CN110606891A

CN110606891A - 一种针对人cldn18.2的新型抗体分子, 抗原结合片段及其医药用途

Info

Publication number: CN110606891A
Application number: CN201810610790.3A
Authority: CN
Inventors: 刘佳建
Original assignee: Shanghai Jian Xin Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Jian Xin Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-17
Filing date: 2018-06-17
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2038-06-17
Also published as: CN110606891B

Abstract

本发明公开了一种抗人CLDN18.2抗体、其抗原结合片段及其医药用途。具体地，本发明涉及包含所述抗人CLDN18.2抗体CDR区的鼠源抗体，嵌合抗体、人源化抗体，全人源化抗体，包含所述抗体及其抗原结合片段的抗体依赖细胞毒性（ADCC），补体依赖细胞毒性（CDC），针对CLDN18.2阳性细胞的杀伤作用，抑制CLDN18.2阳性肿瘤生长作用，体内药效，以及包含所述抗人CLDN18.2抗体及其抗原结合片段的药物及其组合物，及其在肿瘤治疗中的用途，尤其是对CLDN18.2阳性肿瘤患者的治疗。

Description

一种针对人CLDN18.2的新型抗体分子, 抗原结合片段及其医药用途

技术领域

本发明涉及一种人CLDN18.2抗体，CLDN18.2抗原结合片段，包含所述CLDN18.2抗体CDR区的鼠源抗体，鼠源抗体可变区和人抗体恒定区组成的嵌合抗体、人源化抗体，全人源化抗体，包含所述抗体及其抗原结合片段的抗体依赖细胞毒性（ADCC），和补体依赖细胞毒性（CDC）作用。包含所述抗体及其抗原结合片段的药物组合，以及其对肿瘤细胞, 特别是CLDN18.2 高表达（CLDN18.2 阳性）肿瘤细胞的杀伤作用，动物体内药效活性，以及其单独或药物组合物作为抗癌药物的用途，特别是对CLDN18.2过表达肿瘤患者的治疗。

背景技术

癌症是人类健康的巨大威胁，也是疾病领域导致死亡的重要原因之一。癌症治疗在经历手术，化疗，靶向药物，肿瘤免疫治疗，联合治疗等各阶段的发展，近年已经取得了巨大成就。在众多的癌症患者中，肺癌，胃癌，胰腺癌，食道癌，卵巢癌等癌症患者的治疗手段仍然是高度未满足的需求。针对这些肿瘤的治疗手段，包括大分子靶向药物，比如新的单克抗体，以及这些单克隆抗体和已有的肿瘤免疫治疗手段，包括免疫检查点抑制剂PD-1，PD-L1抗体联合治疗，为临床巨大的未满足的治疗需求提供了新的可能和选择。

细胞连接密蛋白（Claudin or CLDN）在人、鼠等物种都有表达，是细胞间层密封关联蛋白，控制对细胞层间离子流，维持细胞极性和细胞间信号转递具有重要作用。该家族蛋白早在1998年已经被研究报道（Furuse M, Fujita K et al. J Cell Biol. 1998,141:1539-50; Tsukita S and Furuse M, 2000. J. Cell Biol. 149,13-16）。CLND是巨大的蛋白家族，在细胞连接中发挥重要作用，和细胞迁移，病变，肿瘤浸润转移相关。CLDN家族蛋白已经发现的有29种之多，CLDN18就是其中之一。CLDN18有两个同源分子，分别称为密蛋白18.1 (CLDN18.1) 和密蛋白18.2 (CLDN18.2)。人密蛋白18.1 (hCLDN18.1) 和人密蛋白18.2 (hCLDN18.2)高度同源，氨基酸同源性高达92%。CLDN在不同组织中表达各有不同，hCLDN18.1在正常组织有表达，而hCLDN18.2则在肿瘤组织表达并和肿瘤形成有关，特别是胃癌相关（Sanada Y. et al. Down-regulation of the claudin-18 gene, identifiedthrough serial analysis of gene expression data analysis, in gastric cancerwith an intestinal phenotype. J Pathol. 2006: 208(5), 633-42.）。CLDN18.2在正常组织表达非常有限，仅见于胃黏膜分化上皮细胞，但在胃癌，包括转移胃癌组织有特别的高表达（Sahin U. et al. Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer targetsuitable for therapeutic antibody delveopment. Clin Cancer Res. 2008; 14(23):7642-34）。进一步发现，CLDN18.2在不同癌症患者组织都有表达，包括大约70%的胃癌、50%的胰腺癌，30%的食道癌、25%的肺癌、卵巢癌等。

因此，CLDN18.2早已经成为理想的肿瘤患者标记物和抗肿瘤药物开发靶点，特别是抗CLDN18.2抗体开发用于肿瘤治疗，满足患者，特别是胃癌病人、胰腺癌，食道癌、肺癌、卵巢癌等病人需求是非常有希望的手段之一。但因为靶点的特殊性，开发针对hCLDN18.2治疗性抗体非常困难。

人CLDN18.2蛋白全长261个氨基酸，见NCBI公开序列NP_001002026.1 claudin-18isoform 2，其中1-23为信号肽。CLDN18.2蛋白是一个跨膜蛋白，有两个膜外区域分别为信号肽后面大约55个氨基酸的胞外区1 (Extracellular loop 1，ECL1)和23个氨基酸ECL2。这一结构和人CLDN18.1非常相似，而且人CLDN18.2 和人CLDN18.1的ECL2区域则完全相同。因而针对人CLDN18.2蛋白靶点抗体的开发需要寻找针对人CLDN18.2蛋白的ECL1区域的抗体，或者寻找针对人CLDN18.2膜蛋白空间结构的抗体。这使得这方面的工作变得更加困难。

此外，针对人CLDN18.2膜蛋白的抗体发挥其功效至少包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长，通过和病人免疫细胞的效应作用，包括抗体依赖细胞毒性（ADCC），和补体依赖细胞毒性（CDC）效应细胞介导的杀伤肿瘤细胞作用。而要寻找这样功能的抗体会更加困难。

目前针对人CLDN18.2抗体研究只有IMAB362抗体在临床试验阶段。IMAB362是针对人CLDN18.2的抗体，是鼠源嵌合抗体，存在免疫原性风险。

因此，本领域需要更好的针对人CLDN18.2蛋白的抗体，特别是人源化抗人CLDN18.2抗体以减少治疗中潜在的免疫原性，并且也需要活性更好，包括结合活性，效应细胞活性，肿瘤杀伤活性，药效等方面性能更好的抗体，以满足本领域病人治疗，及治疗相关需求。本发明创新选用人CLDN18.2高表达细胞免疫小鼠，辅以大量的优化创新筛选方法，意外得到了优选的抗人CLDN18.2抗体，包括鼠源抗体，和人源化抗体。本发明提供新的抗体，包括鼠源，人源化，全人源化抗体，和人、鼠CLDN18.2特异结合活性更好，Emax更高；人血细胞中CDC活性更好；诱导CLDN18.2+ cell 凋亡活性更好，抑制肿瘤细胞生长活性更好，动物药效更优，且体内药物代谢（PK），特别是T1/2更好的抗体。和鼠CLDN18.2更好的结合活性为临床前研究提供了更好的非灵长类动物选择。突出的PK可为生产成本，临床药效等带来优势。这为肿瘤患者，特别是CLDN18.2高表达癌症患者提供了更好治疗选择、手段和方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供人源化，全人源化，结合活性更好，人血细胞CDC活性更优，诱导肿瘤凋亡活性更好，抑制肿瘤细胞生长活性更好，动物药效更优的抗人CLDN18.2抗体，为肿瘤患者，特别是CLDN18.2高表达的肿瘤患者治疗提供更好的选择。

通过大量的优化创新筛选，本发明得到了优选的抗人CLDN18.2的抗体。简言之，本发明提供了抗人CLDN18.2抗体，包括鼠源抗体，人源化抗体，全人源化抗体。本发明所提供新的抗体和不仅和人CLDN18.2，也和鼠CLDN18.2有更好的结合活性，且Emax更高；人血细胞中CDC活性更好；诱导肿瘤细胞凋亡活性，抑制肿瘤细胞生长活性更好，动物药效更优。

本发明提供一种能够和人CLDN18.2蛋白(hCLDN18.2蛋白)特异性结合的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)。在其轻链可变区和/或重链可变区中，所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可相应地包含至少1个选自以下的CDR序列或其突变序列：

对于轻链可变区(VL)：SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO:23所示的VLCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列；

对于重链可变区(VH)：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO:26所示的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21或SEQ IDNO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 22所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 23所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 21所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 26所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的 VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 22所示的 VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 23所示的 VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 21所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 26所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 21所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 21所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 22所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 26所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 23所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和VH，所述VH包含SEQ ID NO: 26所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，所述鼠源CLDN18.2抗体分子或其结合片段经亲和力(affinity)成熟，其亲和力提高3-10倍或以上，优选10倍或以上。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述鼠源抗体分子或其结合片段的轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 5所示的碱基序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述鼠源抗体分子或其结合片段的重链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 6所示的碱基序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述鼠源抗体分子或其结合片段的轻链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 5所示的碱基序列或其突变序列，重链可变区碱基序列为SEQ ID NO: 6所示的碱基序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述鼠源抗体分子或其结合片段的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述鼠源抗体分子或其结合片段的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述鼠源抗体分子或其结合片段的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或其突变序列，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段包含鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和鼠或人抗体恒定区，所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b3或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区；所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区等。优选地，所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和人抗体恒定区组合成的嵌合抗体分子或其结合片段。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述嵌合抗体分子或其结合片段的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述嵌合抗体分子或其结合片段的重链氨基酸序列为SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述嵌合抗体分子或其结合片段的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列或其突变序列，重链氨基酸序列为SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为嵌合抗体，所述嵌合抗体或其结合片段经亲和力(affinity)成熟，其亲和力提高3-10倍或以上，优选10倍或以上。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为人源化抗体分子或其结合片段。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的轻链可变区框架(FR)序列选自人种系轻链序列，例如 IGKV4-1*01(F), IGKV2-28*01(F), IGKV2D-28*01(F), IGKV1-27*01(F),IGKV1-39*01(F), IGKV1D-39*01(F), IGKV2-40*01(F), IGKV2D-29*01(F), IGKV2D-40*01(F), 或IGKV3-15*01(F)等，优选IGKV4-1*01(F)；更优选地，所选人种系轻链IGKV4-1*01的CDR2序列同SEQ ID NO: 13; J基因例如hJK1, hJK2.1, hJK2.2, hJK2.3, hJK2.4等，优选hJK2.1。FR序列优选包含0-10个氨基酸回复突变。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的轻链可变区CDR序列可以分别按照CCG、Kabat、Chothia、AbM或Contact等编号规则定义，所述CDR序列包含表4-8所列轻链CDR序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的轻链可变区序列包含SEQ ID NO: 29-33中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体分子或其结合片段的轻链可变区CDR序列人源化优化。优选地，轻链CDR1 0-5个位点优化；优选地，轻链CDR1第L30E和L34位优化（突变）成人种系CDR1相应位点的氨基酸。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的重链可变区框架(FR)序列选自人种系重链序列，例如IGHV1-69*02(F), IGHV1-69*06(F), IGHV1-69*08(F), IGHV1-69*09(F),IGHV1-69*10(F), IGHV1-69*04(F), IGHV1-69*14(F), IGHV1/OR15-2*02(P), IGHV1-69*01(F), IGHV1-69*11(F)等,优选IGHV1-69*01(F)；J基因例如hJh4.1, hJh4.2, hJh4.3,hJh1, hJh2, hJh3.1, hJh3.2等，优选hJH4.1；FR序列优选包含0-10个氨基酸回复突变。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的重链可变区CDR序列可以分别按照CCG、Kabat、Chothia、AbM或Contact等编号规则定义，所述CDR序列包含表4-8所列重链CDR序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的重链可变区序列包含SEQ ID NO: 34-37中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体分子或其结合片段的CDR区为脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为轻链CDR序列；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为轻链CDR1第L30A和/或L30B位优化的CDR1序列或片段。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列的轻链可变区序列包含SEQ IDNO: 46-49中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体分子或其结合片段的CDR区为脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为重链CDR序列；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为重链CDR3第H99和/或H100位优化的CDR序列或片段。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列的重链可变区序列包含SEQ IDNO: 50-54中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含序列为SEQ ID NO: 29-33、SEQ IDNO: 46-49中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO:34-37、SEQ ID NO: 50-54中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列的重链可变区的组合。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的轻链包含选自人抗体κ或λ型轻链恒定区或其变体。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段的重链包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其变体。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体分子或其结合片段的重链包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其变体，所述重链恒定区或其变体，包含人IgG1 Fc区第243位，或第239、第330和第332位突变。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体分子或其结合片段的重链包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其变体，所述重链恒定区或其变体，包含人IgG1 Fc区第356-358位为EEM或DEL的变体。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的抗体分子或其结合片段的轻链包含SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO: 58或SEQ ID NO: 60所示的氨基酸序列或者与其具有至少85%序列同源性的全长轻链序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化，和/或优选IgG1变体的抗体分子或其结合片段的重链包含SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ IDNO: 44、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO: 63所示的氨基酸序列或者与其具有至少85%序列同源性的全长重链序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 40所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化抗体分子或其结合片段包含人源化的轻链和重链组合，优选地，所述人源化的轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 39所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 55所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 55所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 56所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 57所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 58所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 57所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化，和/或IgG Fc变体的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 38所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 59所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化，和/或IgG Fc变体的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 59所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化，和/或IgG Fc变体的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 60所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 61所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化，和/或IgG Fc变体的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 60所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 62所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述抗体包含人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化，和/或IgG Fc变体的轻链和重链组合，优选地，所述轻链和重链组合为：SEQ ID NO: 60所示的氨基酸序列和SEQ ID NO: 63所示的氨基酸序列。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为人源化抗体，CDR序列优化抗体，CDR区脱氨基化敏感位点优化，IgG Fc变体；所述抗体或其结合片段经亲和力(affinity)成熟，其亲和力提高3-10倍或以上，优选10倍或以上。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段包含半抗体或半抗体的抗原结合片段，优选地，包含Fab、Fab’、F(ab)₂、Fv或单链Fv片段(scFv)。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可诱导人血细胞（效应细胞）和肿瘤细胞之间的ADCC活性，增强ADCC对肿瘤细胞的杀伤作用。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可诱导人血细胞（效应细胞）和肿瘤细胞之间的CDC活性，增强CDC对肿瘤细胞的杀伤作用。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可诱导CLDN18.2阳性肿瘤细胞凋亡，显示本发明CLDN18.2抗体诱导CLDN18.2阳性肿瘤细胞凋亡作用。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可抑制CLDN18.2阳性肿瘤细胞生长，显示本发明CLDN18.2抗体对CLDN18.2阳性肿瘤细胞生长的抑制作用。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可抑制CLDN18.2阳性肿瘤细胞体内生长，显示本发明CLDN18.2抗体体内药效。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可抑制CLDN18.2高表达肿瘤细胞体内生长，显示本发明CLDN18.2抗体体内药效。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段可和鼠CLDN18.2结合。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段和鼠CLDN18.1不结合。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段显示优秀的体内药物代谢（PK）性能，特别是良好的体内半衰期（T1/2）。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，包含所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段的ADC（antibody drug conjugates）分子活性。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段的双特异抗体分子活性。

在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，包含所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段的嵌合抗原受体（chimeric antigenreceptor，CAR）T, NK细胞活性。

本发明进一步提供一种DNA分子，其编码上述CLDN18.2抗体分子或其结合片段。

本发明进一步提供一种表达载体，其表达上述CLDN18.2抗体分子或其结合片段的DNA分子。

本发明进一步提供一种生产抗体的方法，其包括用表达载体转化可表达上述CLDN18.2抗体分子或其结合片段的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，更优选为CHO细胞。

本发明进一步提供一种药物组合物，在本发明一个优选的实施方案中，其包含上述CLDN18.2抗体分子或其结合片段和任选地药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。

在本发明一个优选的实施方案中，本发明进一步提供一种治疗癌症的方法，其包括以有效治疗癌症的量向需要其的对象施用上述CLDN18.2抗体分子或其结合片段或药物组合物；优选地，所述方法包括施用包含本发明CLDN18.2抗体分子或其结合片段的任何组合，更优选地，包括施用上述CLDN18.2抗体分子或其结合片段和免疫检查点抗体，包含PD-1抗体或抗体药物的组合。

本发明进一步提供一种治疗癌症的方法，其包括和本发明所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段联合治疗的方法。

在一个优选的实施方案中，本发明进一步提供一种如上所述的施用CLDN18.2抗体分子或其结合片段或药物组合物治疗癌症的方法，所述癌症优选为肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌结肠直肠癌、肝癌，胰腺癌，膀胱癌，白血病等或癌症的转移性病灶。

附图说明：

图1 本发明鼠源抗人CLDN18.2抗体mab5b和人CLDN18.2 (图1a) 以及鼠CLDN18.2 (图1b) 的结合活性（ELISA）

图2 本发明抗人CLDN18.2抗体mab5b人源化抗体(图2a) 以及人源化优化抗体(图2b)和人CLDN18.2的结合活性（ELISA）

图3 本发明抗体序列脱酰胺基敏感（deamidation）位点序列优化。图3a, CDR1 序列为KSSQSLLNSGNQKNYLT时，重链H100 位 S->T 突变失去结合活性（Ab30）；图3b, CDR1 序列KSSQSLLNSGNQKNYLT时,轻链L30B 位S->T和重链H100 位S->T 突变失去活性(Ab35)

图4 本发明人源化抗人CLDN18.2抗体、人源化优选抗体CDC活性评价

图5 本发明人源化抗人CLDN18.2抗体、人源化优选抗体诱导肿瘤细胞凋亡的活性

图6 本发明人源化抗人CLDN18.2抗体、人源化优选抗体动物模型体内药效评价

具体实施方式

为了更容易理解本发明，描述实施例子之前，先对本发明某些技术和科学术语做说明。

除显而易见在本发明申请文件中的它处另有明确定义，本发明使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J. biol. Chem., 1968, 243: 3557中所述。

术语"CLDN18.2" 包括同种型、哺乳动物(例如人)的CLDN18.2 、人CLDN18.2 的物种同源物和包含至少一个与CLDN18.2 的共同表位的类似物。CLDN18.2 (例如人CLDN18.2)的氨基酸序列是本领域中己知的，如NCBI数据库显示。

术语"CLDN18.1" 包括同种型、哺乳动物(例如人)的CLDN18.1 、人CLDN18.1 的物种同源物和包含至少一个与CLDN18.1 的共同表位的类似物。CLDN18.1 (例如人CLDN18.1)的氨基酸序列是本领域中己知的，如NCBI数据库显示。

本发明所述“抗体分子”可为抗体，所述“结合片段”可为抗原或抗原表位结合片段。本发明所述的“CLDN18.2抗体分子”与“抗CLDN18.2抗体分子”可互换使用。

本发明所述的抗体指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为µ链，δ链γ，α链，ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG 可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链因恒定区的不同分为κ型或λ型。五类Ig中第每类Ig都可以有κ或λ型轻链。

本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ型轻链恒定区或其变体。本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1, 2, 3, 4重链恒定区或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区（V区）；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区（C区）。可变区包括3个高变区（HVR）和4个序列相对保守的骨架区（FR）。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区（CDR）。每条轻链可变区（LCVR）和重链可变区（HCVR）由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指VLCDR1，VLCDR2，和VLCDR3；重链的3个CDR区指VHCDR1，VHCDR2和VHCDR3。

本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基的数量和位置符合本领域已知的CCG编号规则（VLCDR1-3，VHCDR1-3）、Kabat编号规则、AbM、Chothia、和Contact的编号规则。所述定义规则以及所述抗体定义之CDR序列，见表3-8。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的，来自人CLDN18.2抗原（人CLDN18.2高表达细胞）免疫的鼠脾杂交瘤细胞提取的单克隆抗体。制备时用CLDN18.2抗原（人CLDN18.2高表达细胞）注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ型或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1, IgG2, IgG3或 IgG4或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体（chimeric antibody）”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆所得人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核细胞，工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的CLDN18.2嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ型或其变体的轻链FR区。所述的CLDN18.2嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1, IgG2,IgG3, IgG4或其变体的重链RF区。人抗体的恒定区可选自人源IgG1, IgG2, IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1或 IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后改变ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用）, CDC (complement dependent cytotoxicity, CDC, 补体依赖细胞毒作用) 活性的IgG1。可通过对IgG上Fc段的修饰，可降低或消除，或增强抗体的ADCC, CDC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1 的N297A，L234A，L235A； IgG2/4chimera，IgG4的F235E,或L234A/E235A， F243L, 或 S239D/A330L/I332E突变。

术语“脱氨基化（deamidation）” 指移除位点上或分子某个位点上的氨基。“脱氨基化（deamidation）敏感位点，指更容易，更倾向产生脱氨基化作用的分子和分子某个位点。

术语“人源化抗体（humanized antibody）”，也称为CDR移植抗体（CDR-graftedantibody），是指将小鼠的CDR序列，特别的，本发明所述CLDN18.2抗体的CDR是按CCG,Kabat, AbM，Chothia或 Contact等编号规则定义的各CDR序列，移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。优选地，本发明所述CLDN18.2抗体的CDR，优选轻链CDR1中的0-5个位点突变成人抗体CDR对应位点的氨基酸。这些可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics (IMGT)的网站www.imgt.org, 和/或 www.vbase2.org得到。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的CLDN18.2人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO: 11-28。人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV4-1*01(F)和hJK2.1的组合序列SEQ ID NO: 29-33，包含人种系轻链IGKV4-1*01(F)的FR1，FR2，FR3区和hJK2.1的FR4区；其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-69*01(F) 和hJH4.1的组合序列SEQ IDNO: 34-37，包含人种系重链IGHV1-69*01(F) 的FR1，FR2，FR3区和hJH4.1的FR4区。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少回复突变，以保持活性。在本发明一个优选的实施方案中，所述的人源化抗体可变区回复突变为0，即全人源化抗体。

本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F（ab’）2片段，以及与人CLDN18.2结合的Fv片段sFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体（single chain antibody）或单链Fv（sFv 或 scFv）。本发明的术语“与CLDN18.2结合”，指能与人CLDN18.2相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

抗体分子包含双体抗体(diabody) 和单链分子以及抗体的抗原结合片段 (例如，Fab 、F(ab' )2, scFv 和 Fv) 。抗体分子包含一条重链和一条轻链(在本发明中称作半抗体)或由其组成。 Fab' 、F(ab’) 2 、Fc 、Fd 、Fv 、单链抗体 (例如scFv) 、单一可变结构域抗体、双体抗体(Dab) (双价和双特异性)和嵌合 (例如，人源化)抗体，它们可以通过修饰完整抗体产生，或使用重组DNA技术从头合成的那些抗体分子。这些功能性抗体片段保留选择性地与其相应抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体类别，包括但不限于IgG 、IgA 、IgM 、IgD和IgE并且来自任何抗体亚类(例如， IgG1 、IgG2 、IgG3 和IgG4)。抗体分子的制备可以是单克隆或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外生成的抗体。抗体可以具有例如选自IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 的重链恒定区。抗体还可以具有例如选自K或λ型的轻链。术语"免疫球蛋白" (I g) 在本发明中与术语"抗体"互换地使用。

本发明所公开的抗体也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然缺少轻链的抗体、衍生自常规4 链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些支架之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是现有技术的任何抗体，或将来的任何单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、鱼类、重鱼、山羊、兔和牛。根据一些方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称作缺少轻链的重链抗体。出于清晰原因，从天然缺少轻链的重链抗体衍生的这种可变结构域在本发明中称作VHH或纳米体以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这种VHH 分子可以衍生自骆驼科 ( Camelidae )物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼) 中产生的抗体。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体，这类VHH也被考虑。VH 区和VL 区可以再划分为超变区，称作"互补性决定区"(CDR) ，其间插有更保守的区域，称作"框架区" (FR) 。框架区和CDR 的范围己有多种方法定义。

本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体或mAb或Ab，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。本发明所述载体的宿主细胞，可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero 细胞、Hela细胞、COS 细胞、CHO细胞、HEK293 细胞、BHK细胞、合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9 细胞。

单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术（如CDR-grafting），或其它现有技术进行重组得到。生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量（也称作“治疗有效量”）可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征（例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等）的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。

整个说明书和权利要求书中使用的术语 “基本上由……组成”或其变形，变体表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。

“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“外源性”指根据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。

“同源性” 、“变异序列”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60%同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。

本发明使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。

本发明使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA所述扩增的程序或技术。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。本发明使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。

“任选”、“任选地”、“任意”或 “任一”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

本发明所用， "一个" 和"一种"在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。除非内容明确提示，否则术语"或"在本发明中用来意指术语"和/或"并且与之互换使用。"约"和"大约"应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度一般在其10% 范围内和更一般在其5% 范围内。本发明公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸，它们具有指定的序列，变异序列或与其基本上相同或相似的序列，例如，与序列指定至少85% 、90% 、95% 或更多相同的序列。在氨基酸序列的情况下，术语 "基本上相同"在本发明中用来指第一氨基酸序列。

“药物组合物”表示含有一种或多种本发明所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散剂、脂质体或适合高抗体浓度的其他有序结构。可以通过将活性化合物 (即抗体或抗体部分) 以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在适宜的溶剂中并入，根据需要，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。

