CN108948193B - 针对tim-3的抗体分子,抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了TIM‑3抗体、其抗原结合片段及其医药用途。具体地，本发明涉及包含所述TIM‑3抗体CDR区的鼠源抗体，嵌合抗体、人源化抗体，以及包含人TIM‑3抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。尤其地，本发明涉及TIM‑3抗体，联合PD‑1抗体的药物组合，及其在肿瘤治疗中的用途。

Description

针对TIM-3的抗体分子,抗原结合片段及其医药用途
技术领域
本发明涉及一种TIM-3抗体，TIM-3抗原结合片段，包含所述TIM-3抗体的CDR区的鼠源抗体，鼠源抗体可变区和人抗体恒定区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含所述抗体及其抗原结合片段的对人血细胞PBMC, T细胞，NK细胞的激活并对肿瘤细胞的杀伤作用，抑制肿瘤的生长，以及其单独或药物组合物，和作为抗癌药物的用途。
背景技术
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域近年取的重大突破。针对免疫检查点PD-1/PD-L1的抗药物自2014年开始已经有5款药物被批准上市，但还未在中国上市。其中PD-1抗体药物Opdivo和Keytruda早已超过10亿美元的年销售额。遗憾的是PD-1/PD-L1抗体药物只能对部分病人有效，还有大量的病人没有办法从这一巨大进展的肿瘤免疫治疗领域获益。T细胞是免疫治疗的中心，能否有效地调控T细胞是免疫治疗是否有效的关键因素之一。 其中，免疫检查点抗体联用是提高肿瘤病人有效率的方法之一。事实上，抗PD-1抗体Opdivo 和 抗CTLA-4的抗体联用已经被批准用于治疗黑色素瘤。 其它的免疫检查点的抗体和PD-1/PD-L1抗体联合也被认为提高PD-1/PD-L1抗体有效率的有效途径。
在PD-1/PD-L1以外的免疫检查点中，T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3) 是可能和PD-1/PD-L1联合调控T细胞活性的免疫检查点分子之一。TIM-3在分泌IFN-γ 的Th1 (T辅助l) CD4+ 细胞和细胞毒性的CD8+T （Tc1）细胞上被表达的跨膜受体蛋白。除在分泌INF-γ的Th1，Tc1表达外，在调节T细胞（Treg）, 先天性免疫细胞，包括树突细胞DC, 自然杀伤细胞 NK, 单核细胞 monocytes等中均有表达（Anderson A.C. et al,Immunity 44, 2016, p989-1004）。TIM-3有多个配体，包括半乳凝素9 （galectin-9）, 磷脂酰丝氨酸phosphatidylserine, HMGB1, CEACM-1等。 TIM 3一般不在幼稚T细胞上被表达，而是在活化的效应T细胞上被上调， 在调节体内的免疫性和耐受度中具有作用。同有些免疫检查点分子不同的是，TIM-3并非只是在T细胞激活后，如Th1, Tc1中高表达，参与协同抑制功能，抑制效应T细胞活性，引起耐受， 还在耗竭（exhausted）T细胞中高表达，抑制了T细胞的功能。TIM-3在PD-1抗体治疗的动物模型中高表达，而且联合TIM-3的抗体后显著提高治疗药效。 Nigiow SF et al. Cancer Res. 71(10):3540-51, 2011. 最近研究还发现，PD-1 抗体治疗的病人，出现耐药，其CD4+, CD8+细胞 TIM-3表达显著提高，这个动物模型上看到的情况一致 （Koyama S et al. Nat Communication. 2016 Feb 17）。因此， 抗体TIM-3抗体和PD-1抗体联合治疗不仅可能是提高PD-1抗体的有效率的方法之一，而且还可能是PD-1抗体治疗耐药后的病人的有效选择。目前临床试验的TIM-3抗体有Tesaro 的TSR-022, 用于单独或者和PD-1抗体联用治疗晚期或转移实体瘤和诺华的MGB-453, 用于单独或和PD-1抗体联用治疗晚期恶性肿瘤。关于TIM-3靶点的抗体还没有更多的临床治疗信息。
本领域需要更好的抗TIM-3的抗体，单独或能够联合PD-1抗体用于肿瘤的免疫治疗，提高肿瘤病人对这些治疗的有效率。本发明通过大量的优化创新筛选，得到了优选抗体TIM-3的抗体。本发明提供了结合活性更好，并且在人血细胞上具有更好活性功能的抗体TIM-3抗体。本发明抗体激活BPMC杀伤肿瘤细胞，激活耗竭T细胞杀伤肿瘤细胞的活性更强，而且能和PD-1抗体协同激活T细胞杀伤肿瘤细胞，促进INF-γ的分泌。
发明内容
本发明提供一种能和人T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3 (TIM-3) 特异结合的抗体分子或其结合片段，其包含至少1个选自以下的CDR区序列或其突变序列:
a) 轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO: 5 的 VLCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO:6 的 VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO: 7 的 VLCDR3 氨基酸序列；和重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO: 8 的 VHCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO: 9 的 VHCDR2 氨基酸序列和SEQ ID NO: 10 的 VHCDR3氨基酸序列；
b) VL，其包含SEQ ID NO: 5 的 VLCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO: 6 的 VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO: 7 的 VLCDR3 氨基酸序列；和VH，其包含选自SEQ ID NO: 11 的VHCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO: 12 的 VHCDR2 氨基酸序列和 SEQ ID NO: 10 的VHCDR3氨基酸序列；
c) VL，其包含SEQ ID NO: 5 的 VLCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO: 6 的 VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO: 7 的 VLCDR3 氨基酸序列；和VH，其包含选自SEQ ID NO: 13 的VHCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO: 14 的 VHCDR2 氨基酸序列和 SEQ ID NO: 10 的VHCDR3氨基酸序列；或
d) VL，其包含SEQ ID NO: 15 的 VLCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO: 16 的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO: 17 的 VLCDR3 氨基酸序列；和VH，其包含选自SEQ IDNO: 18 的 VHCDR1 氨基酸序列、SEQ ID NO: 19 的 VHCDR2 氨基酸序列和 SEQ ID NO:20 的 VHCDR3氨基酸序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 5所示的VLCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 6所示的VLCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 7所示的VLCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 15所示的VLCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 16所示的VLCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO: 17所示的VLCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 8所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 9所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 10所示的VHCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 11所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 12所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 13所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 14所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 18所示的VHCDR1氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 19所示的VHCDR2氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO: 20所示的VHCDR3氨基酸或其突变序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO: 5 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 6 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 7 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VL，其包含SEQ ID NO: 15 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 16 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 17 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO: 8 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ ID NO: 9 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 10 的VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VH，其包含选自SEQ ID NO: 11 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQID NO: 12 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 10 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VH，其包含选自SEQ ID NO: 13 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQID NO: 14 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 10 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VH，其包含选自SEQ ID NO: 18 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQID NO: 19 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 20 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VL，其包含SEQ ID NO: 5 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 6 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 