整至1.0E+06/ml，500g離心30分鐘，離心後於37℃ CO2 培養箱靜置培養48小時。轉染後以含5% FBS X-vivo15之培養液（LONZA，貨號：04-418Q）培養，隔日補充Tscm（終濃度2U/ml），計數細胞，調整細胞密度至0.5E+06/ml，培養至第8-10天收穫細胞。
得到的各組CART細胞的陽性率檢測結果見圖7。
9.3 CART細胞活化
用CHO構建表達人CLDN18.1抗原和人CLDN18.2抗原的細胞，作為靶細胞。
細胞的相關抗原表達檢測結果見圖8。CHO-BLANK（空白對照）、CHO-CLDN18.1無CLDN18.2抗原的表達，CHO-CLDN18.2高表達CLDN18.2抗原。
於1.5mL的離心管中將上述調整好密度的效應細胞，包括各組CAR-T細胞和未轉導之慢病毒T細胞，分別與靶細胞混合，效應細胞與靶細胞的比例為16:1，用T細胞培養液X-vivo15培養液（不含自體血清以及Tscm）將總體積補足至200μL；將配製的200μL體系分別移入96孔V型板中共孵育24小時。
孵育結束後，取各組培養體系的上清液檢測人IFNγ。發現417組CART與CHO-CLDN18.1以及CHO-CLDN18.2孵育後，IFNγ釋放顯著增加，418、419、420組CART僅與CHO-CLDN18.2孵育後，IFNγ釋放增加。結果見表8和圖9。 表8. 培養體系的上清中檢測到的人IFNγ
組別 T: CHO-BLANK T: CHO-密連蛋白18.1 T: CHO-密連蛋白18.2
nc 1020.1 912 1095.2
135 1441.2 1458.6 1877
417 9016 60328.2 79178.6
418 3940.8 4540 78903.4
419 4486.2 4670.6 75516.8
420 7381.1 6973.2 78247
取各組CART細胞檢測T細胞活化標誌蛋白CD3/CD25。發現417 CART與CHO-CLDN18.1以及CHO-CLDN18.2孵育後，CD25表達上調，418、419、420 CART僅與CHO-CLDN18.2孵育後，CD25表達上調。見圖10。
本專利申請要求於2019年9月29日提交之申請號為CN201910929614.0的中國發明專利申請案的優先權權益，在此將其全部內容引入作為參考。
以上對本發明具體實施方式的描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附申請專利範圍的範圍。
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中： 圖1顯示了抗人CLDN18.2嵌合抗體的體外細胞結合實驗結果。 圖2顯示了抗人CLDN18.2人源化抗體的補體依賴性細胞毒性（CDC）實驗結果，其中2A：CHOK1；2B：BxPC3；2C：NCI-N87。 圖3顯示了抗人CLDN18.2人源化抗體的抗體依賴性細胞毒性（ADCC）實驗結果，其中3A：CHOK1；3B：BxPC3；3C：NCI-N87。 圖4顯示了抗人CLDN18.2人源化抗體的同族蛋白結合特徵分析結果。 圖5顯示了抗人CLDN18.2人源化抗體在不同濃度下與人CLDN18.1表達細胞的結合情況。 圖6顯示了抗人CLDN18.2人源化抗體的種屬交叉結合特徵分析結果。 圖7顯示了製備的各組CART細胞的陽性率檢測結果。 圖8顯示了構建的各CHO細胞株的不同抗原表達情況。 圖9顯示了各組CART細胞與靶細胞孵育後上清液中IFN-γ檢測結果。 圖10顯示了各組CART細胞與靶細胞孵育後CD25表達的檢測結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Claims (22)

  1. 一種抗人密連蛋白（Claudin；CLDN）18.2抗體的製備方法，其包括： （1）利用表面表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞作為免疫原來免疫動物； （2）利用步驟（1）中經過免疫的動物來製備能產生抗體的細胞殖株； （3）利用表面表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞作為正向篩選抗原，篩選對該正向篩選抗原具有結合活性的抗體及產生該抗體的細胞； （4）利用表面表達人密連蛋白18.1蛋白的細胞作為反向篩選抗原，排除對該反向篩選抗原具有結合活性的抗體及產生該抗體的細胞。
  2. 如請求項1之製備方法，其中，該步驟（1）中表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞係源自與該被免疫動物相同的物種，較佳地，該表達人密連蛋白18.2蛋白的細胞為小鼠細胞、該被免疫動物為小鼠。
  3. 如請求項1之製備方法，其中，該步驟（2）係以選自以下之技術製備能產生抗體的細胞殖株：融合瘤技術、及單細胞擴增技術。
  4. 如請求項1之製備方法，其中，該步驟（3）中的正向篩選抗原與步驟（1）中的免疫原相同；該步驟（4）中的反向篩選抗原與步驟（1）中免疫原的區別僅在於其所表達的蛋白為人密連蛋白18.1。
  5. 如請求項1之製備方法，其中，該步驟（3）、（4）採用選自以下的方法進行篩選：酶聯免疫法（ELISA）、及螢光共振能量轉移（FRET）。
  6. 一種以請求項1至6中任一項之製備方法所獲得的抗人密連蛋白18.2抗體。
  7. 如請求項6之抗人密連蛋白18.2抗體，其特異性結合人密連蛋白18.2的N端，較佳係特異性結合人密連蛋白18.2之N端的胞外區，包括第一胞外環（Extracellular Loop 1，ECL1）。
  8. 如請求項6之抗人密連蛋白18.2抗體，其對人密連蛋白18.2有nM級的特異性結合；並且，其對人密連蛋白18.1的結合與同種型陰性抗體或無關抗體相比無顯著差異。
  9. 一種抗體或其片段，該抗體或其片段包含重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL），其中該重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）包含選自以下的CDR組合（VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3）： (1) 如SEQ ID NO: 31所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 32所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 35所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 36所示的VL-CDR3； (2) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR3； (3) 如SEQ ID NO: 43所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 44所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 45所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 47所示的VL-CDR3； (4) 如SEQ ID NO: 48所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 49所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 50所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 40所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 51所示的VL-CDR3； (5) 如SEQ ID NO: 52所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 53所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 54所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 55所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 56所示的VL-CDR3； (6) 如SEQ ID NO: 57所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 58所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 33所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 34所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 59所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 60所示的VL-CDR3； (7) 如SEQ ID NO: 61所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 62所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 63所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 46所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 64所示的VL-CDR3； (8) 如SEQ ID NO: 65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 66所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 67所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 68所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 69所示的VL-CDR3； (9) 如SEQ ID NO: 65所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 70所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 71所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 72所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 73所示的VL-CDR3； (10) 如SEQ ID NO: 74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 75所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 77所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 78所示的VL-CDR3； (11) 如SEQ ID NO: 79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 80所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 82所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 83所示的VL-CDR3； (12) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 42所示的VL-CDR3； (13) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 86所示的VL-CDR3； (14) 如SEQ ID NO: 37所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 38所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 39所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 85所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 87所示的VL-CDR3； (15) 如SEQ ID NO: 74所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 75所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 76所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 89所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 90所示的VL-CDR3；以及 (16) 如SEQ ID NO: 79所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO: 91所示的VH-CDR2、如SEQ ID NO: 81所示的VH-CDR3；如SEQ ID NO: 92所示的VL-CDR1、如SEQ ID NO: 41所示的VL-CDR2、如SEQ ID NO: 93所示的VL-CDR3。
  10. 如請求項6至9中任一項之抗體或其片段，其中，該重鏈可變區包含： SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 27及SEQ ID NO: 29中任一個所示之胺基酸序列、或與所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；及／或 該輕鏈可變區包含： SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 30中任一個所示之胺基酸序列、或與所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
  11. 如請求項6至10中任一項之抗體或其片段，其中，該抗體或其片段包含的重鏈可變區及輕鏈可變區係選自以下組合： (1) 如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (2) 如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 4所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (3) 如SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 5所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 6所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (4) 如SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 7所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 8所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (5) 