本发明所述的方法、组合物、联合治疗可以与其他活性剂或治疗方式，所述的方法包括向对象以有效治疗或预防疾病 (例如，癌症)的量，施用本发明所述的抗CLDN18.2 抗体分子，任选地，与PD-1 、PD-L1、PD-L2 、LAG-3 、CTLA-4、Tim-3抗体 (免疫治疗) 或其它肿瘤治疗抗体，Her-2、EGFR、VEGF、VEGFR抗体等，以及ADC（抗体药物偶联，如T-DM1），双特异抗体，化疗药物等的一种或多种抑制剂的组合，还包括施用抗CLDN18.2抗体分子、额外的活性剂或全部可以按这样的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或等于单独 (例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量。抗CLDN18.2抗体，额外的活性剂或全部的施用量或剂量比单独 (例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量低 (例如，至少20% 、至少30% 、至少40% 或至少50% )。

"保守性氨基酸置换"是其中氨基酸残基以具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、细氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有自分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸) ，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质" (如果为单链) 在本发明中互换地使用。术语"核酸"、"核酸序列“ ，"核苷酸序列"或"多核苷酸序列"和"多核苷酸"互换使用。术语"分离的"指从其原始或原初环境 (例如，如果天然存在，则为天然环境) 取出的物质。

术语"竞争"或"交叉竞争"在本发明中可互换地用来指抗体分子干扰抗CLDN18.2抗体分子与靶(例如，人CLDN18.2) 结合的能力。对结合作用的干扰可以是直接或间接的(例如，通过抗体分子或靶的变构调节作用)。可以使用竞争结合测定法(例如， FACS 测定法、ELISA或BIACORE测定法)确定抗体分子能够干扰另一种抗体分子与其靶结合的程度并且是否因此可以称它为竞争。术语"表位"指抗原(例如，人CLDN18.2) 中与抗体分子特异性相互作用的部分。

此外，正如本发明的实施例中描述的那样，抗CLDN18.2抗体可以结合CLDN18.2 诱导靶细胞（肿瘤细胞）凋亡，抑制肿瘤细胞生长，增加体内效应细胞对肿瘤细胞ADCC，CDC杀伤作用来达到治疗癌症患者的目的。因此，在某些实施方案中，本发明所描述的抗CLDN18.2抗体分子通过这些机理显示本发明抗体抗肿瘤效应。以及抑制肿瘤细胞生长的方法，包括将治疗有效量的本发明中所述的抗CLDN18.2抗体分子施用于受试者。该方法适用于癌症的体内治疗。为了获得靶向特异治疗效果，抗CLDN18.2抗体分子可以与其它抗体一起施用。在将CLDN18.2抗体组合一种或多种活性剂施用时，该组合可以以任何顺序或同时施用癌症类型，特别是CLDN18.2高表达的肿瘤患者。在某些方面中，提供在对象中治疗对象(例如，减少或缓解)过度增生性病状或疾病(例如，癌症) ，例如，实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤或转移性病灶的方法。该方法包括向对象单独或与其他活性剂或治疗方式组合地施用本发明所述的一种或多种抗CLDN18.2抗体分子。

如本发明所用，术语"癌", ”癌症”，“癌症病人” 意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如，多个器官系统的肉瘤和癌(包括腺癌和鳞状细胞癌) ，如侵袭肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、生殖泌尿道(例如，肾、膀肮上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤如大部分结肠癌、直肠癌、胃癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌中的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。鳞状细胞癌包括恶性肿瘤，如在肺、食道、皮肤、头部和颈部区域、口腔、肛门和子宫颈中。前述癌的转移性病灶也可以使用本发明所述的方法和组合物治疗或预防。针对CLDN18.2 的抗体分子可以与免疫原性剂如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、细胞和用编码免疫剌激性细胞因子的基因转染的细胞组合。

组合进一步包括免疫检查点调节物的抑制物或激活物，例如，抗PD-L1抗体分子、抗PD-1 抗体分子，或CTLA-4抑制物(例如，抗CTLA-4抗体)，或非免疫检查点调节物的抑制物或激活物(例如化学药物，小分子靶向药物，大分子包括抗体靶向药物，例如anti-Her2,ant-VEGF, anti-VEGFR, anti-EGFR等抗体，抗体偶联药物，双特异抗体，CAR-T细胞组合等)，或其任意组合。CLDN18.2抗体治疗也可以与标准癌症治疗组合。CLDN18.抗体治疗可以有效地与化疗方案组合。在这些情况下，可以减少施用的化疗药物剂量。组合物可以与一者或多者组合施用，免疫调节剂 (例如，共刺激分子的激活物或抑制性分子的抑制物) ;疫苗或其他形式的细胞免疫疗法。

术语"免疫检查点"是指在免疫细胞的细胞表面上的一组分子，其可以充当"闸"以下调或抑制免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答, 进而和本发明抗体联合治疗肿瘤。免疫检查点分子包括但是不同限于PD-1、PD-L1、细胞毒性的T淋巴细胞抗原4(CTLA-4) 、B7-H1、B7-H3、OX-40，4-1BB(CD137) 、CD40 、CLDN18.2和淋巴细胞活化基因3(LAG-3) ，等等。特别地，与抗PD-1 抗体或其抗原结合片段组合施用抗CLDN18.2 抗体分子。与抗CLDN18.2抗体和抗PD-1抗体或其抗原结合片段组合施用抗CLDN18.2抗体分子。施用双特异性抗体，其包括抗CLDN18.2抗体分子和抗PD-1 或抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，或CLDN18.2抗体和其它免疫检查点抗体，或CD3抗体或其抗原结合片段。

使用单独的或与另一种免疫调节剂(例如抗LAG-3，抗Tim-3, 抗PD-l或抗PD-L1、抗CTLA-4抗体分子)组合的抗CLDN18.2抗体分子来治疗胃癌、胰腺癌，肺癌，食管道癌, 卵巢癌等。抗CLDN18.2抗体分子可以与以下一者或多者组合施用: 基于免疫的策略、靶向药物(例如， VEGF抑制剂如针对VEGF 的单克隆抗体); VEGF酪氨酸激酶抑制剂如舒尼替尼、索拉非尼、阿帕替尼; RNAi 抑制剂或VEGF信号传导的下游介导物的抑制剂，例如，雷帕霉素哺乳动物靶(mTOR) 的抑制剂。

可以利用本发明中公开的抗体分子抑制其生长的示例性的癌症包括典型地对免疫疗法应答的癌症。适合治疗的癌症的非限定性的实例包括，胃癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外，可以利用本发明中描述的抗体分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。癌症包括但是不同限于基底细胞癌、胆道癌、膀肮癌、骨癌、大脑和CNS癌症、原发性CNS淋巴瘤、中枢神经系统(CNS) 瘤、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼睛癌症、头部和颈部癌症、胃癌、肾癌、喉癌、血病 (包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巳母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性或急性白血病) 、肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞癌)、淋巴瘤，包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、黑素瘤，例如皮肤或眼内的恶性黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口腔癌) ; 卵巢癌，胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌症、肉瘤:皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、肝癌、肛区癌症、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、脊椎轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波因肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉诱导的那些癌症，以及其它癌和肉瘤和所说的癌症的组合。

具体实施例子

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1: 密蛋白（Claudin, or CLDN）18.1, 18.2（缩写英文：CLDN18.1,CLDN18.2）高表达细胞株构建

本发明所用的人CLDN18.1, 人CLDN18.2, 小鼠CLDN18.1, 小鼠CLDN18.2高表达细胞株通过公司稳定细胞株构建平台完成。具体步骤如下：

实验开始第1天，将293T 细胞 (中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 Cat#GNHu17) 接种于两个6 cm 培养皿，每个培养皿里的细胞数达到7.5×10⁵。第2天将包裹质粒（pGag-pol, pVSV-G, pBabe等BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心）和克隆有人或鼠CLDN18.2或CLDN18.1基因的质粒pBabe-CLDN18.2 或 pBabe-CLDN18.1 各4µg 加入OPTI-MEM （Thermofisher Scientific Cat#31985070），使最终体积为200µl，另准备200µlOPTI-MEM加入36µl转染试剂fectin （上海源培生物科技股份有限公司 Cat#F210），二者混匀，室温放置5min，然后将混合物（每皿各200µl）滴加入培养好的293T细胞。第3天将293T细胞培养液换为4ml DMEM高糖培养基（上海源培生物科技股份有限公司/源培生物： Cat#L130KJ）。第4天将CHO-K1细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 Cat#SCSP-507）接种于10cm 培养皿，使细胞数达到5×10⁵。第5天收集293T细胞上清（病毒），用0.45µm滤膜过滤至培养好的CHO-K1细胞，同时加入10ug/ml polybrene （上海翊圣生物科技有限公司Cat# 40804ES76），混匀后放置培养箱，3~4h后换成DMEM/F12 10% FBS 培养基（源培生物，Cat#L310KJ）。第7天将CHO-K1细胞传代，第8天传代的细胞开始加入10ug/ml puromycin进行筛选（源培生物，Cat#S250J0）。2-3天细胞大量死亡，更换培养基继续培养，直到细胞不再死亡时，细胞大量扩增，筛选单克隆细胞株，扩培，冻存保种。

本发明构建稳定表达CLDN18细胞株分别标记为，人CLDN18.1+ 细胞或hCLDN18.1+cell,人CLDN18.2+ 细胞或hCLDN18.2+ cell, 鼠CLDN18.1+ 细胞或mCLDN18.1+ cell, 鼠CLDN18.2+细胞或mCLDN18.2+ cell。所用的蛋白序列源自公开发表的数据库，各蛋白氨基酸序列如下。

人CLDN18.1 (hCLDN18.1):

>NP_057453.1,claudin-18 isoform 1 precursor [Homo sapiens]

MSTTTCQVVAFLLSILGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTSVFQYEGLWRSCVRQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 1)

人CLDN18.2(hCLDN18.2):

>NP_001002026.1 claudin-18 isoform 2 [Homo sapiens]

MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 2)

鼠CLDN18.1 (mCLDN18.1):

>NP_062789.1 claudin-18 isoform A1.1 precursor

MATTTCQVVGLLLSLLGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTAVFQYEGLWRSCVQQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGVIGILVSIFALKCIRIGSMDDSAKAKMTLTSGILFIISGICAIIGVSVFANMLVTNFWMSTANMYSGMGGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLTPDDSNFKAVSYHASGQNVAYRPGGFKASTGFGSNTRNKKIYDGGARTEDDEQSHPTKYDYV (SEQ ID NO: 3)

鼠CLDN18.2(mCLDN18.1):

>NP_001181850.1 claudin-18 isoform A2.1 [Mus musculus]

MSVTACQGLGFVVSLIGFAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGVIGILVSIFALKCIRIGSMDDSAKAKMTLTSGILFIISGICAIIGVSVFANMLVTNFWMSTANMYSGMGGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLTPDDSNFKAVSYHASGQNVAYRPGGFKASTGFGSNTRNKKIYDGGARTEDDEQSHPTKYDYV (SEQ ID NO: 4)

实施例2：抗CLDN18.2抗体和CLDN18.2 + 和CLDN18.1 +细胞株结合（ELISA）实验

将实施例子1得到的细胞人CLDN18.1, 人CLDN18.2, 鼠CLDN18.1, 或鼠CLDN18.2高表达的单克隆细胞株扩培后，按5x10⁴/孔铺96-well plate，37°C培养箱过夜孵育后去除上清，用免疫染色固定液（上海碧云天生物技术有限公司 Cat#P0098）100μl/孔室温固定半小时。PBS（源培生物，Cat# B320）洗一遍后5%牛奶37°C 封闭2小时, PBST洗3遍。加入待测样品（人或鼠源抗体，Jackson Immuno Research）。37°C 孵育1小时，后PBST洗3遍。加Anti-human or mouse HRP 1:2500 50μl/孔37°C 孵育1小时，后PBST洗3遍， TMB （SurmodicCat# TTMB-1000-01）显色，加入50µl/孔1MH₂SO₄终止反应。酶标仪 ( MultiskanGO Thermo型号51119200) 读数，Graphpad prism 5进行数据分析。

实施例3：重组蛋白，抗体的克隆，表达和纯化

本发明用到的重组蛋白/抗体的克隆，表达和纯化均按本领域技术人员熟知的分子克隆方法进行。

具体地，本发明用到的表达载体购自长沙优宝生物科技有限公司，后由上海健信生物医药科技有限公司(健信生物)引入EcoRI酶切位点（GAATTC），便于双酶切切或同源重组方法克隆外源基因。基因合成由生工生物工程（上海）股份有限公司（生工生物）等CRO（外包）公司完成。293细胞，CHO-K购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