7 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列；和VH，其包含选自SEQ ID NO: 8 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 9 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 10 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VL，其包含SEQ ID NO: 5 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 6 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 7 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列；和VH，其包含选自SEQ ID NO: 11 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 12 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 10 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VL，其包含SEQ ID NO: 5 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 6 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 7 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列；和VH，其包含选自SEQ ID NO: 13 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 14 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 10 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的所述的TIM-3抗体或其结合片段，其包含VL，其包含SEQ ID NO: 15 的 VLCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQ IDNO: 16 的 VLCDR2氨基酸序列或其变异序列和SEQ ID NO: 17 的 VLCDR3 氨基酸序列或其变异序列；和VH，其包含选自SEQ ID NO: 18 的 VHCDR1 氨基酸序列或其变异序列、SEQID NO: 19 的 VHCDR2 氨基酸序列或其变异序列和 SEQ ID NO: 20 的 VHCDR3氨基酸序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段，所述鼠源TIM-3抗体分子或其结合片段经亲和力 (affinity) 成熟将其affinity提高3-10倍以上，优选10倍。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的鼠源抗体分子或其结合片段轻链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的鼠源抗体分子或其结合片段重链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 2或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的鼠源抗体轻链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1或其变异序列，重链可变区氨基酸序列为 SEQ ID NO: 2或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和人抗体恒定区，包括人抗体重链恒定区IgG1, IgG2, IgG4, IgG4和轻链恒定区κ、λ链等组合成的嵌合抗体分子或其结合片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 25或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 26或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 25或其变异序列，重链氨基酸序列为 SEQ ID NO: 26或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体或其结合片段为嵌合抗体，所述TIM-3嵌合抗体或其结合片段经亲和力 (affinity) 成熟将其affinity提高3-10倍以上，优选10倍。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体或其结合片段为人源化的抗体分子或其结合片段。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区框架FR序列选自人种系轻链序列，包含IGKV1-20*01，IGKV1-20*02, IGKV1-16*01, IGKV1-39*01, IGKV1-NL1*01, IGKV1D-12*01, 或IGKV1D-39*01 等，优选IGKV1-39*01 。J 基因hJK2.1, hJK1, hJK2.2 等，优选hJK2.1。FR序列区优选 0-10个氨基酸回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区CDR序列, 分别按照Kabat,Chothia, AbM, 或Contact等编号规则定义的各CDR序列，所述CDR序列包含表3-6所列轻链CDR序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区序列包含选自SEQ ID NO: 27-35或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区框架FR序列选自人种系重链序列，包含IGHV3-7*01(F), IGHV3-7*02（F）, IGHV3-7*03(F), IGHV3-48*01(F), IGHV3-48*02(F), IGHV3-48*03(F), IGHV3-48*04(F), IGHV3-21*-1(F), 或IGHV3-21*02（F）等，优选IGHV3-21*01(F)。 J基因hJH1, hJH2, hJH3.1, hJH3.2, hJH4.1， hJH4.2, hJH4.3等，优选hJH4.1。FR序列区优选 0-10个氨基酸回复突变。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区CDR序列, 分别按照Kabat,Chothia, AbM, 或Contact等编号规则定义的各CDR序列，所述CDR序列包含表3-6所列重链CDR序列或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区序列包含选自SEQ ID NO: 36-37或其变异序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体包含任选自SEQ ID NO: 27-35或其变体序列的轻链可变区和任选自 SEQ ID NO: 36-37或其变体序列的重链可变区的组合。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链包含选自人κ或λ链恒定区或其变体。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链包含选自人抗体IgG1, IgG2, IgG4, IgG4重链恒定区或其变体。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链包含选自SEQ ID NO: 38，SEQ ID NO: 40，或SEQ ID NO: 42或与其具有至少85 %序列同源性的全长轻链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链包含选自SEQ ID NO: 39，SEQ ID NO: 41，或SEQ ID NO: 43或与其具有至少85%序列同源性的全长重链序列。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段选自任人源化的轻重和重链组合，优选地，所述人源化抗体轻、重链组合：SEQ ID NO: 38 和SEQ ID NO: 39。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段选自任人源化的轻重和重链组合，优选地，所述人源化抗体轻、重链组合：SEQ ID NO: 40 和 SEQ ID NO: 41。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段选自任人源化的轻重和重链组合，优选地，所述人源化抗体轻、重链组合：SEQ ID NO: 42 和 SEQ ID NO: 43。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体或其结合片段为人源化抗体，所述TIM-3人源化抗体或其结合片段经亲和力 (affinity) 成熟将其affinity提高3-10倍以上，优选10倍。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体或其结合片段包含半抗体或半抗体的抗原结合片段，优选地，包含Fab 、F( ab’)2、Fv或单链Fv 片段(scFv) 。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段,其中所述的TIM-3抗体或其结合片段和人血细胞PBMC抗原结合，增强PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段,其中所述的TIM-3抗体或其结合片段可增强激活的人血T细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段,其中所述的TIM-3抗体或其结合片段可增强激活的人血T细胞分泌INF-γ。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段,其中所述的TIM-3抗体或其结合片段协同PD-1抗体可增强激活的人血T细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用。
在本发明一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的TIM-3抗体或其结合片段,其中所述的TIM-3抗体或其结合片段协同PD-1抗体可增强激活的人血T细胞分泌INF-γ。
本发明进一步提供一种DNA分子，其编码上述TIM-3抗体分子或其结合片段。
本发明进一步提供一种表达载体，表达上述TIM-3抗体分子或其结合片段的DNA分子。
本发明进一步提供一种生产抗体的方法，包含用表达载体转化表达上述TIM-3抗体分子或其结合片段的宿主细胞，优选哺乳动物细胞，更优选为CHO细胞。
本发明进一步提供一种药物组合物，其包含在本发明一个优选的实施方案中，包含所述任一TIM-3抗体或其结合片段和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
本发明进一步提供一种治疗癌症的方法，包括以有效的治疗癌症的量，向需要其的对象施用在本发明一个优选的实施方案中，提供上述所述任一TIM-3抗体分子或其结合片段或药物组合物， 优选地，所述方法包括包含本发明抗体分子或其结合片段的任何组合，更优选地，为上述任一抗体分子或其结合片段和PD-1的抗体或抗体药物组合。
本发明进一步提供一种治疗癌症的方法，包括和本发明所述抗体联合治疗方法。
本发明进一步提供一个优选的实施方案中，提供一种如上所述的包含TIM-3抗体治疗癌症的方法，所述癌症包括实体肿瘤、液体肿瘤，优选为肺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌结肠直肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、食道癌、神经肿瘤、白血病等或癌症的转移性病灶。
附图说明：
图1 本发明TIM-3抗体mab5-c和人TIM-3的结合活性（ELISA）。结果表明，本发明TIM-3 抗体 mab5-c特异结合人TIM-3（EC50 = 0.06nM）比对照抗体强一倍。