如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 9所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (6) 如SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 12所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (7) 如SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (8) 如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 16所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (9) 如SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 18所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 18所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (10) 如SEQ ID NO: 19所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 19所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 20所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 20所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (11) 如SEQ ID NO: 21所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 21所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 22所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 22所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (12) 如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 24所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 24所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (13) 如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 25所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (14) 如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 23所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 26所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (15) 如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 27所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 28所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 28所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； (16) 如SEQ ID NO: 29所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 29所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列；以及，如SEQ ID NO: 30所示之胺基酸序列、或與如SEQ ID NO: 30所示之胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
  12. 如請求項6至11中任一項之抗體或其片段，其中，該抗體或其片段為單株抗體、單鏈抗體、雙功能抗體、單域抗體、奈米抗體、完全或部分人源化的抗體或者嵌合抗體等任意形式，或者，該抗體或其片段為半抗體或半抗體的抗原結合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2 、Fab、Fab’、F(ab’)2 或Fv； 較佳地，該抗體或其片段更包含人或鼠的恆定區，較佳包含人或鼠的輕鏈恆定區（CL）及／或重鏈恆定區（CH）； 更佳地，該抗體或其片段包含選自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重鏈恆定區及／或κ或λ型輕鏈恆定區。
  13. 如請求項6至12中任一項之抗體或其片段，其中，該抗體為單株抗體，較佳為鼠源、嵌合或人源化的單株抗體；較佳地，該單株抗體的重鏈恆定區為IgG1或IgG4亞型，輕鏈恆定區為κ型； 較佳地，該單株抗體的重鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 124所示之胺基酸序列、或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列； 較佳地，該單株抗體的輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO: 125所示之胺基酸序列、或者與該胺基酸序列具有至少75%同一性的胺基酸序列。
  14. 一種核酸分子，其編碼請求項6至13中任一項之抗體或其片段，或者編碼該抗體或其片段中所包含的重鏈CDR、輕鏈CDR、輕鏈可變區、重鏈可變區、重鏈或輕鏈。
  15. 一種載體，其包含請求項14之核酸分子。
  16. 一種宿主細胞，該宿主細胞包含請求項14之核酸分子及／或請求項15之載體，或者該宿主細胞被請求項14之核酸分子及／或請求項15之載體轉化或轉染。
  17. 一種共軛物或融合蛋白，該共軛物或融合蛋白包含請求項6至13中任一項之抗體或其片段。
  18. 一種藥物組成物，其包含請求項6至13中任一項之抗體或其片段、請求項14之核酸分子、請求項15之載體、請求項16之宿主細胞及／或請求項17之共軛物或融合蛋白，以及視需要的藥學上可接受的輔料。
  19. 一種試劑盒，該試劑盒包括請求項6至13中任一項之抗體或其片段、請求項14之核酸分子、請求項15之載體、請求項16之宿主細胞、請求項17之共軛物或融合蛋白及／或請求項18之藥物組成物。
  20. 一種使用請求項6至13中任一項之抗體或其片段、請求項14之核酸分子、請求項15之載體、請求項16之宿主細胞、請求項17之藥物組成物或請求項18之共軛物或融合蛋白在製備用於預防及／或治療癌症之藥物中的用途。
  21. 一種使用請求項6至13中任一項之抗體或其片段、請求項14之核酸分子、請求項15之載體、請求項16之宿主細胞、請求項17之藥物組成物或請求項18之共軛物或融合蛋白在製備用於診斷癌症之試劑中的用途。
  22. 一種使用請求項6至13中任一項之抗體或其片段、請求項14之核酸分子、請求項15之載體、請求項16之宿主細胞、請求項17之藥物組成物或請求項18之共軛物或融合蛋白在製備CART細胞中的用途。
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