本发明中重组蛋白和抗体是在293细胞瞬时转染表达，纯化得到。具体步骤是，293细胞在Gibco FreeStyle 293 Expression Medium（Gibco，Cat# 12338018）培养基扩培。开始瞬转之前，调节细胞浓度至 6~8×10⁵ cell /ml，1% FBS （Aus Gene X FBSExcellent 供应商：AusGeneX，China， Cat# FBSSA500-S），37℃ 8% CO2 摇床培养 24h，再次镜检存活率 > 95%，细胞浓度在1.2×10⁶ cell/ml。

准备300ml 培养体系细胞，15ml Opti-MEM（Gibco，Cat#31985070）溶入重链、轻链质粒各150ug， 0.22 um 过滤除菌。再取15ml Opti-MEM 溶入1mg/ml PEI（Polysciences, Inc, Cat# 23966-2 ）600μl后静置5min。For 500ml培养体系，25mlOpti-MEM（Gibco，Cat# 31985070）溶入重链、轻链质粒各250ug，0.22 um 过滤除菌。再取25ml Opti-MEM 溶入1mg/ml PEI 1000μl后静置5min。把PEI缓慢加入质粒中，室温孵育10min，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液， 37℃ 8% CO2 摇床培养 5天收样，3300G 10 min 取上清进行纯化。

纯化：将样品高速离心去除杂质，用PBS pH7.4平衡含有Protein A （Mabselect,GE Healthcare Life Science, Cat# 71-5020-91 AE）的重力柱（生工生物，Cat#F506606-0001），2-5倍柱体积冲洗。将样品过柱。用5-10倍柱体积的PBS（生工生物，Cat#B548117-0500）冲洗柱子。再用pH 3.5 0.1M乙酸洗脱目的蛋白，后用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，酶标仪测定浓度，分装、储存备用。

本发明中的重组人CLDN18.2 (claudin18.2)胞外区域（20位D – 70为A片段）和Fc融合蛋白（序列如下）是通过293系统瞬时转染后纯化。该蛋白可用于免疫小鼠血清滴度检测。

本发明有的实验中用到抗体人CLDN18.2 (anti-hCLDN18.2)抗体（称为对照分子或阳性分子）作为比较。该抗体在本发明中简写为Ref (Reference), 序列源自WO2014146672。

本发明所发现的anti-hCLDN18.2抗体可变区序列从优化筛选杂交瘤得到的单克隆细胞得到，并经过人源化筛选，成药性序列优化筛选等得到优化的可变区序列，和不同的轻、重链恒定区（序列如下），用上述方法重组表达得到各个不同抗体分子，用于活性、功能等检测评估。

实施例4：抗人CLDN18.2抗体的发现

本发明抗人CLDN18.2单克隆抗体是用实施例1中得到的人CLDN18.2高表达细胞株(hCLDN18.2+ cell)免疫的小鼠，取免疫小鼠脾进行杂交瘤融合，从数百万株杂交瘤克隆中筛选、优化得到的。

实验用小鼠，雌性，4周龄 (SJL购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京) 2016-0011； Balb/c 购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，白天光/夜晚暗周期调节，温度20-25 ℃；湿度40-60 %。小鼠分成3只/组/笼。

培养实施例子1中构建的人CLDN18.2高表达细胞株 (hCLDN18.2+ cell, 人CLDN18.2+ 细胞)，胰酶消化后DMEM培养基(源培生物，Cat#L310KJ) 洗涤后，重悬于DMEM培养基中。按100μl/1x10⁷细胞/只，腹腔注射免疫小鼠。首次免疫的时候用Titermax (Sigma-Aldrich, T2684) 按1：1和细胞混匀免疫。随后免疫1周一次，免10次后，用实施例子2之ELISA方法，人CLDN18.1+ cell 和人CLDN18.2+ cell同时铺板，或用上述实施例子3中的重组表达的人CLDN18.2胞外 (ECL1) 蛋白铺板，检测免疫小鼠血清效价，以人CLDN18.1+cell铺板的ELISA值作为背景，计算小鼠血清免疫效价（滴度）。在12-15次免疫以后，选择血清滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合，融合前以200μl/2x10⁷细胞/只冲免小鼠，冲免3天后，取小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞 (ATCC® CRL-8287™ ) 进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板。

取96孔板中杂交瘤细胞上清同时用人CLDN18.1+ cell 和人CLDN18.2+ cell铺板检测杂交瘤细胞产生的抗体结合情况。表1a是部分杂交瘤上清的检测结果。

表1a 杂交瘤融合克隆和人CLDN18.2+ cell、人CLDN18.1+ cell结合活性检测

编号	初始杂交瘤克隆号	人CLDN18.2+ cell 结合活性 (ELISA)	人CLDN18.1+ cell 结合活性 (ELISA)
				mab1	F2A4	1.617	1.192
mab2	F6B1	0.176	0.123
				mab3	C6F9	0.671	0.448
mab4	C11A11	0.436	0.524
				mab5	C13C1	1.41	0.09
……	……	……	……

因为人的CLDN18.2和CLDN18.1有高达 92%的同源性（240/261），且该蛋白是跨膜蛋白，只有少部分的肽段在胞外(比如51氨基酸的ECL1)，免疫原性极低，产生特异抗体的可能性非常小。所以上述筛选中，能得到分泌识别CLDN18的杂交瘤不仅很少，而且在很少的杂交瘤中，绝大部分杂交瘤上清中的抗体是能同时结合人CLDN18.2和CLDN18.1的抗体。

非常意料之外的是，本发明惊奇的发现一株杂交瘤克隆，其分泌的上清只同人CLDN18.2+ cell结合，和人CLDN18.1+ cell不结合，见表1a中的 mab5, C13C1。表1a数据显示，同样的筛选条件下，该克隆上清只和人CLDN18.2+ cell结合，检测值是1.41，而同人CLDN18.1+ cell几乎不结合，读值只为0.09.

进一步对本发明意外发现的该杂交瘤细胞株C13C1能分泌独特的抗人CLDN18.2抗体进行确认。将C13C1杂交瘤细胞进行了多次有限稀释，精心又精细的优化筛选每次稀释后的单克隆，最终发现了能分泌独特的抗人CLDN18.2的抗体的单克隆细胞株，结果见表1b。

表1b杂交瘤C13C1优化筛选发现的杂交瘤单克隆细胞株

从表1b的结果可以看出，本发明得到初始杂交瘤克隆C13C1经精细、优化筛选得到的的单克隆细胞株C13C1F1D3G6和C13C1F1D3H5所分泌的抗体均保留了和人CLDN18.2细胞结合，读值分别为0.8895和0.8778。而和人CLDN18.1细胞没有结合，读值分别为0.0859和0.0756。该读值接近本次ELISA本底0.081。初始杂交瘤克隆F2A4经同步筛选也得到了单克隆细胞株F2A4F6F3E4和F2A4F6F3H7。这些单克隆细胞株和预期一样，和人CLDN18.2细胞、人CLDN18.1细胞有同样的结合活性，数据见表1b。这些结果表明，本发明发现单克隆细胞株，比如C13C1F1D3G6，能够分泌独特的抗体，意外地，所分泌的抗体只能同人CLDN18.2 结合，而不结合人CLDN18.1。

这意味着本发明意外发现的抗体能够有效的只识别人CLDN18.2蛋白，具有作为单克隆抗体治疗肿瘤的潜力，特别是治疗人CLDN18.2蛋白过表达的癌症患者，包括但不限于胰腺癌，胃癌，食道癌，肺癌等。因为完全不结合人CLDN18.1蛋白，从而预期可以避免治疗性抗体和人CLDN18.1等蛋白非特异结合而导致的毒、副作用。

实施例5：本发明鼠源抗人CLDN18.2抗体筛选、鉴定

从上述实施例子中得到的杂交瘤单克隆细胞株C13C1F1D3G6 （表1b）中提取该细胞株所分泌的抗体序列，即得到本发明鼠源抗体mab5b序列。从杂交瘤优选的单克隆细胞株中提取抗体序列过程为本领域技术人员熟知并常用的方法。

具体地，本发明通过扩增培养上述实施例子中发现的杂交瘤单克隆细胞C13C1F1D3G6，收取1 x 10⁶个细胞，用Trizol （Invitrogen, 15596-018）提取RNA (按照试剂盒说明书步骤)，将提取的RNA反转录成cDNA，反转录试剂盒购自生工生物技术（上海）股份有限公司，Cat # B532435。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增后，扩增产物测序即得到mab5b的抗体轻重链可变区序列。所用引物参阅Novagen 发表的手册 TB326 Rev.C0308。

本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株C13C1F1D3G6中获得的抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2)单克隆轻链可变区氨基酸编码序列(划线部分)如下：

taatgggcttcaagatgaagtcacagtttctggtcctcatgtccctgctgttctgggtatctggtacctgtggggacattgtgatgacacagtctccatcctccctgactgtgacagcaggagagaaggtcactatgagttgcaagtcca gtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagaactacttgacctggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaaa ctgttgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacacattt cactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattatttttatccattca cgttcggctcggggacaaagttggaaaaaaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctgaacaactctaccccaaagaccatccatgccc (SEQID NO: 5)

本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株C13C1F1D3G6中获得的抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2)单克隆重链可变区氨基酸编码序列(划线部分)如下：

taatgggatggaccgggatctttatctttctcctgtcagtaactgcaggtgttcactcccaggtccagctgca gcagtctggagctgagctgataggacctgggacttcagtgaaggtgtcctgcaaggcctctggatacgccttcagta attacttgatagaatgggtaaaacagaggcctgaacagggccttgagtggattggtttgattaatcctggaagtggt ggcactaactacaatgagaagttcaagggcaaggcaacactgactgcagacaaatcctccagcactgcctacatgca actcagcagcctgacatctgatgactctgcggtctacttctgtgcaagggtctactatggtaactcctttgcttact ggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctattaccgagcaagaaatgtcg (SEQID NO: 6)

由上述轻链碱基序列翻译即得到本发明发现的杂交瘤单克隆细胞株提取的鼠源抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2) 单克隆抗体mab5b轻链可变区的氨基酸序列为：

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTHFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYFYPFTFGSGTKLEKK (SEQ ID NO: 7)

由上述重链碱基序列即得到本发明发现的杂交瘤单克隆细胞株提取的鼠源抗人CLDN18.2(anti-hCLDN18.2) 单克隆抗体mab5b重链可变区的氨基酸序列为：

QVQLQQSGAELIGPGTSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQRPEQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 8)

本发明发现的杂交瘤单克隆细胞株中提取的上述抗体mab5b，用实施例子3所述方法将抗体轻、重链可变区和恒定区分别进行克隆 (序列如下) 重组表达，纯化后，和对照抗体Ref同时检测对人hCLDN18.1，和hCLDN18.2和鼠mCLDN18.1，和mCLDN18.2的结合活性，结果如下表2a, 表2b和图1。

本发明anti-hCLDN18.2抗体mab5b 轻链（L Chain）：

DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTHFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYFYPFTFGSGTKLEKKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 9)

本发明anti-hCLDN18.2抗体mab5b 重链（H Chain）：

QVQLQQSGAELIGPGTSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQRPEQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 10)

表 2a 本发明anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和人CLDN18+ cell的结合活性

表 2b 本发明anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和鼠CLDN18+ cell的结合活性

表2a，图1a 结果表明，本发明发现的anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和对照抗体（Ref）都不和hCLDN18.1+ cell结合，EC50检测不到（ND），即使在200nM 高浓度的时候仍检测不到结合活性, 结合值Emax（指在样品浓度提高，结合达到平台时的结合值，即最大特异结合数值）仍然是本底，即背景值。而两个抗体均和hCLDN18.2+ cell有很好的结合活性。意外的是，本发明的抗体mab5b结合活性比Ref好1倍以上（EC50 为0.115 nM vs 0.249 nM）。更加意外的是，mab5b所能达到的最大结合数值Emax比Ref要高36%以上 [(1.92-1.41)/1.41]。

表2b, 图1b结果表明，本发明发现的anti-hCLDN18.2鼠源抗体mab5b和对照抗体（Ref）都不和鼠CLDN18.1+ cell结合，EC50检测不到（ND），即使在200nM 高浓度的时候仍检测不到结合活性, 结合值Emax（指在样品浓度提高，结合达到平台时的结合值，即最大特异结合数值）仍然是本底，即背景值。而两个抗体均和鼠CLDN18.2+ cell有很好的结合活性。意外的是，本发明的抗体mab5b结合活性比Ref好4倍以上（EC50为0.182 nM vs 1.04 nM）。更加意外的是，mab5b所能达到的最大结合数值Emax比Ref要高1倍以上 [2.21 vs 1.0]。

上述结果表明本发明所发现的新分子mab5b 的结合活性(EC50 和 Emax)比对照分子都要好。并且和hCLDN18.1 和mCLDN18.1都没有任何结合活性，说明mab5b不仅结合活性更好，而且特异性也非常优秀。这表明mab5b用于肿瘤治疗产品开发能提供更好疗效和安全性的优势。并且和鼠CLDN18.2也有更好的结合，为在鼠上进行临床前研究提供了更加便利的非灵长类动物选择。