图2 本发明TIM-3抗体mab5-c 结合TIM-3显著增强人血细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。mab5-c结合PBMC增强NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤作用呈浓度依赖，而且在3ug/ml的浓度下杀伤作用达到平台。其杀伤活性是对照抗体的2.8倍。
图3 本发明人源化TIM-3抗体增强人血细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。人源化抗体保留了鼠源抗体的结合力，并结合PBMC增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。ab6的活性为对照抗体的2倍以上。
图4 本发明人源化TIM-3抗体和PD-1抗体联合激活人T细胞，显著抑制肿瘤细胞的生长。
具体实施方式
为了更容易理解本发明，描述实施例子之前，先对本发明某些技术和科学术语做说明。
除显而易见在本发明件中的它处另有明确定义，本发明使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J. biol. chem, 243, p3558 (1968) 中所述。
术语"TIM-3" 包括同种型、哺乳动物(例如人)的TIM-3 、人TIM-3 的物种同源物和包含至少一个与TIM-3 的共同表位的类似物。TIM-3 (例如人TIM-3 )的氨基酸序列是本领域中己知的，例如Sabatos 等人， 2003. Nat Immunol ,4 (11): 1102。
本发明所述的抗体指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为µ链，δ链γ，α链，ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG 可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1, 2, 3, 4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区（V区）；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区（C区）。可变区包括3个高变区（HVR）和4个序列相对保守的骨架区（FR）。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区（CDR）。每条轻链可变区（LCVR）和重链可变区（HCVR）由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指VLCDR1，VLCDR2，和VLCDR3；重链的3个CDR区指VHCDR1，VHCDR2和VHCDR3。
本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则（VLCDR1-3，VHCDR1-3），Chothia，AbM, Contact的编号规则（见表2，CDR定义方法）。本发明抗体轻链、重链的CDR区分别按照Kabat, Chothia, AbM, 或Contact等编号规则定义各CDR序列，见表2，表3-6。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人TIM-3的单克隆抗体。制备时用TIM-3抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源TIM-3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1, IgG2, IgG3或 IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体（chimeric antibody）”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆源于人抗体区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核细胞，工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的TIM-3嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区，抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO: 1所示。 所述的TIM-3嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1, IgG2, IgG3, IgG4或其变体的重链FR区，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO: 2所示。人抗体的恒定区可选自人源IgG1, IgG2, IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或 IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后无ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用）IgG1。可通过对IgG上Fc段的修饰，可降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1 的N297A，L234A，L235A； IgG2/4chimera，IgG4的F235E,或L234A/E235A 突变。
术语“人源化抗体（humanized antibody）”，也称为CDR移植抗体（CDR-graftedantibody），是指将小鼠的CDR序列，特别的，本发明所述TIM-3抗体的CDR是按Kabat,Chothia, AbM或 Contact等编号规则定义的各CDR序列 （见表2，表3-6），移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到。在本发明一个优选的实施方案中，所述的TIM-3人源化抗体小鼠的CDR序列选自SEQ ID NO: 5，6，7，15, 16, 17。人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV1-39*01和hJK2.1的组合序列SEQID NO: 27-35，包含人种系轻链IGKV1-39*01的FR1，FR2，FR3区和hJK2.1的FR4区；其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV3-21*01(F)和hJH4.1的组合序列SEQ ID NO: 36-37，包含人种系重链IGHV3-21*01(F) 的FR1，FR2，FR3区和hJH4.1的FR4区。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少回复突变，以保持活性。
本发明中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F（ab’）2片段，以及与人TIM-3结合的Fv片段sFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体（single chain antibody）或单链Fv（sFv）。本发明的术语“与TIM-3结合”，指能与人TIM-3相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
抗体分子包含双体抗体(diabody) 和单链分子以及抗体的抗原结合片段 (例如，Fab 、F(ab' )2 和Fv) 。抗体分子包含一条重链和一条轻链(在本发明中称作半抗体)或由其组成。 Fab' 、F(ab’) 2 、Fc 、Fd 、Fv 、单链抗体 (例如scFv) 、单一可变结构域抗体、双体抗体(Dab) (双价和双特异性)和嵌合 (例如，人源化)抗体，它们可以通过修饰完整抗体产生，或使用重组DNA技术从头合成的那些抗体分子。这些功能性抗体片段保留选择性地与其相应抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体类别，包括但不限于IgG 、IgA 、IgM 、IgD和IgE并且来自任何抗体亚类(例如， IgG1 、IgG2 、IgG3 和IgG4) 。抗体分子的制备可以是单克隆或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外生成的抗体。抗体可以具有例如选自IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 的重链恒定区。抗体还可以具有例如选自K或λ的轻链。术语"免疫球蛋白" (I g) 在本发明中与术语"抗体"互换地使用。
本发明所公开的抗体也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然缺少轻链的抗体、衍生自常规4 链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些支架之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是现有技术的任何抗体，或将来的任何单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、鱼类、重鱼、山羊、兔和牛。根据一些方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称作缺少轻链的重链抗体。出于清晰原因，从天然缺少轻链的重链抗体衍生的这种可变结构域在本发明中称作VHH或纳米体以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这种VHH 分子可以衍生自骆驼科 ( Camelidae )物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼) 中产生的抗体。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体，这类VHH也被考虑。VH 区和VL 区可以再划分为超变区，称作"互补性决定区"(CDR) ，其问插有更保守的区域，称作"框架区" (FR) 。框架区和CDR 的范围己有多种方法定义。
本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。本发明所述载体的宿主细胞，可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero 细胞、Hela细胞、COS 细胞、CHO细胞、HEK293 细胞、BHK细胞、合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9 细胞。
单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术（如CDR-grafting），或其它现有技术进行重组得到。生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量（也称作“治疗有效量”）可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征（例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等）的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。
整个说明书和权利要求书中使用的术语 “基本上由……组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性” 、“变异序列”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源怀百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60%同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本发明使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本发明使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA所述扩增的程序或技术。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。本发明使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”、“任选地”、“任意”或 “任一”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