实施例 6: 本发明抗体mab5b的人源化

本发明发现的抗体mab5b活性优于Ref，显示该抗体可以用于肿瘤治疗药物开发。为了减少药物开发过程中的免疫原性等方面的风险，比如由鼠源抗体完成人源化，并且优化人源化后分子特性，便于用于药物开发，本发明对mab5b进行了人源化筛选，以及序列优化工作。具体过程描述如下。

抗体的CDR定义本领域还有多种不同的方法，这些标记CDR方法可总结如下表3。

表3 本领域抗体CDR定义不同方法汇总*

Loop	CCG定义	Kabat定义	AbM 定义	Chothia定义	Contact定义
						轻链CDR1	L24-L34	L24-L34	L24-L34	L24-L34	L30-L36
轻链CDR2	L50-L56	L50-L56	L50-L56	L50-L56	L45-L55
						轻链CDR3	L89-L97	L89-L97	L89-L97	L89-L97	L89-L96
重链CDR1	H26-35	H31-35	H26-35	H26-32	H30-35
						重链CDR2	H50-65	H50-65	H50-58	H52-56	H47-H58
重链CDR3	H95-H102	H95-H102	H95-H102	H95-H102	H93-H101

*更多信息可以参阅网站：http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef

上述实施例子5中得到的鼠源抗人CLDN18.2 抗体mab5b按照表3各种定义方法，其CDR序列标记/注释如下。

表4本发明抗人CLDN18.2 (anti-hCLDN18.2)抗体mab5b按CCG定义CDR序列

抗体	mab5b CDRs
		轻链CDR1	KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 11) 或者人源化优化序列 KSSQSLLNSGN<u>N</u>KNYL<u>A</u> (SEQ ID NO: 12. 划线是和SEQ ID NO: 11不同的氨基酸)
轻链CDR2	WASTRES (SEQ ID NO: 13, 完全同人源化所选人种系抗体CDR2序列)
		轻链CDR3	QNDYFYPFT (SEQ ID NO: 14)
重链CDR1	GYAFSNYLIE (SEQ ID NO: 15)
		重链CDR2	LINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16)
重链CDR3	VYYGNSFAY (SEQ ID NO: 17)

表5本发明抗人抗体按Kabat定义CDR序列

抗体	mab5b CDRs
		轻链CDR1	KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 11) 或者人源化优化序列 KSSQSLLNSGN<u>N</u>KNYL<u>A</u> (SEQ ID NO: 12 )
轻链CDR2	WASTRES (SEQ ID NO: 13)
		轻链CDR3	QNDYFYPFT (SEQ ID NO: 14)
重链CDR1	NYLIE (SEQ ID NO: 18)
		重链CDR2	LINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 16)
重链CDR3	VYYGNSFAY (SEQ ID NO: 17)

表6本发明抗体按AbM定义CDR序列

抗体	mab5b CDRs
		轻链CDR1	KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 11) 或者人源化优化序列 KSSQSLLNSGN<u>N</u>KNYL<u>A</u> (SEQ ID NO: 12 )
轻链CDR2	WASTRES (SEQ ID NO: 13)
		轻链CDR3	QNDYFYPFT (SEQ ID NO: 14)
重链CDR1	GYAFSNYLIE (SEQ ID NO: 15)
		重链CDR2	LINPGSGGTN (SEQ ID NO: 19)
重链CDR3	VYYGNSFAY (SEQ ID NO: 17)

表7本发明抗体按Chothia定义CDR序列

抗体	mab5b CDRs
		轻链CDR1	KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 11) 或者人源化优化序列 KSSQSLLNSGN<u>N</u>KNYL<u>A</u> (SEQ ID NO: 12)
轻链CDR2	WASTRES (SEQ ID NO: 13)
		轻链CDR3	QNDYFYPFT (SEQ ID NO: 14)
重链CDR1	GYAFSNY (SEQ ID NO: 20)
		重链CDR2	NPGSGG (SEQ ID NO: 21)
重链CDR3	VYYGNSFAY (SEQ ID NO: 17)

表8本发明抗体按Contact定义CDR序列

抗体	mab5b CDRs
		轻链CDR1	LNSGNQKNYLTWY (SEQ ID NO: 22) 或者人源化优化序列LNSGN<u>N</u>KNYL<u>A</u>WY (SEQ ID NO: 23 )
轻链CDR2	KLLIYWASTRE (SEQ ID NO: 24)
		轻链CDR3	QNDYFYPF (SEQ ID NO: 25)
重链CDR1	SNYLIE (SEQ ID NO: 26)
		重链CDR2	WIGLINPGSGGTN (SEQ ID NO: 27)
重链CDR3	ARVYYGNSFA (SEQ ID NO: 28)

对本发明 anti-hCLDN18.2 抗体（mab5b）上述CDR分析，根据抗体标记系统，标记识别抗体轻、重链的CDR区（如上）基础上，将鼠源抗体mab5b轻、重链可变区序列分别和人抗体种系数据库（v-base）比较，找出同源性高的人抗体轻、重链种系，在此基础上，计算机建模，模拟抗体结构中可能影响和抗原结合的位点，回复突变关键位点和组合，筛选出活性优选的人源化抗体分子。

具体地，通过序列同源性比较分析，发现和mab5b轻链同源性比较好的人抗体种系包含有IGKV4-1*01(F), IGKV2-28*01(F), IGKV2D-28*01(F), IGKV1-27*01(F), IGKV1-39*01(F), IGKV1D-39*01(F), IGKV2-40*01(F), IGKV2D-29*01(F), IGKV2D-40*01(F),IGKV3-15*01(F)。进一步比较、分析，优选人抗体种系轻链IGKV4-1*01(F)。特别地，所选定的人种系轻链IGKV4-1*01(F)的CDR2 序列为WASTRES，和本发明发现的鼠源抗体mab5b 轻链CDR2序列完全相同。序列比对发现mab5b 轻链的 J 基因区和人抗体种系hJK1,hJK2.1, hJK2.2, hJK2.3, hJK2.4同源性高，进一步比较、分析，优选hJK2.1用于mab5b轻链人源化人抗体种系J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。

通过序列同源性比较分析，发现和mab5b重链同源性比较好的人抗体种系包含有IGHV1-69*02(F), IGHV1-69*06(F), IGHV1-69*08(F), IGHV1-69*09(F), IGHV1-69*10(F), IGHV1-69*04(F), IGHV1-69*14(F), IGHV1/OR15-2*02(P), IGHV1-69*01(F),IGHV1-69*11(F), 进一步比较、分析，优选人种系重链IGHV1-69*01(F) 序列用于本发明抗体人源化。序列比对发现mab5b 的重链J基因区和人抗体种系重链J基因 hJh4.1,hJh4.2, hJh4.3, hJh1, hJh2, hJh3.1, hJh3.2 同源性高，进一步比较、分析，优选hJh4.1用于本发明mab5b重链人源化人抗体种系J区，进行人源化设计、筛选和序列优化。

将本发明抗体mab5b CDR区（见上述CDR之定义）移植到所选择的人源化轻、重链人抗体种系模板上，再与IgG轻、重链恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，筛选这些突变以及突变组合，看对抗体活性的影响，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，得到结构、活性等优化的抗体分子序列，即本发明抗人CLDN18.2鼠源抗体mab5b的人源化系列优化抗体分子。

具体地，在对本发明抗体mab5b轻链分析发现，包含CDR1 (L24-L34位, 如下序列划线部分) 和CDR2 (L50-L56位, 如下序列划线斜体部分) 序列 KSSQSLLNSGNQKNYLT WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES 和本发明人源化优选人种系轻链IGKV4-1*01(F)的序列同源性很高。其中，L24-L34 CDR1 只有5个氨基酸不同，分别是L29, L30A, L30C, L30E和L34位，见下表9a。而L50-L56位CDR2则完全相同（见下表9b）。本发明首先对mab5b CDR1 五个位点（L29, L30A, L30C, L30E和L34位）进行了回复突变成人种系IGKV4-1*01（F）对应位点的氨基酸，组合设计如下表9a。

表9a 本发明鼠源anti-hCLDN18.2抗体mab5b 序列L24-L34位 (CDR1)氨基酸以及人源化

氨基酸位置编号

L24

L25

L26

L27

L28

L29

L30

L30A

L30B

L30C

L30D

L30E

L30F

L31

L32

L33

L34

mab5b

K

S

Q

S

L

L

N

S

G

N

Q

K

N

Y

L

T

IGKV4-1 *01(F)

V

Y

S

N

A

Var1

V

Var2

V

A

Var3

N

A

Var4

Y

S

Var5

Y

S

A

Var6

V

Y

S

A

Var7

V

Y

S

N

A

Var8

A

表9b 本发明鼠源anti-hCLDN18.2抗体mab5b 序列L50-L56位 (CDR2)氨基酸

氨基酸位置编号

L50

L51

L52

L53

L54

L55

L56

mab5b CDR2

W

A

S

T

R

E

S

IGKV4-1 *01(F) CDR2

W

A

S

T

R

E

S

将上述人源化设计分子Var1, Var2, Var3, Var4, Var5, Var6, Var7, Var8和mab5b按前述实施例子3克隆表达纯化，按实施例子2检测和人CLDN18.2+细胞结合活性，结果如下表10。

表10 本发明抗体轻链CDR1 序列人源化优化

抗体	EC50 (nM)	Emax
			mab5b	0.215	1.93
Var1	0.461	1.83
			Var2	0.221	1.7
Var3	0.143	1.46
			Var4	0.434	1.7
Var5	0.656	1.37
			Var6	7.67	1.14
Var7	9.51	1.02
			Var8	0.20	1.79

上述结果表明，本发明抗体mab5b的轻链CDR1 人源化优化序列KSSQSVLNSGNQKNYLT(Var1), KSSQSVLNSGNQKNYLA (Var2), KSSQSLLNSGNNKNYLA(Var3), KSSQSLLYSSNQKNYLT(Var4), KSSQSLLYSSNQKNYLA(Var5), KSSQSLLNSGNQKNYLA(Var8), 均保留了和mab5b同样(接近)的结合活性。

进一步，用上述所述人源方法，将mab5b进行人源化设计，优选得到本发明mab5b抗体人源化轻链可变区优选序列如下：

L14：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 29)

L11：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTHFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 30)

L12：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 31)

L13:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 32)

L15：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTHFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 33)

由上述所述方法得到本发明人源化重链可变区优选序列如下：

H51：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 34)

H52：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 35)

H53：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 36)

H54：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 37)

上述轻链可变区序列，包含列出的如 L14, L11, L12，L13, L15和未列出的所示任意序列与人抗体轻链κ型或λ型轻链恒定区组合得到本发明人源化抗体轻链序列。上述重链可变区序列，包含列出的如H51, H52, H53, L54和未列出的所示重链可变区序列和hIgG1,2, 3, 4等不同亚型的恒定区序列组合得到本发明抗体的重链序列。所述轻链、重链任意组合得到本发明人源化抗体，部分人源化抗体序列如下表11所示。

表 11 本发明人源化抗体部分优选序列

本发明部分人源化抗体序列：

人源化Ab10抗体氨基酸序列：

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 38)

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 39)

人源化Ab7抗体氨基酸序列：

轻链:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTHFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 40)

重链：

人源化Ab8抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 41)

人源化Ab9抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

人源化Ab6抗体氨基酸序列：

轻链:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNSGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 42)

重链：

人源化Ab11抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 43)

人源化Ab12抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 44)

人源化Ab13抗体氨基酸序列：

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 45)

重链：

人源化Ab14抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

人源化Ab15抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO: 39)

用本发明所述实施例3方法克隆、表达纯化重组抗体，实施例子2 所述ELISA 方法检测筛选上述人源化抗体和hCLDN18.2+ cell, hCLDN18.1+ cell 的结合活性, 结果见下表12，和图2a。

表12本发明人源化anti-hCLDN18.2抗体和hCLDN18.2+cell,hCLDN18.1+cell的结合活性

NA:不适用；ND:没有检测到

表12结果表明，本发明发现的抗体mab5b人源化后，保持了鼠源抗体结合活性比对照抗体Ref高的优势，人源化抗体Ab10的EC 50比Ref要好2倍(0.117vs 0.345)。不仅如此，这些人源化优化的分子的结合最高值Emax比对照抗体Ref高出39.8％-54.1％。比鼠源抗体mab5b更加优于对照抗体。

为了进一步优化本发明人源化分子，优选最终序列和人抗体种系轻、重链尽量趋于一致，减少鼠源抗体中少量序列可能造成的免疫原性，优选人源化优化轻链CDR1序列Var3（见表9）设计了系列人源化抗体，并进行了特异结合活性筛选。结果如下表13和图 2b。