本发明所用， "一个" 和"一种"在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。除非内容明确提示，否则术语"或"在本发明中用来意指术语"和/或"并且与之互换使用。"约"和"大约"应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度一般在其10% 范围内和更一般在其5% 范围内。本发明公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸，它们具有指定的序列，变异序列或与其基本上相同或相似的序列，例如，与序列指定至少85% 、90% 、95% 或更多相同的序列。在氨基酸序列的情况下，术语 "基本上相同"在本发明中用来指第一氨基酸序列。
“药物组合物”表示含有一种或多种本发明所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散剂、脂质体或适合高抗体浓度的其他有序结构。可以通过将活性化合物 (即抗体或抗体部分) 以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在适宜的溶剂中并入，根据需要，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。
本发明所述的方法、组合物、联合治疗可以与其他活性剂或治疗方式，所述的方法包括向对象以有效治疗或预防疾病 (例如，癌症)的量，施用本发明所述的抗TIM-3 抗体分子，任选地，与PD-1 、PD-L1、PD-L2 、LAG-3 、CEACAM-1 和/或CEACAM-5 或CTLA-4抗体 的一种或多种抑制剂的组合，还包括施用抗TIM-3抗体分子、额外的活性剂或全部可以按这样的量或剂量施用，所述量或剂量高于、低于或等于单独(例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量。抗TIM-3抗体，额外的活性剂或全部的施用量或剂量比单独 (例如，作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量低 (例如，至少20% 、至少30% 、至少40% 或至少50% )。
"保守性氨基酸置换"是其中氨基酸残基以具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬眈胶、谷氨酌胶、丝氨酸、苏氨酸、酷氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、细氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有自分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、做氨酸、异亮氨酸) ，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质" (如果为单链) 在本发明中互换地使用。术语"核酸"、"核酸序列“ ，"核苷酸序列"或"多核苷酸序列"和"多核苷酸"互换使用。术语"分离的"指从其原始或原初环境 (例如，如果官天然存在，天然环境) 取出的物质。
术语"竞争"或"交叉竞争"在本发明中可互换地用来指抗体分子干扰抗TIM-3抗体分子与靶(例如，人TIM-3) 结合的能力。对结合作用的干扰可以是直接或间接的(例如，通过抗体分子或靶的变构调节作用)。可以使用竞争结合测定法(例如， FACS 测定法、ELISA或BIACORE测定法)确定抗体分子能够干扰另一种抗体分子与其靶结合的程度并且是否因此可以称它为竞争。术语"表位"指抗原(例如，人TIM-3) 中与抗体分子特异性相互作用的部分。
此外，正如本发明的实施例中描述的那样，抗TIM-3抗体可以刺激NK细胞介导的对靶细胞的杀伤，并且可以增强CD4+T细胞的IFN- γ 分泌和增殖。因此，在某些实施方案中，本发明中描述的抗TIM-3抗体分子适用于剌激所要的免疫应答，例如抗癌症细胞或病原体的免疫应答。本发明中描述的抗TIM-3抗体可以被用来治疗免疫病症，尤其是与T淋巴细胞有关的病症，包括但不限于慢性炎性疾病和癌症。以及抑制肿瘤细胞生长的方法，包括将治疗有效量的本发明中所述的抗TIM-3抗体分子施用于受试者。该方法适用于癌症的体内治疗。为了获得免疫性的抗原特异性增强，抗TIM-3抗体分子可以与其它抗体一起施用。在将TIM-3抗体组合一种或多种活性剂施用时，该组合可以以任何顺序或同时施用癌症类型。在某些方面中，提供在对象中治疗对象(例如，减少或缓解)过度增生性病状或疾病(例如，癌症) ，例如，实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤或转移性病灶的方法。该方法包括向对象单独或与其他活性剂或治疗方式组合地施用本发明所述的一种或多种抗TIM-3抗体分子。
如本发明所用，术语"癌", ”癌症”，“癌症病人” 意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如，多个器官系统的肉瘤和癌(包括腺癌和鳞状细胞癌) ，如侵袭肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、生殖泌尿道(例如，肾、膀肮上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌中的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。鳞状细胞癌包括恶性肿瘤，如在肺、食道、皮肤、头部和颈部区域、口腔、肛门和子宫颈中。前述癌的转移性病灶也可以使用本发明所述的方法和组合物治疗或预防。针对TIM-3 的抗体分子可以与免疫原性剂如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖分子)、细胞和用编码免疫剌激性细胞因子的基因转染的细胞组合。
组合进一步包括免疫检查点调节物的抑制物或激活物(例如，LAG-3 抑制物(例如，抗TIM-3抗体分子)、PD-L1抑制物(例如，抗PD-L1抗体分子)、PD-1 抑制物(例如抗PD-1抗体分子) ，或CTLA-4抑制物(例如，抗CTLA-4抗体)或其任意组合。TIM-3阻断作用也可以与标准癌症治疗组合。TIM-3阻断作用可以有效地与化疗方案组合。在这些情况下，可以减少施用的化疗药物剂量。组合物可以与一者或多者组合施用，免疫调节剂 (例如，共刺激分子的激活物或抑制性分子的抑制物) ;疫苗或其他形式的细胞免疫疗法。
抗TIM-3抗体分子的示例性非限制组合和用途包括抗TIM-3抗体分子与共剌激分子或抑制性分子(例如，共抑制性配体或受体) 的调节物组合施用。 抗TIM-3抗体分子与调节物(例如，共刺激分子的激动剂) 组合施用。和共剌激分子的激动剂选自OX40 、CD2 ，CD27 、CDS 、ICAM-1 、LFA-1 (CD11a/CD18) 、ICOS(CD278) 、4-1BB( CD13 7)、GITR 、CD30、CD40 、BAFFR 、HVEM 、CD7 、LIGHT 、NKG2C 、SLAMF7 、NKp80 、CD160 、B7-H3或CD83配体的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段，或可溶性融合物)。与免疫检查点分子(或免疫抑制性分子)的抑制剂组合施用抗TIM-3 抗体分子。术语"免疫检查点"是指在免疫细胞的细胞表面上的一组分子，其可以充当"闸"以下调或抑制免疫应答，例如抗肿瘤免疫应答。免疫检查点分子包括但是不同限于PD-1、PD-L1、细胞毒性的T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、B7-H1、B7-H3、OX-40，4-1BB(CD137) 、CD40 、TIM-3和淋巴细胞活化基因3(LAG-3) ，等等。可用于与本发明中描述的抗TIM-3分子组合的可以充当免疫检查点分子的抑制剂的免疫治疗剂包括但是不同限于PD-L1、PD-L2 、CTLA-4 、TIM-3 、LAG-3 ， VISTA 、BTLA 、TIGIT 、LAIR1 ， CD160 、2B4 、CEACAM( 例如CEACAM-l 、CEACM-3 和/或CEACAM-5) 和/或TGFRbeta 的抑制剂。可以通过在DNA 、RNA或蛋白质水平上的抑制来对免疫抑制性分子进行抑制。免疫检查点分子(例如PD-1 、LAG-3 、TIM-3 、CEACAM- 1/-5) 可以调节T细胞功能而促进肿瘤的免疫逃避。与抗TIM-3抗体或其抗原结合片段组合施用抗TIM-3抗体分子，与抗PD-1 抗体或其抗原结合片段组合施用抗TIM-3 抗体分子。与抗TIM-3抗体和抗PD-1抗体或其抗原结合片段组合施用抗TIM-3抗体分子。施用双特异性抗体，其包括抗TIM-3抗体分子和抗PD-1 或抗TIM-3抗体或其抗原结合片段， 或TIM-3抗体和LAG-3抗体或其抗原结合片段。
使用单独的或与另一种免疫调节剂(例如抗LAG-3 ，抗PD-l或抗PD-L1抗体分子)组合的抗TIM-3抗体分子来治疗肾癌，例如肾细胞癌(RCC) (例如，透明细胞肾细胞癌(CCRCC) 或转移性RCC 。抗TIM-3抗体分子可以与以下一者或多者组合施用:基于免疫的策略(例如，自介素2或干扰素α) 、靶向药物(例如， VEGF抑制剂如针对VEGF 的单克隆抗体);VEGF酷氨酸激酶抑制剂如舒尼苔尼、索拉非尼、阿昔苔尼和帕瞠帕尼;RNAi 抑制剂)或VEGF信号传导的下游介导物的抑制剂，例如，雷帕霉素哺乳动物靶(mTOR) 的抑制剂。
可以利用本发明中公开的抗体分子抑制其生长的示例性的癌症包括典型地对免疫疗法应答的癌症。适合治疗的癌症的非限定性的实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外，可以利用本发明中描述的抗体分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。癌症包括但是不同限于基底细胞癌、胆道癌、膀肮癌、骨癌、大脑和CNS癌症、原发性CNS淋巴瘤、中枢神经系统(CNS) 瘤、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼睛癌症、头部和颈部癌症、胃癌、土皮内瘤、肾癌、喉癌、血病 (包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巳母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性或急性白血病) 、 肝癌、肺癌(例如小细胞和非小细胞癌)、淋巴瘤，包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、黑素瘤，例如皮肤或眼内的恶性黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口腔癌) ; 卵巢癌，胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌症、肉瘤:皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、肝癌、月工区癌症、输卵管癌、阴道癌、外阴癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体瘤、脊椎轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波因肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括由石棉诱导的那些癌症，以及其它癌和肉瘤和所说的癌症的组合。
具体实施例子
以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：抗原，抗体的克隆，表达和纯化
本发明所用的TIM-3-his （货号：TM3-H5229），TIM3-hFc（货号： TM3-H5258）购自北京百普赛斯生物科技有限公司。TIM-3-his-hFc购自北京义翘神州科技有限公司， 货号：10390-H03H。本发明抗体，包括对照抗体ABTIM3 （序列来自WO2015117002A1），和 PD-1抗体nivolumab（序列来自WO2013019906）轻、重链序列合成后，分别克隆到pTT5载体上（Biovector，Cat#: 102762），瞬时转染HEK293E细胞 (Life Technologies Cat. No.11625019) 表达得到。瞬时染细胞密度 6~8×105 细胞/ml ，培养基为 Free Style 293（Gibco，Cat#12338018），37℃ 8% CO2 摇床培养，转染 5-6天后收样， 离心收集上清。按常规方法进行抗体纯化，即用PBS（上海源培生物科技股份有限公司, 目录号S320）平衡含有protein A（GE, Cat#: 175199）的重力柱，冲洗2-5倍柱体积, 将离心收集的上清过柱，用5-10倍柱体积的PBS冲洗柱子，再用pH 3.5 0.1M乙酸洗脱目的蛋白，再用pH 8.0的Tris-HCl调节至中性，检测浓度备用。