表 13本发明人源化 anti-hCLDN18.2抗体优化抗体和hCLDN18.2+ cell,hCLDN18.1+ cell的结合活性

ND: 没有检测到

上述结果表明，本发明进一步优化得到的人源化抗体（表13和图2b）中，这些人源化抗体的回复突变的氨基酸数目各有不同，包括Ab1-Ab20（见表11）。其中，有6个回复突变的，如Ab10 (轻链1个，重链5个)；有6个回复突变，并且轻链 CDR1人源化优化的，如Ab6 (轻链1个，重链5个)；有 2个回复突变如Ab14 (轻链0个，重链2个)；有只有 1个回复突变如Ab11(轻链1个，重链0个)，以及完全没有回复突变的，如Ab13。这些优化的人源化分子活性，包括EC50 和 Emax 活性，都保持了和Ab10（表12中已经优化的mab5b人源化分子）相同的水平且都不和hCLDN18.1+细胞结合。

特别意外地发现的Ab13抗体分子没有任何回复突变，即是全人源化的抗体分子，且CDR1序列人源化优化，其结合活性（EC50 和 Emax）和Ab6, Ab10一样。

上述结果表明，本发明在鼠源抗体mab5b序列通过人源化，优化筛选得到的抗体分子，包含只人源化FR区，轻链CDR1 保持wild type (没有突变)，如Ab10; 或FR区人源化外，轻链CDR1也进行了人源化优化的序列Var3, 所得到的Ab6, Ab11-15等，均保持了其结合活性，且均优于对照分子， EC50比对照分子强1倍， Emax 比对照分子高出 30%-50%, 而且都不同hCLDN18.1+细胞结合。

实施例7: 本发明抗体序列脱酰胺基敏感（deamidation）位点序列优化

通过对本发明mab5b 序列以及人源化后的优化序列（上述表9a, 9b，11）计算机结构模拟分析，对可能存在的，特别是CDR区的转录后修饰（Potential post-translationalmodifications，PTMs）位点分析，包括抗体的聚集，脱酰胺基敏感（asparaginedeamidation）位点（NG, NS, NH等），天冬氨酸异构（DG，DP）敏感位点, N 糖基化（N-{P}S/T）敏感位点, 氧化敏感位点等分析，发现本发明抗体轻链 CDR1 （CDR1, L Chain）第L30A,L30B 位为 NS，重链CDR3 (CDR3, H Chain) 第H99, H100为NS, 其中的L30A位、H99位的asparagine (N) 可能对deamidation敏感。为了降低本发明抗体用于药物制剂时抗体分子的成药性相关风险，我们对这两个可能的敏感位点进行了序列优化。具体地，对本发明抗体轻链 CDR1 的 L30A, L30B位 (NS); 重链 CDR3的 H99， H100位（NS）点进行突变，优选方案如下：

表14 本发明抗体序列脱氨基敏感位点序列优化设计

突变设计	CDR 序列	轻链CDR1	重链CDR3
				野生型（即没有突变）	KSSQSLLNSGNNKNYLA (SEQ ID NO: 12)	NA*	NA
突变设计1	KSSQSLLTSGNNKNYLA (SEQ ID NO: 64)	NS->TS	NA
				突变设计2	KSSQSLLNTGNNKNYLA (SEQ ID NO: 65)	NS->NT	NA
野生型（未引入突变）	VYYGNSFAY (SEQ ID NO: 17)或者 ARVYYGNSFA (SEQ ID NO: 28)	NA	NA
				突变设计1	VYYGTSFAY (SEQ ID NO: 66)或者 ARVYYGTSFA (SEQ ID NO: 67)	NA	NS->TS
突变设计2	VYYGNTFAY (SEQ ID NO: 68)或者 ARVYYGNTFA (SEQ ID NO: 69)	NA	NS->NT

*: NA, 不适用（没有做改变）

上述优选脱氨基优化可变区序列如下：

L20:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLTSGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 46)

L21:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNTGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 47)

L22:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNTGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 48)

L23:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNTGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 49)

H60:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGTSFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50)

H61:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51)

H62:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 52)

H63：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53)

H64:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 54)

将上述优化的脱酰胺基敏感位点优化设计后的序列以不同轻、重链组合表达抗体后进一步筛选结合活性。所述抗体组合部分见下表。

表15本发明抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体

*: - 代表没有突变

Ab30 抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 55)

Ab34 抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

Ab35 抗体氨基酸序列：

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNTGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 56)

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 57)

Ab36抗体氨基酸序列：

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLNTGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 58)

重链：

上述优选抗体按实施例子3方法表达、纯化后用实施例2之方法检测其和人CLDN18.2+cell的结合活性，结果见表16a，16b, 表16c和图3a, 3b。

表 16a本发明人源化 anti-hCLDN18.2抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体活性

*: Ab14作为本次assay 对照样品（没有NT突变）

表 16b本发明人源化 anti-hCLDN18.2抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体活性

*: Ab14作为本次assay 对照样品（没有NT突变）

表 16c本发明人源化 anti-hCLDN18.2抗体脱酰胺基敏感位点优化抗体活性

表16a结果表明，Ab21 (轻链 CDR1 NS->TS 和重链 CDR3 NS-> TS) “几乎没有” 结合活性（>16nM）。 Ab23 (轻链CDR1 NS->NT, 重链 CDR3 NS-> TS) 也 “几乎没有” 结合活性（>40nM）。 Ab22 (轻链CDR1 NS-> TS, 重链 CDR3 NS-> NT) 结合活性有所下降，但没有完全消失 (EC50=1.37nM vs Ab14 EC50 =0.35) 。也就是说虽然轻链CDR1的L30A位 N-> T, 但因为重链 CDR3的 H99位 N没有突变，抗体的结合活性从 “几乎没有” 回复到1.37nM, 比正常Ab14减少了近3倍。而Ab56 (轻链CDR1 NS-> NT, 重链 CDR3 NS-> NT) 的结合活性则和正常分子Ab14一样，其EC50=0.295nM。

综合表16a结果说明，本发明抗体轻链 CDR1 的 L30A位 N 和重链 CDR3 第H99位N 对本发明抗体的结合非常重要，这些点的突变（比如变为T）直接导致活性丢失或者完全没有活性。但是轻链的 L30B位 S 和重链 CDR3 第H100位S突变为T对结合活性没有影响。

表16b数据进一步证明单独轻链的 L30B位 S 突变为T, 或者单独重链 CDR3的第H100位S突变为T，对结合活性没有影响。

非常意外地，表16b数据表明，Ab30(重链CDR3,NS->NT)完全失去了结合活性(EC50>11nM,即实际上结合曲线已经和阴性对照一样，和抗原没有特异结合作用了)，但Ab34 含有同样的重链(CDR3,NS->NT)却没有失去活性。这说明Ab30活性的丢失不是由于CDR3, NS->NT的变化引起的。鉴于这两个分子唯一的差别是轻链CDR1的不同，即Ab30轻链为L14，其CDR1为KSSQSLLNSGNQKNYLT；Ab34轻链为L12,其CDR1KSSQSLLNSGNNKNYLA，划线部分为两个CDR1序列的不同。这一意外的发现表明，当重链CDR3第H100位S突变为T(以避免潜在的脱酰胺基)的时候，轻链的CDR1序列必须是KSSQSLLNSGNNKNYLA(即CDR1序列优化的Var3,见表9a)。轻链CDR1如果是KSSQSLLNSGNQKNYLT的话(划线部分为两个 CDR1序列的差异)，则整个抗分子将完全失去结合活性(见图3a中的Ab30)。这一发现表明，本发明抗体CDR1如果第L30E位是Q和L34位是T(划线标出)则重链第H100位S 不能进行突变，如以避免潜在的脱酰胺基H100位S突变为T，否则整个抗体失去结合活性。为了进一步确认本发明抗体轻链CDR1序列KSSQSLLNSGNQKNYLT(第L30E位Q和L34位T) 和人源化优化的CDR1序列KSSQSLLNSGNNKNYLA(第L30E位N和L34位A)的不同对本发明抗体轻链CDR1和重链CDR3中NS突变(以避免潜在的脱酰胺基)的影响，我们比较了Ab10 (CDR1:KSSQSLLNSGNQKNYLT)和Ab6(CDR1:KSSQSLLNSGNNKNYLA)，这两个分子唯一的区别在于其轻链CDR1(划线的氨基酸为两者的不同)。以及这两个分子的轻链CDR1和重链CDR3 上同时进行NT->NS突变，得到的Ab35,Ab36两个抗体。表16c结果表明Ab35完全失去了结合活性(EC50>62nM)(见图3b，Ab35)。

这一数据确认了本发明所发现的轻链CDR1 序列KSSQSLLNSGNNKNYLA第L30E位是N和L34位是A（划线标出）即CDR1人源化优化的序列不影响轻链CDR1第L30B位S(斜体)，和或重链第H100位S进行突变以避免潜在的脱酰胺基（比如L30B位S突变为T或/和 H100位 S突变为T）。

如果CDR1 序列KSSQSLLNSGNQKNYLT第L30E位是Q和L34位是T（划线标出）则CDR1第L30B位S(斜体)或重链第H100位S均不能进行突变（比如L30B位S突变为T或 H100位 S突变为T），任何这样的突变会让抗体的结合活性消失。

综合上述结果表明，本发明抗体轻链CDR1 L30A，L30B 位NS；重链CDR3 H99,H100位NS可以通过 NS->NT之优化突变来降低可能的deamidation风险，但只对CDR1 的第L30E位是N, L34位是A (即序列为人源化优化的序列KSSQSLLNSGNNKNYLA) 时候才可以，如果该区序列为KSSQSLLNSGNQKNYLT则抗体完全失去活性（划线部分为两者的序列不同）。

实施例 8: 本发明抗体Fc序列（变体）活性分析

本发明抗体可变区和人抗体不同的轻、重链恒定区，包括但不限于实施例子3所列出的人抗体不同的轻链（κ、λ型轻链等）、重链恒定区（hIgG2, hIgG4, hIgG1）组合，特别是人的IgG1 Fc 序列变体，比如第356-358位为DEL 或 EEM的不同形式，可以得到不同抗体变体形式。表17列出了部分本发明抗体和Fc序列的变体形式，包括Fc 区序列第356-358位为DEL 或 EEM。

表17 本发明抗体轻重链、重链恒定区不同的抗体

编号	轻链	重链	hIgG1, 356-358位
				Ab10	L14	H51	DEL
Ab42	L14	H51	EEM
				Ab6	L12	H51	DEL
Ab43	L12	H51	EEM
				Ab13	L13	H53	DEL
Ab48	L13	H53	EEM
				Ab51	L21	H64	DEL
Ab52	L21	H64	EEM
				Ab14	L13	H54	DEL
Ab53	L13	H54	EEM
				Ab24	L21	H61	DEL
Ab56	L21	H61	EEM

所述部分抗体序列如下：

Ab42 抗体氨基酸序列：

轻链：

重链:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVKQAPGQGLEWIGLINPGSGGTNYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNSFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 59)

Ab43 抗体氨基酸序列：

轻链：

重链:

Ab24 抗体氨基酸序列：

轻链：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNTGNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 60)

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 61)

Ab51抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 62)

Ab56 抗体氨基酸序列：

轻链：

重链：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSNYLIEWVRQAPGQGLEWMGLINPGSGGTNYNEKFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYYGNTFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ IDNO: 63)

上述优选抗体按实施例子3方法表达、纯化后用实施例2之方法检测其和人CLDN18.2+cell 的结合活性，代表数据如下表18。结果表明，轻、重链恒定区的上述变化，包括hIgG1的356-358位分别是DEL或者EEM不影响本发明抗体的活性。

表 18本发明人源化 anti-hCLDN18.2抗体 IgG1 Fc 356-358位DEL 或EEM的结合活性

实施例 9:本发明抗体Fc 区 (人IgG1) 针对 ADCC, CDC 活性的序列优化

本发明抗体特异结合人CLDN18.2用于肿瘤治疗作用机理之一是可以通过抗体Fc介导效应细胞（effector cells）对肿瘤细胞的杀伤达到治疗肿瘤的目的。本发明抗体人Fc区（hIgG1 Fc）介导效应细胞ADCC和CDC作用，能特异增强靶向肿瘤细胞作用，对非特异靶点则导致靶点外的副作用。人抗体Fc区 (hIgG1 Fc) 介导的 ADCC和CDC作用有很多研究。本发明对所发现抗体分子的Fc区域针对人血细胞的效应作用（ADCC 和 CDC）进行了确认。具体地，在本发明抗体的人抗体Fc区域 (hIgG1 Fc) 进行不同的突变，评价这些突变体的ADCC和 CDC活性，突变设计见表19，活性数据见表20a, 20b。