实施例2：抗TIM-3抗体结合ELISA实验
用pH7.4的PBS缓冲液将goat-anti-hFc（Jackson, 109-005-008）稀释至1ug/ml浓度，以50ul/孔的体积加入96孔酶标板（Corning, CLS3590-100EA）中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5%脱脂牛奶（光明脱脂奶粉）封闭液200ul/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜（16-18小时）进行封闭。弃去封闭液，并用PBST缓冲液（PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20）洗板5次后，加入50ul/孔 ，0.5ug/ml的TIM3-hFc（货号：TM3-H5258，北京百普赛斯生物科技有限公司），置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，用PBST洗板6次后，加入50ul/孔 上清（含检测抗体）或不同浓度的待测抗体， 37℃ 孵育2小时， PBST洗板5次，加入50ul/孔 1：2500稀释的HRP标记的二抗（Jackson ImmunoResearch, 115-035-003），37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50µl/孔TMB显色底物（KPL, 52-00-03），室温孵育10-15min，加入50µl/孔1MH2SO4终止反应，用MULTISKAN Go酶标仪 （ThermoFisher, 51119200）在450nm处读取吸收值，根据OD值 计算EC50 或者挑选结合活性高的克隆。
实施例3：抗人TIM-3抗体人血细胞活性实验
人血细胞（PBMC）来自健康人捐献的外周血，或者购自妙通（上海）生物科技有限公司（产品号：SER-PBMC-F ）。将 PBMC按2.5x10e5个细胞/孔，K562 按5x10e4个细胞/孔铺在96孔板中 （Corning 3599）。待测杂交瘤上清抗体，或者纯化抗体加入96孔细胞板中，37°C培养箱中孵育6小时后用LDH检测试剂盒（上海同仁生物科技有限公司，目录号：CK12），按说明书进行检测，用MULTISKAN Go酶标仪读取490nm吸收值(OD)，计算LDH的释放量，比较待测样品在人血细胞活性强弱。
实施例4：抗人TIM-3抗体的发现
本发明抗人TIM-3单克隆抗体是从人TIM-3抗原免疫小鼠得到融合杂交瘤，从数十万株杂交瘤克隆中筛选、优化得到的。实验用SJL白小鼠，雌性，4周龄 (北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京) 2016-0011)。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，白天光/夜晚暗周期调节，温度20-25 ℃；湿 度40-60 %。小鼠分成3只/组/笼。抗原为TIM-3-his （货号：TM3-H5229，购自北京百普赛斯生物科技有限公司），或TIM-3-his-hFc（北京义翘神州科技有限公司， 货号：10390-H03H）。佐剂为Titermax（sigma， T2684-1ML）。抗原与佐剂比例为1:1，100 ul/25ug/只 (首免) ，100ul/12.5ug/只（加强免疫）。免疫时间为第0、14、28、42、56天, 脾细胞融合前3天加强免疫。于第22，36，50，64天，用上述实施例2的ELISA方法检测小鼠血清抗体滴度，选择血清中抗体滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合，将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞 (ATCC® CRL-8287 ) 进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板。检测得到阳性的细胞株， 将阳性细胞株进行有限稀释得到单克隆细胞株。
对杂交瘤细胞株进行筛选，包括用实施例子2 的ELISA 方法检测细胞株分泌上清中的抗体和人TIM-3的结合活性，并选择活性好的进行实施例3所述方法检测所分泌的抗体在人血细胞中的活性， 得到单克隆（部分克隆结果见表1）， 从中优化意外得到本发明mab5抗体。
表1 鼠源杂交瘤筛选单克隆细胞克隆活性
编号 初始克隆号 ELISA 数值(OD450) 人血细胞活性
mab1 2C11 0.354 弱
mab2 8C9 1.69 强
mab3 1H4 1.02 弱
mab4 5E10 1.07 强
mab5 6F3 1.73 强
实施例5：鼠源抗人TIM-3抗体筛选、鉴定
从数十万株杂交瘤细胞克隆中挑选出和人TIM-3抗原结合活性好， 且在人血细胞实验中显示活性强的单克隆杂交瘤细胞株mab5 （表1），提取该细胞株的抗体序列，再进行重组表达，纯化，鉴定得到本发明候选抗体mab5。
从杂交瘤优选单克隆细胞株中提取抗体序列过程为本领域技术人员常用的方法。收集本发明筛选优选得到单克隆细胞株，扩增培养后，取1 x 106个细胞，用Trizol（Invitrogen, 15596-018）提取RNA (按照试剂盒说明书步骤)，将提取的RNA并反转录成cDNA，反转录试剂盒购自生工生物技术（上海）股份有限公司，Cat # B532435。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增后，扩增产物测序到mab5的抗体轻重链可变区序列。所用引物参阅Novagen 发表的手册 TB326 Rev. C0308。
本发明所得到的单克隆抗体mab5轻重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2以及对应的编码序列SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4。
本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株中获得的单克隆抗体mab5轻链可变区蛋白序列:
DILMTQSPSSMSVSLGDTVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKSFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLEYEDFADYYCVQFAQFPPTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 1)
本发明优选的杂交瘤细胞单克隆株中获得的单克隆抗体mab5重链可变区序列:
EVKLVESEGGLVQPGGSMKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQVPEKGLEWVANINYDGSNTYYLDSLKSRFIISRDNVKNILYLQMSSLKSEDTATYYCARGLYYYGGNYFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 2)
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的单克隆轻链可变区氨基酸编码序列：
GACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCACCATCACTTGCCATGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAAACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTATCAAGGAAGCAACTTGGAAGATGGAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAGCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATATGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTTTGCTCAGTTTCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 3)
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的单克隆重链可变区氨基酸编码序列：
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGAGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGTTCCATGAAACTCTCCTGCACAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCTTGGGTCCGCCAGGTTCCAGAAAAGGGTCTAGAATGGGTTGCAAACATTAATTATGATGGTAGTAACACCTACTATCTGGACTCCTTGAAGAGCCGTTTCATCATCTCGAGAGACAATGTAAAGAACATTCTATACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCAAGAGGGCTATATTATTACGGTGGTAACTACTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAG (SEQ IDNO: 4)
抗体的CDR定义本领域有几种不同的方法。各个方法可总结如下表。
表2 抗体CDR定义方法*
Loop Kabat定义 Chothia定义 AbM 定义 Contact定义
轻链CDR1 L24-L34 L24-L34 L24-L34 L30-L36
轻链CDR2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L45-L55
轻链CDR3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 L89-L96
重链CDR1 H31-35 H26-32 H26-35 H30-35
重链CDR2 H50-65 H52-56 H50-58 H47-H58
重链CDR3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101
*更多信息可以参阅网站：http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef
表3本发明抗人TIM-3抗体mab5按Kabat定义CDR序列
抗体 mab5 CDRs
轻链CDR1 HASQGISSNIG (SEQ ID NO: 5)
轻链CDR2 QGSNLED (SEQ ID NO: 6)
轻链CDR3 VQFAQFPPT (SEQ ID NO: 7)
重链CDR1 DYYMA (SEQ ID NO: 8)
重链CDR2 NINYDGSNTYYLDSLKS (SEQ ID NO: 9)
重链CDR3 GLYYYGGNYFAY (SEQ ID NO: 10)
表4本发明抗人TIM-3抗体按Chothia定义CDR序列
抗体 mab5 CDRs
轻链CDR1 HASQGISSNIG (SEQ ID NO: 5)
轻链CDR2 QGSNLED (SEQ ID NO: 6)
轻链CDR3 VQFAQFPPT (SEQ ID NO: 7)
重链CDR1 GFTFSDY (SEQ ID NO: 11)
重链CDR2 NYDGSN (SEQ ID NO: 12)
重链CDR3 GLYYYGGNYFAY (SEQ ID NO: 10)
表5本发明抗人TIM-3抗体按AbM定义CDR序列
抗体 mab5 CDRs
轻链CDR1 HASQGISSNIG (SEQ ID NO: 5)
轻链CDR2 QGSNLED (SEQ ID NO: 6)
轻链CDR3 VQFAQFPPT (SEQ ID NO: 7)
重链CDR1 GFTFSDYYMA (SEQ ID NO: 13)
重链CDR2 NINYDGSNTY (SEQ ID NO: 14)
重链CDR3 GLYYYGGNYFAY (SEQ ID NO: 10)
表6本发明抗人TIM-3抗体按Contact定义CDR序列
抗体 mab3
轻链CDR1 SSNIGWL (SEQ ID NO: 15)
轻链CDR2 GLIYQGSNLE (SEQ ID NO: 16)
轻链CDR3 VQFAQFPP (SEQ ID NO: 17)
重链CDR1 SDYYMA (SEQ ID NO: 18)
重链CDR2 WVANINYDGSNTY (SEQ ID NO: 19)
重链CDR3 ARGLYYYGGNYFA (SEQ ID NO: 20)
人抗体轻链恒定区κ链：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 21)
人IgG4的重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 22)
人IgG1的重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 23)
人IgG2的重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24)
本发明抗体可以和上述轻、重链恒定区组合，按实施例1表达纯化得到嵌合抗体。该嵌合抗体可以是人 IgG4-κ链（hIgG4）的嵌合抗体，本发明mab5-c。
本发明mab5-c 轻链氨基酸序列：
DILMTQSPSSMSVSLGDTVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKSFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLEYEDFADYYCVQFAQFPPTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 25)
本发明mab5-c 重链氨基酸序列：
EVKLVESEGGLVQPGGSMKLSCTASGFTFSDYYMAWVRQVPEKGLEWVANINYDGSNTYYLDSLKSRFIISRDNVKNILYLQMSSLKSEDTATYYCARGLYYYGGNYFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO: 26)
按实施例1克隆、表达、纯化得到mab5-c抗体。 按实施例子2所述方法检测mab5-c和人TIM-3的结合活性，结果见下表7 和 和图1。
表7 本发明抗体mab5-c和人TIM-3抗原结合活性（ELISA）
抗体 EC50 (nM)
mab5-c 0.06
对照(Reference)# 0.13
# 本发明的对照抗体用的是ABTIM3, 见专利WO2015117002A1
该结果表明本发明抗体mab5-c的ELISA 结合活性优于对照抗体1倍, 0.06 nM vs0.13 nM。
实施例 6 本发明抗体mab5-c和人TIM-3亲和力（KD）测定
用Biacore T200，GE Healthcare仪器测定本发明抗体和人TIM-3的亲和力。用pH7.4的运行缓冲液HBS-EP+（10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA 和 0.05% 的 P20）。先将Protein A (Thermo Pierce, Cat# 21181) 偶联到生物传感芯片CM5 (Cat. # BR-1005-30，GE) 上, 将芯片用新配制的50 mM NHS（N-hydroxysuccinimide）和200mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 激活, 然后注入pH4.0 10 mM NaAC 配制的 10 ug/ml的Protein A 。待测抗浓度为 5ug/ml，抗原TIM-3 浓度梯度 0 nM, 1.875nM， 3.75nM, 7.5nM, 15nM, 和30nM， 流速 30ul/分钟, 结合时间180秒，解离时间 300秒。实验后，用10mM Glycine-HCl, pH 1.5, 30 ul/min, 30s 清洗芯片。实验数据用Biacore T200 evaluation version 3.0 (GE) 软件以1:1 Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值KD。 本发明mab5-c的KD 值为如表8。
表8 mab5-c Biacore 亲和力
抗体 抗原 Ka(1/ms) Kd(1/s) KD (nM)
mab5-c 人Tim-3 1.388E+06 2.442-03 1.76
实施例7本发明抗体mab5-c结合人Tim-3能增强人血细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
本发明抗体mab5-c用实施例3 的方法检测其激活人血细胞对肿瘤细胞K562的杀伤作用，结果见表9 和图2。
表 9 本发明抗体mab5-c结合TIM-3, 增强人血细胞对肿瘤细胞的杀伤活性（%）
Figure 890179DEST_PATH_IMAGE001
上述结果表明本发明抗体mab5-c结合TIM-3增加PBMC/NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用（杀伤效率相对阴性抗体所增加的百分比）呈剂量依赖，在3ug/ml达到平台, 而且其活性是对照抗体的2.8倍（7.81% 对 2.76%）
实施例 8 本发明抗体mab5的人源化
本发明通过免疫小鼠得到结合活性和激活人血细胞杀伤肿瘤的功能意料之外优选效果的抗人TIM-3抗体mab5，进一步对mab5进行人源化。人源化如本领域许多文献公示的方法进行。根据抗体标号系统，标记识别抗体轻、重链的CDR区（见上述实施例5）。 将鼠源抗体序列和人抗体种系数据库（v-base）比较，找出同源性高的人抗体轻链种系, 包括IGKV1-20*01，IGKV1-20*02, IGKV1-16*01, IGKV1-39*01, IGKV1-NL1*01, IGKV1D-12*01,IGKV1D-39*01 等，优选IGKV1-39*01 。J 基因hJK2.1, hJK1, hJK2.2 等，优选hJK2.1。重链种系 IGHV3-7*01(F), IGHV3-7*02（F）, IGHV3-7*03(F), IGHV3-48*01(F), IGHV3-48*02(F), IGHV3-48*03(F), IGHV3-48*04(F), IGHV3-21*-1(F), IGHV3-21*02（F）等，优选IGHV3-21*01(F)。J基因hJH1, hJH2, hJH3.1, hJH3.2, hJH4.1， hJH4.2, hJH4.3等，优选hJH4.1。将本发明抗体mab5-c CDR区（见上述实施例5之定义）移植到所选择的人源化模板上，再与IgG轻、重链恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，得到本发明优化的抗TIM-3人源化的系列抗体分子。
本发明人源化轻链可变区序列：
L11：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 27)
L12：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 28)
L14：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 29)
L15：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWYQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 30)
L16：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKLLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 31)
L17：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWYQQKPGKAPKLLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 32)
L19 (L15-2)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWYQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 33)
L20 (L16-2)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAPKLLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 34)
L21 (L17-2)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWYQQKPGKAPKLLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 35)
本发明人源化重链可变区序列：
H13：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSNTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLYYYGGNYFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 36)
H18：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINYDGSNTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLYYYGGNYFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 37)
上述轻链可变区序列，如SEQ ID NO: 27-35所示任意序列与人抗体轻链恒定区κ链或λ链， 例如与SEQ ID NO: 21所示的轻链恒定区序列组合得到本发明抗体的轻链序列。上述重链可变区序列如SEQ ID NO: 36 -37， 可与任选自SEQ ID NO: 22-24 所示的重链恒定区序列组合得到本发明的重链序列， 部分序列如下表。
表 10 本发明人源化抗体序列（人κ链和hIgG4，hIgG1 为例子）
Figure 807319DEST_PATH_IMAGE002
本发明部分人源化抗体序列：
人源化ab6抗体氨基酸序列：
轻链:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 38)
重链：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSNTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLYYYGGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO: 39)
人源化ab7抗体氨基酸序列：
轻链:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO: 40)
重链：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSNTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLYYYGGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO: 41)
人源化ab8抗体氨基酸序列：
轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISSNIGWLQQKPGKAFKGLIYQGSNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQFAQFPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO: 42)
重链：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVANINYDGSNTYYLDSLKSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLYYYGGNYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO: 43)
用实施例1方法克隆、表达纯化重组抗体，ELISA 方法 (实施例2 )检测本发明人源化抗体和人TIM-3的结合活性，以及在人血细胞的功能活性（实施例3）, 结果见下表和图3。
表 11 本发明人源化抗体ELISA结合活性
人源化抗体 ELISA (nM)
mab5-c 0.107