表19 本发明抗体Fc （IgG1）针对ADCC, CDC的活性位点设计

编号	轻链	重链	hIgG1, Fc区域
				Ab10	L14	H51	WT
Ab57	L14	H51	F243L
				Ab58	L14	H51	S239D/A330L/I332E
Ab6	L12	H51	WT
				Ab59	L12	H51	F243L
Ab60	L12	H51	S239D/A330L/I332E
				Ab24	L21	H61	WT
Ab65	L21	H61	F243L
				Ab66	L21	H61	S239D/A330L/I332E

上述优选抗体按实施例子3方法表达、纯化后得到抗体后，分别进行ADCC（抗体依赖性细胞毒性实验）和 CDC（补体依赖细胞毒性实验）检测抗体Fc序列优化后的活性。具体地，

ADCC：

实施例1中构建好的hCLDN18.2+ 细胞，正常培养。培养基为DMEM/F12 加10% FBS（上海源培生物科技股份有限公司 Cat#L310KJ），作为本实验ADCC用的靶细胞。

实验前一天，取培养好的 hCLDN18.2+细胞，计数5000个/孔铺96-孔板。实验当天，准备PBMC细胞（本发明分离自人体外周血。人体外周血由本公司志愿者捐献），按照150000cell / 50 μl 浓度将PBMC 悬浮于无血清RPMI 1640 培养基 (培源生物，Cat#L210KJ)。待测药物用无血清RPMI 1640配制，起始浓度40ug/ml 按3倍比例稀释。

取出培养好的靶细胞（hCLDN18.2+细胞），小心吸取移去上清，加入配制好的PBMC,50μl/孔; 同时加入50μl/孔配制好的不同浓度的待测样品，后将靶细胞于 37°C, 5% CO2培养箱中孵育4小时，检测LDH。

LDH试剂盒为 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，购自东仁化学科技（上海）有限公司，货号CK12。操作方法按说明书进行，取出孔板，在每孔中加入100 μl WorkingSolution，包裹铝箔避光，在室温反应10-40 min，Multiskan GO （ThermoFisher）酶标仪490nM 读数，每隔10min检测一次，取合适的反应时间数据，用Graphpad prism 5分析处理数据。

CDC：

实施例1中构建好的hCLDN18.2+ 细胞，作为本实验CDC用靶细胞。hCLDN18.2+ 细胞正常培养，培养基为 DMEM/F12加10%FBS（同ADCC）。实验前一天，收集靶细胞，计数，配制1X10⁵/ml细胞，100μl/孔加入到96孔细胞培养板中。37°C, 5% CO2 孵育过夜备用。

实验当天，移走96-孔板细胞中的培养基，用PBS洗2遍待用。待测抗体用无血清培养基（RPMI 1640）稀释, 抗体起始浓度为20ug/ml, 按 5倍稀释。将50μl/孔稀释抗体加入PBS洗过的靶细胞培养板（0 ug/ml 抗体孔用新鲜培养基100μl/孔, 作为对照孔），各个浓度点设6个复孔。37°C , 5% CO2 孵育15min。

准备补体：取新鲜血清于灭菌的离心管中。分取一半血清于56°C水浴锅孵育30分钟灭活补体，作阴性对照。将灭活和没有灭活的血清，分别用RPMI 1640培养基配成血清：RPMI 1640培养基= 40%：60%，即40%为血清， 60%为RPMI 1640。

向含不同浓度待测抗体的靶细胞培养板中加入50μl/孔稀释好的血清，即血清终浓度为20%；样品（抗体）的起始浓度为10ug/ml。前3复孔加入有补体的血清，后3复孔加入灭活补体的血清。37°C, 5% CO2度培养箱孵育2小时, 后取出用LDH试剂盒检测。

LDH试剂盒为 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，购自东仁化学科技（上海）有限公司，货号CK12。操作方法按说明书进行，取出孔板，在每孔中加入100 μl WorkingSolution，包裹铝箔避光，在室温反应，每隔10min检测一次，取合适的反应时间数据，Multiskan GO （ThermoFisher）酶标仪 490nM 读数，Graphpad prism 5分析处理数据。

表20a 本发明抗体Fc （IgG1）突变体ADCC活性检测

样品	EC50 (ug/ml)
		Ab6	1.40
Ab59	检测不到（无结合）
		Ab60	0.431
Neg IgG*	检测不到（无结合）

* Neg IgG: 为和靶点没有结合的非特异性抗体

表20b 本发明抗体Fc （IgG1）突变体CDC活性检测

样品	EC50 (ug/ml)
		Ab6	0.290
Ab59	检测不到（无结合）
		Ab60	0.973
Ab24	0.255
		Ab65	检测不到（无结合）
Ab66	0.927
		Neg IgG*	检测不到（无结合）

* Neg IgG: 为和靶点没有结合的非特异性抗体

上述结果表明，本发明抗体如果用hIgG1的形式，其Fc区域第243位F单个位点突变，比如F243L会完全失去本发明抗体的ADCC和CDC活性；如Fc区域第239，330，332三个位点组合突变，比如 S239D/A330L/I332E，则本发明抗体CDC活性有所减弱。

实施例 10：本发明抗体不同人源化分子ADCC, CDC活性评估

为了评估本发明人源化抗体分子ADCC 和CDC活性，用同上述实施例子的方法，和对照分子（Ref）一起，检测了本发明人源化分子的ADCC和CDC活性，结果见下表21a, 21b和图4。

表21a 本发明抗体不同人源化分子ADCC活性评估

样品	EC50 (ug/ml)
		Ab10	1.55
Ab6	1.40
		Ref	1.39
Neg IgG*	检测不到（无结合）

* Neg IgG: 为和靶点没有结合的非特异性抗体

表21b 本发明抗体不同人源化分子CDC活性评估

样品	EC50 (ug/ml)
		Ab10	0.648
Ab35	检测不到（无结合）
		Ab6	0.293
Ab36	1.75
		Ab14	0.265
Ab24	1.30
		Ab13	0.374
Ab51	2.12
		Ref	2.31
Neg IgG*	检测不到（无结合）

* Neg IgG: 为和靶点没有结合的非特异性抗体

上述结果表明，本发明人源化抗体ADCC活性和对照抗体（Ref）相当（表21a）。意外地，本发明人源化分子，包括含不同回复突变的人源化分子之间，Ab6, Ab13, Ab14 等的CDC活性接近（EC50 分别为0.293ug/ml，0.374ug/ml, 0.265ug/ml）且比Ab10 (0.648ug/ml)好1倍以上，尤为意料之外的是Ab6, Ab13, Ab14 等的CDC活性比对照抗体（EC50 =2.31ug/ml）好近10倍（见表21b, 图4）。Ab36, Ab24的CDC活性也都比对照抗体Ref要好。

Ab35（CDR1, CDR3 NS突变体，参见实施例子7, 表16c）因为失去了结合活性，而检测不到CDC活性。

实施例 11: 本发明抗体诱导肿瘤细胞（hCLDN18.2+ cell）凋亡活性评价

为检测本发明抗体，特别是优选人源化抗体诱导hCLDN18.2+ cell (肿瘤细胞) 凋亡的作用，我们用本发明实施例1中构建好的hCLDN18.2+ cell，检测了本发明抗体诱导肿瘤细胞凋亡活性。hCLDN18.2+ cell正常培养（培养基含10% FBS的DMEM/F12, 供应商:上海源培生物科技股份有限公司，货号：L310），作为本实验所用细胞。实验开始，hCLDN18.2+ cell铺96-孔板，铺板密度为2x10⁴/孔。 37°C, 5% CO2培养过夜贴壁。抗体样品准备：用无血清DMEM/F12培养基制备0gu/ml， 1 ug/ml， 3ug/ml, 10 ug/ml抗体样品。取出过夜贴壁培养的hCLDN18.2+ cell，弃培养基，并用PBS洗细胞两次。分别加入准备好的不同浓度的抗体样品，100μl/well。继续培养24h后，检测LDH。

LDH试剂盒为 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，购自东仁化学科技（上海）有限公司，货号CK12。操作方法按说明书进行，取出孔板，在每孔中加入100 μl WorkingSolution，采用包裹铝箔等方法避光，在室温反应，在不同的时间点（10 min, 20min,30min, 40min , 50min），Multiskan GO （ThermoFisher）酶标仪 490nM 读数，找出最佳的反应时间，取读数值用Graphpad prism 5分析处理数据。

结果见图5a，图5b。图5a, 5b 结果表明，本发明人源化抗体Ab10, Ab6, Ab14,Ab24, Ab36 等诱导肿瘤细胞凋亡的活性都比对照分子（Ref）好，活性好/强3-10倍，这些分子10 ug/ml浓度已经比对照分子的30ug/ml活性相当或者甚至比阳性分子30ug/ml活性还强。

具体地， Ab6 10ug/ml 增加肿瘤细胞凋亡活性（46.7%）比阳性对照同浓度（15.3%）好2倍以上；甚至比阳性对照 30ug/ml（19.6%）还好1倍以上；而30ug/ml 浓度时诱导肿瘤细胞凋亡活性（85.1%）比同浓度下对照抗体（19.6%）的好3倍以上。

更意外地，Ab6 10ug/ml 增加肿瘤细胞凋亡活性（46.7%）比Ab10 同浓度（33.2%）好41%； 30ug/ml 浓度时诱导肿瘤细胞凋亡活性（85.1%）则比同浓度下Ab10 （34.7%）的强1倍多。

实施例 12: 本发明抗体抑制肿瘤细胞（hCLDN18.2+ cell）增值作用

为检测本发明抗体对肿瘤细胞的增值抑制所用，用实施例子1构建的hCLDN18.2+ 细胞进行了活性检测。具体地， hCLDN18.2+ 细胞正常培养（培养基：含10% FBS的DMEM/F12,供应商:上海源培生物科技股份有限公司，货号：L310）。实验开始时，取对数期生长的hCLDN18.2+细胞铺96-孔板，铺板密度为3x10³/孔。37°C, 5% CO2培养过夜贴壁培养。抗体样品准备：用含10% FBS的DMEM/F12 (源培生物) 配制1 ug/ml，10ug/ml，30 ug/ml抗体样品。取出过夜帖壁培养的hCLDN18.2+ 细胞，弃培养基，并用PBS洗细胞一次，后分别加入准备好的不同浓度的抗体样品，100μl/well。继续培养72h后，用 CCK-8试剂盒检测。

CCK-8试剂盒为 Cell Counting Kit-8，购自东仁化学科技（上海）有限公司，货号CK04。操作方法按说明书进行，取出96孔板，在每孔中加入10 μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，否则会影响读数），将培养板在培养箱中孵育1-4h，找出最优检测时间点，Multiskan GO （ThermoFisher）酶标仪 450nM 读数，数值用Graphpad prism 5分析处理数据。结果见下表22。

表22 本发明优选人源化抗体抑制肿瘤细胞（hCLDN18.2+ cell）增值活性(抑制率%)

样品/浓度	1 ug/ml	10 ug/ml	30 ug/ml
				Neg IgG	0	0.34	0.1
Ab10	2.17	2.93	3.16
				Ab6	3.29	6.12	6.2
Ref	2.34	2.94	3.9

表22 结果表明，阴性抗体1 ug/ml，10 ug/ml，30 ug/ml浓度下抑制肿瘤细胞活性（抑制率）在 1%以下，即本底水平。1 ug/ml，10 ug/ml，30 ug/ml Ab10抑制肿瘤细胞活性（抑制率）在2.17 % - 3.16%，这和Ref的抑制率 2.34 % - 3.9%接近。而Ab6抑制肿瘤细胞活性则比Ref 强很多，例如10ug/ml 抑制率 6.12 %是 Ref (2.94%) 的2倍以上。

实施例 13: 本发明人源化抗体和鼠CLDN18的结合活性检测

按照前述实施例2之方法，检测了本发明人源化优选抗体和鼠CLDN18.1+ cell和鼠CLDN18.2+ cell的结合活性。在筛选过程中，我们筛选得到了一个克隆（抗体L180），该抗体和人和鼠的CLDN18.1均有结合。作为本assay的对照， L180 和mCLDN18.1+ cell 结合活性EC50 = 0.48 nM, 表明本发明构建鼠CLDN18.1+ cell和抗CLDN18.1抗体有特异结合。而本发明优选人源化抗体和mCLDN18.1+ cell均没有结合，且都保留了同鼠源抗体mab5b一样的和mCLDN18.2+ cell的结合活性，见下表23。

表23 本发明优选人源化抗体和mCLDN18.2+ cell的结合活性

样品	EC50 (nM)	Emax
			mab5b	0.375	2.17
Ab10	0.371	2.27
			Ab35	ND#	ND
Ab6	0.594	2.47
			Ab36	0.518	2.18
Ab14	0.399	2.39
			Ab24	0.574	2.22
Ab13	0.422	2.37
			Ab51	0.474	1.91
Neg IgG*	无结合	0.19（本底）