ab6 0.159
ab7 0.154
ab8 0.131
对照（Reference） 0.245
表11 和 图3的 结果表明，本发明人源化抗体人源化后结合活性没有丢失， 而且其激活人血细胞杀伤肿瘤细胞的活性，特别是ab6结合PBMC增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤作用最强（图3）。
实施例9：本发明抗体阻断TIM-3增加或协同PD-1抗体抑制肿瘤细胞生长（U87MG）
为了检测本发明抗体在活化的T细胞上的功能，人血细胞PBMC（来源同实施例3）用抗CD3(miltenyibiotec ,130-093-387)， CD28 （miltenyibiotec, 130-093-375 ）抗体各0.5 ug/ml以及100 ng/ml IL-12 (北京义翘神州科技有限公司， 货号: CT050-HNAH ) 刺激。 激活T细胞第7天，待检测抗体和PD-1抗体（3ug/ml），和 肿瘤细胞U87MG（购自中科院细胞库，货号TCHu138） 按 5：1 加入96孔板，共培养3天，用CCK8检测U87MG细胞生长抑制作用；或者在激活T细胞第10天，待检测抗体和PD-1抗体（3ug/ml），和 U87MG细胞按 5：1 加入96孔板，在37℃短时间孵育(6小时), 用LDH 检测（同实施例3），评价本发明抗体和T细胞，PD-1抗体共同抑制肿瘤细胞的生长效率（%），结果见图4。
图4结果表明，本实验中，本发明优选抗体ab6单独对肿瘤细胞生长抑制率为0.35%（2ug/ml）和 0.763%（20ug/ml）；单独PD-1抗体（3ug/ml）对肿瘤细胞U87MG的抑制在0.5%，当2ug/ml 的ab6抗体联合PD-1抗体（3ug/ml）时，对肿瘤细胞的抑制作用增加到1.82%，是单独ab6 的 0.35% 抑制率的 5.2倍；是单独PD-1抗体的0.5% 的3.6倍。当ab6抗体浓度增加到20ug/ml时候， 联合3ug/ml PD-1抗体对肿瘤细胞的抑制率为1.33%，作用趋于平台期，仍然比单独 ab6 (0.763%), 单独PD-1抗体 (0.5% )要高 1-2倍。
这一结果表明，本发明优选人源化抗体和PD-1抗体能协同增加激活的T细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用。
实施例10：本发明抗体单独阻断TIM-3或协同PD-1抗体增加免疫细胞分泌INF-γ
为了进一步检测本发明抗体在活化的T细胞上的功能，人血细胞PBMC用抗CD3，CD28 以及IL-12激活（同实施例9）， 第 7天，重悬并计数激活的T细胞，铺96孔板， 加待测抗体或待测抗体加3ug/ml PD-1抗体，37℃培养3天后，收集上清， 检测IFN-γ量。 按ELISA检测试剂盒（上海欣奥盛生物科技有限公司，EHC102g.96）进行检测分析。结果表明，以人IgG作为对照，10ug/ml 本发明抗体ab6 引起 INF-γ分泌增加9.92% ，而加入3ug/ml PD-1抗体后，ab6 能协同增加30.0% INF-γ分泌, 是ab6单独作用3倍。而单独3ug/ml PD-1抗体在本实验中未能检测到显著的INF-γ分泌增加。本结果说明本发明的抗体能够和PD-1抗体大幅度协同激活的T细胞（exhausted T 细胞）显著分泌INF-γ。
序列表
<110> 上海健信生物医药科技有限公司
<120> 针对TIM-3 的抗体分子，抗原结合片段及其医药用途
<130> 5-16-2017
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus VL
<400> 1
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Phe Ala Gln Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus Musculus VH
<400> 2
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcacc 60
atcacttgcc atgcaagtca gggcattagc agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca 120
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcaa ggaagcaact tggaagatgg agttccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcagcag cctggaatat 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tttgctcagt ttcctcccac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 4
<211> 364
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 4
gaagtgaagc tggtggagtc tgagggaggc ttagtgcagc ctggaggttc catgaaactc 60
tcctgcacag cctctggatt cactttcagt gactattaca tggcttgggt ccgccaggtt 120
ccagaaaagg gtctagaatg ggttgcaaac attaattatg atggtagtaa cacctactat 180
ctggactcct tgaagagccg tttcatcatc tcgagagaca atgtaaagaa cattctatac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccacgt attactgtgc aagagggcta 300
tattattacg gtggtaacta ctttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
gcag 364
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Gln Gly Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Val Gln Phe Ala Gln Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Asn Tyr Asp Gly Ser Asn
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Ser Ser Asn Ile Gly Trp Leu
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Gly Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Asn Leu Glu
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
Val Gln Phe Ala Gln Phe Pro Pro
1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 18
Ser Asp Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 19
Trp Val Ala Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
80 85 90
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
95 100 105
<210> 22
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
80 85 90
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
95 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
160 165 170
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
175 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 23
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 24
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 25
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Phe Ala Gln Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 26
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ile Leu Tyr
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Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
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225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
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Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 27
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<210> 28
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<213> 人工合成
<400> 28
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 29
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 31
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 34
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 38
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210
<210> 39
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 39
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<213> 人工合成
<400> 40
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 41
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
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225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
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Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 42
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Glu Gln Ile Asp
210 215
<210> 43
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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385 390 395 400
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405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445

Claims (36)