#: 未检测。* Neg IgG: 为和靶点没有结合的非特异性抗体

上述结果表明，本发明优选人源化抗体都保留了和mCLDN18.2+ cell 的结合活性。EC50 和人源化前的mab5b (同一assay中EC50=0.375 nM) 具有相同的结合活性。 Emax 在1.91 (Ab51) – 2.47 (Ab6) 之间，和 mab5b (2.17) 接近。

实施例 14: 本发明抗体体内药效活性评估

为了评价本发明抗体的抗肿瘤活性，用BALB/c裸小鼠皮下移植hCLND18.2+细胞（实施例1构建）或者胃癌细胞系NUGC4 (上海素尔生物科技有限公司) 建立的动物药效模型，进行本发明抗体体内药效评估。

具体地，hCLDN18.2+ 细胞培养基为DMEM/F12 (源培生物) 加10% 胎牛血清（上海博升生物科技有限公司，货号BS-0002-500）。 NUGC4细胞培养基为RPMI1640 (源培生物)，加10% 胎牛血清。培养条件为37°C ，5% CO₂。BALB/c Nude小鼠，雌性，4周龄，体重18-20g，购自上海西浦尔必凯实验动物有限公司（生产许可证编号：SCXK(京)2012-0001），室温20-25°C, 湿度 40-60%，自由进食进水，适应性饲养3-4天。适时更换垫料、洁净笼具。取对数生长期细胞，收集并计数。

对于hCLDN18.2+ 细胞异体移植模型，取hCLDN18.2+ 细胞用PBS洗2次后，重悬配成细胞1x10⁸/ml。在小鼠左翼皮下接种0.1ml 共 1 × 10⁷细胞/只。挑选肿瘤长至体积约120-180mm³大小小鼠，随机分组，每组5-6只。

对于胃癌NUGC4细胞异体移植模型，取NUGC4细胞用RPMI1640洗2次后，加入Matrigel，使其与RPMI640比例为1:1，用混合液重悬配成细胞, 1x10⁸/ml。在小鼠左翼皮下接种0.1ml 共 1 × 10⁷细胞/只。挑选肿瘤长至体积约150-200mm³大小小鼠，随机分组，每组5-6只。

待测样品用PBS配制，无菌。 Blank为PBS无样品对照，和靶点无关的抗体，即阴性抗体(Neg IgG) 对照。腹腔注射，200ug/100μl/只。2次/周，连续数周。注射样品当天为第0天。每次给药前测量体重，肿瘤体积，记录数据。

肿瘤大小计算公式：

肿瘤体积TV（mm³）= 0.5 ×（肿瘤长径 × 肿瘤短径²）

相对肿瘤增长率（T/C %） = 100%* (T-T0)/(C-C0)

抑瘤率(TGI) = (1-T/C)* 100%

其中T0, T分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；C0, C 分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。

动物体内药效结果见图6a, 6b (hCLDN18.2+ 细胞异体移植模型) 和下表24(NUGC4肿瘤细胞异体移植模型)。

用人CLDN18.2 高表达细胞(hCLDN18.2+ cell) 建立的肿瘤异体移植模型中，图6a结果显示，本发明抗体Ab10, Ab6和阳性抗体分子（Ref）一样显示非常好的体内药效活性，抑制肿瘤细胞生长和/或杀死肿瘤细胞（抑制率）达到90%以上；意想不到的是，轻链CDR1和重链CDR3 脱氨基敏感位点优化，轻链CDR1人源化优化的优选抗体Ab36完全抑制肿瘤生长，其体内药效明显优于Ab6， Ab10以及对照阳性抗体（Ref）。图6b 结果显示，本发明完全人源化抗体（没有回复突变）Ab13, 及其轻链CDR1和重链CDR3 脱氨基敏感位点优化的完全人源化抗体Ab51, 以及轻链CDR1和重链CDR3 脱氨基敏感位点优化，重链仅有2个回复突变的人源化抗体Ab24均显示了和对照抗体一样的体内药效。

表24本发明抗体在胃癌细胞系NUGC4肿瘤模型中的药效评价

在人胃癌细胞系NUGC4建立的肿瘤模型中，上述结果(表24)表明，本发明人源化优选抗体Ab10,Ab6均显示了一定药效，肿瘤抑制率在10％-20％，并且呈现剂量依赖。而同样的模型中，对照抗体(Ref)则和PBS对照，阴性抗体(Neg IgG)一样，没有抑制肿瘤效果。这一结果表明，本发明抗体具有优于阳性对照抗体的体内药效效果。

实施例 15: 本发明抗体小鼠药物代谢动力学（PK）评价

如上述实施例子13所述，本发明抗体和小鼠CLDN18.2有很好的结合活性，这为本发明抗体提供了临床前研究非灵长类物种选择。本发明评估了本发明抗体在小鼠体内的药物代谢动力学（PK）特性。

具体地，实验用Balb/c小鼠，雌性， 6周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。小鼠购进后，每笼6只，无限量获取饲料和水。实验室环境饲养3天，温度20-25 ℃；湿度40-60 %，12/12小时光/暗周期调节。实验开始前一天，对小鼠进行体重测量，取20-25g小鼠，进行分组编号， 3只/组。实验当天，每只小鼠分别皮下注射受试药物Ab10和对照抗体（Ref）, 药物给药剂量为10 mg/kg，皮下注射100ul/只/次。

注射小鼠后0、 1、6、24、26、30、50、55、71、79、98、143、167、191、215、240小时分别眼眶取血。所取血样离心，取上清，-20度保存，待测。

等收集完血液样本后，用前述实施例子2之ELISA方法检测血清中的血药浓度。正式检测之前，取一只小鼠血清，进行梯度稀释，确定血清最佳稀释比例。所有样品按照最佳稀释比例进行ELISA检测，检测结果用T1/2计算公式和EXCEL软件对数据进行分析，结果如下表25。

表25本发明抗体在小鼠体内PK评价

上述表25结果表明，本发明抗体Ab10的Cmax比对照抗体(Ref)高57％ ([407.7-259.3]/259.3)。更加意外的是，本发明抗体Ab10的半衰期T1/2比对照抗体(Ref)要长30.7多个小时(170.1-139.4)，小鼠体内长达30小时的T1/2优势，预期人体内优势会更大。这些结果表明，本发明人源化抗体具有比对照抗体优良的PK性能，特别是半衰期T1/2 的显著优势，预期为临床至少可以带来药效(时间长)和成本(给药频率低)等优势。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海健信生物医药科技有限公司

<120> 一种针对人CLDN18.2的新型抗体分子, 抗原结合片段及其医药用途

<130> 2018-6-1

<160> 69

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu

1 5 10 15

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1 5 10

Claims

1.一种能够和人细胞连接密蛋白18.2 (hCLDN18.2蛋白) 特异性结合的抗体分子或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，在所述轻链可变区和/或重链可变区中，所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段相应地包含至少1个选自以下的CDR序列或其突变序列：

2.根据权利要求1所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；或

所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；或

所述VL包含SEQ ID NO: 22所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；或

所述VL包含SEQ ID NO: 23所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；

和/或

其包含重链可变区(VH)，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；或

所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；或

所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；或

所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 21所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；或

所述VH包含SEQ ID NO: 26所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

3.根据权利要求1或2所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 16所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 15所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 11所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 21所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 12所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 13所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 14所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 20所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 21所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 17所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 22所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 26所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列；

其包含VL，所述VL包含SEQ ID NO: 23所示的VLCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ IDNO: 24所示的VLCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 25所示的VLCDR3氨基酸序列或其突变序列；和包含VH，所述VH包含SEQ ID NO: 26所示的VHCDR1氨基酸序列或其突变序列、SEQ ID NO: 27所示的VHCDR2氨基酸序列或其突变序列和SEQ ID NO: 28所示的VHCDR3氨基酸序列或其突变序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段；

优选地，所述鼠源抗体分子或其结合片段的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或其突变序列；和/或优选地，所述鼠源抗体分子或其结合片段的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列或其突变序列。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段包含鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和鼠或人抗体恒定区，所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b3或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区等；所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区等；优选地，所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和人抗体恒定区组合成的嵌合抗体分子或其结合片段。

6.根据权利要求5所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述嵌合抗体分子或其结合片段的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列或其突变序列；和/或所述嵌合抗体分子或其结合片段的重链氨基酸序列为SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或其突变序列。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为人源化抗体分子或其结合片段；

优选地，所述人源化抗体分子或其结合片段的轻链可变区框架(FR)序列选自人种系轻链序列，例如 IGKV4-1*01(F), IGKV2-28*01(F), IGKV2D-28*01(F), IGKV1-27*01(F),IGKV1-39*01(F), IGKV1D-39*01(F), IGKV2-40*01(F), IGKV2D-29*01(F), IGKV2D-40*01(F), 或IGKV3-15*01(F)等，优选IGKV4-1*01(F)；更优选地，所选人种系轻链IGKV4-1*01的CDR2序列同SEQ ID NO: 13; J基因例如hJK1, hJK2.1, hJK2.2, hJK2.3, hJK2.4等，优选hJK2.1；

优选地，所述FR序列包含0-10个氨基酸回复突变；优选地，所述人源化抗体分子或其结合片段的轻链可变区CDR1选取0-5个位点进行人源化优化；更加优选地，第L30E和L34位优化（突变）成人种系CDR1相应位点的氨基酸；优选地，所述人源化抗体分子或其结合片段的轻链可变区序列包含SEQ ID NO: 29-33中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段为人源化抗体分子或其结合片段；

优选地，所述人源化抗体分子或其结合片段的重链可变区框架(FR)序列选自人种系重链序列，例如IGHV1-69*02(F), IGHV1-69*06(F), IGHV1-69*08(F), IGHV1-69*09(F),IGHV1-69*10(F), IGHV1-69*04(F), IGHV1-69*14(F), IGHV1/OR15-2*02(P), IGHV1-69*01(F), IGHV1-69*11(F)等,优选IGHV1-69*01(F)；J基因例如hJh4.1, hJh4.2, hJh4.3,hJh1, hJh2, hJh3.1, hJh3.2等，优选hJH4.1；

优选地，所述FR序列包含0-10个氨基酸回复突变；优选地，所述人源化抗体分子或其结合片段的重链可变区序列包含SEQ ID NO: 34-37中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段的CDR区为脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段；

优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为轻链CDR序列；

优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为轻链CDR1第L30A和/或L30B位优化的CDR1序列或片段；优选地，所述人CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列的轻链可变区序列包含SEQ ID NO: 46-49中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

10.根据权利要求1至6或8中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段的CDR区为脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段；

优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为重链CDR序列；

优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列或片段为重链CDR3第H99和/或H100位优化的CDR序列或片段；优选地，所述人CDR区脱氨基化敏感位点优化的CDR序列的重链可变区序列包含SEQ ID NO: 50-54中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列。

11.根据权利要求7至10中所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的抗体分子或其结合片段包含序列为SEQ ID NO: 29-33、SEQ ID NO: 46-49中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列的轻链可变区和序列为SEQ ID NO: 34-37、SEQ ID NO: 50-54中任一个所示的氨基酸序列或其突变序列的重链可变区的组合。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的抗体分子或其结合片段的轻链包含选自人抗体κ或λ型轻链恒定区或其变体；和/或所述人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的抗体分子或其结合片段的重链包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其变体；

优选地，所述重链恒定区或其变体，包含人IgG1 Fc区第243位，或第239、第330和第332位突变；优选地，所述重链恒定区或其变体，包含人IgG1 Fc区第356-358位为EEM或DEL的变体。

13.根据权利要求7至12中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化的抗体分子或其结合片段的轻链包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 58或SEQID NO: 60所示的氨基酸序列或者与其具有至少85%序列同源性的全长轻链序列；和/或

所述人源化，和/或CDR区脱氨基化敏感位点优化，和/或优选IgG1变体的抗体分子或其结合片段的重链包含SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQID NO: 55、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62或SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或者与其具有至少85%序列同源性的全长重链序列。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段，其中所述CLDN18.2抗体分子或其结合片段包含半抗体或半抗体的抗原结合片段，优选地，包含Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或单链Fv片段(scFv)。

15.一种DNA分子，其编码权利要求1至14中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段。

16.一种表达载体，其表达权利要求15所述的DNA分子。

17.一种生产抗体的方法，其包括用表达载体转化可表达权利要求1至14中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，更优选为CHO细胞。

18.一种药物组合物，其包含权利要求1至14中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段和任选地药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。

19.一种治疗癌症的方法，其包括以有效治疗癌症的量向需要其的对象施用权利要求1至14中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段或者权利要求18所述的药物组合物；

优选地，所述方法包含施用包含权利要求1至14中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段的任何组合，包括施用权利要求1至14中任一项所述的CLDN18.2抗体分子或其结合片段和免疫检查点抗体，包含PD-1抗体或抗体药物的组合。

20.根据权利要求19所述的方法，所述癌症为肺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、头颈癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌结肠直肠癌、肝癌，胰腺癌，膀胱癌，白血病等或癌症的转移性病灶。