1.一种能和人T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)特异结合的抗体分子或其结合片段，其包含以下的CDR区序列：
轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:5的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:6的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7的VLCDR3氨基酸序列；和重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:8的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:9的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:10的VHCDR3氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段。
3.如权利要求2所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的鼠源抗体分子或其结合片段轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
4.如权利要求2所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的鼠源抗体分子或其结合片段重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
5.如权利要求2所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的鼠源抗体轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:1，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
6.如权利要求1所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体分子或其结合片段为鼠源抗体分子或其结合片段的可变区和人抗体恒定区，包括人抗体重链恒定区IgG1，IgG2，IgG3，IgG4和轻链恒定区κ、λ链组合成的嵌合抗体分子或其结合片段。
7.如权利要求6所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:25。
8.如权利要求6所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段重链氨基酸序列为SEQ ID NO:26。
9.如权利要求6所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的嵌合抗体分子或其结合片段轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:25，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:26。
10.如权利要求1所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体分子或其结合片段为人源化的抗体分子或其结合片段。
11.如权利要求10所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区框架FR序列选自人种系轻链序列。
12.如权利要求11所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，所述人种系轻链序列为IGKV1-39*01；和/或，FR序列区包含0-10个氨基酸回复突变。
13.如权利要求10-12任一项所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链可变区序列包含选自SEQ ID NO:27-35或其变体序列。
14.权利要求10所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区框架FR序列选自人种系重链序列。
15.如权利要求14所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，所述人种系重链序列为IGHV3-21*01(F)；和/或FR序列区包含0-10个氨基酸回复突变。
16.如权利要求14所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链可变区序列包含选自SEQ ID NO:36-37或其变体序列。
17.如权利要求10所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体包含任选自SEQ ID NO:27-35或其变体序列的轻链可变区和任选自SEQ ID NO:36-37或其变体序列的重链可变区的组合。
18.如权利要求10所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链包含选自人κ或λ链恒定区或其变体。
19.如权利要求10所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链包含选自人抗体IgG1，IgG2，IgG3，IgG4重链恒定区或其变体。
20.如权利要求18所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段轻链包含选自SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，或SEQ ID NO:42或与其具有至少85％序列同源性的全长轻链序列。
21.如权利要求19所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段重链包含选自SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:41，或SEQ ID NO:43或与其具有至少85％序列同源性的全长重链序列。
22.如权利要求10所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，其中所述的人源化抗体分子或其结合片段选自如权利要求18或20所述的人源化轻链和如权利要求19或21所述的人源化重链组合。
23.如权利要求22所述的TIM-3抗体分子或其结合片段，所述人源化抗体轻、重链组合：SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；或SEQ IDNO:42和SEQ IDNO:43。
24.如权利要求1所述抗体分子或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体分子或其结合片段包含半抗体或半抗体的抗原结合片段、Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv)。
25.如权利要求1所述抗体分子或其结合片段，其中所述的TIM-3抗体分子或其结合片段和人血细胞PBMC抗原结合，增强PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用；或其中所述的TIM-3抗体分子或其结合片段可增强或协同PD-1抗体增强激活的人血T细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用。
26.一种DNA分子，编码如权利要求1-25任一所述抗体分子或其结合片段。
27.一种表达载体，包含如权利要求26所述的DNA分子。
28.生产抗体的方法，包含用如权利要求27所述的表达载体转化宿主细胞。
29.如权利要求28所述的方法，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
30.如权利要求29所述的方法，所述宿主细胞为CHO细胞。
31.药物组合物，其包含如权利要求1-25中任意一项所述的抗体分子或其结合片段和药学上可接受的载体。
32.如权利要求1-25中所述任一抗体分子或其结合片段或如权利要求31所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
33.如权利要求32所述的应用，所述抗体分子或其结合片段以组合的形式使用。
34.如权利要求32所述的应用，所述组合为如权利要求1-25任一抗体分子或其结合片段和PD-1的抗体或抗体药物组合。
35.如权利要求32所述的应用，所述癌症包括实体肿瘤、液体肿瘤。
36.如权利要求35所述的应用，所述癌症为肺癌、黑素瘤、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、食道癌、神经肿瘤、白血病或癌症的转移性病灶。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019242505A1 (zh) 2018-06-17 2019-12-26 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用
CN110669135B (zh) * 2018-07-03 2022-11-11 上海健信生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其用途
EP4039702A1 (en) * 2019-09-16 2022-08-10 Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-b7-h3 antibody and application thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102492038A (zh) * 2011-12-09 2012-06-13 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗人Tim-3的中和性单克隆抗体L3D及其用途
CN103721255A (zh) * 2014-01-07 2014-04-16 苏州大学 共同阻断pd-1和tim-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途
CN104592388A (zh) * 2015-03-02 2015-05-06 中国人民解放军总医院 一种抗人Tim-3的单克隆抗体的抗原结合部分
CN105622753A (zh) * 2014-11-04 2016-06-01 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种pd-1单克隆抗体及其应用
WO2016111947A2 (en) * 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20200096A1 (ar) * 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
US20180207273A1 (en) * 2015-07-29 2018-07-26 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
CN106632675A (zh) * 2016-12-15 2017-05-10 常州格露康生物医药科技有限公司 一种抗人Tim‑3单克隆抗体8E11及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102492038A (zh) * 2011-12-09 2012-06-13 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗人Tim-3的中和性单克隆抗体L3D及其用途
CN103721255A (zh) * 2014-01-07 2014-04-16 苏州大学 共同阻断pd-1和tim-3信号通路在抗胃癌治疗中的用途
CN105622753A (zh) * 2014-11-04 2016-06-01 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种pd-1单克隆抗体及其应用
WO2016111947A2 (en) * 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
CN104592388A (zh) * 2015-03-02 2015-05-06 中国人民解放军总医院 一种抗人Tim-3的单克隆抗体的抗原结合部分

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